KR101419816B1

KR101419816B1 - Compositions for preventing or treating non-small cell lung cancer having synergistically therapeutic effects

Info

Publication number: KR101419816B1
Application number: KR1020130010682A
Authority: KR
Inventors: 조병철; 김현정
Original assignee: (주)제욱; 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2013-01-30
Filing date: 2013-01-30
Publication date: 2014-07-17

Abstract

The present invention provides 2-Deoxy-D-glucose for preventing or treating non-small cell lung cancer, a combined medication of irreversible EGFR TKI, and a combining method. The 2-Deoxy-D-glucose synergistically improves the sensitivity of the non-small cell lung cancer to the irreversible EGFR TKI, thereby the composition of the present invention can be usefully used to prevent and treat non-small cell lung cancer exhibiting tolerance to the non-small cell lung, especially the irreversible EGFR TKI.

Description

상승적 치료 효과를 갖는 비소세포폐암의 예방 또는 치료용 조성물{Compositions for preventing or treating non-small cell lung cancer having synergistically therapeutic effects}TECHNICAL FIELD The present invention relates to a composition for preventing or treating non-small cell lung cancer having a synergistic therapeutic effect,

본 발명은 2-Deoxy-D-glucose 및 비가역적 EGFR 티로신 키나아제 억제제를 포함하는 약제 조합물(pharmaceutical combination)의 비소세포폐암의 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다.
The present invention relates to the prophylactic or therapeutic use of non-small cell lung cancer in a pharmaceutical combination comprising 2-Deoxy-D-glucose and an irreversible EGFR tyrosine kinase inhibitor.

티로신 키나아제 수용체의 HER 패밀리 중 하나인 EGFR(epidermal growth factor receptor)은 세포증식, 신생혈관형성, 침윤 및 전이를 매개한다(Harari PM, et al. J Clin Oncol. 2007;25:4057-65; Yarden Y, et al. Nat Rev Mol Cell Biol. 2001;2:127-37). EGFR의 비정상적인 발현은 다수의 종양에서 빈번히 관찰되고, 강력한 종양 형성 잠재력(oncogenic potential)이 있는 것으로 알려져 있다( Hirsch FR, et al. J Clin Oncol. 2003;21:3798-807; Rubin Grandis J, et al. J Natl Cancer Inst. 1998;90:824-32).EGFR (epidermal growth factor receptor), one of the HER family of tyrosine kinase receptors, mediates cell proliferation, neovascularization, invasion and metastasis (Harari PM, et al . J Clin Oncol . 2007; 25: 4057-65; Yarden Y, et al ., Nat Rev Mol Cell Biol ., 2: 127-37). Abnormal expression of EGFR is frequently observed in many tumors and is known to have strong oncogenic potential (Hirsch FR, et al . J Clin Oncol 2003; 21: 3798-807; Rubin Grandis J, et . al J Natl Cancer Inst 1998; 90:. 824-32).

게피티니브(gefitinib) 및 엘로티니브(erlotinib)와 같은 1세대 EGFR 티로신 키나아제 억제제(TKI)는 가역적으로 EGFR 인산화효소 도메인 내의 ATP 클레프트(ATP cleft)에 결합하여 EGFR의 자기인산화를 억제한다(Mendelsohn J, et al. J Clin Oncol. 2003;21:2787-99). 비록 이러한 EGFR TKI가 엑손 19의 작은 인-프레임 결실(in-frame deletions) 또는 엑손 21의 L858R 미스센스 돌연변이와 같은 EGFR 활성화 돌연변이를 갖는 진행성 비소세포폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC) 환자에 효과가 있는 것으로 보였으나, 대부분의 환자는 EGFR 엑손 20에서의 이차적인 T790M 돌연변이를 통하여 상기 EGFR TKI에 대한 내성을 나타내었다(Pao W, et al. PLoS Med. 2005;2:e73). 그러나, EGFR T790M의 획득으로 인한 가역적인 EGFR TKI에 대하여 내성을 획득한 환자를 위한 표준 치료법이 없는 실정이다(Riely GJ. J Thorac Oncol. 2008;3:S146-9).The first-generation EGFR tyrosine kinase inhibitor (TKI) such as gefitinib and erlotinib reversibly inhibits the autophosphorylation of EGFR by binding to ATP cleft within the EGFR phosphorylase domain ( Mendelsohn J, et al J Clin Oncol 2003; 21: 2787-99). Although this EGFR TKI has been implicated in patients with advanced non-small cell lung cancer (NSCLC) with EGFR-activated mutations such as small in-frame deletions of exon 19 or L858R missense mutations of exon 21 (Pao W, et al . PLoS Med . 2005; 2: e73), although most patients showed resistance to the EGFR TKI through a secondary T790M mutation in EGFR exon 20. However, there is no standard treatment for patients who are resistant to the reversible EGFR TKI due to the acquisition of EGFR T790M (Riely GJ. J Thorac Oncol . 2008; 3: S146-9).

