KR101420850B1 - A novel virus like particle of Porcine reproductive and respiratory syndrome virus and vaccine thereof - Google Patents

Abstract

본 발명은 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 바이러스 유사입자 항원 및 이를 유효성분으로 포함하는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 면역원성 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a porcine reproductive-respiratory syndrome virus-like particle antigen and a porcine reproductive-respiratory syndrome virus immunogenic composition comprising it as an active ingredient.

Description

돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 유사입자 및 이를 이용한 백신{A novel virus like particle of Porcine reproductive and respiratory syndrome virus and vaccine thereof}[0001] The present invention relates to a porcine reproductive and respiratory syndrome virus and a vaccine,

본 발명은 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 유사입자 및 이를 유효성분으로 포함하는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 면역원성 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to porcine reproductive / respiratory syndrome virus-like particles and a porcine reproductive / respiratory syndrome virus immunogenic composition comprising the same as an active ingredient.

Porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV, 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스)는 1987년 북미와 유럽에서 처음 보고되었으며, 돼지에게 감염되어 Blue-Ear Pig disease라는 증상을 보이는 바이러스이다. 1991년 처음 명명되었고, 현재는 2 종류의 유전적 형질을 갖고 있는 LV, VR strain을 갖고 있으며 이를 PRRSV라 불려지고 있다. 이 바이러스는 Arteriviridae 에 속하며, positive strand RNA 유전자 형태를 갖고 있다. 이 arterviridae family에 속하는 바이러스들은 Equine arteritis virus, Lactate dehydrogenase elavating virus, Simian hemorrhagic fever virus 그리고 PRRSV가 속한다. PRRSV에 의해서 어린 돼지에게 호흡기 질병을 유발하여 경제적으로 크게 여파를 미치고 있다. 우리나라에서 주로 발생하는 바이러스는 VR 2332 strain으로 보고된바 있다.Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) was first reported in North America and Europe in 1987 and is a virus that is infected with pigs and has the symptoms of Blue-Ear Pig disease. It was first named in 1991 and now has two types of LV and VR strains with genetic traits called PRRSV. This virus belongs to Arteriviridae and has a positive strand RNA gene form. The viruses belonging to this arterviridae family belong to Equine arteritis virus, Lactate dehydrogenase elavating virus, Simian hemorrhagic fever virus and PRRSV. PRRSV induces respiratory disease in young pigs, which is economically significant. Viruses that occur mainly in Korea have been reported as VR 2332 strain.

돼지는 PRRSV 감염 시 항체반응이 빠르게 일어나지만, 중화 항체의 합성은 속도가 느리며, 그 역가도 낮다. 이러한 점은 돼지 개체마다 다양하게 나타난다. PRRSV 감염을 예방하기 위해 약독화된 백신 등이 개발되었으나, 그 효과가 다소 낮아, PRRSV의 감염은 성공적으로 제어되지 못하고 있다. 양돈장에서의 감염 예방 실패의 주요 원인은, 사용이 비교적 간편하면서 정확하고 민감한 PRRSV 감염 진단의 부족이다.In pigs, the antibody reaction occurs rapidly during PRRSV infection, but the synthesis of neutralizing antibodies is slow and vice versa. This varies from pig to pig. In order to prevent PRRSV infection, attenuated vaccines have been developed but the effect of PRRSV has not been successfully controlled. The main reason for the failure to prevent infection in pig farms is the lack of a relatively simple, accurate and sensitive diagnosis of PRRSV infection.

PRRSV는 enveloped virus이며, 전체 유전자 크기는 대략 15kb이며, 9개의 opening reading frame을 갖고 있으며, 이는 ORF 1a, 1b, 2a, 2b, 3-7이다. ORF 1a, 1b는 비구조 단백질이고 ORF 2-7은 GP2a, GP2b, GP3, GP4, GP5, 막/매트릭스 (M) 단백질 및 뉴클로오캡시드 (N) 단백질로서 구도 단백질을 구성한다. 바이러스의 크기는 40~60nm의 직경을 갖고 있다 (도 1).The PRRSV is an enveloped virus with a total gene size of approximately 15 kb and has nine opening reading frames, ORFs 1a, 1b, 2a, 2b and 3-7. ORFs 1a and 1b are nonstructural proteins and ORF 2-7 constitute the constitutive proteins as GP2a, GP2b, GP3, GP4, GP5, membrane / matrix (M) protein and nucleocapsid (N) protein. The virus has a diameter of 40 to 60 nm (Fig. 1).

PRRSV 감염으로 인한 증상은 크게 두 가지로 나눌 수 있는데, 어린 돼지에서의 폐렴 및 높은 사망률과 모돈의 조산, 후기 유산, 분만비율 감소 및 번식 장애 증상이 대표적이다. PRRSV는 Arterivirus에 속하며 15kb의 단일(+) RNA 바이러스이다. 총 9개의 해독틀 (open reading frame:ORF)을 가지며 ORF1 (ORF1a, 1b)은 비구조 단백질, ORF2-7 (GP2, GP3, GP4, GP5, M, N)은 구조 단백질로서 존재한다. 구조단백질 중 GP2, GP3, GP4는 바이러스가 숙주 세포 내로 침입하여 들어갈 때 작용하는 minor 구조단백질이고, GP5, N, M은 major 구조단백질로 작용하는데, 특히 GP5와 M 단백질은 서로 이합체 (dimer)를 형성하여 바이러스의 감염력을 높여주는 역할을 한다고 알려져 있다. PRRSV는 유전자형에 따라 크게 두가지로 나눌수 있으며, 서로 최대 40%정도의 상이한 유전자형을 가진 북아메리카 타입과 유럽 타입이 존재한다. 따라서 각기 다른 타입별로 백신은 생산되었지만, 서로 교차 방어가 안되는 등 효과가 좋지 않아서 백신에 대한 연구가 더 필요한 실정이다.Symptoms due to PRRSV infection can be divided into two major categories: pneumonia in young pigs, high mortality rate, premature sowing, late lactation, reduced delivery rate and reproductive disorder symptoms. PRRSV belongs to Arterivirus and is a 15 kb single (+) RNA virus. ORF1 (ORF1a, 1b) is a nonstructural protein, and ORF2-7 (GP2, GP3, GP4, GP5, M, and N) exists as a structural protein in a total of nine open reading frames (ORFs). Among the structural proteins, GP2, GP3, and GP4 are minor structural proteins that function when the virus enters the host cell and GP5, N, and M act as major structural proteins. GP5 and M proteins, in particular, It is known that it plays a role to increase the infectivity of virus. PRRSV can be broadly divided into two types according to genotype, and North American type and European type which have different genotypes up to 40% each other exist. Therefore, although vaccines are produced for different types, they are not effective in preventing cross protection, so more research on vaccines is needed.

PRRSV의 면역학적 기전에 대해서는 명확히 밝혀지진 않았지만 일단 돼지에 PRRSV가 감염되면 다른 바이러스에 감염되었을 때와 마찬가지로 항체가 만들어지는데, 이 때 만들어지는 항체는 N 단백질에 대한 항체로서 중화능을 가지고 있지 않다. 심지어 이 항체는 PRRSV가 숙주에 감염되는데 용이한 작용을 하기도 한다. PRRSV에 대한 중화능을 가지는 항체는 GP5에 대한 항체로서 이 중화항체가 만들어지기 시작하는 시기는 이미 바이러스가 전신적으로 감염된 후이다. 이 때문에 PRRSV에 대한 중화항체를 빠르게 만들어낼 수 있는지가 바이러스의 감염 및 증식 억제의 가장 중요한 요인이 된다. 또한 PRRSV가 숙주세포를 감염시키면 숙주세포의 면역력을 억제시켜서 2차 세균 감염율을 높여준다. 그러므로 PRRSV에 감염되면 2차 세균 감염까지 더해져 심각한 호흡기 질병을 일으키게 된다.Although the immunological mechanism of PRRSV has not been elucidated yet, once the pig is infected with PRRSV, an antibody is produced as if it had been infected with other viruses. The antibody produced at this time has no neutralizing ability as an antibody against the N protein. Even this antibody has an easy action to infect the host with PRRSV. The neutralizing antibody against PRRSV is an antibody against GP5, and the time when the neutralizing antibody starts to be produced is already after the virus has been systemically infected. Because of this, the ability to rapidly produce neutralizing antibodies against PRRSV is the most important factor for virus infection and proliferation inhibition. In addition, when PRRSV infects host cells, the immunity of the host cells is suppressed and the infection rate of the second bacteria is increased. Therefore, infection with PRRSV adds a second bacterial infection, leading to serious respiratory disease.

