KR101422121B1 - 광조건 및 배지조건 최적화를 통한 노랑다발 동충하초 균사체 배양방법 - Google Patents

광조건 및 배지조건 최적화를 통한 노랑다발 동충하초 균사체 배양방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 광조건 및 배지조건 최적화를 통한 노랑다발 동충하초 균사체 배양방법에 관한 것으로서, 땅콩 분말, 호두 분말 및 잣 분말 포함하는 노랑다발 동충하초(Cordyceps bassiana) 균사체 배양 배지를 제공하고, 상기 배양 배지에 노랑다발 동충하초를 빛이 없는 암조건에서 배양하는 노랑다발 동충하초(Cordyceps bassiana) 균사체 배양 방법을 제공한다. 상기 배지 조건과 배양 방법은 시토스테롤(sitosterol) 및 스쿠알렌(squalene) 생산을 증가시키는 것을 특징으로 하고, 독성물질인 뷰베리신(beauvericin) 및 엔니아틴 B(enniatin B) 생산을 감소 또는 저해시키는 것을 특징으로 한다.

Description

광조건 및 배지조건 최적화를 통한 노랑다발 동충하초 균사체 배양방법{Method for culturing of Cordyceps bassiana mycellium by optimization of light and medium conditions}
본 발명은 광조건 및 배지조건 최적화를 통한 노랑다발 동충하초(Cordyceps bassiana) 균사체 배양방법에 관한 것으로서, 광조건, 암조건 및 철(Fe)과 견과류를 포함하는 배지에서 배양하여 노랑다발 동충하초 균사체 내에서 시토스테롤(sitosterol)과 스쿠알렌(squalene)과 같은 생리활성물질 생산을 증가시키고, 뷰베리신(beauvericin)과 엔니아틴 B(enniatin B)와 같은 독성물질 생산을 감소시키는 방법에 관한 것이다.
동충하초는 곤충을 기주로 하여 충체 전반에 자실체를 형성하는 버섯으로서, 동물성인 기주와 식물성인 자실체로 이루어진다. 노랑다발 동충하초(Cordyceps bassiana)는 대량생산을 위한 인공재배 연구가 최근에 진행되고 있고, 다당류(polysaccharide), 에르고스테롤(ergosterol), 만니톨(mannitol), 뷰베리신(beauvericin), 바시아크리딘(bassiacridin), 바시아놀리드(bassianolide), 엔니아틴(enniatin) 등의 생리활성 물질을 함유하고 있다. 따라서, 항산화, 항바이러스, 항암, 면역기능 강화, 고혈압, 뇌졸중, 피부질환 개선효과가 있다고 알려져 있고, 노랑다발 동충하초 균주가 생산하는 뷰베리신(beauvericin)과 엔니아틴(enniatin)은 곤충, 박테리아, 곰팡이, 사람 세포 등에 세포독성 물질로 알려져 있다.
노랑다발 동충하초 균주의 변이를 이용하여, 테넬린(tenellin), 바시아닌(bassianin), 우스포레인(oosporein) 등 유용색소 성분이 생산되는 배지 조성에 대한 연구 보고가 있으며, 곰팡이 배양에 있어서, 배지에 지방(lipid)과 철(iron) 을 첨가하여 배양하면 2차 대사산물의 생산이 조절된다고 보고되기도 하였다. 그러나, 노랑다발 동충하초 균사체 배양에 있어서, 암조건과 광조건 및 견과류와 철을 첨가한 배지조성이 2차 대사산물 생성에 영향을 미친다는 연구는 아직까지 알려지지 않았다.
한편, 한국등록특허 제10-0465283호는 동충하초 균사체 및 그 배양방법에 관한 것으로서, 동충하초(Cordyceps sinensis)의 인공 배양 균사체 및 그 배양 방법에 관한 것으로, 인공 배양 동충하초 균사체(Cordyceps sinense JEO-7, KFCC 11292)를 제공하며, 또한 천연 동충하초의 균사체를 밀겨 또는 콩가루 배지에 접종한 후, 7일 이상 23 내지 26℃의 온도로 배양하는 단계를 포함한 배양 방법을 제공하고, 인공 배양 동충하초는 천연 동충하초보다 그 성분 및 미량원소 함량이 우월하며, 빠른 기간내에 상기 동충하초를 대량으로 생산하는 것이 가능하다고 개시하고 있으나, 견과류를 포함한 배지에서의 노랑다발 동충하초(Cordyceps bassiana) 균사체 배양에 대한 언급은 없다.