아파티니브(afatinib, BIBW 2992)는 비가역적인 2세대 EGFR TKI 중 하나이다. 최근의 전임상 연구에 따르면, 아파티니브는 EGFR T790M을 갖는 비소세포폐암에서 인 비트로 및 인 비보에서 항-종양 활성을 나타내었다. 상기 결과에 기초하여 아파티니브는 EGFR T790M을 갖는 비소세포폐암 환자를 위한 표준 치료 선택(standard therapeutic option)이 될 것으로 기대되었다(Li D, et al. Oncogene. 2008;27:4702-11). 그러나, 아파티니브는 EGFR 활성화 돌연변이를 갖는 비소세포폐암 세포에서 보다 EGFR T790M을 갖는 비소세포폐암 세포에서 100배 낮은 효과를 보였다(Takezawa K, et al. Mol Cancer Ther. 2010;9:1647-56). 또한, 아파티니브는 최근의 임상 3상에서 미미한 효능을 나타내었으며, 이는 아파티니브의 효능을 향상시키기 위한 새로운 전략의 개발이 필요함을 의미한다(Miller VA, et al. Lancet Oncol. 2012;13:528-38).
Afatinib (BIBW 2992) is one of the irreversible 2nd generation EGFR TKI. According to recent preclinical studies, apatinate has anti-tumor activity in in vitro and in vivo in non-small cell lung cancer with EGFR T790M. On the basis of these results, apatinate was expected to be the standard therapeutic option for non-small cell lung cancer patients with EGFR T790M (Li D, et al . Oncogene . 2008; 27: 4702-11). However, apapnib is 100-fold less effective in non-small cell lung cancer cells with EGFR T790M than in non-small cell lung cancer cells with EGFR-activated mutations (Takezawa K, et al . Mol Cancer Ther . 2010; 9: 1647-56 ). In addition, apatineib has shown little efficacy in recent clinical trials, suggesting the need to develop a new strategy to improve the efficacy of apathetic (Miller VA, et al . Lancet Oncol . 2012; 13: 528-38).

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
Numerous papers and patent documents are referenced and cited throughout this specification. The disclosures of the cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety to better understand the state of the art to which the present invention pertains and the content of the present invention.

본 발명자들은 비소세포폐암, 특히 가역적인 EGFR TKI에 대하여 내성을 획득한 비소세포폐암의 효과적인 치료전략을 개발하기 위하여 연구 노력하였다. 그 결과, 2-Deoxy-D-glucose 및 아파티니브의 병용이 비소세포폐암 세포에서 AMPK/mTOR 신호전달경로의 변경을 통한 Mcl-1의 하향조절을 통하여 상승적인(synergistically) 항-종양 활성을 나타내는 것을 확인함으로써, 2-Deoxy-D-glucose 및 비가역적 EGFR TKI의 병용 제제 및 요법이 가역적인 EGFR TKI에 대하여 내성을 획득한 비소세포폐암 환자의 치료를 위한 유망한 치료적 전략임을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.The present inventors have sought to develop an effective therapeutic strategy for non-small cell lung cancer, particularly non-small cell lung cancer that has acquired resistance to reversible EGFR TKI. As a result, the combination of 2-Deoxy-D-glucose and apatinate inhibited synergistically anti-tumor activity through down-regulation of Mcl-1 through alteration of the AMPK / mTOR signaling pathway in NSCLC , It is confirmed that the combined treatment and regimen of 2-Deoxy-D-glucose and irreversible EGFR TKI is a promising therapeutic strategy for the treatment of non-small cell lung cancer patients who have acquired resistance to reversible EGFR TKI. Thereby completing the invention.

따라서, 본 발명의 목적은 비소세포폐암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating non-small cell lung cancer.

본 발명의 다른 목적은 비소세포폐암의 내성 저해용 조성물을 제공하는 데 있다.
Another object of the present invention is to provide a composition for inhibiting resistance to non-small cell lung cancer.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 2DG(2-Deoxy-D-glucose) 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염; 및 (b) 아파티니브(afatinib), 다코미티니브(dacomitinib), CI-1033(Canertinib), HKI-272 (Neratinib) 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 비소세포폐암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 을 제공한다.
According to one aspect of the present invention, the present invention provides a pharmaceutical composition comprising (a) 2-Deoxy-D-glucose (2DG) or a pharmaceutically acceptable salt thereof; And (b) non-small cell lung cancer comprising afatinib, dacomitinib, CI-1033 (Canertinib), HKI-272 (Neratinib) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient Or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 명세서에서 용어, "비소세포폐암"은 본 기술분야에 종사하는 당업자에게 알려진 의미대로 사용된다. 예를 들면, 비소세포폐암은 폐의 상피 세포(epithelial cells)로부터 발생하는 악성 종양(malignant cell)으로서, 현미경 하에서 관찰자, 예를 들면, 조직병리학자(histopathologist)에 의하여 관찰된 종양 세포의 크기 및 모양에 따라 분류된 것이다.As used herein, the term "non-small cell lung cancer" is used as is known to those skilled in the art. For example, non-small cell lung cancer is a malignant cell originating from the epithelial cells of the lung. The size of the tumor cell observed under a microscope by an observer, for example, a histopathologist, It is classified according to shape.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 비소세포폐암은 편평세포암, 선암 또는 큰세포암이다.According to an embodiment of the present invention, the non-small cell lung cancer is squamous cell cancer, adenocarcinoma or large cell cancer.