현재 개발된 PRRSV에 대한 백신은 많지만 유전자 돌연변이의 확률이 높은 RNA 바이러스이기 때문에 변이주가 많은 PRRSV의 특성상 불활화 백신은 효과가 좋지 못하고, 생독 백신도 상동성 (homogenus) 바이러스에 대한 방어력은 있어도 이형 (heterogenus) 바이러스에 대해서는 백신으로서의 작용을 하지 못한다. 이러한 실정 때문에 다양한 방법으로 안전성, 면역원성, 및 방어능을 효과적으로 갖춘 백신을 제작하기 위한 시도가 이루어지고 있다. 본 발명자들도 PRRSV의 많은 변종 바이러스를 최대한 많이 중화할 수 있는 국내맞춤형 백신 개발에 힘쓰고 있다.Since the presently developed vaccine against PRRSV is highly susceptible to genetic mutation, the inactivated vaccine is ineffective due to the nature of PRRSV, which has a large number of mutant strains. Even though the vaccine against virulence is homozygous for homogenous virus, heterogenus) viruses do not act as vaccines. Because of these circumstances, attempts have been made to produce vaccines with effective safety, immunogenicity, and protective properties in a variety of ways. The present inventors are also trying to develop a customized vaccine that can neutralize as many viruses as possible of PRRSV.

한편 바이러스유사 입자 (virus-like particle; VLP) 는 면역원 조성물에의 혼입을 위한 항원으로서 최근 많은 주목을 받고 있다. VLP는 바이러스의 자연적인 (네이티브) 형태와 충분히 유사한 형태로 보이며, 하나 이상의 표면 단백질을 함유하여 이에 의한 면역반응을 일으킬 수 있기 때문이다. 또한 VLP는 야생형 바이러스와는 달리 유전물질이 결여되어 있기 때문에 숙주에 감염을 일으킬 수 없어 안전하다.
Meanwhile, virus-like particles (VLPs) have received much attention as antigens for incorporation into immunogen composition. VLPs appear to be sufficiently similar to the natural (native) form of the virus, and can contain more than one surface protein, thereby causing an immune response. In addition, VLPs are safe because they lack the genetic material, unlike the wild-type virus, and can not cause infection in the host.

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 유사입자를 제공하는 것이다.DISCLOSURE OF THE INVENTION The present invention has been made to solve the above-mentioned problems, and it is an object of the present invention to provide porcine reproductive and respiratory syndrome virus-like particles.

본 발명의 다른 목적은 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 바이러스 유사입자를 이용한 백신을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a vaccine using pig genital respiratory syndrome virus-like particles.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 서열번호 4의 ORF5 및 서열번호 5의 ORF6 단백질을 포함하는 정제된 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 바이러스 유사 입자를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides virus-like particles of purified porcine respiratory syndrome virus including ORF5 of SEQ ID NO: 4 and ORF6 of SEQ ID NO: 5 of porcine reproductive-respiratory syndrome virus.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 바이러스 유사 입자 및 보조제(adjuvant) 또는 면역 자극제(immune stimulator)를 포함하는 것인 항원 제형을 제공한다.The present invention also provides an antigenic formulation comprising virus-like particles and an adjuvant or an immune stimulator of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus of the present invention.

본 발명의 일 구현예에 있어서 상기 항원 제형은 척추동물(vertebrate)에게 경구, 진피 내, 비강내, 근육 내, 복강 내, 정맥 내 또는 피하로 투여되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.In one embodiment of the invention, the antigenic form is preferably, but not exclusively, administered to a vertebrate by oral, buccal, intranasal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous or subcutaneous administration.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 바이러스 유사 입자를 포함하는 백신을 제공한다.The present invention also provides a vaccine comprising virus-like particles of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus of the present invention.

본 발명의 일 구현 예 있어서, 상기 백신은 척추동물(vertebrate)에게 경구, 진피 내, 비강 내, 근육 내, 복강 내, 정맥 내 또는 피하로 투여되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.In one embodiment of the invention, the vaccine is preferably, but not exclusively, administered to a vertebrate by oral, buccal, intranasal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous or subcutaneous administration.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 백신은 보조제 또는 면역 자극제와 함께 제형되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.In one embodiment of the invention, the vaccine is preferably, but not exclusively, formulated with an adjuvant or immunostimulant.

또한 본 발명은 동물에게 상기 본 발명의 항원 제형을 투여하는 것을 포함하는 동물에서 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 감염에 대한 예방 면역을 유도하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method of inducing prophylactic immunity against porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection in an animal comprising administering an antigenic formulation of the present invention to the animal.

또한 본 발명은 동물에게 상기 본 발명의 백신을 투여하는 것을 포함하는 동물에서 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 감염에 대한 예방 면역을 유도하는 방법을 제공한다. The present invention also provides a method for inducing preventive immunity against porcine reproductive / respiratory syndrome virus infection in an animal comprising administering the vaccine of the present invention to the animal.

본 발명에서는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 ORF5 및 ORF6 단백질을 발현하는 VLP항원을 이용하여 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스에 높은 방어능력을 나타내는 백신을 제조하였다. In the present invention, a vaccine showing high defense ability against porcine respiratory syndrome virus was prepared using VLP antigen expressing ORF5 and ORF6 protein of porcine reproductive / respiratory syndrome virus.

본 발명의 VLP는 면역원 또는 약학 조성물의 조제에 사용된다. 그렇게 하기 위해서는, VLP를 적정 농도가 되게 조정하고 임의의 적당한 보조제, 희석제 또는 담체로 제형된다. 생리학적으로 허용 가능한 매질이 담체 및/또는 희석제로 사용될 수 있다. 이러한 것들로는 적당한 등장성 매질, 글리세롤, 에탄올 및 기타 통상의 용매, 포스페이트 완충 생리식염수 등이 포함되며 이에 한정되지 않는다. 적당한 보조제로는 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 하이드록사이드, MPLTM(3-O-탈아실화 모노포스포릴 지질 A; RIBI ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT, 현 Corixa), 529와 같은 합성 지질 A 동족체(Corixa), Stimulon TM QS-21 (Aquila Biopharmaceuticals, Framingham, MA), IL-12 (Genetics Institute, Cambridge, MA), CpG 모티프를 함유하는 올리고뉴클레오타이드와 같은 합성 폴리뉴클레오타이드(U.S. 특허 No. 6,207,646 (28)), 이.콜라이의 열-불안정성 독소, 및 콜레라 독소 (야생형 또는 돌연변이체형에서,예를 들면, 아미노산 위치 29에서의 글루탐산이 또 다른 아미노산, 바람직하게는 히스티딘으로 대치될 경우, 공개된 국제특허출원 No. WO 00/18434 (29))가 포함되며 이에 한정되지 않는다.The VLPs of the present invention are used in the preparation of immunogens or pharmaceutical compositions. To do so, the VLP is adjusted to the proper concentration and formulated with any suitable adjuvant, diluent or carrier. A physiologically acceptable medium may be used as carrier and / or diluent. These include, but are not limited to, suitable isotonic medium, glycerol, ethanol and other conventional solvents, phosphate buffered saline, and the like. Suitable adjuvants include synthetic lipid analogs such as aluminum phosphate, aluminum hydroxide, MPLTM (3-O-deacylated monophosphoryl lipid A; RIBI ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT, current Corixa) ), Stimulon TM QS-21 (Aquila Biopharmaceuticals, Framingham, MA), IL-12 (Genetics Institute, Cambridge, MA), synthetic polynucleotides such as oligonucleotides containing CpG motifs (US Patent No. 6,207,646 , Heat-labile toxin of E. coli, and cholera toxin (in wild-type or mutant forms, for example, when glutamic acid at amino acid position 29 is replaced by another amino acid, preferably histidine, WO 00/18434 (29)), but are not limited thereto.

