KR101443983B1 - A multiple mutated influenza A virus for MDCK cell specific proliferation improvement - Google Patents

Abstract

본 발명은 MDCK 세포 특이적으로 증식성은 향상되었지만 병원성은 오히려 약화된 다중 돌연변이 인플루엔자 A 바이러스에 관한 것이다. 본 발명은 PB1의 153번 아미노산을 Asp에서 Asn으로 치환하고, M1의 137번 아미노산을 Ala에서 Thr으로 치환한 것을 포함하는 다중 돌연변이 재조합 인플루엔자 A 바이러스 및 이의 제조방법을 제공함으로써, 조류, 포유류 및 인체 등 다양한 숙주에 감염되는 인플루엔자 감염 질환을 예방하기 위한 백신으로 유용하게 활용될 수 있을 것이다.The present invention relates to multiple mutant influenza A viruses that have improved MDCK cell-specific proliferative potency but which are less virulent. The present invention provides a multiple mutant recombinant influenza A virus comprising substitution of Asp from Asp for amino acid 153 of PB1 and substitution of Thr for Ala at amino acid 137 of M1 and a method for producing the same, The present invention can be used as a vaccine for preventing influenza infectious diseases infected with various host strains.

Description

MDCK 세포 특이적으로 증식성이 향상된 다중 돌연변이 인플루엔자 A 바이러스{A multiple mutated influenza A virus for MDCK cell specific proliferation improvement}MDCK cell-specific proliferation-enhancing multiple mutated influenza A virus for MDCK cell specific proliferation improvement < RTI ID = 0.0 >

본 발명은 MDCK 세포 특이적으로 증식성은 향상된 약독화 다중 돌연변이 인플루엔자 A 바이러스에 관한 것이다. The present invention relates to attenuated multiple mutant influenza A viruses with improved MDCK cell specific proliferation.

해마다 인플루엔자 유행으로 유발되는 질환을 예방하기 위한 가장 중요한 공중 보건 방법이 백신접종(vaccination)이다. 백신의 유용성은, 안정적이고 배양하기 쉬운 공급원으로부터 다량의 백신 물질(예를 들어, 바이러스)을 신속하게 생산할 수 있는지의 여부에 달려있다. 신속한 백신 개발과 백신의 충분한 공급으로 그 이용성을 증대시키는 것이 인간과 동물의 수많은 질환을 퇴치시키는데 있어서 중요하다. 백신 생산의 지연과 그의 양적인 부족 때문에 급증하는 질환을 처리하는데 있어서 문제가 발생할 수 있기 때문이다. 예를 들어, 세계적으로 유행하는 인플루엔자에 대한 백신을 생산하기 위해 장기간의 소요시간(lead time)이 필요하다는 문제점이 있다고 최근 연구는 시사하고 있다. 따라서, 최근의 백신 생산은 백신용 바이러스의 증식에 초점을 맞추고 있다.The most important public health method to prevent diseases caused by influenza epidemics every year is vaccination. The availability of the vaccine depends on the ability to rapidly produce large quantities of the vaccine (e. G., Virus) from a source that is stable and easy to culture. Rapid vaccine development and increasing availability of vaccines through vaccine supply are important in eradicating many human and animal diseases. Because of the delay in the production of the vaccine and its quantitative shortage, problems may arise in the treatment of soaring diseases. For example, recent research suggests that long-term lead times are needed to produce a vaccine against influenza that is global in popularity. Therefore, recent vaccine production focuses on the propagation of vaccine virus.

일반적으로 백신의 생산을 위해서는 유정란이 사용된다. 그러나 유정란을 이용한 백신 생산은 몇 가지 문제점을 가지고 있는데, 예를 들어, 유정란을 사용할 경우 닭의 사육, 백신 생산 계획에 따른 수정란의 관리, 계란 단백질 유래 성분 제거를 위한 정제의 어려움 등의 문제가 있다.Generally, fertilization is used for the production of vaccines. However, the production of vaccine using fertilized eggs has some problems. For example, when fertilized eggs are used, there are problems such as breeding of chickens, administration of fertilized eggs according to vaccine production plan, and difficulties in purification for removal of egg protein-derived components .

따라서, 세포 배양을 통한 바이러스 증식은 백신 생산에 있어 이러한 문제점을 해결할 수 있는 중요한 돌파구가 될 수 있다. 이 중에서도 마딘 다비 개과 신장(MDCK: Madin Darby Canine Kidney) 세포주는 다양한 바이러스가 증식할 수 있는 확립 세포주이다.Therefore, virus propagation through cell culture can be an important breakthrough in addressing such problems in vaccine production. Among them, the Madin Darby Canine Kidney (MDCK) cell line is an established cell line capable of multiplying various viruses.

MDCK 세포주는 바이러스 적정에 유용한데, 이들 세포는 1958년에 정상적인 수컷 코카 스파니엘(cocker spaniel)의 신장으로부터 확립되었는데, ATCC는 S. 마딘과 N.B. 다비에 의해 기탁된 MDCK(CCL 34) 계통을 목록에 등재하였다. The MDCK cell line is useful for viral titration, which was established in 1958 from the kidney of a normal male cocker spaniel. The MDCK (CCL 34) strain deposited by Darby was listed.

한편, 기존의 인플루엔자 백신은 고 역가로 자랄 수 있는 생, 약독화 바이러스나 사멸 바이러스로부터 제조되어 왔다. 생 바이러스 백신은 면역 체계를 전반적으로 활성화하고 보호 항원 각각에 대한 면역 반응을 자극하여, 불활성화 백신의 제조 동안 발생할 수 있는 보호 항원의 선별적 파괴에 있어서의 어려움을 미연에 방지할 수 있다. 또한, 생 바이러스 백신에 의해 생성된 면역성은 일반적으로 불활성화 백신에 의해 유도되는 것 보다 더 지속적이고, 더 효과적이며, 더 교차-반응성이다. 추가로, 생 바이러스 백신은 불활성화 바이러스 백신보다 제조비용이 저렴하다. On the other hand, existing influenza vaccines have been produced from live, attenuated, or deadly viruses that can grow in high-income countries. Live virus vaccines can activate the immune system generally and stimulate an immune response against each of the protective antigens to prevent the difficulty in selective destruction of protective antigens that may occur during the production of the inactivated vaccine. In addition, the immunity generated by live virus vaccines is generally more persistent, more effective, and more cross-reactive than that induced by inactivated vaccines. In addition, live virus vaccines are cheaper to manufacture than inactivated virus vaccines.

따라서, 의약업계에서는 MDCK 등과 같은 백신 생산용 세포주에서 생산된 증식력이 향상된 백신용 재조합 약독화 인플루엔자 바이러스에 대한 수요가 증가하고 있는 추세이다.Accordingly, there is an increasing demand for the recombinant avian influenza virus, which has an improved proliferative capacity, produced in cell lines for vaccine production such as MDCK in the pharmaceutical industry.

1. Wood, J. M., 2001, Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci., 356:19531. Wood, J. M., 2001, Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci., 356: 1953 2. Zambon M., Textbook of Influenza, ed Nicholson, Webster and Hay, ch 22, pg 291-313, Blackwell Science(1998)2. Zambon M., Textbook of Influenza, ed Nicholson, Webster and Hay, ch 22, pg 291-313, Blackwell Science (1998)

따라서, 본 발명의 목적은, 다중 돌연변이 되어 증식성이 향상된 신규한 재조합 인플루엔자 A 바이러스를 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a novel recombinant influenza A virus which is multiply mutated to improve its proliferation.

본 발명의 다른 목적은, 상기 바이러스 또는 이의 항원을 유효성분으로 하는 인플루엔자 A 바이러스 백신 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide an influenza A virus vaccine composition comprising the virus or an antigen thereof as an active ingredient.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 다중 돌연변이 되어 증식성이 향상된 재조합 인플루엔자 A 바이러스 제조방법을 제공하는 것이다.It is a further object of the present invention to provide a method for producing recombinant influenza A virus having multiple mutations and improved proliferation.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 153번 아미노산인 Asp가 Asn으로 치환된 돌연변이; 서열번호 2의 701번 아미노산인 Asp가 Asn으로 치환된 돌연변이; 서열번호 3의 137번 아미노산인 Ala가 Thr으로 치환된 돌연변이; 서열번호 4의 176번 아미노산인 Asn가 Ser으로 치환된 돌연변이; 및 서열번호 5의 19번 아미노산인 Met가 Val으로 치환된 돌연변이; 중에서 선택된 어느 하나 이상의 돌연변이로서 증식성이 향상된 것을 특징으로 하는 인플루엔자 A 재조합 바이러스를 제공한다.In order to accomplish the above object, the present invention provides a mutant wherein Asp, which is amino acid 153 of SEQ ID NO: 1, is substituted with Asn; A mutation in which Asp, the amino acid at position 701 of SEQ ID NO: 2, is substituted with Asn; A mutation wherein Ala, amino acid 137 of SEQ ID NO: 3, is substituted with Thr; A mutant in which Asn, which is amino acid 176 of SEQ ID NO: 4, is substituted with Ser; And a mutation in which the amino acid 19 of SEQ ID NO: 5, Met, is substituted with Val; Wherein the proliferative activity of the influenza A recombinant virus is improved.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 인플루엔자 A 재조합 바이러스는 상기 서열번호 1의 153번 아미노산인 Asp가 Asn으로 치환되고, 상기 서열번호 3의 137번 아미노산인 Ala가 Thr으로 치환된 이중 돌연변이로서 증식성이 향상된 것을 특징으로 한다.In one embodiment of the present invention, the influenza A recombinant virus is a double mutant in which Asp, which is the amino acid at position 153 of SEQ ID NO: 1, is substituted with Asn, and Ala, which is amino acid at position 137 of SEQ ID NO: 3, Is improved.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 인플루엔자 A 재조합 바이러스는 상기 서열번호 1의 153번 아미노산인 Asp가 Asn으로 치환되고; 상기 서열번호 2의 701번 아미노산인 Asp가 Asn으로 치환되고; 및 상기 서열번호 3의 137번 아미노산인 Ala가 Thr으로 치환된; 삼중 돌연변이로서 증식성이 향상된 것을 특징으로 한다. In one embodiment of the present invention, the influenza A recombinant virus is Asp, which is amino acid 153 of SEQ ID NO: 1, is substituted with Asn; Asp, which is amino acid 701 of SEQ ID NO: 2, is substituted with Asn; And Ala which is amino acid 137 of SEQ ID NO: 3 is substituted with Thr; And is characterized in that the proliferation is improved as a triple mutation.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 인플루엔자 A 재조합 바이러스는 야생형 인플루엔자 A 바이러스에 비하여 약독화된 것을 특징으로 한다.In one embodiment of the present invention, the influenza A recombinant virus is characterized as attenuated compared to the wild-type influenza A virus.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 인플루엔자 A 재조합 바이러스는 MDCK 세포 특이적으로 증식성이 향상된 것을 특징으로 한다.In one embodiment of the present invention, the influenza A recombinant virus is characterized in that the proliferative activity is specifically enhanced in MDCK cells.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 인플루엔자 A 재조합 바이러스는 A/PR/8/34를 백본(backbone)으로 한 재조합 바이러스인 것을 특징으로 한다.In one embodiment of the present invention, the influenza A recombinant virus is a recombinant virus comprising A / PR / 8/34 as a backbone.

본 발명은 서열번호 1의 153번 아미노산이 Asp에서 Asn으로 치환되도록 이를 인코딩하는 유전자; 서열번호 2의 701번 아미노산이 Asp에서 Asn으로 치환되도록 이를 인코딩하는 유전자; 서열번호 3의 137번 아미노산이 Ala에서 Thr으로 치환되도록 이를 인코딩하는 유전자; 서열번호 4의 176번 아미노산이 Asn에서 Ser으로 치환되도록 이를 인코딩하는 유전자; 또는 서열번호 5의 19번 아미노산이 Met이 Val으로 치환되도록 이를 인코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.The present invention relates to a gene encoding amino acid 153 of SEQ ID NO: 1 so that Asp is substituted with Asn; A gene encoding amino acid 701 of SEQ ID NO: 2 so that Asp is substituted with Asn; A gene encoding amino acid 137 of SEQ ID NO: 3 so as to substitute Thr with Ala; A gene encoding amino acid 176 of SEQ ID NO: 4 from Asn to Ser; Or a gene encoding amino acid 19 of SEQ ID NO: 5 such that Met is substituted with Val.