본 발명의 약제학적 조성물은 제1유효성분으로서 2DG와 제2유효성분으로서 아파티니브, 다코미티니브, CI-1033(Canertinib) 또는 HKI-272(Neratinib)를 포함한다. 즉, 본 발명은 비소세포폐암의 예방 및 치료를 위한, 2DG 및 아파티니브, 다코미티니브, CI-1033 및 HKI-272와 같은 비가역적 EGFR TKI의 신규한 병용 제제 및 요법에 관한 것이다.The pharmaceutical composition of the present invention comprises 2DG as a first active ingredient and afacnib, dacomitinib, CI-1033 (Canertinib) or HKI-272 (Neratinib) as a second active ingredient. That is, the present invention relates to a novel combination preparation and therapy for irreversible EGFR TKI such as 2DG and apatineib, dakomitinib, CI-1033 and HKI-272 for the prevention and treatment of non-small cell lung cancer.

제1유효성분인 2DG는 2-하이드록시기가 수소로 치환된 글루코스 분자로서 분자식이 C₆H₁₂O₅이며, 해당과정(glycolysis)을 억제하는 것으로 알려져 있다.The first active ingredient, 2DG, is a glucose molecule whose 2-hydroxy group is substituted with hydrogen, and its molecular formula is C ₆ H ₁₂ O ₅ and is known to inhibit glycolysis.

제2유효성분 중 하나인, 아파티니브(BIBW 2992)는 화합물 4-[(3-클로로-4-플루오로페닐)아미노]-6-{[4-(N,N-디메틸아미노)-1-옥소-2-부텐-1-일]아미노}-7-((S)-테트라하이드로푸란-3-일옥시)-퀴나졸린으로 공지되어 있다. 아파티니브는 ErbB1 수용체(EGFR) 및 ErbB2(Her2/neu) 수용체 티로신 키나아제의 강력한 선택적 이중 억제제이다. 또한, 아파티니브는 EGFR 및 HER2에 공유적으로 결합하여 아파티니브가 결합하는 수용체 분자를 비가역적으로 불활성화 시키도록 고안되었다. 이러한 화합물, 이의 염(예를 들어 디말레에이트 염) 및 이의 제법은 WO 02/50043 및 WO 2005/037824에 기술되어 있으며, 이들 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.(BIBW 2992), which is one of the second active ingredients, can be prepared by reacting compound 4 - [(3-chloro-4-fluorophenyl) amino] -6 - {[4- (N, -Oxo-2-buten-l-yl] amino} -7 - ((S) -tetrahydrofuran-3-yloxy) -quinazoline. Acapanib is a potent selective dual inhibitor of ErbB1 receptor (EGFR) and ErbB2 (Her2 / neu) receptor tyrosine kinase. In addition, apatinate is designed to covalently bind to EGFR and HER2 to irreversibly inactivate the receptor molecule to which apathi- nide binds. Such compounds, salts thereof (e.g. dimaleate salts) and their preparation are described in WO 02/50043 and WO 2005/037824, which are incorporated herein by reference.

다른 제2유효성분 중 하나인, 다코미티니브(PF299804)는 아파티니브와 마찬가지로 비가역적인 EGFR TKI로서, EGFR T790M 돌연변이를 갖는 비소세포폐암 세포에서 EFGR 신호전달을 억제하고, 아폽토시스를 유도하는 것으로 알려져 있는 소분자 화합물이다.(PF299804), another irreversible EGFR TKI like apatinib, is known to inhibit EFGR signaling and induce apoptosis in non-small cell lung cancer cells with the EGFR T790M mutation Small molecule compound.

또 다른 제2유효성분 중 하나인, CI-1033은 EGFR, HER-2 및 ErbB-4에 대한 비가역적 TKI로서 알려져 있다.One of the other second active ingredients, CI-1033, is known as irreversible TKI for EGFR, HER-2 and ErbB-4.

또 다른 제2유효성분 중 하나인, HKI-272는 TKI로서 EGFR 및 HER-2에 대한 이중 억제제(dual inhibitor)로서 알려져 있다.HKI-272, another of the second active ingredients, is known as a dual inhibitor of EGFR and HER-2 as a TKI.