본 발명의 목적은 땅콩 분말, 호두 분말 및 잣 분말 포함하는 노랑다발 동충하초(Cordyceps bassiana) 균사체 배양 배지를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 배양 배지에 노랑다발 동충하초를 빛이 없는 암조건에서 배양하는 노랑다발 동충하초(Cordyceps bassiana) 균사체 배양 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 암조건과 광조건 및 견과류와 철을 첨가한 배지조성이 노랑다발 동충하초(Cordyceps bassiana) 균사체 배양에서 2차 대사산물의 생성 및 독성물질 생성에 영향을 줄 수 있는지에 대해 연구하고, 이러한 연구결과를 바탕으로 노랑다발 동충하초 균사체에서 시토스테롤(sitosterol)과 스쿠알렌(squalene)과 같은 생리활성물질 생산을 증가시키고, 뷰베리신(beauvericin)과 엔니아틴 B(enniatin B)와 같은 독성물질 생산을 감소시키는 방법을 개발하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 땅콩 분말, 호두 분말 및 잣 분말 포함하는 노랑다발 동충하초(Cordyceps bassiana) 균사체 배양 배지를 제공한다. 상세하게는, 상기 배양 배지는 배지 100 중량부에 대하여 땅콩 분말 2g 내지 5g 중량부, 호두 분말 2g 내지 5g 중량부 및 잣 분말 2g 내지 5g 중량부를 포함하는 것을 특징으로 한다. 보다 상세하게는, 상기 배양 배지는 배지 1L 당 땅콩 분말 3.4g, 호두 분말 3.4g, 잣 분말 3.4g 및 아가(Agar) 15g을 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 노랑다발 동충하초(Cordyceps bassiana)를 배지에 배양하여 포자를 형성하는 단계; 상기 배양 배지에 상기 형성된 포자를 접종하는 단계; 및
상기 접종된 포자를 빛이 없는 암조건에서 배양하는 단계를 포함하는 노랑다발 동충하초(Cordyceps bassiana) 균사체 배양 방법을 제공한다. 상세하게는, 상기 암조건에서 배양하는 단계는 20 내지 30 ℃ 에서 2일 내지 7일 동안 배양하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 노랑다발 동충하초(Cordyceps bassiana) 균사체 배양 배지 및 배양 방법은 시토스테롤(sitosterol) 및 스쿠알렌(squalene) 생산을 증가시키는 것을 특징으로 하고, 노랑다발 동충하초에서 생산되는 것으로 알려진 독성물질인 뷰베리신(beauvericin) 및 엔니아틴 B(enniatin B) 생산을 감소 또는 저해시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, "시토스테롤(sitosterol)"은 분자량 414.72, 화학식 C29H50O이고, 식물계에 가장 널리 분포하는 대표적인 식물스테롤로서, α-시토스테롤, β-시토스테롤, γ-시토스테롤의 혼합물로 존재한다. 콜레스테롤 생합성의 중간체인 스콸렌에서 시클로아르테놀 등을 거쳐 생합성된다. 초식성 곤충(누에 등)은 시토스테롤의 곁사슬로 있는 에틸기를 절단해서 필요한 콜레스테롤을 합성한다. 시토스테롤은 항균 효과에 의한 잇몸 염증 감소 및 세균에 대한 저항력을 증가시키는 것으로 알려져 있다.
본 발명에 있어서, "스쿠알렌(squalene)"은 분자량 410.73, 화학식 C30H50이고, 심해 상어간유에서 발견되는 불포화탄화수소이고 테르펜(terpene)의 하나이다. 스쿠알렌은 무색투명, 무미, 무취의 액체로 불포화결합이 없고, 열안정성이 우수하며, 안전성이 높고, 피부에 대한 침투성 및 윤활성에 뛰어나므로 거의 화장품의 기제로 사용되고, 또한 연고, 좌약 등의 약품에서 약제의 피부에의 흡수를 높일 목적으로 사용되고 있다. 또한 기체 크로마토그래피의 고정상 액체로서도 사용된다.
본 발명에 있어서, "뷰베리신(beauvericin)"은 분자량 738.95, 화학식 C45H57N3O9이고, 고리형 뎁시펩타이드(depsipeptide)로 알려져 있다. 세포자살(apoptosis) 비슷한 세포의 프로그램화된 사멸 야기와 DNA 조각화에 따른 세포 용해 등이 그 주요 독성으로 보고된다. 한편, 동물 실험에서 심박동수를 감소시키거나 심장 수축력을 약화시킨다는 연구결과가 있다.
본 발명에 있어서, "엔니아틴 B(enniatin B)" 는 분자량 639.8, 화학식 C33H57N3O9이고, 곰팡이인 푸사리움(Fusarium) 종에 의해 생산되는 식물 독소로서 보고되었다. 엔니아틴 B는 사람 또는 동물 유래 세포에 세포 독성이 있는 것으로 알려지고 있다.
본 발명은 광조건, 암조건 및 철(Fe)과 견과류를 포함하는 배지 조건에서 노랑다발 동충하초(Cordyceps bassiana) 균사체의 배양방법에 관한 것으로서, 본 발명에 따라 노랑다발 동충하초를 배양하면 시토스테롤(sitosterol)과 스쿠알렌(squalene)과 같은 생리활성물질 생산은 증가시키고, 동시에 뷰베리신(beauvericin)과 엔니아틴 B(enniatin B)와 같은 독성물질 생산은 감소 또는 저해시키므로, 식품 및 의약품 소재로서의 활용이 가능하다.
