KR101437600B1 - 비쭈기나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품 - Google Patents

비쭈기나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품 Download PDF

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Abstract

본 발명은 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료에 효과적인, 비쭈기나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물 및 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.

Description

비쭈기나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품{Pharmaceutical composition and functional food for prevention or treatment of angiogenesis-related diseases comprising Cleyera japonica extraction}
본 발명은 비쭈기나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.
혈관신생(Angiogenesis)이란 기존의 미세혈관으로부터 새로운 모세혈관이 형성되는 과정을 의미하며, 정상적인 생리작용으로 발생과정과 상처치유(wound healing), 여성의 생식 사이클에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 또한, 혈관신생이 자율적으로 조절되지 못하고 병적으로 성장함으로써 야기되는 질환들이 있는데, 예를 들어 비정상적으로 과도한 혈관신생은 암의 성장과 전이(metastasis), 당뇨병성 망막병증(diabetic retinopathy), 연령관련 황반변성(agerelated macular degeneration), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 자궁내막증, 건선(psoriasis) 또는 만성 염증(chronic inflammation)과 같은 질환에 결정적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 반면에, 불충분한 혈관신생은 관상 동맥 질환(coronary artery disease), 뇌졸중(stroke), 심근경색(myocardiac infarction), 궤양(ulcer) 또는 상처치유의 지연(delayed wound healing) 등의 원인이 되고 있다.
암은 육체를 이루는 세포에 어떤 발암인자가 작용하여 불규칙하게 분열함으로써, 그 세포 자체가 육체를 구성하는 제어로부터 벗어나 무계획적으로 증식하게 된다. 나아가 주위에 있는 조직을 침해하고 혈관, 림프관 등을 통하여 다른 장기로 원격전이하여 장애를 일으키고, 그대로 방치하면 생명을 빼앗기는 병태이기 때문에 악성종양 또는 악성신생물이라고도 하며, 그 세포를 암세포, 악성세포라고 한다.
병인은 다종다양하지만, 우선 외인성과 내인성으로 생각할 수 있다. 외인성으로 피르호의 자극설이 유명한데, 그것은 만성 자극이 조직이나 세포에 가해지면 암이 발생할 수 있다는 주장이다. 자극에는 화학적 발암물질, 종양바이러스, 방사선 등의 물리적 자극 외에 기계적 자극 등이 있다. 내인성으로는 호르몬, 유전, 면역 등이 있으며, 또 연령, 성 등도 포함된다. 외인성으로는 환경물질에 의한 것이 많다.
치료의 방법으로는 암조직을 세포레벨에서 체내로부터 제거하는 데 있다. 지금의 암 치료방법은 외과요법, 방사선요법, 화학요법 등으로 나뉜다. 외과요법은 암을 조직레벨에서 체내로부터 제거하는 것으로서, 가장 합리적이지만 세포레벨에서 보면 주위의 조직 속에 침윤하거나 림프선에 전이해 있는 현미경적 병소를 완전히 제거하는 것은 실제로 곤란하다. 그러므로 조기암 또는 병소가 일부에 국한되어 있는 암(병기가 1기 또는 2기인 암)에 대해서는 외과요법이 매우 효과적이지만, 어느 정도 진행된 3기의 암인 경우에는 수술(외과요법)뿐만 아니라 방사선요법이나 화학요법을 병용할 필요가 있다. 방사선요법, 화학요법은 3기 이후의 진행암 또는 말기암에서만 쓰이는 것은 아니다. 후두암, 자궁경부암에서는 1기의 암이라도 방사선요법만으로 완치되므로 방사선요법이 제일 우선이 된다. 또, 폐암 중 소세포암은 종래부터 외과요법으로 시술하여도 예후가 좋지 않았는데, 지금은 화학요법을 우선으로 하며 방사선요법을 병용하는 경우가 많다. 이 요법에 의해 최근에는 근소하나마 5년 생존율(시술 수 5년을 경과한 생존율)을 상승시킬 수 있게 되었다. 이상과 같이 암 치료법은 지금으로서는 조기암 치료를 제외하고는 어느 것이나 완전하다고 말하기 어렵다. 그러나 각각의 치료법이 지닌 장점을 병증에 맞추어 단독 또는 병용하여 활용하면 더욱 좋은 효과를 기대할 수 있다. 임상적으로는 외과요법, 방사선요법, 화학요법 3가지를 어떻게 병용하는가가 가장 중요한 연구대상이 되고 있다.