본 발명의 일 양태에서, VLP를 포함하는 제형은 면역원 조성물로서 사용하기 위한 것이다. 바이러스는 단백질(예를 들면, 알부민, 젤라틴), 당(예를 들면, 수크로스, 락토스, 솔비톨), 아미노산(예를 들면, 나트륨 글루타메이트), 생리식염수, 또는 기타 보호제와 같은 저온보호 첨가제 또는 안정제와 혼합시킬 수 있다. 이 혼합물을 액체 상태로 유지시키고, 또는 그런 다음 수송과 보관을 위해 건조 또는 동결 건조시키고 투여 직전에 물과 혼합 한다In one aspect of the invention, the formulation comprising VLP is for use as an immunogen composition. The virus may be a cold protection additive or stabilizer such as a protein (e.g. albumin, gelatin), a sugar (e.g. sucrose, lactose, sorbitol), an amino acid (e.g. sodium glutamate), saline, ≪ / RTI > This mixture is kept in a liquid state, or is then dried or lyophilized for transportation and storage and mixed with water immediately before administration

본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이, 본 발명은 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 단백질을 발현하는 VLP항원을 이용하여 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스에 높은 방어능력을 나타내는 백신을 제조하였다. As can be seen from the present invention, the present invention uses a VLP antigen expressing a protein of a porcine reproductive / respiratory syndrome virus to prepare a vaccine exhibiting high defense ability against porcine respiratory syndrome virus.

도 1은 PRRSV의 유전자 구조를 나타낸 그림,
도 2는 PRRSV VLP의 생산과정을 도식화한 그림,
도 3은 재조합 배큘로바이러스 제조과정을 설명한 그림,
도 4는 PRRSV 유전자의 클로닝 및 재조합 배큘로 바이러스 구축을 확인한 그림으로, 각 특정 프라이머를 사용하여 PRRSV gene detection in pFastBac1 벡터에서 PRRSV 유전자 검출한 것. Lane M; 1kb ladder, lane 1; PRRSV ORF 3 gene, lane 2; PRRSV ORF 4 gene, lane 3; PRRSV ORF 5 gene, lane 4; PRRSV ORF 6 gene, lane 5; + or - ve를 나타냄.
도 5는 GP5 및 M VLP의 웨스턴 블럿 결과 사진이다. A) 1ug의 GP5 및 M VLP이고, B) lane 1: 2.5ug의 GP5 및 M VLP, lane 2: 1ug의 GP5 및 M VLP, lane 3: 음성 대조군.
도 6은 PRRSV VLP를 생쥐에 접종하고 분석한 항체가 수준을 나타낸 그림으로, 생쥐는 4개의 그룹(VLP를 0.5, 1.0, 2.0, 4.0 ug 접종한 시험군)으로　 선정하였다.　 대조군으로 상용화된 PRRSV 사독 백신, 생리식염수(PBS)처리군으로 두었다.　 모돈 생쥐는 2주 간격으로 3회 VLP 백신을 접종하였다.　 혈액 시료는 접종전, 2주, 4주, 6주에 채취한 후, 면역글로불린 (IgG)의 역가는 GP5를 항원으로하는 ELISA법으로 측정하였다.　　 VLP를 0.5, 1.0, 2.0, 4.0 ug을 접종한 생쥐에서 4주, 6주의 혈청 항체가는 PRRSV불활화 백신보다 유의성 있게 증가하였다. Figure 1 shows the gene structure of PRRSV,
FIG. 2 is a diagram illustrating a production process of a PRRSV VLP,
FIG. 3 is a view illustrating a process for preparing a recombinant baculovirus,
FIG. 4 is a diagram showing the cloning of the PRRSV gene and the construction of the recombinant baculovirus. The PRRSV gene was detected in the PRRSV gene detection in pFastBac1 vector using each specific primer. Lane M; 1kb ladder, lane 1; PRRSV ORF 3 gene, lane 2; PRRSV ORF 4 gene, lane 3; PRRSV ORF 5 gene, lane 4; PRRSV ORF 6 gene, lane 5; + or - Indicates ve.
Figure 5 is a Western blot results photograph of GP5 and M VLP. A) 1 ug of GP5 and M VLP, B) lane 1: 2.5 ug of GP5 and M VLP, lane 2: 1 ug of GP5 and M VLP, lane 3: negative control.
FIG. 6 is a graph showing the levels of antibodies inoculated and analyzed with PRRSV VLP in mice, and mice were selected as four groups (test group inoculated with 0.5, 1.0, 2.0, and 4.0 ug of VLP). PRRSV sadox vaccine commercialized as a control group and physiological saline (PBS) treated group. Sow mice were vaccinated 3 times with VLP vaccine every 2 weeks. Blood samples were collected at 2, 4, and 6 weeks before inoculation, and immunoglobulin (IgG) potency was measured by ELISA using GP5 as an antigen. In mice vaccinated with 0.5, 1.0, 2.0, and 4.0 ug of VLP, serum antibody titers were significantly higher than PRRSV inactivated vaccines at 4 weeks and 6 weeks.

이하, 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위하여 예시된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail by way of non-limiting examples. The following examples are provided to illustrate the present invention and the scope of the present invention is not construed as being limited by the following examples.

실시예 1: VLP의 제작Example 1: Fabrication of VLPs

돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV) LMY strain을 MARC-145 cell line에 접종하여 5일 동안 증식시킨 후 CPE를 확인한 후 바이러스를 확보하였다. 확보된 PRRSV 바이러스로부터 (+) viral genomic RNA를 추출하였다. 이후 표1 에서 제시된 특이적인 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR을 수행함으로써 GP5, 및 M 유전자를 증폭하였다. 증폭된 2개의 유전자를 pGEM-T클로닝 벡터에 클로닝한 후 DNA 시컨싱을 통해 유전자 서열을 확인하였다. 이후 2개의 유전자를 위 표에서 상시 된 제한 효소를 이용하여 곤충 세포에서 단백질을 발현할 수 있는 벡터인 pFASTBAC1 (Invitrogen,USA)에 클로닝을 실시하였다. 이를 DH10Bac(invitrogen)에 형질전환한 후 재조합이 일어난 bacmid를 얻었다. 이렇게 하여 얻어진 bacmid를 35mm 세포 배양 플레이트에서 8X10⁵의 Sf9 cell에 트랜스팩션하여 재조합 baculovirus를 얻었다. Pig reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) LMY strain was inoculated into MARC-145 cell line and propagated for 5 days. CPE was confirmed and virus was obtained. (+) Viral genomic RNA was extracted from the obtained PRRSV virus. The GP5 and M genes were amplified by performing RT-PCR using the specific primer set shown in Table 1 below. The amplified two genes were cloned into the pGEM-T cloning vector and the gene sequence was confirmed by DNA sequencing. Two genes were then cloned into pFASTBAC1 (Invitrogen, USA), a vector capable of expressing proteins in insect cells using the restriction enzymes set forth in the table above. This was transformed into DH10Bac (Invitrogen) and the recombinant bacmid was obtained. The bacmid thus obtained was transfected into 8 × 10 ⁵ Sf9 cells on a 35 mm cell culture plate to obtain recombinant baculovirus.