본 발명은 또한, 상기 바이러스 또는 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 백신 조성물을 제공한다.The present invention also provides an influenza A virus vaccine composition comprising the virus or the recombinant vector as an active ingredient.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 153번 아미노산이 Asp에서 Asn으로 치환되도록 이를 인코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터; 서열번호 2의 701번 아미노산이 Asp에서 Asn으로 치환되도록 이를 인코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터; 서열번호 3의 137번 아미노산이 Ala에서 Thr으로 치환되도록 이를 인코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터; 서열번호 4의 176번 아미노산이 Asn에서 Ser으로 치환되도록 이를 인코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터; 및 서열번호 5의 19번 아미노산이 Met이 Val으로 치환되도록 이를 인코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터; 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 백신 조성물을 제공한다.The present invention also provides a recombinant vector comprising a gene encoding the amino acid 153 of SEQ ID NO: 1 so that Asp is substituted with Asn; A recombinant vector comprising a gene encoding amino acid 701 of SEQ ID NO: 2 such that Asn is substituted with Asn; A recombinant vector comprising a gene encoding amino acid 137 of SEQ ID NO: 3 so as to substitute Thr with Ala; A recombinant vector comprising a gene encoding amino acid 176 of SEQ ID NO: 4 such that the amino acid at position 176 is substituted with Asn to Ser; And a gene encoding amino acid 19 in SEQ ID NO: 5 such that Met is substituted with Val; As an active ingredient. The present invention also provides an influenza A virus vaccine composition comprising the recombinant vector as an active ingredient.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 153번 아미노산이 Asp에서 Asn으로 치환되도록 이를 인코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터; 서열번호 2의 701번 아미노산이 Asp에서 Asn으로 치환되도록 이를 인코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터; 서열번호 3의 137번 아미노산이 Ala에서 Thr으로 치환되도록 이를 인코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터; 서열번호 4의 176번 아미노산이 Asn에서 Ser으로 치환되도록 이를 인코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터; 및 서열번호 5의 19번 아미노산이 Met이 Val으로 치환되도록 이를 인코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터; 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 재조합 벡터를 제작하되, 상기 유전자가 인플루엔자 A 바이러스에서 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하도록 제작하는 단계(a); 상기 제작된 재조합 벡터 중 하나 이상을 인플루엔자 A 바이러스에 도입하여 재조합 인플루엔자 A 바이러스를 생성하는 단계(b);를 포함하는, 증식성이 향상된 인플루엔자 A 바이러스의 제조방법을 제공한다.The present invention also provides a recombinant vector comprising a gene encoding the amino acid 153 of SEQ ID NO: 1 so that Asp is substituted with Asn; A recombinant vector comprising a gene encoding amino acid 701 of SEQ ID NO: 2 such that Asn is substituted with Asn; A recombinant vector comprising a gene encoding amino acid 137 of SEQ ID NO: 3 so as to substitute Thr with Ala; A recombinant vector comprising a gene encoding amino acid 176 of SEQ ID NO: 4 such that the amino acid at position 176 is substituted with Asn to Ser; And a gene encoding amino acid 19 in SEQ ID NO: 5 such that Met is substituted with Val; (A) preparing one or more recombinant vectors selected from the group consisting of influenza A viruses and viruses, wherein said gene comprises a promoter operably linked to influenza A virus; (B) introducing at least one of the prepared recombinant vectors into an influenza A virus to produce a recombinant influenza A virus. The present invention also provides a method for producing an influenza A virus having improved proliferation.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 인플루엔자 A 바이러스 제조방법은 상기 생성된 인플루엔자 A 바이러스를 MDCK 세포에 접종하여 증식시키는 단계(c)를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.In one embodiment of the present invention, the method for producing influenza A virus further comprises the step (c) of inoculating and propagating the resulting influenza A virus into MDCK cells.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 인플루엔자 A 바이러스는 A/PR/8/34를 백본(backbone)으로 하는 바이러스인 것을 특징으로 한다.In one embodiment of the present invention, the influenza A virus is a virus having A / PR / 8/34 as a backbone.

본 발명은 다중 돌연변이를 이용하여 증식성이 향상된 인플루엔자 A 바이러스를 제공함으로써, 조류, 포유류 및 인체 등 다양한 숙주에 감염되는 인플루엔자 감염 질환을 예방하기 위한 백신으로 유용하게 활용될 수 있을 것이다The present invention can be effectively utilized as a vaccine for preventing influenza infectious diseases infecting various hosts such as birds, mammals, and humans by providing an influenza A virus having improved proliferation using multiple mutations

도 1은 MDCK 세포에서 증식력이 향상된 인플루엔자 A 바이러스를 선별하기 위한 실험과정을 보여주는 모식도이다.
도 2는 도 1의 방법으로 선별된 MDCK 세포에서 증식력이 향상된 A/PR/8/34 바이러스 및 이의 내부유전자 (돌연변이가 포함된 유전자)를 가지는 H7N2 x PR8 및 H5N1 x PR8 인플루엔자 A 바이러스의 MDCK 세포에서 배양 시 증가된 바이러스 역가(A) 및 플라크 크기(B)를 보여주는 실험 결과이다.
도 3은 계대배양 과정에서 증식력이 향상된 바이러스의 유전자 돌연변이 양상을 보여주는 실험결과이다.
도 4는 다양한 점 돌연변이를 유도한 재조합 바이러스의 바이러스 역가를 보여주는 그래프이다.
도 5는 이중 돌연변이를 유도한 재조합 바이러스의 바이러스 역가를 보여주는 그래프이다.
도 6은 삼중 돌연변이를 유도한 재조합 바이러스의 바이러스 역가를 보여주는 그래프이다.
도 7은 사중 및 오중 돌연변이를 유도한 재조합 바이러스의 바이러스 역가를 보여주는 그래프이다.
도 8은 다양한 돌연변이형의 재조합 바이러스의 바이러스 역가를 보여주는 그래프이다.
도 9는 MDCK 세포에서 증식력이 향상된 재조합 바이러스 간의 성장곡선을 비교한 그래프이다.
도 10은 다양한 재조합 바이러스의 병원성( 마우스 50% lethal dose (LD50))을 비교한 표(A) 및 그래프(B)이다.Brief Description of the Drawings Fig. 1 is a schematic diagram showing an experimental procedure for screening influenza A viruses with enhanced proliferation in MDCK cells.
FIG. 2 is a graph showing the results of a comparison between MDCK cells of H7N2 x PR8 and H5N1 x PR8 influenza A viruses having an A / PR / 8/34 virus and an internal gene thereof (mutation-containing gene) with enhanced proliferation in MDCK cells selected by the method of FIG. (A) and plaque size (B) at the time of culture in the culture medium.
FIG. 3 is a graph showing the results of experiments showing gene mutation patterns of viruses having improved proliferative power during subculture.
Figure 4 is a graph showing the virus titers of recombinant viruses that induced various point mutations.
5 is a graph showing the virus titer of a recombinant virus inducing a double mutation.
Figure 6 is a graph showing the virus titers of recombinant viruses that induced triple mutations.
FIG. 7 is a graph showing the virus titers of recombinant viruses inducing quadruple and five-fold mutations.
8 is a graph showing the virus titer of various mutant recombinant viruses.
FIG. 9 is a graph comparing the growth curves of recombinant viruses with enhanced proliferation in MDCK cells. FIG.
Figure 10 is a table (A) and graph (B) comparing the pathogenicity (50% lethal dose (LD50)) of various recombinant viruses.

본 발명은 다중 돌연변이 되어 증식성이 향상된 인플루엔자 A 바이러스에 관한 것이다.The present invention relates to influenza A viruses that are multiply mutated to improve their proliferation properties.

본 발명자들은 MDCK 세포에서 증식성이 향상된 인플루엔자 바이러스를 얻고자, MDCK 세포에 A/PR/8/34 바이러스, H5N1 x PR8 바이러스, H7N3 x PR8 바이러스를 접종하고 40회 이상 계대배양 하여 바이러스 역가를 측정함으로써, 증식성이 향상된 바이러스의 특성을 분석하였다.In order to obtain influenza viruses with enhanced proliferation in MDCK cells, the present inventors measured MDCK cells by inoculating A / PR / 8/34 virus, H5N1 x PR8 virus, H7N3 x PR8 virus and subculturing MDCK cells 40 times or more Thereby analyzing the characteristics of the virus with improved proliferation.

그 결과, 몇몇 유전자에서 점 돌연변이가 관찰된바, 본 발명자들은 상기 점 돌연변이를 역으로 바이러스에 도입하고, 이들 점 돌연변이가 도입된 재조합 바이러스가 실제 증식력이 향상되는지에 대해 연구하였다.As a result, point mutations were observed in some genes, and the inventors of the present invention studied whether the point mutation was introduced into the virus in reverse, and the recombinant virus into which these point mutations were introduced improved the actual propagation ability.

그 결과, 기존 A/PR/8/34 바이러스의 경우 10⁶ PFU/ml의 바이러스 역가를 보이던 것이 MDCK 세포에서 48번 계대배양 후 10^8.3 PFU/ml의 바이러스 역가를 보일 정도로 증식성이 증가하였고, 계대배양에 의해 돌연변이된 유전자를 분석해 본 결과, A/PR/8/34 의 내부 유전자에 각각 PB2 D701N, PB1 D153N, M1 A137T, NS1 N176S, NS2 M19V의 돌연변이를 확인할 수 있었다. As a result, the proliferative activity of the existing A / PR / 8/34 virus showed 10 ⁶ PFU / ml virus titer, which was increased to such an extent that the virus titer was 10 ^8.3 PFU / ml after 48 passages in MDCK cells, Mutations of PB2 D701N, PB1 D153N, M1 A137T, NS1 N176S, and NS2 M19V were confirmed in the internal genes of A / PR / 8/34, respectively, as a result of analysis of mutated genes by subculture.

따라서, 본 발명자들은 상기 돌연변이가 실제로 A/PR/8/34를 백본(backbone)으로 하는 바이러스의 증식성 향상에 기여하는지 여부를 확인하고자, 상기 돌연변이를 유도한 재조합 벡터를 바이러스에 도입하여 재조합 바이러스를 제조하였다. Therefore, in order to confirm whether or not the mutation actually contributes to the enhancement of the proliferation of viruses with A / PR / 8/34 as a backbone, the present inventors have found that the recombinant vector inducing the mutation is introduced into the virus, .

그 결과, 상기 재조합 바이러스도 높은 증식력을 확인할 수 있었는데, PB2 D701N, PB1 D153N, M1 A137T, NS1 N176S, NS2 M19V가 각각 돌연변이된 재조합 바이러스는 모두 10⁷ PFU/ml 이상의 바이러스 역가를 나타내었다.As a result, the recombinant viruses also showed high proliferative activity. All recombinant viruses having mutations of PB2 D701N, PB1 D153N, M1 A137T, NS1 N176S and NS2 M19V showed viral titers of 10 ⁷ PFU / ml or more.

한편, 상기 돌연변이가 다중으로 도입된 다중 돌연변이 재조합 바이러스에서 증식력을 비교해 본 결과, PB1 및 M1 유전자의 돌연변이를 공통으로 가지고 있는 다중 돌연변이 바이러스에서 높은 증식력을 확인할 수 있어서, 본 발명인 증식력이 향상된 돌연변이 바이러스는 PB1의 D153N 돌연변이 및 M1의 A137T 돌연변이를 포함하여 구성되는 것이 특히 바람직하다고 판단된다.As a result of comparing the proliferation power of the multiple mutant recombinant virus into which the mutation was introduced in multiple, it is possible to confirm a high proliferative power in the multiple mutant viruses having the mutations of the PB1 and M1 genes in common, The D153N mutation of PB1 and the A137T mutation of M1 are particularly preferable.

또한, 본 발명은 생독 백신으로 활용하는 것이 바람직한데, 생독 백신으로 활용하기 위해서는 약독화가 요구되는바, 다양한 돌연변이 재조합 바이러스 중에서도 PB1의 D153N 돌연변이, M1의 A137T 돌연변이 및 PB2의 D701N 돌연변이를 포함하는 경우 마우스에서 LD₅₀가 가장 낮아 이를 이용한 생독 백신의 활용 가능성을 높이 평가할 수 있었다.In addition, it is preferable that the present invention is utilized as a vaccine for human immunity. In order to be used as a virulence vaccine, attenuation is required. Among the various mutant recombinant viruses, when D153N mutation of PB1, A137T mutation of M1 and D701N mutation of PB2 are included, , LD ₅₀ was the lowest, and it was possible to evaluate the possibility of using the virulent vaccine.