본 발명의 약제학적 조성물에는 제1유효성분 또는 제2유효성분의 약제학적으로 허용되는 염이 포함될 수 있다. 본 명세서에서 용어, "약제학적으로 허용되는 염"은 화합물이 투여되는 유기체에 심각한 자극을 유발하지 않고 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는, 화합물의 제형을 의미한다. 상기 약제학적으로 허용되는 염은 약학적으로 허용 가능한, 실질적으로 비독성인 유기산 및 무기산을 이용하는 당업계에 잘 알려진 통상의 방법으로 제조된다. 상기 산은 염산, 브롬산, 황산, 질산, 인산 등의 무기산; 메탄술폰산, 에탄술폰산, p-톨루엔술폰산 등의 술폰산, 타타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리클로로아세트산, 트리플루오로아세트산, 카프릭산, 이소부탄산, 말론산, 숙신산, 프탈산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 말레인산, 살리실산 등과 같은 유기산을 포함한다. 또한, 본 발명의 화합물을 염기와 반응시켜 암모니움 염; 나트륨 또는 칼륨 염 등의 알칼리 금속염; 칼슘 또는 마그네슘 염 등의 알칼리 토금속염 등의 염; 디시클로헥실아민, N-메틸-D-글루카민, 트리스(히드록시메틸) 메틸아민 등의 유기염기들의 염; 및 아르기닌, 리신 등의 아미노산 염을 형성할 수도 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may include a pharmaceutically acceptable salt of the first active ingredient or the second active ingredient. As used herein, the term "pharmaceutically acceptable salt" means a formulation of a compound that does not cause serious irritation to the organism to which the compound is administered and does not impair the biological activity and properties of the compound. The pharmaceutically acceptable salts are prepared by conventional methods well known in the art using pharmaceutically acceptable, substantially non-toxic organic and inorganic acids. The acid includes inorganic acids such as hydrochloric acid, bromic acid, sulfuric acid, nitric acid, and phosphoric acid; There may be mentioned sulfonic acids such as methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid and p-toluenesulfonic acid, tartaric acid, formic acid, citric acid, acetic acid, trichloroacetic acid, trifluoroacetic acid, capric acid, isobutanoic acid, malonic acid, succinic acid, phthalic acid, , Lactic acid, fumaric acid, maleic acid, salicylic acid, and the like. Further, the compound of the present invention is reacted with a base to form an ammonium salt; Alkali metal salts such as sodium or potassium salts; Salts of alkaline earth metal salts such as calcium or magnesium salts; Salts of organic bases such as dicyclohexylamine, N-methyl-D-glucamine, and tris (hydroxymethyl) methylamine; And amino acid salts such as arginine, lysine and the like.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 비소세포폐암은 EGFR 활성화 돌연변이를 갖는다. 상기 용어, "EGFR 활성화 돌연변이"는 EGFR을 암호화하는 ErbB1 유전자의 뉴클레오타이드 서열에서의 변화로 키나아제 활성을 증가시키는 것을 의미한다. 증가된 키나아제 활성은 핵산에서의 변화에 대한 직접적인 결과이며, 유전자가 암호화하는 단백질과 연관된다.According to one embodiment of the present invention, the non-small cell lung cancer has an EGFR activating mutation. The term "EGFR-activated mutation" means increasing the kinase activity by a change in the nucleotide sequence of the ErbBl gene encoding EGFR. Increased kinase activity is a direct consequence of changes in nucleic acids and is associated with proteins that the gene encodes.

하나의 특정예에서 상기 EGFR 활성화 돌연변이는 엑손 19번 내의 결실 돌연변이 또는 엑손 21번의 점돌연변이이다. 상기 엑손 19번 내의 결실 돌연변이의 예로는 E746-A750del, S752-I759del, K747-A750del 및 K747-E749 + A750에서의 돌연변이를 들 수 있으며, 상기 엑손 21번의 점돌연변이의 예로는 L858R 및 L861Q 점돌연변이를 들 수 있다.In one particular example, the EGFR-activated mutation is a deletion mutation in exon 19 or a point mutation in exon 21. Examples of deletion mutants in exon 19 include E746-A750del, S752-I759del, K747-A750del and K747-E749 + A750. Examples of point mutations in exon 21 include L858R and L861Q point mutations .

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 비소세포폐암은 EGFR 활성화 돌연변이 외에 가역적(reversible) EGFR TKI에 대한 내성을 유발하는 EGFR 돌연변이를 추가적으로 갖는다. 하나의 특정예에서는 상기 EGFR TKI에 대한 내성을 유발하는 EGFR 돌연변이는 T790M이다.According to one embodiment of the present invention, the non-small cell lung cancer additionally has an EGFR mutation in addition to EGFR activation mutation, which causes resistance to reversible EGFR TKI. In one particular example, the EGFR mutation that results in resistance to the EGFR TKI is T790M.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 비소세포폐암은 게피티니브 또는 엘로티니브와 같은 가역적 EGFR TKI에 대한 내성을 나타낸다.According to one embodiment of the present invention, the non-small cell lung cancer shows resistance to reversible EGFR TKI such as gefitinib or elotinib.

가역적인 EGFR TKI는 E746-A750의 결실 돌연변이 및 L858R 점돌연변이와 같은 EGFR 활성화 돌연변이를 갖는 비소세포폐암의 치료에 효과가 있으나, 비소세포폐암에 T790M과 같은 이차적인 돌연변이가 생기면 가역적인 EGFR TKI에 대한 저항성을 나타내게 되어(내성) 폐암 치료에 더 이상 유효하지 않게 된다. 이러한 내성을 나타내는 비소세포폐암의 치료를 위하여 아파티니브와 같은 비가역적인 2세대 EGFR TKI가 개발되었으나, 상기 비가역적인 EGFR TKI는 내성을 획득한 비소세포폐암에 대하여 제한적인 효과만 나타내어 비소세포폐암 치료에 미흡한 문제가 있었다.The reversible EGFR TKI is effective in the treatment of non-small cell lung cancer with EGFR-activated mutations such as E746-A750 deletion mutations and L858R point mutations. However, when secondary mutations such as T790M occur in non-small cell lung cancer, reversible EGFR TKI (Resistant) to become more ineffective in the treatment of lung cancer. The irreversible second generation EGFR TKI such as apatinib has been developed for the treatment of non - small cell lung cancer showing this resistance. However, the irreversible EGFR TKI has only limited effect on resistant non - small cell lung cancer, There was a problem.