도 1은 배양조건별 균사체의 특징을 나타내는 그림이다. A는 암조건 (SD), B는 광조건 (SL), C는 리피드 조건 (ND), D는 철 조건 (FD)을 나타내고, 왼쪽 판은 배양 판의 앞쪽을 나타내고, 오른쪽 판은 배양 판의 뒤쪽을 나타낸다.
도 2는 노랑다발동충하초 균사체에 함유하는 대사체의 대사경로를 나타낸 그림이다. 1차대사산물에서 2차대사산물로 변하는 경로를 나타내고 조건별 대사체 함량차이를 보여준다.
도 3a는 70% 메탄올 추출물을 다변량 통계분석으로 처리한 PCA 스코어 플롯을 나타낸 그래프이다 (PC 1을 기준으로 철조건과 리피드 조건이이 광조건과 암조건과 분리된 샘플을 보여준다).
도 3b는 100% 메탄올 추출물을 다변량 통계분석으로 처리한 PCA 스코어 플롯을 나타낸 그래프이다 (PC 1을 기준으로 철조건과 리피드 조건이이 광조건과 암조건과 분리된 샘플을 보여준다).
이하, 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1 > 노랑다발 동충하초( Cordyceps bassiana ) 균주 배양
노랑다발 동충하초(Cordyceps bassiana) 균주는 주식회사 머쉬텍(춘천, 한국)에서 제공받아 사용하였다. 접종원은 사보드덱스트로즈 브로스(SDAY) 배지에 배양하여 포자를 형성 한 후, 동일한 농도로 고체 배지에 접종하였고, 노랑다발 동충하초의 균주는 배양조건 및 배지 조성을 달리하여 배양하였다. SDAY 배지를 노랑다발 동충하초 배양 기본 배지로 사용하였고 SDAY 배지 조성에 광조건(SL), SDAY 배지 조성에 암조건(SD), SDAY에 Fe3 + 을 첨가한 철 배지 조건(FD), 아가(agar) 배지에 분쇄한 땅콩, 호두, 잣을 각각 3.4 g씩 혼합 첨가한 리피드 배지 조건(ND)을 이용하였다(표 1). 노랑다발 동충하초 균주의 광조건 배양은 3,000 lux 빛 조건을 주었고, 암조건은 빛이 없는 상태에서 배양하였다. 각 조건의 배양은 25℃ 인큐베이터에서 3일간 배양 후 균사체를 수확하여 분석에 이용하였다. 수득된 샘플은 24 시간 동안 동결 건조하였고(FDU-1200, EYELA, 일본), -80℃에 보관하여 분석에 이용하였다.
배지 배지 조성(g/l) 광조건 약어
덱스트로스
(Dextrose)		 프로톤
(Protone)		 효모
추출물		 아가
(Agar)		 철-
EDTA		 호두
분말		 땅콩
분말		 잣
분말		 암/명
SDAY 20 5 5 15 암 SD
SDAY 20 5 5 15 명 SL
Nut 15 3.4 3.4 3.4 암 ND
철-
첨가된
SDAY		 20 5 5 30 42.1 암 FD
< 실시예 2 > 노랑다발 동충하초( Cordyceps bassiana ) 균사체 추출물 분석
1. 가스크로마토그래피-매스(GC-MS) 분석을 위한 샘플 준비
각각 다른 조건에서 배양한 균사체 시료 20 mg을 에펜도르프튜브에 넣고, 70％ 메탄올 1 ml와 100％ 노르말 헥산 1 ml로 각각 추출하였다. 샘플을 볼텍싱하고 실온에서 30분간 방치 후 40분 동안 초음파처리를 하였다. 이 후 튜브를 10분 동안 2,000rpm에서 원심분리하였고, 상층액을 분리하여 0.45 ㎛ 필터(Acrodisc Syringe Filters, Pall Corporation, 미국)로 여과하였다. 각 샘플 100 ㎕를 취하여 유리 바이알(vial)에 옮기고 질소가스로 용매를 완전히 건조시킨 후, 옥심화 반응을 위해 피리딘-메톡실아민 하이드로 클로라이드(20,000 ㎍/㎖) 30 ㎕를 첨가하였다. 여기에 BSTFA 200 ㎕와 1% TMCS(N,O-비스 트리메킬실릴 트리프로로아세트아마이드, Alfa Aesar, 미국)를 첨가하고 내부표준 물질로 클로로나프탈렌 10 ㎕를 첨가하여 60℃에서 30분 동안 반응시켰다. 반응 후 즉시 GC-MS를 위한 GC 바이알로 옮겼다.