A/PR/8/34 바이러스 외에도 H5N1 x PR8 (HA와 NA는 H5N1유래이며, 나머지 내부 유전자는 A/PR/8/34 유래의 바이러스)의 경우에서도 MDCK 세포에서의 계대배양에 의한 증식성 향상을 관찰할 수 있었는데, 이 경우 증식성 향상은 상기 변이 및NS2의 M52T와 함께 유도됨을 확인할 수 있었다. 또한, 본 발명자들은 H7N3 x PR8 (HA와 NA는 H7N3유래이며, 나머지 내부 유전자는 A/PR/8/34 유래의 바이러스)바이러스의 경우에서는 PA T32A, NS1 R67Q의 돌연변이도 증식성 향상에 기여함을 확인하였다.In addition to the A / PR / 8/34 virus, the proliferation of H5N1 x PR8 (HA and NA derived from H5N1, and the remaining internal genes, viruses derived from A / PR / 8/34) , And in this case, it was confirmed that the improvement in proliferation was induced together with the mutation and M52T of NS2. In addition, the inventors of the present invention contributed to the mutation of PA T32A and NS1 R67Q in the case of H7N3 x PR8 (HA and NA are derived from H7N3 and the remaining internal genes are viruses derived from A / PR / 8/34) Respectively.

인플루엔자 A 바이러스는 총 10개의 단백질을 코딩하는 8개의 단일 가닥 (-)-센스 바이러스 RNAs(vRNAs)의 게놈을 갖는다. 인플루엔자 바이러스 생활주기는 숙주 세포의 표면 상의 시알산-함유 수용체에 대한 HA의 결합으로 시작하고, 수용체-매개된 엔토시토시스가 뒤따른다. 후기 엔도솜의 낮은 pH는 HA의 형태적 전이를 촉발함으로써, HA2 서브유닛의 N-말단(소위 융합 펩티드)을 노출시킨다. 융합 펩티드는 바이러스와 엔도솜 막의 융합을 개시시키고, 매트릭스 단백질(M1)과 RNP 복합체가 세포질로 방출된다. RNPs는 vRNA를 캡시드화하는 핵단백질(NP)과, PA, PB1 및 PB2 단백질에 의해 형성되는 바이러스 폴리머라제 복합체로 이루어진다. RNPs는 전사와 복제가 일어나는 핵으로 수송된다. RNA 폴리머라제 복합체는 세 상이한 반응을 촉매한다: 5' 캡 및 3' 폴리A 구조를 갖는 mRNA, 전장 상보적 RNA(cRNA) 및 주형으로서 cDNA를 이용하는 게놈 vRNA의 합성. 새로이 합성된 vRNAs, NP 및 폴리머라제 단백질은 그런 다음 RNPs로 조립되고, 핵으로부터 수출(export)되고, 자손 바이러스 입자의 출아가 일어나는 원형질막으로 수송된다. 뉴라미니다제(NA) 단백질은 감염 후기에 시알릴로올리고당으로부터 시알산을 제거함으로써 결정적인 역할을 하여, 새로 조립된 비리온을 세포 표면으로부터 방출하고 바이러스 입자의 자가 응집을 방지한다. 비록 바이러스 조립은 단백질-단백질 및 단백질-vRNA 상호작용을 포함하지만, 이들 상호작용의 성질은 대개 알려져 있지 않다.Influenza A virus has a genome of eight single-stranded (-) - sense virus RNAs (vRNAs) that encode a total of ten proteins. The influenza virus life cycle begins with the binding of HA to the sialic acid-containing receptors on the surface of host cells and is followed by receptor-mediated endocytosis. The low pH of late endosomes exposes the N-terminal (so-called fusion peptide) of the HA2 subunit by triggering the morphological transition of HA. The fusion peptide initiates fusion of the virus with the endosomal membrane, and the matrix protein (M1) and the RNP complex are released into the cytoplasm. RNPs consist of a nuclear protein (NP) that encapsulates vRNA and a viral polymerase complex formed by PA, PB1 and PB2 proteins. RNPs are transported to the nucleus where transcription and replication occur. RNA polymerase complexes catalyze three different reactions: synthesis of mRNA with 5 'cap and 3' poly A structure, full length complementary RNA (cRNA) and genomic vRNA using cDNA as template. The newly synthesized vRNAs, NP and polymerase proteins are then assembled into RNPs, exported from the nucleus, and transported to the plasma membrane where the offspring of the progeny virus particles occurs. The neuraminidase (NA) protein plays a crucial role by removing sialic acid from sialylated oligosaccharide at the later stages of infection, releasing newly assembled virions from the cell surface and preventing self-aggregation of viral particles. Although viral assembly involves protein-protein and protein-vRNA interactions, the nature of these interactions is largely unknown.

본 발명에 따르면, 증식성 향상에 기여하는 돌연변이된 인플루엔자 A 바이러스의 효율적인 복제를 지지하는 어떠한 세포도 본 발명에서 사용될 수 있다. 본 방법에 의해 수득되는 바이러스는 재조합체(reassortant) 바이러스로 제조될 수 있다.According to the present invention, any cell that supports efficient replication of a mutated influenza A virus that contributes to improved proliferation can be used in the present invention. The virus obtained by the present method can be produced as a reassortant virus.

바람직하게는, 세포는 WHO 인증된, 또는 인증 가능한, 연속 세포주이다. 그러한 세포주를 인증하기 위한 요건은 가계, 성장 특성, 면역학적 마커, 바이러스 감수성, 발암성 및 저장 조건 중 적어도 하나에 관하여, 또한 동물, 알 및 세포 배양에서의 시험에 의한 특성분석을 포함한다. 그러한 특성분석은 세포가 검출가능한 외래 물질이 결여된 것을 확인하는데 사용된다. 일부 국가에서, 핵학이 또한 요구될 수 있다. 또한, 발암성은 바람직하게는 백신 생산을 위해 사용되는 것들과 동일한 계대 수준에 있는 세포에서 시험된다. 바이러스는 바람직하게는 백신 생산을 위해 불활성화되거나 약독화되기 전에, 일관된 결과를 제공하는 것으로 나타난 방법에 의해 정제된다. 본 발명에 있어 특히 바람직한 세포주는 MDCK 세포주이다.Preferably, the cell is a WHO-approved, or verifiable, continuous cell line. Requirements for authenticating such cell lines include characterization by at least one of household, growth characteristics, immunological markers, virus susceptibility, carcinogenicity and storage conditions, as well as testing in animals, eggs and cell culture. Such characterization is used to confirm that the cell lacks detectable foreign material. In some countries, nuclear science may also be required. In addition, carcinogenicity is preferably tested in cells at the same passage level as those used for vaccine production. The virus is preferably purified by a method that appears to provide consistent results before being inactivated or attenuated for vaccine production. A particularly preferred cell line in the present invention is the MDCK cell line.

최종 산물의 순도에 대한 적절한 시험이 포함될 수 있도록, 사용되는 세포주의 완전한 특성분석을 확립하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 이용되는 세포의 특성분석을 위해 사용될 수 있는 데이터는 (a) 그의 기원, 유래 및 계대 내력에 관한 정보; (b) 그의 성장 및 형태학적 특성에 관한 정보; (c) 외래 물질의 시험 결과; (d) 세포가 다른 세포주 중에서 명확하게 인식되도록 하는 생화학적, 면역학적 및 세포유전학적 양상과 같은, 구별되는 특징; 및 (e) 발암성에 대한 시험결과를 포함한다. 바람직하게는, 사용되는 숙주세포의 계대 수준, 또는 집단 이배체화는 가능한 한 낮다.It is desirable to establish a complete characterization of the cell line used so that appropriate testing of the purity of the final product can be included. Data that can be used for the characterization of the cells used in the present invention include: (a) information about its origin, origin, and transmembrane potency; (b) information on its growth and morphological characteristics; (c) test results of foreign substances; (d) distinguishing features, such as biochemical, immunological and cytogenetic aspects, which allow cells to be clearly recognized in different cell lines; And (e) test results for carcinogenicity. Preferably, the passage level of the host cell used, or group diploidization, is as low as possible.

세포에서 생산되는 바이러스는 백신이나 유전자 요법 제제 이전에 고도로 정제되는 것이 바람직하다. 일반적으로, 정제 과정은 세포 DNA, 기타 세포 성분 및 외래 물질의 광범위한 제거를 일으킬 것이다. DNA를 광범위하게 분해하거나 변성시키는 과정도 사용될 수 있다.It is desirable that viruses produced in cells are highly purified prior to vaccines or gene therapy agents. In general, the purification process will result in extensive removal of cellular DNA, other cellular components and foreign substances. The process of extensive degradation or denaturation of DNA can also be used.

본 발명에서 상기 돌연변이 된 인플루엔자 A 바이러스 또는 이의 내부유전자를 유효성분으로 하는 인플루엔자 A 바이러스 백신 조성물로 활용 가능하다.The present invention can be utilized as an influenza A virus vaccine composition containing the mutated influenza A virus or an internal gene thereof as an active ingredient.

본 발명의 백신 조성물이 면역 반응을 일으킬 수 있는 숙주 동물은 인간을 비롯하여 각종 조류 및 개, 돼지,말, 고양이 등을 포함할 수 있다. The host animal in which the vaccine composition of the present invention can cause an immune response may include humans, various birds, and dogs, pigs, horses, cats and the like.

본 발명의 백신은 약독화된 생독 백신 또는 사독 백신, 서브유닛 백신(subunit vaccine), 합성 백신(synthetic vaccine) 또는 유전공학 백신(genetic engineering vaccine)일 수 있다.The vaccine of the present invention may be an attenuated live vaccine or a sadox vaccine, a subunit vaccine, a synthetic vaccine or a genetic engineering vaccine.

본 발명에서 사용된 용어 "생독 백신"이란 살아있는 균의 활성성분을 포함하는 백신을 의미한다. 또한 용어 "약독화된(attenuation)"이란 살아있는 병원체의 병원성을 인공적으로 약하게 한 것으로, 병원체의 필수 대사에 관여하는 유전자를 변이시켜 체내에서 증식을 억제하여 질병을 일으키지 못하고 면역 체계만을 자극해서 면역성을 유도하는 것을 의미한다. 균의 약독화는 자외선(UV) 조사, 약품처리 또는 시험관 내 고차 연속 계대배양, 저온에서의 연속 계대배양에 의해 달성될 수 있다. 약독화는 또한 명확한 유전 변화를 만듦으로써, 예를 들어 병원성을 제공하는 것으로 알려진 유전자 서열의 특정 결실, 변이, 또는 균주의 게놈 내로의 서열의 삽입에 의해 달성될 수 있다.The term " live vaccine " as used herein means a vaccine comprising the active ingredient of a live bacterium. The term "attenuation" is artificially weakened pathogenicity of a living pathogen, mutating a gene involved in essential metabolism of a pathogen, inhibiting proliferation in the body, causing no disease, stimulating only the immune system, . The attenuation of the bacteria can be accomplished by ultraviolet (UV) irradiation, chemical treatment or in vitro high-throughput subculture, and continuous subculture at low temperature. Inactivation can also be accomplished by creating a clear genetic change, for example by insertion of a particular deletion, mutation, or sequence into the genome of the gene sequence known to provide virulence.

용어 "사독 백신"이란 불활화 백신 또는 사균 백신이라고도 하며, 죽은 균을 포함한 백신이다..The term " Sadox vaccine "is also referred to as inactivated vaccine or killed vaccine, and is a vaccine containing dead bacteria.

용어 "서브유닛 백신"은 균의 구성성분 중 면역기능을 일으킬 수 있는 항원 성분만을 추출하여 제조한 백신으로, 균의 방어에 필요한 항원 부위에 대해서만 면역형성을 유도함으로써 부작용을 최소화할 수 있다. The term "subunit vaccine" is a vaccine prepared by extracting only an antigen component capable of causing an immune function among the constituents of a germ. The vaccine can minimize side effects by inducing immune formation only at an antigenic site necessary for the defense of germ.

"유전공학 백신"은 균의 병원성을 일으키는 특이 유전자를 변형하거나 제거한 것일 수 있다.A "genetic engineering vaccine" may be a modification or removal of a specific gene that causes the pathogenicity of the bacteria.

또한, 본 발명의 백신은 숙주동물에 발생하는 살모넬라 균 이외의 균에 의해 발생하는 질병을 예방하기 위하여 사용되는 다른 백신의 제조에 사용되는 불활화된 균체들 또는 항원들과 혼합하여 식중독을 포함한 다른 질병들을 함께 예방할 수 있는 혼합 또는 복합 백신으로 사용될 수 있다. 용어 "혼합 백신"이란 서로 다른 바이러스 백신을 함께 사용한 백신을 말한다.In addition, the vaccine of the present invention may be mixed with inactivated cells or antigens used for the preparation of other vaccines used for preventing diseases caused by bacteria other than Salmonella occurring in host animals, Can be used as a mixed or complex vaccine that can prevent diseases together. The term "combined vaccine " refers to a vaccine in which different antiviral drugs are used together.