본 발명은 비가역적 EGFR TKI와 이의 치료 효과를 상승적으로 향상시키는 2DG를 함께 사용함으로써, 비가역적인 EGFR TKI가 갖는 종래의 효과상의 문제점을 보완하였다. 하기 실시예에서 증명된 바와 같이, 비가역적 EGFR TKI와 2DG의 병용은 이들을 각각 사용하는 경우 보다 T790M 돌연변이를 갖는 비소세포폐암 세포의 성장 및 세포사를 인 비트로 및 인 비보에서 현저히 억제하였다(도 2 및 10 참조).The present invention has solved the problems of the conventional effects of irreversible EGFR TKI by using 2DG synergistically improving the irreversible EGFR TKI and its therapeutic effect synergistically. As demonstrated in the following examples, the combined use of irreversible EGFR TKI and 2DG significantly inhibited the growth and cell death of non-small cell lung cancer cells with T790M mutations in vitro and in vivo , respectively, than when using them individually (Figures 2 and 3) 10).

본 발명의 일구현예에 따르면, 제1유효성분인 2DG는 하기와 같은 제2유효성분의 비소세포폐암에 대한 효과를 상승적으로 증가시킨다:According to one embodiment of the present invention, the first active ingredient, 2DG, synergistically increases the effect of the second active ingredient on non-small cell lung cancer, such as:

(i) 제2유효성분에 대한 비소세포폐암의 민감성(sensitivity),(i) the sensitivity of the non-small cell lung cancer to the second active ingredient,

(ii) 제2유효성분의 항-종양 활성, 또는(ii) the anti-tumor activity of the second active ingredient, or

(iii) 제2유효성분의 비소세포폐암 세포의 해당과정 억제 효과.(iii) Inhibitory effect of the second active ingredient on the corresponding process of non-small cell lung cancer cells.

이러한 관점에서, 본 발명의 제1유효성분은 항암감작제로서 기능을 하는 것이다. 상기 용어, "항암 감작"이란 화학 감작과 동일한 의미로 사용되는 것으로, 화학 물질 항암제로 암을 치료 시 항암감작제(화학감작제)가 없을 때보다 있을 때 항암제의 항암 활성이 더 강화되거나 증가되는 것으로서, 항암제 내성 등 항암제에 대한 저항성이 줄어들고 항암제의 효과가 더 잘 발휘되는 것을 의미한다. 본 발명에 있어서는 항암감작제인 2DG가 비가역적 EGFR TKI에 대해 비소세포폐암 세포를 민감화 시킴으로써, 항암제에 대한 암세포의 저항성을 줄이고 항암제의 효과를 높이는 것을 항암감작이라 한다.From this point of view, the first active ingredient of the present invention functions as an anticancer sensitizer. The term "anti-cancer sensitization" is used in the same sense as chemical sensitization. When the cancer is treated with a chemical anti-cancer agent, the anticancer activity of the anti-cancer agent is further enhanced or increased when there is no anti-cancer sensitizer (chemical sensitizer) , Which means that resistance to anticancer drugs such as anticancer drug resistance is reduced and the effect of anticancer drugs is better displayed. In the present invention, 2DG, which is an anti-cancer sensitizer, sensitizes non-small cell lung cancer cells against irreversible EGFR TKI, thereby reducing the resistance of cancer cells to anti-cancer drugs and enhancing the effect of anti-cancer drugs.

본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 제1유효성분 및 제2유효성분을 동일한 용기에 포함하거나, 또는 각각 별개의 용기에 포함할 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the composition of the present invention can contain the first active ingredient and the second active ingredient in the same container or each separately contained container.

본 발명의 약제학적 조성물은 제1유효성분 및 제2유효성분을 약제학적 유효량으로 포함한다. 본 명세서에서 용어, "약제학적 유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 활성 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 유효 용량 수준은 환자의 질병 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention comprises a first effective ingredient and a second active ingredient in a pharmaceutically effective amount. As used herein, the term "pharmaceutically effective amount" refers to the amount of active ingredient or pharmaceutical composition that elicits a biological or medical response in a tissue system, animal or human, as contemplated by a researcher, veterinarian, physician or other clinician, This includes an amount that induces relief of the symptoms of the disease or disorder being treated. Effective dose levels are well known to those skilled in the art, including the type and severity of the patient ' s disease, age, sex, drug activity, drug sensitivity, time of administration, route of administration and rate of release, Can be determined according to the element.

본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.The pharmaceutical composition of the present invention includes a pharmaceutically acceptable carrier. The pharmaceutically acceptable carriers to be contained in the pharmaceutical composition of the present invention are those conventionally used in the present invention and include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, But are not limited to, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrups, methylcellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil. It is not.