이와 같은 유전자를 포함하고 있는 단백질 발현 벡터를 Sf9 세포에 transfection 시킨 후 recombinant baculovirus 제작 및 단백질의 발현을 Western blot을 이용하여 확인하였다. 각각의 유전자를 포함하고 있는 recombinant baculovirus (rBV)를 plaque assay를 이용해 역가를 측정하였다. 각각의 유전자의 역가를 확인 한 후 GP5 및 M이 포함 된 VLP 제작을 위해 낮은 M.O.I로 Sf9 cell에 동시 감염을 유도하였다. 세포를 제거한 상층액을 VLP 수거를 위해 ultracenterifugation (100,000 X g , 1시간)을 수행 한 뒤, 침전물을 다시 PBS로 resuspension 시킨 뒤 4℃에 24시간 보관하였다. VLP 만을 정제하기 위해 20%-30%-50%-60%의 sucrose gradient를 이용하여 VLP 밴드를 수거하여 Western blot을 이용하여 확인하였다. After transfection of Sf9 cells with a protein expression vector containing these genes, recombinant baculovirus production and protein expression were confirmed by Western blot. Recombinant baculovirus (rBV) containing each gene was measured by plaque assay. After confirming the activity of each gene, co-infection was induced in Sf9 cells with low M.O.I for the preparation of VLP containing GP5 and M. The supernatant from which the cells were removed was subjected to ultracenterifugation (100,000 × g, 1 hour) for VLP collection, and the precipitate was resuspensioned with PBS and stored at 4 ° C. for 24 hours. To purify VLP only, VLP bands were collected using 20% -30% -50% -60% sucrose gradient and confirmed by Western blot.

primer (5' - 3')primer (5'-3 ') sizeyou ORF5ORF5 Forward: XhoI CTCGAGATGTTGGGGAAATGCTTGACC(서열번호 17)Forward: XhoI CTCGAG ATGTTGGGGAAATGCTTGACC (SEQ ID NO: 17) 603bp603bp Reverse: SphI GCATGCCTAAGGATGACCCCATTGTTCCGC (서열번호 18)Reverse: SphI GCATGC CTAAGGATGACCCCATTGTTCCGC (SEQ ID NO: 18) ORF6ORF6 Forward: SphI
GCATGCATGGGGTCATCCTTAGATGACTTC(서열번호 19)Forward: SphI
GCATGC ATGGGGTCATCCTTAGATGACTTC (SEQ ID NO: 19) 525bp525bp Reverse: HindIII AAGCTTTTATTTGGCATATTTAACAAGG (서열번호 20)Reverse: HindIII AAGCTT TTATTTGGCATATTTAACAAGG (SEQ ID NO: 20)

표 1은 PRRSV 유전자 증폭용 프라이머 서열이다.Table 1 shows primer sequences for PRRSV gene amplification.

실시예 2: 마우스를 대상으로 백신의 효능 검증Example 2: Verification of efficacy of vaccine against mouse

항원 농도별 면역원성 및 방어능을 확인하기 위하여 제작된 GP5-M 발현 VLP 항원을 Freud's Adjuvant 와 1:1로 혼합하여 VLP 백신을 제조하였다. 상술하자면, 각 그룹의 용량을 0.5ug, 1ug, 2ug, 그리고 4ug을 투여한 그룹과 투여하지 않은 그룹을 나누어 실험을 실시하였으며, 각 그룹 당 10마리의 BALB/C 암컷 6주령을 사용하였다. 백신의 투여는 2주 간격으로 3회에 걸쳐서 실시할 것이며 백신의 투여 경로는 근육주사(intramuscular route)를 통해서 투여하였다. 현재 시판되어지고 있는 PRRSV 백신을 근육주사 하기 때문에 본 실험에도 근육주사를 통해 백신을 진행하였으며 상용화된 사독백신을 양성 그룹으로 진행하였다. 2차 백신을 투여한 지 2주 후에 비장을 적출하여, VLP를 이용하여 항원 자극을 주어 IL-4, IL-10 그리고 IFN-감마의 발현 정도를 cytokine sandwich ELISA (R&D, USA)와 real-time RT-PCR를 통해 측정하였다. 즉 VLP 백신이 Th1 사이토카인 혹은 Th2 사이토카인의 발현에 어떠한 영향을 미치는지 검토하였다.VLP vaccine was prepared by mixing 1: 1 of Freund's Adjuvant with GP5-M expressing VLP antigen to confirm immunogenicity and protective ability by antigen concentration. In detail, experiments were conducted by dividing the dose of each group into groups of 0.5 ug, 1 ug, 2 ug, and 4 ug doses and groups not administered, and 10 BALB / C female rats aged 6 weeks were used per group. The vaccine will be administered three times at intervals of two weeks, and the route of administration of the vaccine is administered through an intramuscular route. Because the PRRSV vaccine currently marketed is intramuscularly injected, the vaccine was administered through intramuscular injection in this experiment, and the commercialized Sadox vaccine was administered as a positive group. The expression of IL-4, IL-10 and IFN-gamma was assessed by cytokine sandwich ELISA (R & D, USA) and real-time Were measured by RT-PCR. That is, the effect of the VLP vaccine on the expression of Th1 cytokine or Th2 cytokine was examined.

또한 백신 접종 전, 1차 및 2차 백신 후 혈액 샘플을 수거하여 항체 검사를 실행하였다. Indirect ELISA를 통해 total IgG를 비롯해 IgG1과 IgG2a의 비율을 확인하여 앞서 측정한 사이토카인과 비교하여 Th1과 Th2 면역반응의 양상을 확인하였다. Blood samples were also collected before and after the first and second vaccinations to perform antibody testing. Indirect ELISA was used to confirm the ratio of IgG1 to IgG2a, including total IgG, and the pattern of Th1 and Th2 immunoreactivity was confirmed compared with the cytokines previously measured.