본 발명의 백신 조성물은 나출된(naked) 핵산 조성물들도 포함할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서, 핵산은 본 발명의 돌연변이형 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 핵산 백신접종 방법들은 업계에 공지되어 있는 방법을 통해 실시할 수 있다. 예를 들어, 미국등록특허 제6,063,385호 및 제6,472,375호에 설명되어 있다. 상기 핵산은 플라스미드 또는 유전자 발현 카세트(expression cassette)의 형태일 수 있다. 일실시예에서, 상기 핵산은 동물에 투여되는 리포좀에 둘러싸여진 채로 제공된다.The vaccine composition of the present invention may also comprise naked nucleic acid compositions. In one embodiment of the invention, the nucleic acid may comprise a nucleotide sequence encoding the mutant protein of the invention. Methods of nucleic acid vaccination can be carried out by methods known in the art. For example, in U.S. Patent Nos. 6,063,385 and 6,472,375. The nucleic acid may be in the form of a plasmid or gene expression cassette. In one embodiment, the nucleic acid is provided surrounded by liposomes administered to the animal.

또한, 본 발명의 백신 조성물을 추가적으로 용매, 면역증강제(adjuvant) 및 부형제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 더 포함할 수 있다. 상기 용매로는 생리식염수 또는 증류수가 있으며, 면역증강제로는 프레운즈(Freund's) 불완전체 또는 완전체 어쥬번트, 알루미늄 하이드록사이드 겔과 식물성 및 광물성 오일 등이 있으며, 부형제로는 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 하이드록사이드 또는 알루미늄 포타슘 설페이트가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자가 기술자에게 잘 알려진 백신 제조에 사용되는 물질을 더 포함할 수 있다.In addition, the vaccine composition of the present invention may further comprise at least one member selected from the group consisting of a solvent, an adjuvant, and an excipient. Examples of the solvent include physiological saline or distilled water. Examples of the immunity enhancer include Freund's incomplete or complete adjuvant, aluminum hydroxide gel, vegetable and mineral oil, etc. Examples of excipients include aluminum phosphate, aluminum hydroxide Side or aluminum potassium sulfate, but are not limited thereto and may further comprise materials used in the manufacture of vaccines well known to those skilled in the art.

본 발명의 백신 조성물을 경구형 또는 비경구형 제제로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 비경구형 제제인 주사액제로 제조하며, 진피내, 근육내, 복막내, 정맥내, 비강 또는 경막외(eidural) 경로로 투여할 수 있다.The vaccine composition of the present invention may be prepared in oral or parenteral formulations, preferably in the form of parenteral injectable solutions and may be formulated in intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, intranasal, or eidural routes ≪ / RTI >

본 발명에서 용어 "예방"이란 조성물의 투여에 의해 인플루엔자 A 바이러스 감염을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 본 발명에서 용어 "치료"란 조성물의 투여에 의해 인플루엔자 A 바이러스 감염에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.The term "prophylactic" as used herein means any action that inhibits or delays the onset of influenza A virus infection by administration of the composition. The term "treatment" in the present invention means any action that improves or alleviates symptoms due to influenza A virus infection by the administration of the composition.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 용어 "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체의 종류 및 중증도, 연령, 성별, 감염된 바이러스 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로, 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.The composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount. The term "pharmaceutically effective amount" means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment and the effective dose level will depend on the species and severity of the subject, age, sex, The activity of the compound, the sensitivity to the drug, the time of administration, the route of administration, the rate of release, the duration of the treatment, factors including co-administered drugs, and other factors well known in the medical arts. The composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. And can be administered singly or multiply. It is important to take into account all of the above factors and to administer the amount in which the maximum effect can be obtained in a minimal amount without adverse effect, and can be easily determined by those skilled in the art.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예들은 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Advantages and features of the present invention and methods of achieving them will become apparent with reference to the embodiments described in detail below. Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples. However, these examples are for illustrating the present invention specifically, and the scope of the present invention is not limited to these examples.

<< 실시예Example 1> 1>

A/PR/8/34 백신의 MDCK 세포에서의 계대 배양Transfection of A / PR / 8/34 vaccine in MDCK cells

본 발명자들은 MDCK 세포에서 성장성이 향상된 백신 바이러스 원형주(backbone virus)를 개발하기 위하여 A/PR/8/34 바이러스를 MDCK 세포에서 계대배양하였다. T75cm² 플라스크에 MDCK 세포를 1ml (1x10⁶cells/ml) 분주하여 overnight 배양한 후, A/PR/8/34 바이러스를 10^4.0 TCID₅₀/ml 접종하고, 10번의 계대 배양 후 플라크를 순화(plaque purification)하고, 상기와 같은 방법을 4회 이상 반복하였다(도 1 참조).The present inventors subcultured A / PR / 8/34 virus in MDCK cells to develop a vaccine virus backbone virus with improved growth in MDCK cells. MDCK cells were added to T75 cm &lt; ² &gt; After overnight incubation with 1 ml (1 x 10 ⁶ cells / ml), 10 ⁴ TCID ₅₀ / ml of A / PR / 8/34 virus was inoculated, plaque was purified after 10 passages, The method was repeated 4 times or more (see Fig. 1).

그 결과, 기존 A/PR/8/34 바이러스의 경우 10⁶PFU/ml의 바이러스 역가를 보인 반면, MDCK 세포에서 48번의 계대배양을 거친 후 10^8.3PFU/ml의 바이러스 역가를 보여, MDCK 세포에서의 계대배양에 의해 바이러스 역가 및 플라크 크기 증가를 확인할 수 있었다(도 2 참조).
As a result, the virus titer of 10 ⁶ PFU / ml was observed in the case of the existing A / PR / 8/34 virus, while the virus titer was 10 ^8.3 PFU / ml after 48 passages in MDCK cells. (See FIG. 2). The results are shown in FIG.

<< 실시예Example 2> 2>

MDCK 세포에서 증식성 향상 바이러스의 유전자 분석Genetic analysis of virus that enhances proliferation in MDCK cells

본 발명자들은 MDCK 세포에서 증식성이 향상된 바이러스의 게놈 DNA를 추출하여 염기분석을 통하여 기존 A/PR/8/34 바이러스의 유전자와의 차이를 분석해 보았다. The present inventors extracted the genomic DNA of the virus having improved proliferation in MDCK cells and analyzed the difference with the gene of the existing A / PR / 8/34 virus through base analysis.

그 결과, 증식성이 향상된 바이러스에서 PB1, PB2, M1, NS1, PA의 유전자에서 점 돌연변이가 유발되었음을 확인할 수 있었다(도 3 참조).
As a result, it was confirmed that point mutations were induced in the genes of PB1, PB2, M1, NS1, and PA in the virus with improved proliferation (see FIG. 3).

<< 실시예Example 3> 3>

점 point 돌연변이법에In the mutation method 의한 다중 돌연변이 균주 제조 Multiple mutant strains by

본 발명자들은 증식성이 향상된 바이러스에서 PB1, PB2, M1, NS1, PA 유전자의 점 돌연변이를 확인할 수 있었는바, 기존 A/PR/8/34 백신 바이러스 원형주에 상기와 같은 돌연변이를 유발한 경우에도 실제적으로 증식력 향상을 유발할 수 있는지 실험해 보고자 하였다.The present inventors were able to confirm the point mutation of the PB1, PB2, M1, NS1, and PA genes in the virus having improved proliferation, and even when the above-mentioned mutation was induced in the original A / PR / 8/34 vaccine virus circular strain And to test whether it can actually induce the proliferation.

본 발명자들은 PB1 단백질의 153번 아미노산을 Asp에서 Asn으로 치환하거나, PB2 단백질의 701번 아미노산을 Asp에서 Asn으로 치환하거나, M1 단백질의 137번 아미노산을 Ala에서 Thr으로 치환하거나, NS1 단백질의 176번 아미노산을 Asn에서 Ser으로 치환하는 점 돌연변이된 바이러스를 제작하였다. 점 돌연변이를 제작하기 위한 프라이머는 하기와 같다. 점 돌연변이를 제작하기 위한 PCR 조건은 95도에서 5분 (initial denaturation), 95도에서 30초 (heat denaturation, step 1), 55도에서 50초 (primer annealing, step 2), 72도에서 3분 30초(synthesis of complementary chain, step 3)로 step1-3 사이클을 30번 진행하였고, 점돌연변이된 유전자(PB2, PB1, M1, NS1)를 나머지 유전자(PA, HA, NA, NP)와 각각의 다른 조합으로 넣어서 293T 세포와 MDCK 세포를 배양한 12well plate에 동일한 농도로 transfection을 시행한다. 48시간 후에 세포를 배양한 상층액을 200ul 씩 걷어내어 원하는 조합의 바이러스가 만들어졌는지 RT-PCR로 확인한다.The present inventors have found that substitution of Asp for Asp for PB1 protein, substitution of Asp for Asp for amino acid 701 of PB2 protein, substitution of Thr for amino acid 137 for A1, Point mutated viruses in which the amino acid was substituted with Asn to Ser was prepared. The primers for producing the point mutations are as follows. PCR was performed at 95 ° C for 5 minutes (initial denaturation), 95 ° C for 30 seconds (heat denaturation, step 1), 55 ° to 50 seconds (primer annealing, step 2) (PB2, PB1, M1, and NS1) with the remaining genes (PA, HA, NA, and NP) and each of the genes Transfection is performed at the same concentration in a 12-well plate in which 293T cells and MDCK cells are cultured in another combination. After 48 hours, the cells were incubated with 200 μl of the supernatant to confirm the desired combination of viruses was confirmed by RT-PCR.

한편, 상기와 같이 제작된 점 돌연변이는 최종적으로 염기 서열 분석을 통해 확인하였다. On the other hand, the point mutation produced as described above was finally confirmed through base sequence analysis.

프라이머 서열(5'→3')The primer sequence (5 '- &gt; 3') PR8 M A137T FPR8 M A137T F CTCATATACAACAGGATGGGGACTGTGACCACCTCATATACAACAGGATGGGG A CTGTGACCAC PR8 M A137T RPR8 M A137T R CCCCATCCTGTTGTATATGAGGCCCATACAACCCCATCCTGTTGTATATGAGGCCCATACAA PR8 PB1 D153N FPR8 PB1 D153N F ACAATAGAAGTGTTCAGATCAAATGGCCTCACACAATAGAAGTGTTCAGATCA A ATGGCCTCAC PR8 PB1 D153N RPR8 PB1 D153N R TGATCTGAACACTTCTATTGTGTTGGCCAATTGATCTGAACACTTCTATTGTGTTGGCCAAT PR8 PB2 D701N FPR8 PB2 D701N F TCCTCATTCTGGGCAAAGAAAACAAGAGATATCCTCATTCTGGGCAAAGAA A ACAAGAGATA PR8 PB2 D701N RPR8 PB2 D701N R TTCTTTGCCCAGAATGAGGAATCCCCTCAGTTCTTTGCCCAGAATGAGGAATCCCCTCAG PR8 NS N176S FPR8 NS N176S F TACTGCTGAGGATGTCAAAAGTGCAGTTGGATACTGCTGAGGATGTCAAAA G TGCAGTTGGA PR8 NS N176S RPR8 NS N176S R TTTTGACATCCTCAGCAGTATGTCCTGGAATTTTGACATCCTCAGCAGTATGTCCTGGAA

<< 실시예Example 4> 4>

PlaquePlaque assayassay 를 통한 Through 야생균주와Wild strains and 돌연변이형Mutant type 균주의 바이러스  Virus of strain 역가Potency 측정 Measure

본 발명자들은 상기 점 돌연변이된 재조합 바이러스의 역가를 측정하기 위하여 Plaque assay를 실시하였다.The present inventors conducted a plaque assay to measure the activity of the above-mentioned point mutated recombinant virus.