그러나 상기한 외과요법, 방사선요법 및 화학요법들은 모두 정상세포들에게도 영향을 주어 심각한 부작용을 초래하는 문제가 있다.
따라서 보다 안전하고, 그러면서도 치료 효과가 높은 대체적인 암치료 방법이 요구되고 있으며, 수술을 수행하는 외과요법이나 방사선요법 이외의 방법으로 암을 치료하기 위한 대안적 방법으로서 신생혈관 억제제에 대한 연구가 활발히 진행되고 있는 실정이다. 기존의 항암 화학요법은 암세포가 빠르게 성장하는 특성을 이용하여 치료하기 때문에 세포주기가 빠른 위장세포, 골수세포, 머리카락 등에 독성을 나타냈으나, 신생혈관 억제제는 장기간 투여하여도 부작용이 적고 치료제에 대한 내성을 나타낼 가능성이 적기 때문에 대체적인 치료제로서 각광받고 있다. 또한 하나의 혈관세포가 수백 개의 암세포에 영양분, 산소를 공급하기 때문에 하나의 혈관세포의 억제를 통해서 많은 암세포의 억제 효과가 발생되며 기존 항암용법은 항암제가 혈관 밖으로 유출되어 암세포에 영향을 끼치는 반면 신생혈관 억제제는 직접 혈관 내피세포에 작용하므로 약물 전달이 용이하다는 장점이 있다.
암세포가 성장하여 거대 종양이 되는 과정에서 성장에 필요한 영양소 및 산소 등을 공급받기 위해서는 신체에서 이들을 운반하는 매체인 혈액을 통해야 하는데, 암세포는 기존의 혈관으로부터 새로운 혈관을 만들어 내어 산소와 영양분을 집중적으로 공급을 받는다. 이렇게 새로운 혈관을 생성 하는 것을 혈관생성(angiogenesis)이라고 하는데, 암세포에 의해 임의로 형성된 신생혈관은 암세포의 중요한 영양공급의 통로가 되기도 하지만 인체의 다른 장기나 조직으로 암세포를 전이시키는 경로가 되기도 한다.
암의 신생혈관 형성은 신생혈관형성 유도인자(angiogenic factor)에 의해 일어나며, 암세포가 신생혈관형성 유도인자를 분비하며, 이것이 내피세포에 존재하는 수용체에 결합을 하면서 새로운 혈관의 형성과정이 시작된다. 자극된 내피세포는 성장하기 시작하면서 단백질가수분해효소(protease)를 분비한다. 이로서 기존의 세정맥에 있는 기저막(basement membrane)의 지엽적인 분해가 일어나고, 내피세포가 신생혈관형성 유도인자가 나오는 곳을 향하여 움직인다. 이후 이동한 내피세포들이 서로 연결되어 solid sprout가 생기고, 각각의 내피세포들에 만곡(cuvature)이 일어나면 루멘(lumen) 길이가 증가된다. 끝으로 2개의 속이 빈 sprouts의 끝이 결합하면 루프(loop)가 형성되고 이곳으로 혈액이 들어오게 된다.
이러한 신생혈관을 통해 정상세포로 가야 할 산소와 영양분을 암세포에게 빼앗겨 우리 몸을 구성하고 있는 많은 정상조직들의 생육이 정상적이지 못하게 되고, 암세포의 성장을 억제하는 면역세포의 활성도 점점 약해져 암세포는 시간이 지날수록 더욱 빠르게 성장하게 되고 악화가 가속화된다. 새로운 혈관의 형성은 매우 엄격하게 조절되어지고 있으며 그렇기 때문에 꼭 필요한 부분이 아닌 곳에서 혈관이 새롭게 만들어지는 것은 중요한 질병들의 원인이 된다. 특히 암종양은 자신의 성장을 위해 영양분을 흡수하고 노폐물을 배출하는 통로로서 새로운 모세혈관을 계속적으로 유도하므로, 암종양의 전이(metastasis)도 신생혈관형성에 의존한다.