본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may further contain a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, etc. in addition to the above components. Suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations are described in detail in Remington ' s Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 제1유효성분 및 제2유효성분은 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally, and in the case of parenteral administration, it can be administered by intravenous injection, subcutaneous injection, muscle injection, intraperitoneal injection, transdermal administration or the like. The first active ingredient and the second active ingredient of the present invention can be administered simultaneously or sequentially.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 예컨대 0.0001-100 ㎎/㎏이다.The appropriate dosage of the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on factors such as the formulation method, administration method, age, body weight, sex, pathological condition, food, administration time, administration route, excretion rate, . The daily dose of the pharmaceutical composition of the present invention is, for example, 0.0001-100 mg / kg.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때, 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
The pharmaceutical composition of the present invention may be formulated into a unit dose form by formulating it using a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to a method which can be easily carried out by a person having ordinary skill in the art to which the present invention belongs. Or by intrusion into a multi-dose container. Here, the formulations may be in the form of solutions, suspensions, syrups or emulsions in an oil or aqueous medium, or in the form of excipients, powders, powders, granules, tablets or capsules, and may additionally contain dispersing or stabilizing agents.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 2DG 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염; 및 (b) 아파티니브, 다코미티니브, CI-1033(Canertinib), HKI-272(Neratinib) 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 EGFR 티로신 키나아제 억제제에 대한 비소세포폐암의 내성 저해용 조성물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a pharmaceutical composition comprising (a) 2DG or a pharmaceutically acceptable salt thereof; And (b) an EGFR tyrosine kinase inhibitor comprising apapnibe, dakomitinib, CI-1033 (Canertinib), HKI-272 (Neratinib) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient. A composition for inhibiting resistance is provided.

상기 내성 저해용 조성물에 포함되는 유효성분은 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 유효성분과 동일한 것이기 때문에, 이 둘 사이의 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.Since the active ingredient contained in the composition for inhibiting tolerance is the same as the active ingredient contained in the pharmaceutical composition of the present invention, the description common to both is omitted in order to avoid the excessive complexity of the present specification.

본 명세서에서 용어, "내성"은 비소세포폐암 세포가 가역적인 EGFR TKI와 같은 항암제에 저항성을 나타내는 것으로, 게피티니브와 같은 EGFR TKI를 이용하여 폐암 환자를 치료할 때, 치료 초기부터 치료 효과가 없거나 초기에는 암 치료 효과가 있었으나 계속적인 치료 과정에서 암 치료 효과가 상실(감소)되는 것을 의미한다. 이와 같이, 항암제를 암환자에게 계속 투여하면 점차적으로 효과가 감소하는 것이 잘 알려져 있으며, 특히 비소세포폐암의 경우에는 EGFR의 돌연변이로 인하여 가역적인 EGFR TKI에 대하여 내성을 획득할 수 있음이 알려져 있다.As used herein, the term "resistant" indicates that non-small cell lung cancer cells are resistant to anticancer agents such as reversible EGFR TKI. When treating patients with lung cancer using EGFR TKI such as gefitinib, Initially, cancer treatment was effective, but the cancer treatment effect is lost (decreased) in the continuous treatment process. Thus, it is well known that the effect of chemotherapeutic agents on cancer patients is gradually reduced when they are continuously administered to cancer patients. In particular, in the case of non-small cell lung cancer, mutation of EGFR is known to obtain resistance against reversible EGFR TKI.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 비소세포폐암은 EGFR의 엑손 20번의 T790M 돌연변이에 의하여 EGFR TKI에 대한 내성을 나타낸다. 하나의 특정예에서는 상기 EGFR TKI는 게피티니브 또는 엘로티니브이다.According to one embodiment of the present invention, the non-small cell lung cancer shows resistance to EGFR TKI by mutation of T790M of exon 20 of EGFR. In one specific example, the EGFR TKI is goitinib or elotinib.

2DG는 가역적 EGFR TKI에 내성을 나타내는 비소세포폐암의 비가역적 EGFR TKI에 대한 민감성을 상승적으로 향상시키므로, 본 발명의 내성 저해용 조성물은 가역적 EGFR TKI에 무반응성 또는 저하된 반응성을 나타내는 비소세포폐암 환자의 치료를 위하여 유용하게 이용될 수 있다.
2DG synergistically enhances the sensitivity to irreversible EGFR TKI of non-small cell lung cancer that is resistant to reversible EGFR TKI, so that the composition for inhibiting resistance of the present invention is useful as a non-small cell lung cancer patient exhibiting no or low reactivity to reversible EGFR TKI And the like.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:The features and advantages of the present invention are summarized as follows:

(i) 본 발명은 비소세포폐암의 예방 또는 치료를 위한 2-Deoxy-D-glucose, 및 비가역적 EGFR TKI의 병용 제제 및 병용 용법을 제공한다.(i) The present invention provides a combined preparation and a combined use of 2-Deoxy-D-glucose and irreversible EGFR TKI for the prevention or treatment of non-small cell lung cancer.