우선, 야생형 A/PR/8/34 바이러스와 상기 4가지 점 돌연변이 된 재조합 바이러스를 각각 PBS 900㎕에 바이러스 100㎕을 혼합하고, 각각 1/10로 차례로 희석하였다. MDCK를 일정량씩 분주해 overnight 배양한 6 well plate를 꺼내어 배지를 제거하고 PBS로 2번 워싱한 후, 순차 희석한 상기 바이러스를 200㎕씩 접종하였다. 6well plate를 37℃, 5%CO₂ incubator에 1시간 동안 배양하되, 30분 간격으로 plate를 흔들어 주었다. 이 후, 각 well을 PBS로 워싱하고, Agarose가 포함된 overlay media를 녹여 45℃ 내지 55℃ 온도가 되도록 한 후, 3㎖씩 glass pipet을 사용하여 벽면을 따라 흘러내리게 하며 부은 후, 실온에서 굳도록 하였다. 감염된 plate를 72시간동안 37℃, 5%CO₂ incubator에서 배양한 후 methylene blue로 염색하고, plaque 수를 계산하였다.First, the wild type A / PR / 8/34 virus and the above-mentioned four point mutated recombinant viruses were mixed with 100 μl of virus in 900 μl of PBS, respectively, and diluted to 1/10 each in turn. MDCK was dispensed into a 6-well plate overnight, and the medium was removed. After washing twice with PBS, 200 μl of the virus was sequentially inoculated. The 6-well plate was incubated in a 5% CO ₂ incubator at 37 ° C for 1 hour, and the plates were shaken at 30-minute intervals. Then, each well was washed with PBS, and the overlay media containing the agarose was melted to a temperature of 45 ° C to 55 ° C. Then, 3 ml of the solution was flowed down along the wall using a glass pipette. After pouring, Respectively. Infected plates were incubated for 72 h at 37 ° C in a 5% CO ₂ incubator, stained with methylene blue, and counted.

그 결과, PB1 D153N의 역가는 10^7.49 PFU/ml, PB2 D701N의 역가는 10^7.57 PFU/ml, M1의 A137T 역가는 10^7.34 PFU/ml, NS1 N176S의 역가는 10^7.64 PFU/ml로 모두 기존의 A/PR/8/34 바이러스에 비하여 10배 이상의 증식력 향상을 확인할 수 있었다(도 4).
As a result, the potency of PB1 D153N was 10 ^7.49 PFU / ml, the potency of PB2 D701N was 10 ^7.57 PFU / ml, the A137T potency of M1 was ^7.34 PFU / ml and the potency of NS1 N176S was ^7.64 PFU / ml. It was confirmed that the proliferation power of the A / PR / 8/34 virus was increased 10 times or more (FIG. 4).

<< 실시예Example 5> 5>

다중 돌연변이 종의 증식력 비교Comparison of proliferation of multiple mutant species

본 발명자들은 상기와 같은 점 돌연변이가 단일하게 존재할 때보다 이들 점 돌연변이의 조합에 의해 더 큰 증식력 향상을 기대할 수 있다는 예상 하에서 다중 돌연변이를 만들어 보기로 하였다. The present inventors have attempted to make multiple mutations under the expectation that a larger proliferation enhancement can be expected by a combination of these point mutations than when such point mutations are present singly.

이를 위해 상기 점 돌연변이 된 바이러스에 각각의 점 돌연변이된 유전자 (PB2, PB1, M1, NS1) 플라스미드 조합하여 넣고 나머지 유전자(PA, HA, NA, NP) 플라스미드와 함께 Vero 세포와 MDCK 세포를 배양한 12well plate에 동일한 농도로 transfection을 한다. 37℃, 5%CO₂ incubator에서 48시간 후에 세포를 배양한 상층액을 200ul 씩 걷어내어 원하는 조합의 바이러스가 만들어졌는지 RT-PCR로 확인한다. 이러한 방법으로 2중, 3중, 혹은 4중의 점돌연변이 유전자가 치환된 재조합 바이러스를 제작하고, 상기 기재된 plaque assay를 통하여 바이러스 역가를 비교해 보았다. To this end, a plasmid of each mutated point mutation (PB2, PB1, M1, NS1) was inserted into the point mutated virus, 12 wells of Vero cells and MDCK cells with the remaining plasmids (PA, HA, NA, NP) Transfection is performed at the same concentration in the plate. After 48 hours in a 5% CO ₂ incubator at 37 ° C, the cells were incubated with 200 μl of the supernatant to confirm the desired combination of viruses by RT-PCR. A recombinant virus in which a double, triple, or quadruple point mutation gene was substituted by this method was prepared, and the virus titers were compared through the plaque assay described above.

그 결과, 2개의 조합으로 돌연변이 된 2중 돌연변이 재조합 바이러스에서는 10⁸PFU/ml 이상의 높은 바이러스 역가를 나타냈으며, 특히 PB1 단백질과 M1 단백질에서 돌연변이 된 바이러스에서 특히 높은 증식성을 나타내었다(도 5). As a result, the mutant recombinant viruses mutated in two combinations showed a high virus titer of 10 ⁸ PFU / ml or more, especially in viruses mutated from PB1 protein and M1 protein (FIG. 5) .

한편, 3개의 조합으로 돌연변이 된 삼중 돌연변이 재조합 바이러스에서도 10⁸PFU/ml 이상의 높은 바이러스 역가를 나타냈으며, 이 경우에도 PB1 단백질과 M1 단백질에서의 돌연변이를 포함하는 삼중 돌연변이 바이러스에서 특히 높은 증식성을 나타내었다. 즉, PB2 PB1 M1 삼중 돌연변이의 경우, 바이러스 역가가 10^8.53PFU/ml을 나타내었고, PB1 M1 NS1의 경우 (10^8.58)의 바이러스 역가를 나타내었다(도 6). On the other hand, triple mutant recombinant viruses mutated by three combinations showed high virus titers of more than 10 ⁸ PFU / ml, which also exhibited particularly high proliferation in triple mutant viruses including mutations in PB1 protein and M1 protein . Namely, in the case of the PB2 PB1 M1 triple mutant, the virus titer was 10 ^8.53 PFU / ml and the virus titer of PB1 M1 NS1 (10 ^8.58 ) (FIG. 6).

또한, 4개의 조합 및 5개의 조합 돌연변이 재조합 바이러스에서도 기존 A/PR/8/34 바이러스에 비하여 10 내지 100배의 바이러스 역가가 증가된 결과를 나타내었다(도 7).
In addition, the virus titer was increased 10 to 100 times compared to the conventional A / PR / 8/34 virus even in four combinations and five combination mutant recombinant viruses (Fig. 7).

<< 실시예Example 6>  6>

PB1PB1 M1M1 돌연변이를 포함하는 다중 돌연변이 바이러스의 성장곡선 비교 Comparison of Growth Curves of Multiple Mutant Viruses Containing Mutants

본 발명자들은 상대적으로 높은 바이러스 역가를 보이는 PB1 M1 이중 돌연변이 재조합 바이러스, PB2 PB1 M1 삼중 돌연변이 재조합 바이러스, PB1 M1 NS1 삼중 돌연변이 재조합 바이러스의 성장곡선을 기존 A/PR/8/34 백신 바이러스 원형주와 비교해 보고자 하였다.We compared the growth curves of PB1 M1 double mutant recombinant virus, PB2 PB1 M1 triple mutant recombinant virus and PB1 M1 NS1 triple mutant recombinant virus, which have relatively high virus titers, to the existing A / PR / 8/34 vaccine virus circular strain I would like to see.

이를 위해 본 발명자들은 HA assay를 실시하였는데, 이는 A/PR/8/34 바이러스의 표면 단백질이 인간 또는 동물 적혈구의 N-acetylneuraminic acid와 결합하여 응집되는 반응을 통해 바이러스 양을 측정하는 것이다. 본 발명자들은 MDCK 세포를 24 well에 overnight 배양한 후, 0.02MOI의 바이러스로 감염시킨 후, 12시간마다 총 84시간까지 측정하였다. To this end, the present inventors performed HA assay, which measures the amount of virus through the surface protein of A / PR / 8/34 virus, which binds to N-acetylneuraminic acid in human or animal erythrocytes and aggregates. We incubated MDCK cells overnight in 24 wells, then infected with 0.02 MOI of virus, and then measured for a total of 84 hours every 12 hours.

그 결과, 24시간에서 기존 A/PR/8/34보다 이중 또는 삼중 돌연변이 재조합 바이러스에서 약 2배 이상 높은 HA 값을 나타내었고, 36시간 이후에는 약 4배 이상 높은 HA 값을 나타내었다. 그 중에서도 PB1 M1 NS1 삼중 돌연변이 재조합 바이러스는 다른 재조합 바이러스보다도 1 내지 1.5배 높은 HA 값을 나타내었다(도 9A). As a result, the HA value was about 2 times higher than that of the double or triple mutant recombinant viruses at 24 hours, and about 4 times higher than that of the existing A / PR / 8/34 at 36 hours. Among them, the PB1 M1 NS1 triple mutant recombinant virus showed HA values 1 to 1.5 times higher than other recombinant viruses (Fig. 9A).

한편, 상기와 같은 결과는 PFU 값을 측정한 경우에도 동일하게 관찰되었는데, 감염 후 6시간부터 기존 A/PR/8/34 바이러스 보다 재조합 바이러스에서 5배 내지 10배 높은 바이러스 역가를 나타내었고, 24시간부터는 약 100배 이상 높은 바이러스 역가를 나타내었다. 특히, PB1 M1 NS1 삼중 돌연변이 재조합 바이러스는 다른 재조합 바이러스보다 12시간에서 48시간 사이 가장 높은 바이러스 역가를 나타내었다(도 9B).The same result was also obtained when the PFU value was measured. From 6 hours after the infection, the virus titer was 5 to 10 times higher than that of the conventional A / PR / 8/34 virus and 24 From the time point, virus titers were about 100 times higher. In particular, the PB1 M1 NS1 triple mutant recombinant virus exhibited the highest viral titers from 12 to 48 hours than the other recombinant virus (FIG. 9B).

또한, 본 발명자들은 부유 MDCK 세포에서도 야생형 A/PR/8/34 바이러스와 다양한 돌연변이 재조합 바이러스의 바이러스 역가를 측정해 본 결과, 야생형 A/PR/8/34 바이러스에 비해 돌연변이 재조합 바이러스에서 높은 바이러스 역가가 나타남을 확인할 수 있었다.
The present inventors also measured the viral titers of the wild-type A / PR / 8/34 virus and various mutant recombinant viruses in floating MDCK cells and found that the mutant recombinant virus had a higher viral titer than the wild-type A / PR / 8/34 virus .

<< 실시예Example 7> 7>

PB1PB1 M1M1 돌연변이를 포함하는 다중 돌연변이 병원성 비교 Comparison of multiple mutagenic pathways including mutations

본 발명자들은 증식성이 향상된 재조합 바이러스에서 병원성도 함께 증가하는지 관찰해 보고자 하였다.The present inventors tried to observe whether the pathogenicity also increases in a recombinant virus having improved proliferation.

이를 위해 본 발명자들은 6 주된 암컷 Balb/c 마우스를 샘타코에서 구입하여, 22°C 조건에서 1주일간 사육한 후, 한 그룹당 5마리의 마우스로 그룹지어, 마우스를 avertin으로 300ul 복강 주사하여 마취시킨 후, 야생형 A/PR/8/34 바이러스 및 PB1 M1 이중 돌연변이 재조합 바이러스, PB1 NS1 이중 돌연변이 재조합 바이러스, PB2 PB1 M1 삼중 돌연변이 재조합 바이러스, PB1 M1 NS1 삼중 재조합 바이러스를 30ul씩 비강으로 투여하였다. 그리고, 50% 치사량을 보이는 바이러스 역가(LD₅₀)를 측정하여 보았는데, PB1 M1 이중 돌연변이 재조합 바이러스는 1.0×10³의 LD₅₀를 나타내어 야생형 A/PR/8/34보다도 오히려 치사량이 증가하는 것으로 확인되었으나, PB2 PB1 M1 삼중 돌연변이 재조합 바이러스는 1.0×10^4.5의 LD₅₀를 나타내어 야생형 A/PR/8/34에 비해 병원성이 상당히 감소함을 확인할 수 있었다(도 10).
To this end, the present inventors purchased a 6-week-old female Balb / c mouse from Samutoco and incubated for 1 week at 22 ° C, grouped into 5 mice per group, and anesthetized by intraperitoneal injection of 300ul avertin Afterwards, 30 ul of wild type A / PR / 8/34 virus and PB1 M1 double mutant recombinant virus, PB1 NS1 double mutant recombinant virus, PB2 PB1 M1 triple mutant recombinant virus and PB1 M1 NS1 triple recombinant virus were administered nasally. In addition, we measured the virus activity (LD ₅₀ ) of 50% lethal dose. The PB1 M1 double mutant recombinant virus showed an LD ₅₀ of 1.0 × 10 ³ , indicating that the lethal dose was increased rather than wild type A / PR / 8/34 However, the PB2 PB1 M1 triple mutant recombinant virus showed an LD ₅₀ of 1.0 × 10 ^4.5 , indicating that the pathogenicity was significantly reduced compared to the wild type A / PR / 8/34 (FIG. 10).