이렇듯 신생혈관이 암세포 성장과 전이에 중요한 통로로 작용한다는 점에서 암의 치료와 재발의 방지에 중요한 단서가 된다는 사실이 밝혀지면서 많은 연구가 진행되어 왔으며, 현재 신생혈관을 억제하여 암을 치료하기 위한 신생혈관 억제제(Anti-angiogenesis material)에 대한 연구가 계속적으로 진행되고 있다.
즉, 신생혈관 억제제는 신생혈관의 발생 억제를 통해서 암세포로 영양소를 공급하여 주는 통로를 차단하고 이 영양소가 정상 세포로 전달되어 암세포에 영양분을 차단하는 작용과, 암세포의 이동통로를 막아줌으로써 암 전이를 억제하는 작용 및 치료 후 암세포가 다시 신생혈관을 통하여 성장하는 것을 방지하여 암의 재발을 막아주는 작용을 통해 암의 완치를 도울 수 있다. 또한, 신생혈관의 억제는 아직 암이 발생하지 않은 사람에게도 유익하게 작용하여 암의 예방에 도움을 줄 수 있다는 연구가 보고된 바 있다(William W. Li, et al; Tumor Angiogenesis as a Target for Dietary Cancer Prevention; Journal of Oncology Volume 2012 (2012), 23 pages).
특히, 신생혈관을 효과적으로 억제하면서 정상혈관에 영향을 주지 않는 약품의 개발이 필요한 실정이다. 현재 신생혈관 치료제로서 개발된 아바스틴®의 경우 혈전증, 출혈 등의 부작용이 수반되어 안정성에 있어서 보다 강화된 약품의 개발이 시급한 실정이다.
이에 본 발명자들은 보다 안전하고, 치료 효과가 높은 한약을 이용한 치료제를 개발하고자 연구하던 중, 비쭈기나무 추출물의 신생 혈관 생성 억제 효과 및 암에 대한 세포독성을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 혈관신생 관련 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 비쭈기나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물 또는 건강기능식품을 제공하기 위한 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 비쭈기나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 “비쭈기나무(Cleyera japonica)”는, 상록소교목으로서 높이는 10m에 이르며 겨울눈의 모양이 비쭉해서 비쭈기나무라고 한다. 빗죽이나무라고도 하며 장미과식물로서 이의 수피는 적갈색의 염료로 이용하며 이의 항산화 효과, 멜라닌 생성 억제효과를 이용하여 화장료로서 사용되고 있다. 우리나라 중부 이남에서 자생하며 제주도에서 흔하게 볼 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "추출물"은, 비쭈기나무로부터 액체의 용매를 사용하여 추출된 특정 성분을 의미한다. 상기 용매로는 물, C1 -4 알코올 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있다. 유효성분을 효율적으로 추출하기 위하여 메탄올로 추출하는 것이 바람직하다.
본 발명의 비쭈기나무 추출물은, 비쭈기나무의 다양한 기관 또는 부분(예: 잎, 꽃, 뿌리, 줄기, 가지, 껍질 및 종자 등)으로부터 추출하여 얻을 수 있으며, 바람직하게는 비쭈기나무 잎을 추출하여 얻을 수 있다. 추출방법은 초음파 추출, 상온 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 및 증기 추출로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "혈관신생 질환"은, 기존의 혈관으로부터 혈관내피세포가 출아하여 조직에 침입하는 형태로 모세혈관이 뻗어나가는 맥관 형성으로 인해 발생되는 질환을 의미한다. 또한 상기 혈관신생 관련 질환은 암, 당뇨병성 망막증, 연령관련 황반변성, 류마티스관절염, 자궁내막증, 건선 또는 만성염증일 수 있다. 특히, 상기 혈관신생 관련 질환은 중 암이 대표적이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "암"은, 신체 조직의 자율적인 과잉 성장에 의해 비정상적으로 자라난 덩어리를 의미하며, 양성종양과 악성종양으로 구분할 수 있다. 양성종양이 비교적 성장 속도가 느리고 전이되지 않는 것에 반해 악성종양은 주위 조직에 침윤하면서 빠르게 성장하고 신체 각 부위에 확산되거나 전이되어 생명을 위협하게 된다. 따라서 악성종양을 암과 동일한 의미로 생각할 수 있다.