(ii) 2-Deoxy-D-glucose는 비소세포폐암의 비가역적 EGFR TKI에 대한 민감성을 상승적으로 향상시킴으로, 본 발명의 조성물은 비소세포폐암, 특이 가역적인 EGFR TKI에 대하여 내성을 나타내는 비소세포폐암의 예방 및 치료를 위하여 유용하게 이용될 수 있다.
(ii) 2-Deoxy-D-glucose synergistically enhances the sensitivity of non-small cell lung cancer to irreversible EGFR TKI. Thus, the composition of the present invention is useful for non-small cell lung cancer, non-small cell lung cancer Can be usefully used for prevention and treatment.

도 1은 2DG가 EGFR T790M을 갖는 비소세포폐암 세포를 아파티니브에 민감하게 함을 보여준다. [A] 세포를 각 약물과 72시간 동안 인큐베이션 하였다. 세포 생존율을 MTT 분석으로 측정하였다. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001. [B] 세포에 2 mM 2DG, 100 nM 아파티니브 또는 이의 조합을 24시간 동안 처리하였다. 아넥신 V/PI 염색 및 FACS 분석으로 죽은 세포를 확인하였다.
도 2는 2DG와 아파티니브의 조합 처리가 암세포에 선택적으로 세포독성을 야기함을 보여준다. 비소세포폐암 세포(H1975 및 PC9-GR) 및 정상세포(NHBE 및 MRC5)에 2 mM 2DG, 100 nM 아파티니브 또는 이의 조합을 도에 기재된 시간 동안 처리하였다.
도 3은 2DG와 아파티니브의 조합 처리가 해당과정의 대사를 상승적으로 억제시킴을 보여준다. [A 및 B] 세포에 2 mM 2DG, 100 nM 아파티니브 또는 이의 조합을 처리하였다. 48시간 후, ATP 또는 락테이트 수준을 측정하였다. ** p < 0.01, *** p < 0.001.
도 4는 아파티니브가 Akt 활성 억제를 통하여 ATP 생산을 억제함을 보여준다. [A 및 B] mock 또는 myr-Akt 벡터의 형질도입 24시간 후, 세포에 2 mM 2DG, 100 nM 아파티니브 또는 이의 조합을 처리하였다. 48시간 후, ATP 생산 분석 또는 웨스턴 블랏 분석을 위하여 세포를 회수하였다.
도 5a는 2DG와 아파티니브의 조합 처리에 의한 세포 독성이 AMPK/mTOR/Mcl-1 신호전달경로의 조절을 통하여 매개됨을 보여준다. [A] 세포에 2 mM 2DG, 100 nM 아파티니브 또는 이의 조합을 24시간 동안 처리하고, 세포를 회수하였다. [B] 세포에 1 μM 화합물 C를 1시간 동안 처리하고 2 mM 2DG, 100 nM 아파티니브 또는 이의 조합과 함께 72시간 동안 인큐베이션 하였다. [C] AICAR를 72시간 동안 처리한 후, 세포 생존율을 MTT 분석으로 결정하였다. [D] 세포에 1 μM 화합물 C를 1시간 동안 처리하고 2 mM 2DG, 100 nM 아파티니브 또는 이의 조합과 함께 24시간 동안 인큐베이션 하였다. [E 및 F] 세포에 AICAR 또는 라파마이신을 24시간 동안 처리하고, 세포를 회수하였다. *** p < 0.001.
도 5b는 2DG와 아파티니브의 조합 처리에 의한 세포 독성이 AMPK/mTOR/Mcl-1 신호전달경로의 조절을 통하여 매개됨을 보여준다. [A] 세포에 2 mM 2DG, 100 nM 아파티니브 또는 이의 조합을 24시간 동안 처리하고, 세포를 회수하였다. [B] 세포에 1 μM 화합물 C를 1시간 동안 처리하고 2 mM 2DG, 100 nM 아파티니브 또는 이의 조합과 함께 72시간 동안 인큐베이션 하였다. [C] AICAR를 72시간 동안 처리한 후, 세포 생존율을 MTT 분석으로 결정하였다. [D] 세포에 2 mM 2DG, 100 nM 아파티니브 또는 이의 조합을 24시간 동안 처리하였다. Mcl-1, Bcl-xL 및 Bcl-2의 수준을 웨스턴 블랏으로 평가하였다. [E] 세포에 1 μM 화합물 C를 1시간 동안 처리하고 2 mM 2DG, 100 nM 아파티니브 또는 이의 조합과 함께 24시간 동안 인큐베이션 하였다. [F 및 G] 세포에 AICAR 또는 라파마이신을 24시간 동안 처리하고, 세포를 회수하였다. *** p < 0.001.
도 6은 Mcl-1 넉다운이 2DG와 아파티니브의 조합처리에 의한 세포독성과 유사한 효과를 보임을 나타낸다. Mcl-1 특이적 siRNA 또는 대조군으로 24시간 동안 형질도입한 후, 대조군 siRNA 형질도입 된 세포에 2 mM 2DG, 100 nM 아파티니브 또는 이의 조합을 처리하였다. 72시간 동안 인큐베이션 후, 세포생존율을 MTT로 평가하였다. *** p < 0.001 vs 대조군 siRNA 형질도입 된 세포.
도 7은 2DG와 아파티니브의 조합처리에 의한 글루코스 대사 억제가 Mcl-1의 전사에 영향을 미치지 않음을 보여준다. 세포에 2 mM 2DG, 100 nM 아파티니브 또는 이의 조합을 24시간 동안 처리하였다. Mcl-1의 mRNA 발현을 qRT-PCR로 측정하였다. 결과는 Mcl-1 수준 대 대조군의 비로 표현하였다.
도 8은 2DG와 아파티니브의 조합 처리에 의한 Mcl-1의 하향조절이 세포의 번역 억제를 통하여 일어남을 보여준다. [A 및 B] 세포에 2 mM 2DG, 100 nM 아파티니브 또는 이의 조합을 24시간 동안 처리하고, 20 μM MG132를 3시간 동안 또는 100 ㎍/㎖ CHX를 1시간 동안 처리하였다. Mcl-1의 정량을 β-액틴으로 정규화하고, 결과를 대조군에 대한 Mcl-1의 수준의 비로 나타내었다. [C] 세포에 1 μM 화합물 C로 1시간 동안 전처리하고, 2 mM 2DG, 100 nM 아파티니브 또는 이의 조합과 함께 24시간 동안 인큐베이션 하였다. methyl⁷-GTP pull down assay 후, 4E-BPI와 eIF4E 사이의 연관성을 웨스턴 블랏으로 규명하였다.