2. 가스크로마토그래피-매스 시스템
자동 샘플러(7683 B series, Agilent Technologies, 미국), 분할식 모세 분리관 주입장치, 주입 모듈 및 켐스테이션 소프트웨어를 탑재한 Agilent GC (7890A, Agilent Technologies. 미국) 모델에 MSD 디텍터 (5975 C, Agilent Technologies, 미국)를 이용하여 샘플을 분석하였다. 주입구 온도는 250℃, 주입 볼륨 1.0 ㎕ 및 운반기체로 헬륨가스를 사용하였고, 1.0 ㎖/분 속도로 일정하게 흘려주었다. 디텍터 전압은 1529 V, 보조온도 280℃, 매스 원천 온도는 280℃, 매스 쿼드 온도는 150℃로 세팅하였다. 메스 범위는 70% 메탄올 추출물은 50-700 Da 이고, 100% 노르말 헥산 추출물은 50-600 Da 범위에서 분석하였고, 데이터는 전체 스캔 모드 메스 디텍터에서 수집하였다. 크기가 30 m X 0.25 mm i.d.X 0.25 인 5% 페닐 메틸폴리실록산 용융 실리카 모세관 컬럼을 사용하여 분석하였다. 70% 메탄올 추출 시료 분석을 위한 초기 오븐 온도는 60℃로 3분간 고정하였고, 60-180℃ 에서 5℃/분, 180-300℃에서 10℃/분으로 3분 동안 고정하였고, 300-320℃에서 15℃/분으로 3분 동안 고정하였다. 100% 노르말 헥산 추출물 분석을 위한 오븐 조건은 80-260℃ 에서 5℃/분, 260-300℃에서 3℃/분으로 3분 동안 고정하였다. 화합물의 매스 스펙트럼은 NIST-Wiley 메스 스펙트럼 라이브러리와 비교하여 80% 이상 일치하는 것을 확인하였다.
3, 질량분석 데이터 프로세싱
가스크로마토그래피 질량분석 스펙트라 데이터 처리는 AMDIS (Automated Mass Spectral Deconvolution and Identification System, http://chemdata.nist.gov/mass-spc/amdis/) 프로그램을 이용하였다. AMDIS 프로그램의 설정은 component width=18, adjacent peaks subtraction=1, medium resolution, medium sensitivity, and medium shape requirement로 파라미터(parameter)를 조절하여 피크 데콘볼루션(peak deconvolution)을 수행하였다. 피크 데콘볼루션(peak deconvolution) 수행 후 얻어진 ELU 파일을 SpectConnect (SpectConnect, http://spectconnect.mit.edu) 프로그램을 이용하여 성분들(components)에 대한 세기(intensity)를 얻어 내부 표준 세기(internal standard intensity) 값으로 나누어 표준화(normalization) 하여 질량 스펙트랄(mass spectral) 데이터를 처리하였다. SIMCA (Umetrics, Sweden) 프로그램을 이용하여 PCA(principal component analysis), PLS-DA(least squares discriminant analysis)를 수행하였다.
4. 액체크로마토그래피-매스 시스템에 의한 뷰베리신(beauvericin)과 엔니아틴 B(enniatin B) 분석
뷰베리신(beauvericin)와 엔니아틴 B(enniatin B) 표준품은 100ug/ml 농도로 HPLC용 메탄올을 사용하여 제조하였고, 균사체 시료 20mg,을 70% 메탄올 추출하여 분석시료로 사용하였다. 대사체 분석은 시넵 쿼도로플 토프 질량분석기(Synapt quadrupole-TOF MS) 장비에 연결된 UPLC-photodiode array(PDA)에서 실시했다. 컬럼은 C18 column (100×2.1mm I.d., 1.7)을 사용하였고, 이동상 A는 물에 0.1% 포름산을 첨가하고, 이동상 B는 아세토니트릴에 0.1% 포름산을 첨가하여 사용하였다. 이동상의 유속은 0.4mL/min의 일정한 속도에서 흘려주었고, 이동상 조성 시스템은 A용매를 0.5분 동안 97% 흘리고 14.5분 동안 97-50%, 3분 동안 50-10%, 0.5분 동안에 초기 상태 97%로 2.5분 동안 97% 용매조건으로 컨디셔닝하여 전체 분석시간은 22분이었다. 컬럼 온도는 25℃로 유지하였고, 액체크로마토그래피의 UV 검출기 파장은 210에서 500 nm 사이 값을 사용하였다. LC-MS 분석 전기분무이온화 방식(electrospray interface source; ESI-positive)으로 수행하였다. 케필러리 전압 3.0KV, 콘 전압 20-40eV, 트랩 콜리전 에너지 3.5eV, 트랜스(transfer) 콜리전 에너지 4.0eV으로 설정하였고, 질소 가스는 콜리전 가스로서 사용하였고, 질량 범위(m/z)는 50-1,500Da으로 분석하였다. LC-MS분석에서 시료 주입량은 2였다. UPLC-PDA-qTOF-MS 분석으로부터 획득된 크로마토그램(chromatogram)의 피크(peak)는 정량과 정성분석을 위해 매스링스(MassLynx) 와 마커링스(MarkerLynx v4.1) 소프트웨어에 의해 처리되었다. 다음의 세트 매개변수는 처리과정을 위해 사용되었다; noise elimination level; 0, mass window; 0.04, retention time window; 0.2, 초기 retention time; 0분, 마지막 retention time; 22분으로 설정하였다.