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
The present invention has been described with reference to the preferred embodiments. It will be understood by those skilled in the art that various changes in form and details may be made therein without departing from the spirit and scope of the invention as defined by the appended claims. Therefore, the disclosed embodiments should be considered in an illustrative rather than a restrictive sense. The scope of the present invention is defined by the appended claims rather than by the foregoing description, and all differences within the scope of equivalents thereof should be construed as being included in the present invention.

<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> A multiple mutated influenza A virus for MDCK cell specific proliferation improvement <130> PN1209-469 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 757 <212> PRT <213> PB1 amino acid seqeunce from A/PR/8/34 <400> 1 Met Asp Val Asn Pro Thr Leu Leu Phe Leu Lys Val Pro Ala Gln Asn 1 5 10 15 Ala Ile Ser Thr Thr Phe Pro Tyr Thr Gly Asp Pro Pro Tyr Ser His 20 25 30 Gly Thr Gly Thr Gly Tyr Thr Met Asp Thr Val Asn Arg Thr His Gln 35 40 45 Tyr Ser Glu Lys Gly Arg Trp Thr Thr Asn Thr Glu Thr Gly Ala Pro 50 55 60 Gln Leu Asn Pro Ile Asp Gly Pro Leu Pro Glu Asp Asn Glu Pro Ser 65 70 75 80 Gly Tyr Ala Gln Thr Asp Cys Val Leu Glu Ala Met Ala Phe Leu Glu 85 90 95 Glu Ser His Pro Gly Ile Phe Glu Asn Ser Cys Ile Glu Thr Met Glu 100 105 110 Val Val Gln Gln Thr Arg Val Asp Lys Leu Thr Gln Gly Arg Gln Thr 115 120 125 Tyr Asp Trp Thr Leu Asn Arg Asn Gln Pro Ala Ala Thr Ala Leu Ala 130 135 140 Asn Thr Ile Glu Val Phe Arg Ser Asp 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Met Lys Leu Arg Thr Gln Ile 355 360 365 Pro Ala Glu Met Leu Ala Ser Ile Asp Leu Lys Tyr Phe Asn Asp Ser 370 375 380 Thr Arg Lys Lys Ile Glu Lys Ile Arg Pro Leu Leu Ile Glu Gly Thr 385 390 395 400 Ala Ser Leu Ser Pro Gly Met Met Met Gly Met Phe Asn Met Leu Ser 405 410 415 Thr Val Leu Gly Val Ser Ile Leu Asn Leu Gly Gln Lys Arg Tyr Thr 420 425 430 Lys Thr Thr Tyr Trp Trp Asp Gly Leu Gln Ser Ser Asp Asp Phe Ala 435 440 445 Leu Ile Val Asn Ala Pro Asn His Glu Gly Ile Gln Ala Gly Val Asp 450 455 460 Arg Phe Tyr Arg Thr Cys Lys Leu Leu Gly Ile Asn Met Ser Lys Lys 465 470 475 480 Lys Ser Tyr Ile Asn Arg Thr Gly Thr Phe Glu Phe Thr Ser Phe Phe 485 490 495 Tyr Arg Tyr Gly Phe Val Ala Asn Phe Ser Met Glu Leu Pro Ser Phe 500 505 510 Gly Val Ser Gly Ile Asn Glu Ser Ala Asp Met Ser Ile Gly Val Thr 515 520 525 Val Ile Lys Asn Asn Met Ile Asn Asn Asp Leu Gly Pro Ala Thr Ala 530 535 540 Gln Met Ala Leu Gln Leu Phe Ile Lys Asp Tyr Arg Tyr Thr Tyr Arg 545 550 555 560 Cys His Ile Gly Asp Thr Gln Ile Gln Thr Arg Arg Ser Phe Glu Ile 565 570 575 Lys Lys Leu Trp Glu Gln Thr Arg Ser Lys Ala Gly Leu Leu Val Ser 580 585 590 Asp Gly Gly Pro Asn Leu Tyr Asn Ile Arg Asn Leu His Ile Pro Glu 595 600 605 Val Cys Leu Lys Trp Glu Leu Met Asp Glu Asp Tyr Gln Gly Arg Leu 610 615 620 Cys Asn Pro Leu Asn Pro Phe Val Ser His Lys Glu Ile Glu Ser Met 625 630 635 640 Asn Asn Ala Val Met Met Pro Ala His Gly Pro Ala Lys Asn Met Glu 645 650 655 Tyr Asp Ala Val Ala Thr Thr His Ser Trp Ile Pro Lys Arg Asn Arg 660 665 670 Ser Ile Leu Asn Thr Ser Gln Arg Gly Val Leu Glu Asp Glu Gln Met 675 680 685 Tyr Gln Arg Cys Cys Asn Leu Phe Glu Lys Phe Phe Pro Ser Ser Ser 690 695 700 Tyr Arg Arg Pro Val Gly Ile Ser Ser Met Val Glu Ala Met Val Ser 705 710 715 720 Arg Ala Arg Ile Asp Ala Arg Ile Asp Phe Glu Ser Gly Arg Ile Lys 725 730 735 Lys Glu Glu Phe Thr Glu Ile Met Lys Ile Cys Ser Thr Ile Glu Glu 740 745 750 Leu Arg Arg Gln Lys 755 <210> 2 <211> 759 <212> PRT <213> PB2 amino acid seqeunce from A/PR/8/34 <400> 2 Met Glu Arg Ile Lys Glu Leu Arg Asn Leu Met Ser Gln Ser Arg Thr 1 5 10 15 Arg Glu Ile Leu Thr Lys Thr Thr Val Asp His Met Ala Ile Ile Lys 20 25 30 Lys Tyr Thr Ser Gly Arg Gln Glu Lys Asn Pro Ala Leu Arg Met Lys 35 40 45 Trp Met Met Ala Met Lys Tyr Pro Ile Thr Ala Asp Lys Arg Ile Thr 50 55 60 Glu Met Ile Pro Glu Arg Asn Glu Gln Gly Gln Thr Leu Trp Ser Lys 65 70 75 80 Met Asn Asp Ala Gly Ser Asp Arg Val Met Val Ser Pro Leu Ala Val 85 90 95 Thr Trp Trp Asn Arg Asn Gly Pro Met Thr Asn Thr Val His Tyr Pro 100 105 110 Lys Ile Tyr Lys Thr Tyr Phe Glu Arg Val Glu Arg Leu Lys His Gly 115 120 125 Thr Phe Gly Pro Val His Phe Arg Asn Gln Val Lys Ile Arg Arg Arg 130 135 140 Val Asp Ile Asn Pro Gly His Ala Asp Leu Ser Ala Lys Glu Ala Gln 145 150 155 160 Asp Val Ile Met Glu Val Val Phe Pro Asn Glu Val Gly Ala Arg Ile 165 170 175 Leu Thr Ser Glu Ser Gln Leu Thr Ile Thr Lys Glu Lys Lys Glu Glu 180 185 190 Leu Gln Asp Cys Lys Ile Ser Pro Leu Met Val Ala Tyr Met Leu Glu 195 200 205 Arg Glu Leu Val Arg Lys Thr Arg 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Asn Gln Arg Leu Asn Pro Met His 420 425 430 Gln Leu Leu Arg His Phe Gln Lys Asp Ala Lys Val Leu Phe Gln Asn 435 440 445 Trp Gly Val Glu Pro Ile Asp Asn Val Met Gly Met Ile Gly Ile Leu 450 455 460 Pro Asp Met Thr Pro Ser Ile Glu Met Ser Met Arg Gly Val Arg Ile 465 470 475 480 Ser Lys Met Gly Val Asp Glu Tyr Ser Ser Thr Glu Arg Val Val Val 485 490 495 Ser Ile Asp Arg Phe Leu Arg Val Arg Asp Gln Arg Gly Asn Val Leu 500 505 510 Leu Ser Pro Glu Glu Val Ser Glu Thr Gln Gly Thr Glu Lys Leu Thr 515 520 525 Ile Thr Tyr Ser Ser Ser Met Met Trp Glu Ile Asn Gly Pro Glu Ser 530 535 540 Val Leu Val Asn Thr Tyr Gln Trp Ile Ile Arg Asn Trp Glu Thr Val 545 550 555 560 Lys Ile Gln Trp Ser Gln Asn Pro Thr Met Leu Tyr Asn Lys Met Glu 565 570 575 Phe Glu Pro Phe Gln Ser Leu Val Pro Lys Ala Ile Arg Gly Gln Tyr 580 585 590 Ser Gly Phe Val Arg Thr Leu Phe Gln Gln Met Arg Asp Val Leu Gly 595 600 605 Thr Phe Asp Thr Ala Gln Ile Ile Lys Leu Leu Pro Phe Ala Ala Ala 610 615 620 Pro Pro Lys Gln Ser Arg Met Gln Phe Ser Ser Phe Thr Val Asn Val 625 630 635 640 Arg Gly Ser Gly Met Arg Ile Leu Val Arg Gly Asn Ser Pro Val Phe 645 650 655 Asn Tyr Asn Lys Ala Thr Lys Arg Leu Thr Val Leu Gly Lys Asp Ala 660 665 670 Gly Thr Leu Thr Glu Asp Pro Asp Glu Gly Thr Ala Gly Val Glu Ser 675 680 685 Ala Val Leu Arg Gly Phe Leu Ile Leu Gly Lys Glu Asp Arg Arg Tyr 690 695 700 Gly Pro Ala Leu Ser Ile Asn Glu Leu Ser Asn Leu Ala Lys Gly Glu 705 710 715 720 Lys Ala Asn Val Leu Ile Gly Gln Gly Asp Val Val Leu Val Met Lys 725 730 735 Arg Lys Arg Asp Ser Ser Ile Leu Thr Asp Ser Gln Thr Ala Thr Lys 740 745 750 Arg Ile Arg Met Ala Ile Asn 755 <210> 3 <211> 252 <212> PRT <213> M1 amino acid sequence from A/PR/8/34 <400> 3 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Tyr Val Leu Ser Ile Ile Pro 1 5 10 15 Ser Gly Pro Leu Lys Ala Glu Ile Ala Gln Arg Leu Glu Asp Val Phe 20 25 30 Ala Gly Lys Asn Thr Asp Leu Glu Val Leu Met Glu Trp Leu Lys Thr 35 40 45 Arg Pro Ile Leu Ser Pro Leu Thr Lys Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe 50 55 60 Thr Leu Thr Val Pro Ser Glu Arg Gly Leu Gln Arg Arg Arg Phe Val 65 70 75 80 Gln Asn Ala Leu Asn Gly Asn Gly Asp Pro Asn Asn Met Asp Lys Ala 85 90 95 Val Lys Leu Tyr Arg Lys Leu Lys Arg Glu Ile Thr Phe His Gly Ala 100 105 110 Lys Glu Ile Ser Leu Ser Tyr Ser Ala Gly Ala Leu Ala Ser Cys Met 115 120 125 Gly Leu Ile Tyr Asn Arg Met Gly Ala Val Thr Thr Glu Val Ala Phe 130 135 140 Gly Leu Val Cys Ala Thr Cys Glu Gln Ile Ala Asp Ser Gln His Arg 145 150 155 160 Ser His Arg Gln Met Val Thr Thr Thr Asn Pro Leu Ile Arg His Glu 165 170 175 Asn Arg Met Val Leu Ala Ser Thr Thr Ala Lys Ala Met Glu Gln Met 180 185 190 Ala Gly Ser Ser Glu Gln Ala Ala Glu Ala Met Glu Val Ala Ser Gln 195 200 205 Ala Arg Gln Met Val Gln Ala Met Arg Thr Ile Gly Thr His Pro Ser 210 215 220 Ser Ser Ala Gly Leu Lys Asn Asp Leu Leu Glu Asn Leu Gln Ala Tyr 225 230 235 240 Gln Lys Arg Met Gly Val Gln Met Gln Arg Phe Lys 245 250 <210> 4 <211> 230 <212> PRT <213> NS1 amino acid sequence from A/PR/8/34 <400> 4 Met Asp Pro Asn Thr Val Ser Ser Phe Gln Val Asp Cys Phe Leu Trp 1 5 10 15 His Val Arg Lys Arg Val Ala Asp Gln Glu Leu Gly Asp Ala Pro Phe 20 25 30 Leu Asp Arg Leu Arg Arg Asp Gln Lys Ser Leu Arg Gly Arg Gly Ser 35 40 45 Thr Leu Gly Leu Asp Ile Glu Thr Ala Thr Arg Ala Gly Lys Gln Ile 50 55 60 Val Glu Arg Ile Leu Lys Glu Glu Ser Asp Glu Ala Leu Lys Met Thr 65 70 75 80 Met Ala Ser Val Pro Ala Ser Arg Tyr Leu Thr Asp Met Thr Leu Glu 85 90 95 Glu Met Ser Arg Asp Trp Ser Met Leu Ile Pro Lys Gln Lys Val Ala 100 105 110 Gly Pro Leu Cys Ile Arg Met Asp Gln Ala Ile Met Asp Lys Asn Ile 115 120 125 Ile Leu Lys Ala Asn Phe Ser Val Ile Phe Asp Arg Leu Glu Thr Leu 130 135 140 Ile Leu Leu Arg Ala Phe Thr Glu Glu Gly Ala Ile Val Gly Glu Ile 145 150 155 160 Ser Pro Leu Pro Ser Leu Pro Gly His Thr Ala Glu Asp Val Lys Asn 165 170 175 Ala Val Gly Val Leu Ile Gly Gly Leu Glu Trp Asn Asp Asn Thr Val 180 185 190 Arg Val Ser Glu Thr Leu Gln Arg Phe Ala Trp Arg Ser Ser Asn Glu 195 200 205 Asn Gly Arg Pro Pro Leu Thr Pro Lys Gln Lys Arg Glu Met Ala Gly 210 215 220 Thr Ile Arg Ser Glu Val 225 230 <210> 5 <211> 121 <212> PRT <213> NS2 amino acid sequence from A/PR/8/34 <400> 5 Met Asp Pro Asn Thr Val Ser Ser Phe Gln Asp Ile Leu Leu Arg Met 1 5 10 15 Ser Lys Met Gln Leu Glu Ser Ser Ser Glu Asp Leu Asn Gly Met Ile 20 25 30 Thr Gln Phe Glu Ser Leu Lys Leu Tyr Arg Asp Ser Leu Gly Glu Ala 35 40 45 Val Met Arg Met Gly Asp Leu His Ser Leu Gln Asn Arg Asn Glu Lys 50 55 60 Trp Arg Glu Gln Leu Gly Gln Lys Phe Glu Glu Ile Arg Trp Leu Ile 65 70 75 80 Glu Glu Val Arg His Lys Leu Lys Ile Thr Glu Asn Ser Phe Glu Gln 85 90 95 Ile Thr Phe Met Gln Ala Leu His Leu Leu Leu Glu Val Glu Gln Glu 100 105 110 Ile Arg Thr Phe Ser Phe Gln Leu Ile 115 120 <110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> A multiple mutated influenza A virus for MDCK cell specific          proliferation improvement <130> PN1209-469 <160> 5 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 757 <212> PRT <213> PB1 amino acid sequence from A / PR / 8/34 <400> 1 Met Asp Val Asn Pro Thr Leu Leu Phe Leu Lys Val Pro Ala Gln Asn   1 5 10 15 Ala Ile Ser Thr Thr Phe Pro Tyr Thr Gly Asp Pro Pro Tyr Ser His              20 25 30 Gly Thr Gly Thr Gly Tyr Thr Met Asp Thr Val Asn Arg Thr His Gln          35 40 45 Tyr Ser Glu Lys Gly Arg Trp Thr Thr Asn Thr Glu Thr Gly Ala Pro      50 55 60 Gln Leu Asn Pro Ile Asp Gly Pro Leu Pro Glu Asp Asn Glu Pro Ser  65 70 75 80 Gly Tyr Ala Gln Thr Asp Cys Val Leu Glu Ala Met Ala Phe Leu Glu                  85 90 95 Glu Ser His Gly Ile Phe Glu Asn Ser Cys Ile Glu Thr Met Glu             100 105 110 Val Val Gln Gln Thr Arg Val Asp Lys Leu Thr Gln Gly Arg Gln Thr         115 120 125 Tyr Asp Trp Thr Leu Asn Arg Asn Gln Pro Ala Ala Thr Ala Leu Ala     130 135 140 Asn Thr Ile Glu Val Phe Arg Ser Asp Gly Leu Thr Ala Asn Glu Ser 145 150 155 160 Gly Arg Leu Ile Asp Phe Leu