상기 암은 백혈병, 폐암, 대장암, 전립선암, 위암, 섬유육종, 간암, 흑색종, 유방암, 신장암 또는 난소암일 수 있다. 본 발명에 따른 비쭈기나무 추출물은 이러한 질병의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 암 치료의 지표가 되는 혈관생성 억제 효과 및 세포독성을 확인함으로써, 암의 예방 또는 치료 효능이 있음을 확인하였다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은, 상기 비쭈기나무 추출물을 포함하는 조성물의 투여로 질환을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 또한, 본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는, 상기 비쭈기나무 추출물을 포함하는 조성물의 투여로 암의 증세가 호전되거나 완치되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 조성물은 투여를 위하여, 상기 기재한 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 상세하게는, 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 고형제제는 상기 비쭈기나무 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제할 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 과제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로솔, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 비쭈기나무 추출물의 일일 투여량은 바람직하게는 1 ㎎/㎏ 내지 500 ㎎/㎏이며, 필요에 따라 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 비쭈기나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일 주스 및 과일 주스 및 야체 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 건강기능식품은 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 차, 기능수, 드링크제, 알콜 및 비타민 복합제 중 어느 하나의 형태일 수 있다.
또한 상기 건강기능식품은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, "식품첨가물"로서의 적합여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품안정청에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 과한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 "식품첨가물공전"에 수재된 품목으로 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산 칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성품, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고랭색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합 제제류들을 들 수 있다.
이때, 건강기능식품을 제조하는 과정에서 음료를 포함한 식품에 첨가되는 본 발명에 따른 추출물은 필요에 따라 그 함량을 적절히 가감할 수 있으며, 바람직하게는 식품 100 중량%에 1 내지 15 중량% 포함되도록 첨가하는 것이 바람직하다.
본 발명은 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료에 효과적인 천연 추출물로서, 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물로 약학적으로 이용 가능할 뿐 아니라 건강기능식품으로서도 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은, 본 발명의 일 실시예에 따른 비쭈기나무 추출물의 농도에 따른 혈관내피세포의 증식과 관련한 총 세포수(x105)의 결과를 나타낸 그래프이다(*<0.05 p-value).
도 2는, 본 발명의 일 실시예에 따른 비쭈기나무 추출물의 농도에 따른 혈관내피세포의 생존능(viability %)을 나타낸 것이다.
도 3은, 본 발명의 일 실시예에 따른 비쭈기나무 추출물의 농도별 처리에 따른 healing area (migration) 결과를 나타낸 이미지이다. T=0은 비쭈기나무 추출물 처리전의 이미지를 T=18은 비쭈기나무 추출물 미처리 한 경우 18시간 후의 이미지를 나타낸 것이고, 0, 25, 50 및 100 ㎍/ml 농도로 각각 비쭈기나무 추출물을 처리한 경우의 18시간 후의 이미지를 나타낸 것이다.
도 4는, 본 발명의 일 실시예에 따른 비쭈기나무 추출물의 농도별 처리에 따른 wound healing assay 방법으로 측정한 healing area(migraion, %) 결과를 나타낸 그래프이다(*<0.05 p-value).
도 5는, 본 발명의 일 실시예에 따른 비쭈기나무 추출물의 (a) 미처리(Vehicle), (b) 양성 대조군 (Suforaphane 5uM) (c) 25 ㎍/ml 농도 처리, (d) 50 ㎍/ml 농도 처리, 및 (e) 100 ㎍/ml 농도 처리에 따른 혈관 형성 억제 활성 결과를 나타낸 이미지이다.
도 6은, 본 발명의 일 실시예에 따른 비쭈기나무 추출물의 농도별 처리 후 혈관길이(tube length) 및 혈관 이음수(tube joint)를 통해 상대적인 혈관형성 결과를 나타낸 그래프이다(*<0.05 p-value).
이하, 하기 제조예 및 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 제조예 및 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 : 비쭈기나무 추출물의 제조
비쭈기나무 잎을 건조하여 분쇄한 후 99.9% 메탄올로 추출하였으며 감압농축하여 비쭈기나무 추출물을 수득하였다.