5. 주성분 분석(Principal component analysis; PCA) 및 ANOVA
대사물질의 양적 차이는 PASW 통계학 18 소프트웨어(IBM, somer, 미국)를 이용하여 터키 방법에 따른 ANOVA를 사용하여 분석하였다. 통계학적 유의성은 p < 0.05 이하로 세팅하였다. PCA 통계 분석은 SIMCA-P 소프트웨어(version 12.0, Umetrics, Ume, 스웨덴)를 사용하였다.
6. 결과
(1) 배양조건별 균사체의 형태학적 특징
노랑다발 동충하초의 배양조건별 균사체의 형태학적 특징은 도 1에 나타내었다. 리피드 (ND) 조건에서 다른 조건에 비해 균체의 성장이 늦었고, 모든 조건의 균체의 겉표면은 흰색을 나타내었다. 암(SD) 조건, 광(SL), 철 (FD) 조건 배양의 균에서는 밝은 노랑색에서 짙은 오렌지색의 콜로니(colony)가 관찰되었고, 암조건과 광조건의 콜로니의 특징은 유사하게 나타났으며, 철조건과 리피드 조건은 균사체의 배양형태가 다르게 나타났다.
(2) 노랑다발 동충하초 배양조건이 균사체 대사체 프로파일에 미치는 영향
다른 조건하에서 배양한 균사체를 70% 메탄올에서 추출하여 극성 대사체들을 얻은 후에 GC-MS를 이용하여 분석하였다. 그 결과들은 표 2에 나타내었다. 대사체들을 아미노산, 유기산, 퓨린, 알코올, 당을 포함한 몇 가지의 그룹으로 나누었다. asparagine, aspartic acid, glutamic acid, glutamine, histidine, lysine, ornithine, proline 같은 아미노산의 대사체들의 함유량은 SD 와 SL 조건하에서 더 높게 나타났다. 아데노신은 ND 와 FD 조건하에서 보다 SD 와 SL 조건하에서 더 높게 나타났다. glucitol, glycerol, mannitol, inositol, diethylene glycol 같은 알코올의 대부분과 γ-aminobutyric aicd, succinic acid의 높은 함유량은 ND 조건하에서 얻었다. 견과류 오일들이 생물학적 대사체의 생산을 조절한다는 것이 이전에 보고된 바 있다. aminomalonic acid, malic acid, mannonic acid 같은 유기산의 높은 함유량은 FD 조건하에서 관찰되었다. 또한 erythritol의 함유량은 다른 조건에서 보다 FD 조건하에서 상당히 높았다. ND 와 FD 조건하에서 보다 SD 와 SL 조건하에서 당, 퓨린, 아미노산의 함유량이 더 높은 반면에 알코올의 함유량은 ND 와 FD 조건하에서 더 높게 관찰되었다.
노랑다발 동충하초 균사체의 70% 메탄올 추출물에 대한 GC-MS 프로파일
화합물 보유시간
(Retention time)
(min)		 상대적 세기
(Relative intensity)
SD SL ND FD
Amino acids
Acetyl lysine 12.73 6.18±0.62a ND ND 10.41±0.43b
Alanine 18.66 0.14±0.03ab 0.15±0.01b 0.09±0.01ac 0.08±0.01c
Asparagine 25.64 0.64±0.10a 0.89±0.05b 0.38±0.04c ND
Aspartic acid 21.71 4.86±0.68a 7.49±0.08b 0.95±0.16c 1.75±0.19c
Carbamic acid 11.62 ND ND 0.14±0.01 ND
Glutamic acid 24.45 2.57±0.30a 0.87±0.03b 0.46±0.40b 0.62±0.04b
Glutamine 28.08 22.30±2.45a 20.39±1.10a 11.77±0.51b 10.92±0.67b
Glycine 14.00
20.06		 2.10±0.32a 1.79±0.08ab 1.66±0.26ab 1.43±0.06b
Histidine 31.11 1.67±0.22a 1.39±0.08ab 1.06±0.18b ND
Homoserine 19.49 0.05±0.01a 0.10±0.00b 0.06±0.01a 0.18±0.02c
Isoleucine 13.58 0.57±0.08a 0.33±0.28a 0.64±0.10a 0.60±0.04a
Lysine 26.58
31.24		 10.66±0.76a 6.66±0.47b 1.08±0.21c 1.29±0.06c
Ornithine 24.31
28.99		 7.16±0.52a 9.67±0.67b 5.77±1.09a 0.28±0.00c
Proline 13.70
21.68		 26.54±2.94a 29.48±1.56a 16.15±3.01b 4.19±0.14c
Serine 16.21 0.10±0.01a 0.11±0.01a ND 0.29±0.25a
Threonine 17.20 2.26±0.30a 2.72±0.13ab 1.16±0.20c 3.02±0.08b
Tyrosine 31.55 0.85±0.12a 0.72±0.03a 1.32±0.25b 0.63±0.09a
Valine 10.67 1.77±0.26a 1.27±0.07ab 1.59±0.30ab 1.07±0.03b
Tryptophan 36.62 0.58±0.06a 0.34±0.02b 0.42±0.08b ND