Lys Asp Val Met Glu Ser Met Asn Lys                 165 170 175 Glu Glu Met Gly Ile Thr Thr His Phe Gln Arg Lys Arg Arg Val Arg             180 185 190 Asp Asn Met Thr Lys Lys Met Ile Thr Gln Arg Thr Met Gly Lys Lys         195 200 205 Lys Gln Arg Leu Asn Lys Arg Ser Tyr Leu Ile Arg Ala Leu Thr Leu     210 215 220 Asn Thr Met Thr Lys Asp Ala Glu Arg Gly Lys Leu Lys Arg Arg Ala 225 230 235 240 Ile Ala Thr Pro Gly Met Gln Ile Arg Gly Phe Val Tyr Phe Val Glu                 245 250 255 Thr Leu Ala Arg Ser Ile Cys Glu Lys Leu Glu Gln Ser Gly Leu Pro             260 265 270 Val Gly Gly Asn Glu Lys Lys Ala Lys Leu Ala Asn Val Val Arg Lys         275 280 285 Met Met Thr Asn Ser Gln Asp Thr Glu Leu Ser Phe Thr Ile Thr Gly     290 295 300 Asp Asn Thr Lys Trp Asn Glu Asn Gln Asn Pro Arg Met Phe Leu Ala 305 310 315 320 Met Ile Thr Tyr Met Thr Arg Asn Gln Pro Glu Trp Phe Arg Asn Val                 325 330 335 Leu Ser Ile Pro Ile Met Phe Ser Asn Lys Met Ala Arg Leu Gly             340 345 350 Lys Gly Tyr Met Phe Glu Ser Lys Ser Met Lys Leu Arg Thr Gln Ile         355 360 365 Pro Ala Glu Met Leu Ala Ser Ile Asp Leu Lys Tyr Phe Asn Asp Ser     370 375 380 Thr Arg Lys Lys Ile Glu Lys Ile Arg Pro Leu Leu Ile Glu Gly Thr 385 390 395 400 Ala Ser Leu Ser Pro Gly Met Met Met Gly Met Phe Asn Met Leu Ser                 405 410 415 Thr Val Leu Gly Val Ser Ile Leu Asn Leu Gly Gln Lys Arg Tyr Thr             420 425 430 Lys Thr Thr Tyr Trp Trp Asp Gly Leu Gln Ser Ser Asp Asp Phe Ala         435 440 445 Leu Ile Val Asn Ala Pro Asn His Glu Gly Ile Gln Ala Gly Val Asp     450 455 460 Arg Phe Tyr Arg Thr Cys Lys Leu Leu Gly Ile Asn Met Ser Lys Lys 465 470 475 480 Lys Ser Tyr Ile Asn Arg Thr Gly Thr Phe Glu Phe Thr Ser Phe Phe                 485 490 495 Tyr Arg Tyr Gly Phe Val Ala Asn Phe Ser Met Glu Leu Pro Ser Phe             500 505 510 Gly Val Ser Gly Ile Asn Glu Ser Ala Asp Met Ser Ile Gly Val Thr         515 520 525 Val Ile Lys Asn Asn Met Ile Asn Asn Asp Leu Gly Pro Ala Thr Ala     530 535 540 Gln Met Ala Leu Gln Leu Phe Ile Lys Asp Tyr Arg Tyr Thr Tyr Arg 545 550 555 560 Cys His Ile Gly Asp Thr Gln Ile Gln Thr Arg Arg Ser Phe Glu Ile                 565 570 575 Lys Lys Leu Trp Glu Gln Thr Arg Ser Ser Ays Gly Leu Leu Val Ser             580 585 590 Asp Gly Gly Pro Asn Leu Tyr Asn Ile Arg Asn Leu His Ile Pro Glu         595 600 605 Val Cys Leu Lys Trp Glu Leu Met Asp Glu Asp Tyr Gln Gly Arg Leu     610 615 620 Cys Asn Pro Leu Asn Pro Phe Val Ser His Lys Glu Ile Glu Ser Met 625 630 635 640 Asn Asn Ala Val Met Met Pro Ala His Gly Pro Ala Lys Asn Met Glu                 645 650 655 Tyr Asp Ala Val Ala Thr Thr His Ser Trp Ile Pro Lys Arg Asn Arg             660 665 670 Ser Ile Leu Asn Thr Ser Gln Arg Gly Val Leu Glu Asp Glu Gln Met         675 680 685 Tyr Gln Arg Cys Cys Asn Leu Phe Glu Lys Phe Phe Pro Ser Ser Ser     690 695 700 Tyr Arg Arg Pro Val Gly Ile Ser Ser Met Val Glu Ala Met Val Ser 705 710 715 720 Arg Ala Arg Ile Asp Ala Arg Ile Asp Phe Glu Ser Gly Arg Ile Lys                 725 730 735 Lys Glu Glu Phe Thr Glu Ile Met Lys Ile Cys Ser Thr Ile Glu Glu             740 745 750 Leu Arg Arg Gln Lys         755 <210> 2 <211> 759 <212> PRT <213> PB2 amino acid seqeunce from A / PR / 8/34 <400> 2 Met Glu Arg Ile Lys Glu Leu Arg Asn Leu Met Ser Gln Ser Arg Thr   1 5 10 15 Arg Glu Ile Leu Thr Lys Thr Thr Val Asp His Met Ala Ile Ile Lys              20 25 30 Lys Tyr Thr Ser Gly Arg Gln Glu Lys Asn Pro Ala Leu Arg Met Lys          35 40 45 Trp Met Met Ala Met Lys Tyr Pro Ile Thr Ala Asp Lys Arg Ile Thr      50 55 60 Glu Met Ile Pro Glu Arg Asn Glu Gln Gly Gln Thr Leu Trp Ser Lys  65 70 75 80 Met Asn Asp Ala Gly Ser Asp Arg Val Met Val Ser Pro Leu Ala Val                  85 90 95 Thr Trp Trp Asn Arg Asn Gly Pro Met Thr Asn Thr Val His Tyr Pro             100 105 110 Lys Ile Tyr Lys Thr Tyr Phe Glu Arg Val Glu Arg Leu Lys His Gly         115 120 125 Thr Phe Gly Pro Val His Phe Arg Asn Gln Val Lys Ile Arg Arg Arg     130 135 140 Val Asp Ile Asn Pro Gly His Ala Asp Leu Ser Ala Lys Glu Ala Gln 145 150 155 160 Asp Val Ile Met Glu Val Val Phe Pro Asn Glu Val Gly Ala Arg Ile                 165 170 175 Leu Thr Ser Glu Ser Gln Leu Thr Ile Thr Lys Glu Lys Lys Glu Glu             180 185 190 Leu Gln Asp Cys Lys Ile Ser Pro Leu Met Val Ala Tyr Met Leu Glu         195 200 205 Arg Glu Leu Val Arg Lys Thr Arg Phe Leu Pro Val Ala Gly Gly Thr     210 215 220 Ser Ser Val Tyr Ile Glu Val Leu His Leu Thr Gln Gly Thr Cys Trp 225 230 235 240 Glu Gln Met Tyr Thr Pro Gly Gly Glu Val Lys Asn Asp Asp Val Asp                 245 250 255 Gln Ser Leu Ile Ile Ala Ala Arg Asn Ile Val Arg Arg Ala Ala Val             260 265 270 Ser Ala Asp Pro Leu Ala Ser Leu Leu Glu Met Cys His Ser Thr Gln         275 280 285 Ile Gly Gly Ile Arg Met Val Asp Ile Leu Lys Gln Asn Pro Thr Glu     290 295 300 Glu Gln Ala Val Gly Ile Cys Lys Ala Ala Met Gly Leu Arg Ile Ser 305 310 315 320 Ser Ser Phe Ser Phe Gly Gly Phe Thr Phe Lys Arg Thr Ser Gly Ser                 325 330 335 Ser Val Lys Arg Glu Glu Glu Val Leu Thr Gly Asn Leu Gln Thr Leu             340 345 350 Lys Ile Arg Val His Glu Gly Tyr Glu Glu Phe Thr Met Val Gly Arg         355 360 365 Arg Ala Thr Ala Ile Leu Arg Lys Ala Thr Arg Arg Leu Ile Gln Leu     370 375 380 Ile Val Ser Gly Arg Asp Glu Gln Ser Ile Ala Glu Ala Ile Ile Val 385 390 395 400 Ala Met Val Phe Ser Gln Glu Asp Cys Met Ile Lys Ala Val Arg Gly                 405 410 415 Asp Leu Asn Phe Val Asn Arg Ala Asn Gln Arg Leu Asn Pro Met His             420 425 430 Gln Leu Leu Arg His Phe Gln Lys Asp Ala Lys Val Leu Phe Gln Asn         435 440 445 Trp Gly Val Glu Pro Ile Asp Asn Val Met Gly Met Ile Gly Ile Leu     450 455 460 Pro Asp Met Thr Pro Ser Ile Glu Met Ser Met Arg Gly Val Arg Ile 465 470 475 480 Ser Lys Met Gly Val Asp Glu Tyr Ser Ser Thr Glu Arg Val Val Val                 485 490 495 Ser Ile Asp Arg Phe Leu Arg Val Arg Asp Gln Arg Gly Asn Val Leu             500 505 510 Leu Ser Pro Glu Glu Val Ser Glu Thr Gln Gly Thr Glu Lys Leu Thr         515 520 525 Ile Thr Ser Ser Ser Met Met Trp Glu Ile Asn Gly Pro Glu Ser     530 535 540 Val Leu Val Asn Thr Tyr Gln Trp Ile Ile Arg Asn Trp Glu Thr Val 545 550 555 560 Lys Ile Gln Trp Ser Gln Asn Pro Thr Met Leu Tyr Asn Lys Met Glu                 565 570 575 Phe Glu Pro Phe Gln Ser Leu Val Pro Lys Ala Ile Arg Gly Gln Tyr             580 585 590 Ser Gly Phe Val Arg Thr Leu Phe Gln Gln Met Arg Asp Val Leu Gly         595 600 605 Thr Phe Asp Thr Ala Gln Ile Ile Lys Leu Leu Pro Phe Ala Ala Ala     610 615 620 Pro Pro Lys Gln Ser Arg Met Gln Phe Ser Ser Phe Thr Val Asn Val 625 630 635 640 Arg Gly Ser Gly Met Arg Ile Leu Val Arg Gly Asn Ser Pro Val Phe                 645 650 655 Asn Tyr Asn Lys Ala Thr Lys Arg Leu Thr Val Leu Gly Lys Asp Ala             660 665 670 Gly Thr Leu Thr Glu Asp Pro Asp Glu Gly Thr Ala Gly Val Glu Ser         675 680 685 Ala Val Leu Arg Gly Phe Leu Ile Leu Gly Lys Glu Asp Arg Arg Tyr     690 695 700 Gly Pro Ala Leu Ser Ile Asn Glu Leu Ser Asn Leu Ala Lys Gly Glu 705 710 715 720 Lys Ala Asn Val Leu Ile Gly Gln Gly Asp Val Val Leu Val Met Lys                 725 730 735 Arg Lys Arg Asp Ser Ser Ile Leu Thr Asp Ser Gln Thr Ala Thr Lys             740 745 750 Arg Ile Arg Met Ala Ile Asn         755 <210> 3 <211> 252 <212> PRT <213> M1 amino acid sequence from A / PR / 8/34 <400> 3 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Tyr Val Leu Ser Ile Ile Pro   1 5 10 15 Ser Gly Pro Leu Lys Ala Glu Ile Ala Gln Arg Leu Glu Asp Val Phe              20 25 30 Ala Gly Lys Asn Thr Asp Leu Glu Val Leu Met Glu Trp Leu Lys Thr          35 40 45 Arg Pro Ile Leu Ser Pro Leu Thr Lys Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe      50 55 60 Thr Leu Thr Val Ser Glu Arg Gly Leu Gln Arg Arg Arg Phe Val  65 70 75 80 Gln Asn Ala Leu Asn Gly Asn Gly Asp Pro Asn Asn Met Asp Lys Ala                  85 90 95 Val Lys Leu Tyr Arg Lys Leu Lys Arg Glu Ile Thr Phe His Gly Ala             100 105 110 Lys Glu Ile Ser Leu Ser Tyr Ser Ala Gly Ala Leu Ala Ser Cys Met         115 120 125 Gly Leu Ile Tyr Asn Arg Met Gly Ala Val Thr Thr Glu Val Ala Phe     130 135 140 Gly Leu Val Cys Ala Thr Cys Glu Gln Ile Ala Asp Ser Gln His Arg 145 150 155 160 Ser His Arg Gln Met Val Thr Thr Thr Asn Pro Leu Ile Arg His Glu                 165 170 175 Asn Arg Met Val Leu Ala Ser Thr Thr Ala Lys Ala Met Glu Gln Met             180 185 190 Ala Gly Ser Ser Glu Gln Ala Ala Glu Ala Met Glu Val Ala Ser Gln         195 200 205 Ala Arg Gln Met Val Gln Ala Met Arg Thr Ile Gly Thr His Ser Ser     210 215 220 Ser Ser Ala Gly Leu Lys Asn Asp Leu Leu Glu Asn Leu Gln Ala Tyr 225 230 235 240 Gln Lys Arg Met Gly Val Gln Met Gln Arg Phe Lys                 245 250 <210> 4 <211> 230 <212> PRT <213> NS1 amino acid sequence from A / PR / 8/34 <400> 4 Met Asp Pro Asn Thr Val Ser Ser Phe Gln Val Asp Cys Phe Leu Trp   1 5 10 15 His Val Arg Lys Arg Val Ala Asp Gln Glu Leu Gly Asp Ala Pro Phe              20 25 30 Leu Asp Arg Leu Arg Arg Asp Gln Lys Ser Leu Arg Gly Arg Gly Ser          35 40 45 Thr Leu Gly Leu Asp Ile Glu Thr Ala Thr Arg Ala Gly Lys Gln Ile      50 55 60 Val Glu Arg Ile Leu Lys Glu Glu Ser Asp Glu Ala Leu Lys Met Thr  65 70 75 80 Met Ala Ser Val Pro Ala Ser Arg Tyr Leu Thr Asp Met Thr Leu Glu                  85 90 95 Glu Met Ser Arg Asp Trp Ser Met Leu Ile Pro Lys Gln Lys Val Ala             100 105 110 Gly Pro Leu Cys Ile Arg Met Asp Gln Ala Ile Met Asp Lys Asn Ile         115 120 125 Ile Leu Lys Ala Asn Phe Ser Ile Phe Asp Arg Leu Glu Thr Leu     130 135 140 Ile Leu Leu Arg Ala Phe Thr Glu Glu Gly Ala Ile Val Gly Glu Ile 145 150 155 160 Ser Pro Leu Pro Ser Leu Pro Gly His Thr Ala Glu Asp Val Lys Asn                 165 170 175 Ala Val Gly Val Leu Ile Gly Gly Leu Glu Trp Asn Asp Asn Thr Val             180 185 190 Arg Val Ser Glu Thr Leu Gln Arg Phe Ala Trp Arg Ser Ser Asn Glu         195 200 205 Asn Gly Arg Pro Pro Leu Thr Pro Lys Gln Lys Arg Glu Met Ala Gly     210 215 220 Thr Ile Arg Ser Glu Val 225 230 <210> 5 <211> 121 <212> PRT <213> NS2 amino acid sequence from A / PR / 8/34 <400> 5 Met Asp Pro Asn Thr Val Ser Ser Phe Gln Asp Ile Leu Leu Arg Met   1 5 10 15 Ser Lys Met Gln Leu Glu Ser Ser Ser Glu Asp Leu Asn Gly Met Ile              20 25 30 Thr Gln Phe Glu Ser Leu Lys Leu Tyr Arg Asp Ser Leu Gly Glu Ala          35 40 45 Val Met Arg Met Gly Asp Leu His Ser Leu Gln Asn Arg Asn Glu Lys      50 55 60 Trp Arg Glu Gln Leu Gly Gln Lys Phe Glu Glu Ile Arg Trp Leu Ile  65 70 75 80 Glu Glu Val Arg His Lys Leu Lys Ile Thr Glu Asn Ser Phe Glu Gln                  85 90 95 Ile Thr Phe Met Gln Ala Leu His Leu Leu Leu Glu Val Glu Gln Glu             100 105 110 Ile Arg Thr Phe Ser Phe Gln Leu Ile         115 120