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp. <120> A novel virus like particle of Porcine reproductive and respiratory syndrome virus and vaccine thereof <160> 20 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 256 <212> PRT <213> PRRSV <400> 1 Met Lys Trp Gly Pro Cys Lys Ala Phe Leu Thr Lys Ser Ala Ser Phe 1 5 10 15 Leu Trp Met Leu Ser Arg Ser Ser Trp Cys Pro Leu Leu Ile Ser Leu 20 25 30 Tyr Phe Trp Pro Phe Cys Leu Ala Ser Pro Ser Pro Val Gly Trp Trp 35 40 45 Pro Phe Ala Ser Asp Trp Phe Ala Pro Arg Tyr Ser Val Arg Ala Leu 50 55 60 Pro Phe Thr Leu Ser Asn Tyr Arg Arg Ser Tyr Glu Ala Phe Leu Thr 65 70 75 80 Gln Cys Gln Val Asp Ile Pro Ala Trp Gly Thr Lys His Pro Leu Gly 85 90 95 Ile Leu Trp His His Lys Val Ser Thr Leu Ile Asp Glu Met Val Ser 100 105 110 Arg Arg Met Tyr Arg Ile Met Glu Lys Ala Gly Gln Ala Ala Trp Lys 115 120 125 Gln Val Val Thr Glu Ala Thr Leu Ser Arg Ile Ser Ser Leu Asp Val 130 135 140 Val Ala His Phe Gln His Leu Ala Ala Ile Glu Ala Glu Thr Cys Lys 145 150 155 160 Tyr Leu Ala Ser Arg Leu Pro Met Leu His Asn Leu Arg Leu Thr Gly 165 170 175 Ser Asn Val Thr Ile Val Tyr Asn Ser Thr Leu Asn Gln Val Phe Ala 180 185 190 Val Phe Pro Thr Pro Gly Ser Arg Pro Lys Leu His Asp Phe Gln Gln 195 200 205 Trp Leu Ile Ala Val His Ser Ser Ile Phe Ser Ser Val Ala Ala Ser 210 215 220 Cys Thr Leu Phe Val Val Leu Trp Leu Arg Ile Pro Met Leu Arg Thr 225 230 235 240 Ala Phe Gly Phe Arg Trp Leu Gly Ala Ile Phe Leu Ser Asn Ser Gln 245 250 255 <210> 2 <211> 254 <212> PRT <213> PRRSV <400> 2 Met Val Asn Ser Cys Thr Phe Leu His Ile Phe Leu Cys Cys Ser Phe 1 5 10 15 Leu Tyr Ser Phe Cys Cys Ala Val Val Ala Asp Ser Asn Ala Thr Tyr 20 25 30 Cys Phe Trp Phe Pro Leu Val Arg Gly Asn Phe Ser Phe Glu Leu Thr 35 40 45 Val Asn Tyr Thr Val Cys Pro Pro Cys Leu Thr Arg Gln Ala Ala Ala 50 55 60 Glu Ile Tyr Glu Pro Gly Arg Ser Leu Trp Cys Arg Ile Gly His Asp 65 70 75 80 Arg Cys Gly Glu Asp Asp His Asp Glu Leu Gly Phe Met Val Pro Pro 85 90 95 Gly Leu Ser Asn Glu Gly His Leu Ala Ser Val His Ala Trp Leu Ala 100 105 110 Phe Leu Ser Phe Ser Tyr Thr Ala Gln Phe His Pro Glu Ile Phe Gly 115 120 125 Ile Gly Asn Val Ser Arg Ala Tyr Val Asp Ile Lys His Gln Phe Ile 130 135 140 Cys Ala Val His Asp Gly Gln Asn Thr Thr Leu Pro Arg His Asp Asn 145 150 155 160 Ile Ser Ala Val Phe Gln Thr Tyr Tyr Gln Arg Gln Val Asp Gly Gly 165 170 175 Asn Trp Phe His Leu Glu Trp Leu Arg Pro Phe Phe Ser Ser Trp Leu 180 185 190 Val Leu Asn Val Ser Trp Phe Leu Arg Arg Ser Pro Ala Ser His Val 195 200 205 Ser Val Arg Val Phe Gln Thr Leu Arg Pro Thr Pro Pro Arg Arg Gln 210 215 220 Ala Leu Pro Ser Ser Arg Thr Ser Ala Val Leu Gly Met Ala Thr Gln 225 230 235 240 Pro Leu Arg Arg Phe Ala Arg Phe Leu Ser Ala Val Arg Arg 245 250 <210> 3 <211> 178 <212> PRT <213> PRRSV <400> 3 Met Val Ala Ser Leu Leu Phe Leu Leu Val Gly Phe Glu Arg Leu Leu 1 5 10 15 Val Ser Gln Ala Phe Ala Cys Lys Pro Cys Phe Ser Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Asp Ile Lys Thr Asn Thr Thr Thr Ala Ala Gly Phe Ala Ile Leu Gln 35 40 45 Asp Ile Ser Cys Leu Arg His Gly Asn Ser Thr Ser Glu Ala Phe Arg 50 55 60 Lys Ile Pro Gln Cys Arg Thr Ala Ile Gly Thr Pro Val Tyr Ile Thr 65 70 75 80 Ile Thr Ala Asn Val Thr Asp Glu Asn Tyr Leu His Ser Ser Asp Leu 85 90 95 Leu Met Leu Ser Ala Cys Leu Phe Tyr Ala Ser Glu Met Ser Glu Lys 100 105 110 Gly Phe Lys Val Val Phe Gly Asn Val Ser Gly Ile Val Ala Val Cys 115 120 125 Val Asn Phe Thr Ser Tyr Val Gln His Val Lys Glu Ser Thr Gln Arg 130 135 140 Ser Leu Val Val Asn His Val Arg Leu Leu His Phe Met Thr Pro Glu 145 150 155 160 Thr Met Arg Trp Ala Thr Val Leu Ala Cys Leu Phe Ala Ile Leu Leu 165 170 175 Ala Ile <210> 4 <211> 200 <212> PRT <213> PRRSV <400> 4 Met Leu Glu Lys Cys Leu Thr Ala Gly Cys Cys Ser Gln Leu Leu Phe 1 5 10 15 Leu Trp Cys Ile Val Pro Ser Cys Phe Val Ala Ile Val Ser Ala Asn 20 25 30 Asn Ser Ser Ser Ser Asn Leu Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Thr Leu Cys 35 40 45 Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Ala Asn Arg Phe Asp Trp Ala Val 50 55 60 Glu Cys Phe Val Ile Phe Pro Val Leu Thr His Ile Val Ser Tyr Gly 65 70 75 80 Ala Leu Thr Thr Ser His Phe His Asp Thr Val Gly Leu Val Thr Val 85 90 95 Ser Thr Ala Gly Phe Val His Gly Arg Tyr Val Leu Ser Ser Ile Tyr 100 105 110 Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu Ile Cys Phe Val Ile Arg Leu Ala 115 120 125 Lys Asn Cys Met Ser Trp His Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe 130 135 140 Leu Leu Asp Thr Lys Gly Arg Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val Ile 145 150 155 160 Ile Glu Lys Arg Gly Lys Val Glu Val Glu Gly Gln Lys Ile Asp Leu 165 170 175 Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Ala Ala Thr Pro Val Thr Arg Val 180 185 190 Ser Ala Glu Gln Trp Gly Arg Pro 195 200 <210> 5 <211> 174 <212> PRT <213> PRRSV <400> 5 Met Gly Ser Ser Leu Asp Asp Phe Cys His Asp Ser Thr Ala Pro Gln 1 5 10 15 Lys Val Leu Leu Ala Phe Ser Ile Thr Tyr Thr Pro Val Met Ile Tyr 20 25 30 Ala Leu Lys Val Ser Arg Gly Arg Leu Leu Gly Leu Leu His Leu Leu 35 40 45 Ile Phe Leu Asn Cys Ala Phe Thr Phe Gly Tyr Met Thr Phe Met His 50 55 60 Phe Gln Ser Thr Asn Lys Val Ala Leu Thr Met Gly Ala Val Val Ala 65 70 75 80 Leu Leu Trp Gly Val Tyr Ser Ala Ile Glu Thr Trp Arg Phe Ile Thr 85 90 95 Ser Arg Cys Arg Leu Cys Leu Leu Gly Arg Lys Tyr Ile Leu Ala Pro 100 105 110 Ala His His Val Glu Ser Ala Ala Gly Phe His Pro Ile Ala Ala Asn 115 120 125 Asp Asn His Ala Phe Val Val Arg Arg Pro Gly Ser Thr Thr Val Asn 130 135 140 Gly Thr Leu Val Pro Gly Leu Lys Ser Leu Val Leu Gly Gly Arg Lys 145 150 155 160 Ala Val Lys Gln Gly Val Val Asn Leu Val Lys Tyr Ala Lys 165 170 <210> 6 <211> 771 <212> DNA <213> PRRSV <400> 6 atgaaatggg gtccatgcaa agcctttttg acaaaatcgg ccagcttttt gtggatgctt 60 tcacggagtt cctggtgtcc attgttgata tcattatatt tttggccatt ttgtttggct 120 tcaccatcgc cggttggctg gtggcctttt gcatcagatt ggtttgctcc gcgatactcc 180 gtgcgcgctc taccattcac tctgagcaat tacagaagat cctatgaggc cttcctcacc 240 cagtgtcaag tggacatccc cgcttgggga accaaacatc ccctagggat tctttggcac 300 cacaaggtat cgaccctgat cgatgaaatg gtgtcgcgtc gaatgtaccg catcatggaa 360 aaggcaggac aggctgcctg gaaacaggtg gtgaccgagg ccacgctgtc tcggattagt 420 agcttggatg tggtagctca ttttcagcac cttgccgcca ttgaagccga gacctgtaaa 480 tatttagcat cccggctgcc catgctacac aacctgcgct tgacagggtc aaatgtaacc 540 atagtgtata atagtacttt gaatcaggtg tttgctgttt ttccaacccc cggttcccgg 600 ccaaagcttc atgattttca gcaatggtta atagctgtac attcctccat attttcctct 660 gttgcagctt cttgtactct ttttgttgtg ctgtggttgc ggattccaat gctacgtact 720 gcttttggtt tccgctggtt aggggcaatt tttctttcga actcacagtg a 771 <210> 7 <211> 765 <212> DNA <213> PRRSV <400> 7 atggttaata gctgtacatt cctccatatt ttcctctgtt gcagcttctt gtactctttt 60 tgttgtgctg tggttgcgga ttccaatgct acgtactgct tttggtttcc gctggttagg 120 ggcaattttt ctttcgaact cacagtgaat tacacggtgt gcccgccttg cctcacccga 180 caggcggccg cagagatcta cgaacccggt aggtctcttt ggtgtaggat agggcacgat 240 cgatgtgggg aggatgacca cgacgagtta gggttcatgg taccacctgg cctctccaac 300 gaaggtcatt tggccagtgt tcacgcctgg ttggcgttct tgtcctttag ctacacagcc 360 cagttccacc ctgaaatatt tgggataggg aatgtgagca gagcttatgt tgacatcaag 420 catcaattca tctgcgctgt tcatgacgga cagaacacca ccttgcctcg