Cysteine 22.63 0.07±0.02a 0.05±0.01b 0.03±0.01b ND
Organic acids
Aminomalonic acid 20.08 0.08±0.02a 0.07±0.01a 0.04±0.03a 1.63±0.30b
γ-Aminobutyric acid 9.22
21.88		 1.00±0.13a 1.73±0.10ab 3.44±0.63c 2.53±0.03b
Fumaric acid 15.93 0.31±0.05a 0.26±0.01a 0.17±0.03b ND
Malic acid 20.77 2.00±0.33a 2.32±0.13ab 1.34±0.26a 4.17±1.39c
Succinic acid 14.50
19.04		 0.84±0.11a 0.60±0.03a 1.94±0.35b 1.73±0.03b
Mannonic acid 31.85 0.06±0.01a 0.01±0.02b ND 0.12±0.00c
Citric acid 29.10 11.70±1.68a 7.45±0.36b 10.63±1.35a 7.23±0.39b
Purines
1H-purine 34.66 ND ND 0.07±0.01a 0.04±0.02b
9H-purine 28.70
30.00
33.10
42.48		 0.55±0.08a 0.69±0.03b ND 0.28±0.04c
Adenosine 46.00 0.19±0.06a 0.21±0.02a 0.05±0.04b ND
2,4-O-uracil 15.26 0.04±0.00a 0.08±0.00a 0.17±0.03b 0.20±0.03b
Alcohols
Arabitol 26.84 0.18±0.03a 0.09±0.01b 0.27±0.05c 0.23±0.01ac
Erythritol 21.37 0.26±0.04a 3.96±0.19b 0.50±0.08a 26.27±0.56c
Glucitol 31.60
36.58		 0.33±0.05a 0.06±0.05a 5.29±1.01b 0.99±0.45a
Glycerol 12.90 0.07±0.01a 0.08±0.00a 2.90±0.54b 0.23±0.00a
Mannitol 31.39
41.01		 51.47±5.47a 56.69±2.17ab 80.82±8.79c 66.66±4.28bc
Inositol 34.38 0.64±0.08a 0.74±0.04a 3.17±0.64b 1.46±0.06a
Diethylene glycol 11.75 4.87±0.75a 4.73±0.08a 6.76±0.92b 4.58±0.05a
Triethylene glycol 41.49 0.04±0.01a 0.05±0.00a 0.05±0.00a 0.04±0.00a
Sugars
Furanone 18.56 ND ND ND 0.06±0.00
Maltose 42.84 0.07±0.01a 0.04±0.04a ND ND
Glucose 30.53
32.42
39.24
40.47
44.81		 95.63±7.55a 97.01±3.30a 0.45±0.07b 24.16±0.73c
Mannose 31.04
30.68		 1.12±0.15a 0.94±0.12a 0.25±0.04b 0.44±0.00c
Xylofuranose 29.62 0.99±0.07a 0.99±0.18a ND 2.75±0.38b
다양한 조건하에서 배양된 노랑다발 동충하초(C. bassinia) 균사체의 100% n-헥산 추출물에서 비극성 대사체들 또한 GC-MS 분석을 통해서 측정되었다(표 3). 포화 지방산, 불포화 지방산, 지방산 에스터, 스테롤, 테르펜은 주요한 화합물 그룹으로 동정되었다. 표 3에서 보여지는 것처럼 saturated fatty acids, unsaturated fatty acids, fatty acid esters, sterols and terpenes ( ergosterol 과 propyl stearic acid를 제외한 ) 은 다른 조건들에서 보다 ND 조건하에서 상당히 높았다. ND 조건하에서 검출된 주요한 fatty acids들은 arachidic acid (C20:0), behenic acid (C22:0), palmitic acid (C16:0), stearic acid(C18:0), eicoenoic acid (C20:1), linoleic acid (C18:2), and oleic acid (C18:1) 였다. 주요한 fatty acids들 중에서 palmitic acid, stearic acid, oleic acid 및 linoleic acid들은 필수 fatty acids 과 바이오디젤을 합성하기 위한 적합한 화합물들로 잘 알려져 있다. 이들 주요 fatty acids들은 ND 조건하에서 지배적으로 나타나는 fatty acids 였다. 게다가 squalene은 ergosterol 생합성 단계의 중간생성물이고 비타민 D2 전구체인 ergosterol은 균류의 톡특한 sterol 이다. Squalene 과 sitosterol 은 ND 조건하에서 오직 관찰되었다. 