실험예 1: 비쭈기나무 추출물의 투여에 의한 혈관내피세포( HUVEC ; human umbilical vein endothelial cells )의 총 세포수 및 생존능 측정 실험
상기 실시예에서 제조한 비쭈기나무 추출물의 투여로 인한 혈관내피세포의 총 세포수 및 생존능 변화를 확인하기 위하여 세포 계수기(cell counter)로 세포수와 생존능을 확인하였다.
먼저 혈관내피세포를 24 well plate에 0.5×105/well(500 ㎕)의 농도로 씨딩(seeding)한 후 24시간 전배양(pre-incubation)하고 상기 비쭈기나무 추출물을 0, 12.5, 25, 50 및 100 ㎍/ml 농도로 각각 처리한 후 48시간 동안 배양하였다. 배양액을 각각의 관(tube)에 모은 후 PBS 300 ㎕로 세척하고 PBS를 배양액에 들어있는 관으로 옮겼다. 트립신(trypsin)을 처리하여 세포를 떼어낸 후 상기 관의 배양액 및 PBS에 함침시켜 준비하였다. 준비된 샘플을 세포 계수기(ADAM)를 이용하여 총 세포수 및 생존능을 확인하였으며, 그 결과를 도 1 및 도 2에 나타내었다. 도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 비쭈기나무 추출물(0~100 ㎍/mL)은 혈관내피세포의 생존능에 영향 없이 총 세포수가 감소함을 보여 증식 억제 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 따라서, 비쭈기나무 추출물은 정상 혈관내피세포에 손상을 주지 않음과 동시에 혈관내피세포의 증식을 억제함으로서 신생혈관 형성 억제효과를 보이는 것으로 생각할 수 있다.
실험예 2: 비쭈기나무 추출물의 투여에 의한 혈관내피세포의 미그레이션( migration ) 억제 활성 실험
상기 실시예에서 제조된 비쭈기나무 추출물의 암 전이 과정 중 한 단계인 혈관내피세포의 미그레이션(migration) 억제 효과를 확인하기 위하여, 혈관내피세포 및 상기 비쭈기나무 추출물을 0, 25, 50 및 100 ㎍/ml 농도로 각각 암세포에 처리하여 wound healing assay를 시행하였다. 즉, 혈관내피세포(HUVEC)를 24 well plate에 1×105 cells/well 밀도로 씨딩한 후 세포가 단분자막(monolayer)으로 융합(comfluent)하도록 배양하였다. 그 후 황색 팁(yellow tip)을 이용하여 일부분의 세포 단분자막을 제거하고 비쭈기나무 추출물이 포함된 새로운 배지(media)로 교체하였다. 각각의 농도로 18시간 동안 배양한 후 healing area는 현미경으로 사진을 찍은 후 영상분석프로그램(MetaMorph imaging)으로 분석하였으며, 결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다. 도 3 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 비쭈기나무 추출물은 혈관내피세포의 미그레이션에 강한 억제 효과를 보였다.
실험예 3: 비쭈기나무 추출물의 투여에 의한 혈관내피세포의 혈관 형성 분석( tube formation assay ) 실험
상기 실시예에서 제조된 비쭈기나무 추출물의 혈관신생 억제 작용 활성을 확인하기 위해서 혈관 형성 분석(tube formation assay) 실험을 실시하였다. 마트리겔(matrigel)로 도포된 96 well plate에 혈관내피세포(HUVEC) 및 상기 실시예에서 제조된 비쭈기나무 추출물을 0, 25, 50 및 100 ㎍/㎖ 농도로 각각 처리한 후 12시간 동안 배양하였다. 혈관신생 억제 활성이 알려져 있는 sulforaphane(5 uM)을 양성대조군으로서 사용하였다. 혈관 길이(tube length) 및 혈관 이음(tube joint)수는 현미경으로 사진을 찍은 후 영상분석프로그램(MetaMorph imaging)으로 분석하였으며, 결과를 도 5 및 도 6에 나타내었다. 도 5 및 도 6에 나타낸 바와 같이, 비쭈기나무 추출물은 강한 신생 혈관 억제 활성을 나타내었다.