ccacgacaac 480 atctcagctg tgttccagac ctattaccaa cgtcaggtcg acggcggcaa ttggtttcac 540 ctagaatggt tgcgtccctt cttttcctct tggttggttt tgaacgtctc ttggtttctc 600 aggcgttcgc ctgcaagcca tgtttcagtt cgagtctttc agacattaag accaacacca 660 ccgcggcggc aggctttgcc atcctccagg acatcagctg tcttaggcat ggcaactcaa 720 cctctgaggc gtttcgcaag attcctcagt gccgtacggc gatag 765 <210> 8 <211> 534 <212> DNA <213> PRRSV <400> 8 atggttgcgt cccttctttt cctcttggtt ggttttgaac gtctcttggt ttctcaggcg 60 ttcgcctgca agccatgttt cagttcgagt ctttcagaca ttaagaccaa caccaccacg 120 gcggcaggct ttgctatcct ccaggacatc agctgtctta ggcatggcaa ctcaacctct 180 gaggcgtttc gcaagattcc tcaatgccgc acggcgatag ggacaccagt gtatatcacc 240 atcacagcca atgtaacgga tgagaattat ttacattctt ctgaccttct catgctctct 300 gcttgccttt tctatgcttc tgagatgagc gaaaagggat ttaaggtggt atttggcaat 360 gtgtcaggca tcgtggctgt gtgtgtcaat tttaccagct acgtccaaca cgtcaaggag 420 tctacccagc gctccttagt ggtcaatcat gtacggctgc tccatttcat gacacctgag 480 accatgaggt gggcgactgt tttagcctgt ctttttgcca ttctgttggc catt 534 <210> 9 <211> 603 <212> DNA <213> PRRSV <400> 9 atgttggaga aatgcttgac cgcgggctgt tgctcgcaat tgcttttttt gtggtgtatc 60 gtgccgtctt gttttgttgc gatcgtcagc gccaacaaca gcagcagctc aaatttacag 120 ctgatttaca acttgacgct atgtgagctg aatggcacag attggctagc taacagattt 180 gactgggcgg tggagtgttt tgttattttt cctgtattga ctcacattgt ctcttatggt 240 gccctaacca ctagccactt ccatgacaca gtcggtttgg tcactgtgtc taccgccgga 300 tttgttcacg ggcggtatgt tttgagtagc atttacgcgg tctgtgccct ggctgcgttg 360 atttgcttcg tcattaggct tgcgaagaat tgcatgtcct ggcactactc atgtaccaga 420 tataccaact ttcttctaga taccaagggc agactctacc gttggcggtc gcctgtcatt 480 atagagaaaa ggggcaaagt tgaggtcgag ggtcaaaaaa tcgacctcaa aagagttgtg 540 cttgatggtt ccgcggcaac ccctgtaacc agagtttcgg cggaacaatg gggtcgtcct 600 tag 603 <210> 10 <211> 525 <212> DNA <213> PRRSV <400> 10 atggggtcgt ccttagatga cttctgccat gatagcacag ccccacaaaa ggtgctcttg 60 gcgttttcta tcacctacac gccagtgatg atatacgccc taaaggtaag tcgcggccga 120 ctgctagggc ttttgcacct tttgatcttc ctgaattgtg ctttcacctt cgggtatatg 180 acattcatgc actttcagag tacaaataag gtcgcgctca ctatgggagc agtagtggca 240 ctcctttggg gggtgtactc agccatagaa acctggagat tcatcacctc cagatgccgt 300 ttgtgcttgc taggccgcaa gtacattctg gcccctgccc accacgttga aagtgccgca 360 ggctttcatc cgattgcggc aaatgataac cacgcatttg tcgtccggcg tcccggctct 420 actacggtca acggcacatt ggtgcccggg ttgaaaagcc tcgtgttggg tggcagaaaa 480 gctgttaaac agggagtggt aaaccttgtc aaatatgcca aataa 525 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 ctgcagatga aatggggtcc atgcaaag 28 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 ctcgagtcac tgtgagttcg aaagaaaaat 30 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 ctgcagatgg ttaatagctg tacattcctc 30 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 ctcgagctat cgccgtgcgg cattg 25 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 ctgcagatgg ttgcgtccct tcttttc 27 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 ctcgagtcaa atggccaaca gaatggc 27 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 ctcgagatgt tggggaaatg cttgacc 27 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 gcatgcctaa ggatgacccc attgttccgc 30 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 gcatgcatgg ggtcatcctt agatgacttc 30 <210> 20 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 aagcttttat ttggcatatt taacaagg 28 <110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp. <120> A novel virus like particle of Porcine reproductive and          respiratory syndrome virus and vaccine thereof <160> 20 <170> Kopatentin 1.71 <210> 1 <211> 256 <212> PRT <213> PRRSV <400> 1 Met Lys Trp Gly Pro Cys Lys Ala Phe Leu Thr Lys Ser Ala Ser Phe   1 5 10 15 Leu Trp Met Leu Ser Ser Ser Ser Trp Cys Pro Leu Leu Ile Ser Leu              20 25 30 Tyr Phe Trp Pro Phe Cys Leu Ala Ser Pro Ser Pro Val Gly Trp Trp          35 40 45 Pro Phe Ala Ser Asp Trp Phe Ala Pro Arg Tyr Ser Val Arg Ala Leu      50 55 60 Pro Phe Thr Leu Ser Asn Tyr Arg Arg Ser Tyr Glu Ala Phe Leu Thr  65 70 75 80 Gln Cys Gln Val Asp Ile Pro Ala Trp Gly Thr Lys His Pro Leu Gly                  85 90 95 Ile Leu Trp His His Lys Val Ser Thr Leu Ile Asp Glu Met Val Ser             100 105 110 Arg Arg Met Tyr Arg Ile Met Glu Lys Ala Gly Gln Ala Ala Trp Lys         115 120 125 Gln Val Val Thr Glu Ala Thr Leu Ser Arg Ile Ser Ser Leu Asp Val     130 135 140 Val Ala His Phe Gln His Leu Ala Ala Ile Glu Ala Glu Thr Cys Lys 145 150 155 160 Tyr Leu Ala Ser Arg Leu Pro Met Leu His Asn Leu Arg Leu Thr Gly                 165 170 175 Ser Asn Val Thr Ile Val Tyr Asn Ser Thr Leu Asn Gln Val Phe Ala             180 185 190 Val Phe Pro Thr Pro Gly Ser Arg Pro Lys Leu His Asp Phe Gln Gln         195 200 205 Trp Leu Ile Ala Val His Ser Ser Ile Phe Ser Ser Val Ala Ala Ser     210 215 220 Cys Thr Leu Phe Val Val Leu Trp Leu Arg Ile Pro Met Leu Arg Thr 225 230 235 240 Ala Phe Gly Phe Arg Trp Leu Gly Ala Ile Phe Leu Ser Asn Ser Gln                 245 250 255 <210> 2 <211> 254 <212> PRT <213> PRRSV <400> 2 Met Val Asn Ser Cys Thr Phe Leu His Ile Phe Leu Cys Cys Ser Phe   1 5 10 15 Leu Tyr Ser Phe Cys Cys Ala Val Val Ala Asp Ser Asn Ala Thr Tyr              20 25 30 Cys Phe Trp Phe Pro Leu Val Arg Gly Asn Phe Ser Phe Glu Leu Thr          35 40 45 Val Asn Tyr Thr Val Cys Pro Pro Cys Leu Thr Arg Gln Ala Ala Ala      50 55 60 Glu Ile Tyr Glu Pro Gly Arg Ser Leu Trp Cys Arg Ile Gly His Asp  65 70 75 80 Arg Cys Gly Glu Asp Asp His Asp Glu Leu Gly Phe Met Val Pro Pro                  85 90 95 Gly Leu Ser Asn Glu Gly His Leu Ala Ser Val His Ala Trp Leu Ala             100 105 110 Phe Leu Ser Phe Ser Tyr Thr Ala Gln Phe His Pro Glu Ile Phe Gly         115 120 125 Ile Gly Asn Val Ser Arg Ala Tyr Val Asp Ile Lys His Gln Phe Ile     130 135 140 Cys Ala Val His Asp Gly Gln Asn Thr Thr Leu Pro Arg His His Asp Asn 145 150 155 160 Ile Ser Ala Val Phe Gln Thr Tyr Tyr Gln Arg Gln Val Asp Gly Gly                 165 170 175 Asn Trp Phe His Leu Glu Trp Leu Arg Pro Phe Phe Ser Ser Trp Leu             180 185 190 Val Leu Asn Val Ser Trp Phe Leu Arg Arg Ser Ser Ala Ser His Val         195 200 205 Ser Val Arg Phe Gln Thr Leu Arg Pro Thr Pro Pro Arg Arg Gln     210 215 220 Ala Leu Pro Ser Ser Arg Thr Ser Ala Val Leu Gly Met Ala Thr Gln 225 230 235 240 Pro Leu Arg Arg Phe Ala Arg Phe Leu Ser Ala Val Arg Arg                 245 250 <210> 3 <211> 178 <212> PRT <213> PRRSV <400> 3 Met Val Ala Ser Leu Leu Phe Leu Leu Val Gly Phe Glu Arg Leu Leu   1 5 10 15 Val Ser Gln Ala Phe Ala Cys Lys Pro Cys Phe Ser Ser Ser Leu Ser              20 25 30 Asp Ile Lys Thr Asn Thr Thr Thr Ala Ala Gly Phe Ala Ile Leu Gln          35 40 45 Asp Ile Ser Cys Leu Arg His Gly Asn Ser Thr Ser Glu Ala Phe Arg      50 55 60 Lys Ile Pro Gln Cys Arg Thr Ala Ile Gly Thr Pro Val Tyr Ile Thr  65 70 75 80 Ile Thr Ala Asn Val Thr Asp Glu Asn Tyr Leu His Ser Ser Asp Leu                  85 90 95 Leu Met Leu Ser Ala Cys Leu Phe Tyr Ala Ser Glu Met Ser Glu Lys             100 105 110 Gly Phe Lys Val Val Phe Gly Asn Val Ser Gly Ile Val Ala Val Cys         115 120 125 Val Asn Phe Thr Ser Tyr Val Gln His Val Lys Glu Ser Thr Gln Arg     130 135 140 Ser Leu Val Val Asn His Val Arg Leu Leu His Phe Met Thr Pro