Claims (11)

삭제delete 서열번호 1의 153번 아미노산인 Asp가 Asn으로 치환되고;
서열번호 3의 137번 아미노산인 Ala가 Thr으로 치환된 이중 돌연변이를 포함하는 증식성이 향상된 것을 특징으로 하는 인플루엔자 A 재조합 바이러스.Asp, which is amino acid 153 of SEQ ID NO: 1, is substituted with Asn;
An influenza A recombinant virus characterized by improved proliferation including a double mutation in which Ala which is amino acid 137 of SEQ ID NO: 3 is substituted with Thr. 제2항에 있어서,
상기 이중 돌연변이에 서열번호 2의 701번 아미노산인 Asp가 Asn으로 추가로 치환된 삼중 돌연변이를 포함하는 증식성이 향상된 것을 특징으로 하는 인플루엔자 A 재조합 바이러스.3. The method of claim 2,
Wherein said double mutation has improved proliferative activity including a triple mutation wherein Asp, amino acid 701 of SEQ ID NO: 2 is further substituted with Asn. 제2항에 있어서,
상기 인플루엔자 A 재조합 바이러스는 야생형 인플루엔자 A 바이러스에 비하여 약독화된 것을 특징으로 하는 인플루엔자 A 재조합 바이러스.3. The method of claim 2,
Wherein said influenza A recombinant virus is attenuated compared to wild type influenza A virus. 제2항에 있어서,
상기 인플루엔자 A 재조합 바이러스는 MDCK 세포 특이적으로 증식성이 향상된 것을 특징으로 하는 인플루엔자 A 재조합 바이러스.3. The method of claim 2,
Wherein the influenza A recombinant virus is characterized in that the proliferative activity is specifically enhanced in MDCK cells. 제2항 내지 제5항의 어느 한 항에 있어서,
상기 인플루엔자 A 재조합 바이러스는 A/PR/8/34를 백본(backbone)으로 한 재조합 바이러스인 것을 특징으로 하는 인플루엔자 A 재조합 바이러스.6. The method according to any one of claims 2 to 5,
Wherein said influenza A recombinant virus is a recombinant virus comprising A / PR / 8/34 as a backbone. 서열번호 1의 153번 아미노산이 Asp에서 Asn으로 치환되도록 이를 인코딩하는 유전자; 및
서열번호 3의 137번 아미노산이 Ala에서 Thr으로 치환되도록 이를 인코딩하는 유전자;를 포함하는 재조합 벡터.A gene encoding 153 such that amino acid 153 of SEQ ID NO: 1 is substituted with Asn to Asn; And
A gene encoding amino acid 137 of SEQ ID NO: 3 so that the amino acid at position 137 is substituted with Ala to Thr. 제2항 또는 제7항의 바이러스 또는 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 백신 조성물.9. An influenza A virus vaccine composition comprising the virus or recombinant vector of claim 2 or 7 as an active ingredient. 서열번호 1의 153번 아미노산이 Asp에서 Asn으로 치환되도록 이를 인코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터; 및
서열번호 3의 137번 아미노산이 Ala에서 Thr으로 치환되도록 이를 인코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터;를 제작하되, 상기 유전자가 인플루엔자 A 바이러스에서 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하도록 제작하는 단계(a);
상기 제작된 재조합 벡터 중 하나 이상을 인플루엔자 A 바이러스에 도입하여 재조합 인플루엔자 A 바이러스를 생성하는 단계(b);를 포함하는, 증식성이 향상된 인플루엔자 A 바이러스의 제조방법.A recombinant vector comprising a gene encoding amino acid 153 of SEQ ID NO: 1 such that Asn is substituted with Asn; And
(A) preparing a recombinant vector comprising a gene encoding amino acid 137 of SEQ ID NO: 3 such that amino acid 137 is substituted with Ala to Thr, wherein the gene comprises a promoter operably linked to influenza A virus;
(B) introducing at least one of the prepared recombinant vectors into an influenza A virus to produce a recombinant influenza A virus. 제9항에 있어서,
상기 생성된 인플루엔자 A 바이러스를 MDCK 세포에 접종하여 증식시키는 단계(c)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 A 바이러스 제조방법.10. The method of claim 9,
Further comprising the step (c) of inoculating and propagating the resulting influenza A virus into MDCK cells. 제9항에 있어서,
상기 인플루엔자 A 바이러스는 A/PR/8/34를 백본(backbone)으로 하는 바이러스인 것을 특징으로 하는 인플루엔자 A 바이러스 제조방법.10. The method of claim 9,
Wherein said influenza A virus is a virus having A / PR / 8/34 as a backbone.

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