실험예 4: 비쭈기나무 추출물의 다양한 암종에 대한 세포독성 실험
상기 실시예에서 제조된 비쭈기나무 추출물의 암세포에대한 세포독성을 측정하기 위하여 MTS 분석을 수행하여 viability(%) 값을 구하였으며, 그 결과를 하기의 표 1에 나타내었다. 96 well plate에 5×103개의 암세포를 100 ㎕의 적당한 배양배지와 함께 seeding한 후 24시간 동안 전배양하였다. 비쭈기나무 추출물을 100 ㎍/mL의 농도로 처리 한 후 48시간 동안 추가 배양하였다. 배양배지를 제거하고 100㎕의 MTS working solution을 넣어 주고 1시간 동안 반응시킨 후 490 nm에서 흡광도를 측정하여 음성대조군의 OD 490 값에 대한 상대적인 viability(%)를 계산였다.
세포주(cell line) 암종 (origin) Viability (%)± SD
HL-60 백혈병(Leukemia) 51.91±14.51
CCRF-CEM 백혈병(Leukemia) 10.95±0.67
K-562 백혈병(Leukemia) 63.86±0.37
SR 백혈병(Leukemia) 13.16±2.75
SK-MEL-5 흑색종(Melanomas) 65.14±6.31
SNU-1 위암(Stomach Cancer) 68.46±7.29
SNU638 위암(Stomach Cancer) 55.32±0.35
AGS 위암(Stomach Cancer) 57.73±3.20
KM12(SM) 대장암(Colon Cancer) 56.75±1.28
COLO205 대장암(Colon Cancer) 40.41±3.47
NCI-H460 폐암(Lung Cancer) 25.43±1.59
NCI-H23 폐암(Lung Cancer) 78.75±1.10
MDA-MB-468 유방암(Breast Cancer) 24.39±2.34
SK-OV-3 난소암(Ovarian Cancer) 76.68±0.22
HT-1080 섬유육종(Fibrosarcoma) 10.43±1.70
PC-3 전립선암(Prostate Cancer) 77.23±4.37
Hep3B2.1-7 간암(Liver Cancer) 77.19±6.65
상기 실험 결과 비쭈기나무 추출물은 혈관내피세포의 생존율에는 영향을 미치지 않으면서 세포증식을 효과적으로 억제하며 또한 신생혈관(angiogenesis)에 필수적인 migration을 억제하였다. 그 결과 혈관생성(Tube formation)이 억제되는 것을 확인하였다. 또한 비쭈기나무 추출물은 다양한 암세포종에서 세포독성을 나타냈는바, 효과적인 암의 예방 또는 치료제로서 작용할 것으로 기대된다.

Claims (10)

  1. 비쭈기나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 비쭈기나무 잎 추출물은 비쭈기나무 잎 물, C1-4 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출하여 제조되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 혈관신생 관련 질환은 암, 당뇨병성 망막증, 연령관련 황반변성, 류마티스관절염, 자궁내막증, 건선 또는 만성염증인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 암은 백혈병, 폐암, 대장암, 전립선암, 위암, 섬유육종, 간암, 흑색종, 유방암, 신장암 또는 난소암인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  6. 비쭈기나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 비쭈기나무 잎 추출물은 비쭈기나무 잎을 물, C1-4 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출하여 제조되는 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.
  8. 삭제
  9. 제6항에 있어서, 상기 혈관신생 관련 질환은 암, 당뇨병성 망막증, 연령관련 황반변성, 류마티스관절염, 자궁내막증, 건선 또는 만성염증인 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 암은 백혈병, 폐암, 대장암, 전립선암, 위암, 섬유육종, 간암, 흑색종, 유방암, 신장암 또는 난소암인 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.





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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Cancer Letters, Vol. 251, pp.132-145 (2007) *
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Leukemia, Vol.18, pp.1406-1412 (2004) *
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제주대학교 대학원 석사학위논문, 김정은, "비쭈기나무 가지로부터 항산화, 미백 및 주름개선 활성 성분 규명", (2011) *
제주대학교 대학원 석사학위논문, 김정은, "비쭈기나무 가지로부터 항산화, 미백 및 주름개선 활성 성분 규명", (2011)*

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