Glu 145 150 155 160 Thr Met Arg Trp Ala Thr Val Leu Ala Cys Leu Phe Ala Ile Leu Leu                 165 170 175 Ala Ile         <210> 4 <211> 200 <212> PRT <213> PRRSV <400> 4 Met Leu Glu Lys Cys Leu Thr Ala Gly Cys Cys Ser Gln Leu Leu Phe   1 5 10 15 Leu Trp Cys Ile Val Ser Ser Cys Phe Val Ala Ile Val Ser Ala Asn              20 25 30 Asn Ser Ser Ser Asn Leu Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Thr Leu Cys          35 40 45 Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Ala Asn Arg Phe Asp Trp Ala Val      50 55 60 Glu Cys Phe Val Ile Phe Pro Val Leu Thr His Ile Val Ser Tyr Gly  65 70 75 80 Ala Leu Thr Thr Ser His Phe His Asp Thr Val Gly Leu Val Thr Val                  85 90 95 Ser Thr Ala Gly Phe Val His Gly Arg Tyr Val Leu Ser Ser Ile Tyr             100 105 110 Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu         115 120 125 Lys Asn Cys Met Ser Trp His Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe     130 135 140 Leu Leu Asp Thr Lys Gly Arg Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Ser Val Valle 145 150 155 160 Ile Glu Lys Arg Gly Lys Val Glu Val Glu Gly Gln Lys Ile Asp Leu                 165 170 175 Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Ala Ala Thr Pro Val Thr Arg Val             180 185 190 Ser Ala Glu Gln Trp Gly Arg Pro         195 200 <210> 5 <211> 174 <212> PRT <213> PRRSV <400> 5 Met Gly Ser Ser Leu Asp Asp Phe Cys His Asp Ser Thr Ala Pro Gln   1 5 10 15 Lys Val Leu Leu Ala Phe Ser Ile Thr Tyr Thr Pro Val Met Ile Tyr              20 25 30 Ala Leu Lys Val Ser Arg Gly Arg Leu Leu Gly Leu Leu His Leu Leu          35 40 45 Ile Phe Leu Asn Cys Ala Phe Thr Phe Gly Tyr Met Thr Phe Met His      50 55 60 Phe Gln Ser Thr Asn Lys Val Ala Leu Thr Met Gly Ala Val Val Ala  65 70 75 80 Leu Leu Trp Gly Val Tyr Ser Ala Ile Glu Thr Trp Arg Phe Ile Thr                  85 90 95 Ser Arg Cys Arg Leu Cys Leu Leu Gly Arg Lys Tyr Ile Leu Ala Pro             100 105 110 Ala His His Val Glu Ser Ala Ala Gly Phe His Pro Ile Ala Ala Asn         115 120 125 Asp Asn His Ala Phe Val Val Arg Arg Pro Gly Ser Thr Thr Val Asn     130 135 140 Gly Thr Leu Val Pro Gly Leu Lys Ser Leu Val Leu Gly Gly Arg Lys 145 150 155 160 Ala Val Lys Gln Gly Val Val Asn Leu Val Lys Tyr Ala Lys                 165 170 <210> 6 <211> 771 <212> DNA <213> PRRSV <400> 6 atgaaatggg gtccatgcaa agcctttttg acaaaatcgg ccagcttttt gtggatgctt 60 tcacggagtt cctggtgtcc attgttgata tcattatatt tttggccatt ttgtttggct 120 tcaccatcgc cggttggctg gtggcctttt gcatcagatt ggtttgctcc gcgatactcc 180 gtgcgcgctc taccattcac tctgagcaat tacagaagat cctatgaggc cttcctcacc 240 cagtgtcaag tggacatccc cgcttgggga accaaacatc ccctagggat tctttggcac 300 cacaaggtat cgaccctgat cgatgaaatg gtgtcgcgtc gaatgtaccg catcatggaa 360 aaggcaggac aggctgcctg gaaacaggtg gtgaccgagg ccacgctgtc tcggattagt 420 agcttggatg tggtagctca ttttcagcac cttgccgcca ttgaagccga gacctgtaaa 480 tatttagcat cccggctgcc catgctacac aacctgcgct tgacagggtc aaatgtaacc 540 atagtgtata atagtacttt gaatcaggtg tttgctgttt ttccaacccc cggttcccgg 600 ccaaagcttc atgattttca gcaatggtta atagctgtac attcctccat attttcctct 660 gttgcagctt cttgtactct ttttgttgtg ctgtggttgc ggattccaat gctacgtact 720 gcttttggtt tccgctggtt aggggcaatt tttctttcga actcacagtg a 771 <210> 7 <211> 765 <212> DNA <213> PRRSV <400> 7 atggttaata gctgtacatt cctccatatt ttcctctgtt gcagcttctt gtactctttt 60 tgttgtgctg tggttgcgga ttccaatgct acgtactgct tttggtttcc gctggttagg 120 ggcaattttt ctttcgaact cacagtgaat tacacggtgt gcccgccttg cctcacccga 180 caggcggccg cagagatcta cgaacccggt aggtctcttt ggtgtaggat agggcacgat 240 cgatgtgggg aggatgacca cgacgagtta gggttcatgg taccacctgg cctctccaac 300 gaaggtcatt tggccagtgt tcacgcctgg ttggcgttct tgtcctttag ctacacagcc 360 cagttccacc ctgaaatatt tgggataggg aatgtgagca gagcttatgt tgacatcaag 420 catcaattca tctgcgctgt tcatgacgga cagaacacca ccttgcctcg ccacgacaac 480 atctcagctg tgttccagac ctattaccaa cgtcaggtcg acggcggcaa ttggtttcac 540 ctagaatggt tgcgtccctt cttttcctct tggttggttt tgaacgtctc ttggtttctc 600 aggcgttcgc ctgcaagcca tgtttcagtt cgagtctttc agacattaag accaacacca 660 ccgcggcggc aggctttgcc atcctccagg acatcagctg tcttaggcat ggcaactcaa 720 cctctgaggc gtttcgcaag attcctcagt gccgtacggc gatag 765 <210> 8 <211> 534 <212> DNA <213> PRRSV <400> 8 atggttgcgt cccttctttt cctcttggtt ggttttgaac gtctcttggt ttctcaggcg 60 ttcgcctgca agccatgttt cagttcgagt ctttcagaca ttaagaccaa caccaccacg 120 gcggcaggct ttgctatcct ccaggacatc agctgtctta ggcatggcaa ctcaacctct 180 gaggcgtttc gcaagattcc tcaatgccgc acggcgatag ggacaccagt gtatatcacc 240 atcacagcca atgtaacgga tgagaattat ttacattctt ctgaccttct catgctctct 300 gcttgccttt tctatgcttc tgagatgagc gaaaagggat ttaaggtggt atttggcaat 360 gtgtcaggca tcgtggctgt gtgtgtcaat tttaccagct acgtccaaca cgtcaaggag 420 tctacccagc gctccttagt ggtcaatcat gtacggctgc tccatttcat gacacctgag 480 accatgaggt gggcgactgt tttagcctgt ctttttgcca ttctgttggc catt 534 <210> 9 <211> 603 <212> DNA <213> PRRSV <400> 9 atgttggaga aatgcttgac cgcgggctgt tgctcgcaat tgcttttttt gtggtgtatc 60 gtgccgtctt gttttgttgc gatcgtcagc gccaacaaca gcagcagctc aaatttacag 120 ctgatttaca acttgacgct atgtgagctg aatggcacag attggctagc taacagattt 180 gactgggcgg tggagtgttt tgttattttt cctgtattga ctcacattgt ctcttatggt 240 gccctaacca ctagccactt ccatgacaca gtcggtttgg tcactgtgtc taccgccgga 300 tttgttcacg ggcggtatgt tttgagtagc atttacgcgg tctgtgccct ggctgcgttg 360 atttgcttcg tcattaggct tgcgaagaat tgcatgtcct ggcactactc atgtaccaga 420 tataccaact ttcttctaga taccaagggc agactctacc gttggcggtc gcctgtcatt 480 atagagaaaa ggggcaaagt tgaggtcgag ggtcaaaaaa tcgacctcaa aagagttgtg 540 cttgatggtt ccgcggcaac ccctgtaacc agagtttcgg cggaacaatg gggtcgtcct 600 tag 603 <210> 10 <211> 525 <212> DNA <213> PRRSV <400> 10 atggggtcgt ccttagatga cttctgccat gatagcacag ccccacaaaa ggtgctcttg 60 gcgttttcta tcacctacac gccagtgatg atatacgccc taaaggtaag tcgcggccga 120 ctgctagggc ttttgcacct tttgatcttc ctgaattgtg ctttcacctt cgggtatatg 180 acattcatgc actttcagag tacaaataag gtcgcgctca ctatgggagc agtagtggca 240 ctcctttggg gggtgtactc agccatagaa acctggagat tcatcacctc cagatgccgt 300 ttgtgcttgc taggccgcaa gtacattctg gcccctgccc accacgttga aagtgccgca 360 ggctttcatc cgattgcggc aaatgataac cacgcatttg tcgtccggcg tcccggctct 420 actacggtca acggcacatt ggtgcccggg ttgaaaagcc tcgtgttggg tggcagaaaa 480 gctgttaaac agggagtggt aaaccttgtc aaatatgcca aataa 525 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 ctgcagatga aatggggtcc atgcaaag 28 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 ctcgagtcac tgtgagttcg aaagaaaaat 30 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 ctgcagatgg ttaatagctg tacattcctc 30 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 ctcgagctat cgccgtgcgg cattg 25 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 ctgcagatgg ttgcgtccct tcttttc 27 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 ctcgagtcaa atggccaaca gaatggc 27 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 ctcgagatgt tggggaaatg cttgacc 27 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 gcatgcctaa ggatgacccc attgttccgc 30 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 gcatgcatgg ggtcatcctt agatgacttc 30 <210> 20 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 aagcttttat ttggcatatt taacaagg 28