그러나 ergosterol의 함유량은 조건에 따라서 큰 차이를 나타내지 않았다(표 3, 도 2). Ergosterol은 균류의 세포막에 있어서 중요한 화합물이고 ND, FD, SL, SD 조건하에서 Ergosterol의 높은 함유량은 세포 유지를 위해서 합성된 것으로 예측할 수 있다. ND 조건하에서 전반적으로 증가된 지질 생산은 야기된 지질 대사체 경로에 의한 것으로 예측된다. ND 조건에서는 노랑다발 동충하초(C. bassinia) 균사체 배양에 있어서 바이오디젤 생산을 위한 전구체 화합물이나 생물활성 지질을 생산하기 위해 적합한 것처럼 보인다. 그러나 노랑다발 동충하초(C. bassinia) 균사체의 성장 속도는 다른 배양조건에서 보다 ND조건하에서 더 늦게 자랐다. 따라서 미래의 연구는 지질 화합물의 증가된 생산성을 위해 FD, SL 또는 SD 같은 다른 조건과 ND 배양조건을 융합시킨 2단계의 배양 전략이 적용되어야할 것 같다. 대사체 프로파일링은 노랑다발 동충하초(C. bassinia) 균사체에 대해 다른 조건하에서 그들의 대사체 반응을 결정하기 위해 수행되었다. 관찰된 결과들은 광 조건과 적합한 다른 배양배지를 적용함으로서 노랑다발 동충하초(C. bassinia) 균사체 배양으로부터 극성과 비극성 대사체 생산을 조절할 수 있을 것이라 제안한다. SD 와 SL 조건들 하에서 amino acids, organic acids 및 beauvericin들의 함유량은 더 높게 나타났고 SD 와 SL 조건에서 전반적인 대사체 프로파일은 구별되지 않았다. ND 조건은 γ-aminobutyric acid 과 succinic acid같은 organic acids 그리고 fatty acids, sterols, and terpenes같은 lipid 생산에 더 적합했다. FD 조건은 erythritol의 생산성을 증가하기 위해 더 적합했다. 이러한 연구결과들은 적합한 배양 조건을 적용함으로서 노랑다발 동충하초(C. bassinia) 균사체에서 특정한 기능적 대사체를 생산하는데 적용될 수 있다는 것을 제시한다.
노랑다발 동충하초 균사체의 100% n-헥산 추출물에 대한 GC-MS 프로파일
화합물 보유시간
(Retention time)
(min)		 상대적 세기
(Relative intensity)
SD SL ND FD
Saturated fatty acids
Arachidic acid 34.25 ND ND 19.34±0.26a 0.34±0.29b
Behenic acid 37.34 ND ND 16.24±0.64a 0.50±0.03b
Margaric acid 29.23 ND ND 3.08±0.03 ND
Lauric acid 19.34 0.43±0.01a 0.49±0.02b 0.58±0.02c 0.48±0.01b
Myristic acid 33.49 1.08±0.01a 0.89±0.04b 1.21±0.02c 0.93±0.05b
Pentadecylic acid 24.96 ND ND 1.33±0.01 ND
Palmitic acid 25.11
27.41		 8.61±0.75a 10.60±1.38a 174.91±7.54a 11.14±0.38b
Stearic acid 30.97 4.65±0.25a 5.41±0.18a 106.92±1.53b 6.32±0.25a
Unsaturated fatty acids
Eicosadienoic acid 33.77 ND ND 3.88±0.90 ND
Eicosenoic acid 33.83 ND ND 13.28±0.23a 0.37±0.03b
Mead acid 33.31 ND ND 3.80±0.17 ND
Linoleic acid 30.38 5.22±0.36a 6.63±1.30a 77.33±35.86b 16.52±1.80a
Oleic acid 30.57 9.81±1.45a 11.07±3.94a 266.11±73.79b 11.71±0.60a
Palmitoleic acid 27.01 0.64±0.12a 0.82±0.31a 0.74±0.13a ND
Fatty acid esters
Propyl stearic acid 39.64 46.81±2.45a 41.78±0.63b 49.07±1.76a 39.28±1.07b
Ethyl linoleic acid 29.53 ND ND 1.32±0.03 ND
Ethyl oleic acid 29.66 ND ND 0.87±0.01 ND
Ethyl palmitic acid 26.44 ND ND 0.50±0.03 ND
Methyl linoleic acid 28.31 ND ND 7.90±0.18 ND
Methyl oleic acid 28.44 ND ND 4.99±0.06 ND
Methyl stearic acid 28.93 ND ND 1.02±0.05 ND
Sterols
Ergosterol 47.19 7.30±0.96a 9.46±1.17a 8.08±2.01a 8.06±1.07a
Sitosterol 49.07 ND ND 0.94±0.03 ND
Terpene
Squalene 40.19 ND ND 9.99±0.33 ND
도 3은 시료의 대사체 프로파일들은 70% 메탄올 추출물에서 얻은 스펙트럼 자료에 주성분 분석법(PCA)을 적용함으로써 비교했다. 각각의 배양조건에서 노랑다발 동충하초(C. bassinia) 균사체의 대사체 프로파일은 (R2X=0.96, Q2=0.89) 하나의 점으로서 PCA로 유도된 score plot에 나타내었다. SD 와 SL 시료들은 ND 와 FD시료들과 PC 1에의해 명백히 분리되지 않았다. ND와 FD 조건들은 PC 2에 의해 주로 분리되었다. SD 와 SL조건의 시료는 유사한 프로파일링을 나타내었다. 100% 헥산 추출물은 PCA score plot에서 PC 1로 ND 조건이 다른 조건과 분리됨(R2X=0.99, Q2=0.91)을 확인하였다