Claims (9)

돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 서열번호 4의 ORF5 및 서열번호 5의 ORF6 단백질을 포함하는 정제된 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 바이러스 유사 입자. Virus-like particles of purified porcine respiratory syndrome virus comprising ORF5 of SEQ ID NO: 4 and ORF6 protein of SEQ ID NO: 5 of porcine respiratory syndrome virus. 제 1항의 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 바이러스 유사 입자 및 보조제(adjuvant) 또는 면역 자극제(immune stimulator)를 포함하는 것인 항원 제형.11. An antigenic formulation comprising virus-like particles and an adjuvant or an immune stimulator of the porcine reproductive-respiratory syndrome virus of claim 1. 제2항에 있어서, 상기 항원 제형은 척추동물(vertebrate)에게 경구, 진피 내, 비강내, 근육 내, 복강 내, 정맥 내 또는 피하로 투여되는 것인 항원 제형.The antigenic formulation of claim 2, wherein the antigenic formulation is administered to a vertebrate orally, dermally, intranasally, intramuscularly, intraperitoneally, intravenously or subcutaneously. 제 1항의 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 바이러스 유사 입자를 포함하는 백신.A vaccine comprising virus-like particles of the porcine respiratory syndrome virus of claim 1. 제 4항에 있어서, 상기 백신은 척추동물(vertebrate)에게 경구, 진피 내, 비강 내, 근육 내, 복강 내, 정맥 내 또는 피하로 투여되는 것인 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 포함하는 백신.5. The vaccine of claim 4, wherein the vaccine is administered to the vertebrate orally, dermally, intranasally, intramuscularly, intraperitoneally, intravenously or subcutaneously. 제 4항에 있어서, 상기 백신은 보조제 또는 면역 자극제와 함께 제형되는 것인 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 포함하는 백신. 5. The vaccine of claim 4, wherein the vaccine is formulated with an adjuvant or immunostimulant. 인간을 제외한 동물에게 제 2항의 항원 제형을 투여하는 것을 포함하는 인간을 제외한 동물에서 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 감염에 대한 예방 면역을 유도하는 방법. A method for inducing prophylactic immunity against porcine reproductive / respiratory syndrome virus infection in an animal other than a human, comprising administering the antigenic formulation of claim 2 to an animal other than a human. 인간을 제외한 동물에게 제 4항의 백신을 투여하는 것을 포함하는 인간을 제외한 동물에서 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 감염에 대한 예방 면역을 유도하는 방법. A method for inducing prophylactic immunity against porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection in an animal other than a human, comprising administering the vaccine of claim 4 to an animal other than a human. 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 RNA를 추출하여서 cDNA를 합성하고, 상기 cDNA를 주형으로 하여서 서열번호 17 및 18의 프라이머쌍 및 서열번호 19 및 20의 프라이머쌍을 이용하여 PCR증폭을 수행하여 각각 서열번호 9 및 서열번호 10의 ORF5 및 ORF6 유전자를 얻은 후 배큘로 바이러스의 DNA에 이들 유전자를 삽입하여 재조합 배큘로 바이러스를 제작하고, 상기 배큘로 바이러스를 곤충세포에 감염시키는 단계를 포함하는 제1항의 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 바이러스 유사 입자 제조방법.PCR of the primers of SEQ ID NOs: 17 and 18 and the primer pairs of SEQ ID NOs: 19 and 20 was carried out using the cDNA as a template to obtain SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: And the ORF5 and ORF6 genes of SEQ ID NO: 10, and then inserting these genes into the DNA of baculovirus to produce a recombinant baculovirus, and infecting the baculovirus with insect cells. A method for producing virus-like particles of respiratory syndrome virus.

Images