(3) LC-MS를 이용한 뷰베리신(beauvericin) 과 엔니아틴 B(enniatin B) 상대적 함량 비교
LC-MS를 이용하여 뷰베리신(beauvericin) 과 엔니아틴 B(enniatin B)의 상대적인 함량을 분석하였다(표 4). 엔니아틴 B(enniatin B)는 640-196 m/z의 mass transition fragment patterns을 가지고 뷰베리신(beauvericin)은 784-244 m/z mass transition fragment pattern을 가지는 것으로 동정되었다. 엔니아틴 B(enniatin B)는 노랑다발 동충하초에서 생산되는 독소로 알려져 있으나, 엔니아틴 B(enniatin B)는 모든 시료에서 검출되지 않았다. 따라서 상기 배양조건은 엔니아틴 B(enniatin B)의 생산을 저해하는 것으로 생각된다. 또한, 뷰베리신(beauvericin)은 ND 조건에서만 검출되지 않았다. 따라서 ND 조건이 뷰베리신(beauvericin) 생산을 저해하는 것으로 생각된다. 결과적으로, ND 조건은 뷰베리신(beauvericin) 과 엔니아틴 B(enniatin B)를 감소 또는 저해하는데 효과적인 것으로 나타났다.
LC-MS 분석기기를 이용한 노랑다발 동충하초 균사체의 70% 메탄올 추출물에 함유된 엔니아틴 B(enniatin B) 와 뷰베리신(beauvericin)의 상대적 함량비교
화합물 RT
(min)		 전이
(Transition) (m/z)a 		상대적 샘플 세기
(Relative sample intensity)
SD SL ND FD
Enniatin B 17.9 640 → 196 ND ND ND ND
Beauvericin 18.3 784 → 244 1.99±0.27a 1.61±0.05ab ND 1.41±0.35b
a모든 전이(transitions)는 [M+H}+로부터 생성

Claims (9)

  1. 땅콩 분말, 호두 분말 및 잣 분말 포함하는 노랑다발 동충하초(Cordyceps bassiana) 균사체 배양 배지.
  2. 제1항에 있어서, 상기 배양 배지는 배지 100 중량부에 대하여 땅콩 분말 2g 내지 5g 중량부, 호두 분말 2g 내지 5g 중량부 및 잣 분말 2g 내지 5g 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는 노랑다발 동충하초(Cordyceps bassiana) 균사체 배양 배지.
  3. 제1항에 있어서, 상기 배양 배지는 배지 1L 당 땅콩 분말 3.4g, 호두 분말 3.4g, 잣 분말 3.4g 및 아가(Agar) 15g을 포함하는 것을 특징으로 하는 노랑다발 동충하초(Cordyceps bassiana) 균사체 배양 배지.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 배지는 시토스테롤(sitosterol) 및 스쿠알렌(squalene) 생산을 증가시키는 것을 특징으로 하는 노랑다발 동충하초(Cordyceps bassiana) 균사체 배양 배지.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 배지는 독성물질인 뷰베리신(beauvericin) 및 엔니아틴 B(enniatin B) 생산을 감소 또는 저해시키는 것을 특징으로 하는 노랑다발 동충하초(Cordyceps bassiana) 균사체 배양 배지.
  6. 노랑다발 동충하초(Cordyceps bassiana)를 배지에 배양하여 포자를 형성하는 단계;
    제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 배양 배지에 상기 형성된 포자를 접종하는 단계; 및
    상기 접종된 포자를 빛이 없는 암조건에서 배양하는 단계를 포함하는 노랑다발 동충하초(Cordyceps bassiana) 균사체 배양 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 암조건에서 배양하는 단계는 20℃ 내지 30℃ 에서 2일 내지 7일 동안 배양하는 것을 특징으로 하는 노랑다발 동충하초(Cordyceps bassiana) 균사체 배양 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 배양 방법은 시토스테롤(sitosterol) 및 스쿠알렌(squalene) 생산을 증가시키는 것을 특징으로 하는 노랑다발 동충하초(Cordyceps bassiana) 균사체 배양 방법.
  9. 제6항에 있어서, 상기 배양 방법은 독성물질인 뷰베리신(beauvericin) 및 엔니아틴 B(enniatin B) 생산을 감소 또는 저해시키는 것을 특징으로 하는 노랑다발 동충하초(Cordyceps bassiana) 균사체 배양 방법.
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