도 9는 DG와 아파티니브의 조합 처리에 의한 Mcl-1의 하향조절이 세포의 번역 억제를 통하여 일어남을 보여준다. PC9-GR 세포에 2 mM 2DG, 100 nM 아파티니브 또는 이의 조합을 24시간 동안 처리하였다. 각 분획의 Mcl-1, Bcl-1 및 β-액틴 mRNA의 상대적인 양을 폴리솜 구배(polysome gradient)의 전체 mRNA의 %로 표시하였다.
도 10은 2DG가 PC9-GR 종양 이종이식 모델에서 아파티니브에 의한 항-종양 활성을 증가시킴을 보여준다. [A] PC9-GR 이종이식편을 갖는 마우스에 약물을 매일 투여하였다. 데이터는 mean ㅁ SE로 표시하였다. *** p < 0.001 vs 대조군, ### p < 0.0001 vs 2DG, +++ p < 0.001 vs 아파티니브. [B] 약물 처리 5일 후, 종양 조직을 IHC 분석하였다.Figure 1 shows that 2DG sensitizes non-small cell lung cancer cells with EGFR T790M to apapnibe. [A] cells were incubated with each drug for 72 hours. Cell viability was measured by MTT assay. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001. [B] cells were treated with 2 mM 2DG, 100 nM apatapnib or a combination thereof for 24 hours. Dead cells were identified by Annexin V / PI staining and FACS analysis.
Fig. 2 shows that the combination treatment of 2DG and apatinate causes selective cytotoxicity to cancer cells. 2 mM 2DG, 100 nM apatanide, or a combination thereof was treated with non-small cell lung cancer cells (H1975 and PC9-GR) and normal cells (NHBE and MRC5) for the time indicated in the figure.
Figure 3 shows that the combination treatment of 2DG and apatineib synergistically inhibits the metabolism of the process. [A and B] cells were treated with 2 mM 2DG, 100 nM apatanide, or a combination thereof. After 48 hours, ATP or lactate levels were measured. ** p < 0.01, *** p < 0.001.
Fig. 4 shows that apapanib inhibits ATP production through inhibition of Akt activity. After 24 h of transfection of [A and B] mock or myr-Akt vectors, cells were treated with 2 mM 2DG, 100 nM apatinate, or a combination thereof. After 48 hours, the cells were harvested for ATP production assay or Western blot analysis.
Figure 5a shows that cytotoxicity by combination treatment of 2DG and apatinate is mediated through modulation of the AMPK / mTOR / Mcl-1 signaling pathway. [A] cells were treated with 2 mM 2DG, 100 nM apatanide or a combination thereof for 24 hours and the cells were recovered. [B] cells were treated with 1 [mu] M of Compound C for 1 hour and incubated for 72 hours with 2 mM 2DG, 100 nM apatanide or a combination thereof. After treatment of [C] AICAR for 72 h, cell viability was determined by MTT assay. [D] cells were treated with 1 [mu] M of Compound C for 1 hour and incubated with 2 mM 2DG, 100 nM apatanide or a combination thereof for 24 hours. [E and F] cells were treated with AICAR or rapamycin for 24 hours and cells were harvested. *** p < 0.001.
Figure 5b shows that cytotoxicity by combination treatment of 2DG and apatinate is mediated through modulation of the AMPK / mTOR / Mcl-1 signaling pathway. [A] cells were treated with 2 mM 2DG, 100 nM apatanide or a combination thereof for 24 hours and the cells were recovered. [B] cells were treated with 1 [mu] M of Compound C for 1 hour and incubated for 72 hours with 2 mM 2DG, 100 nM apatanide or a combination thereof. After treatment of [C] AICAR for 72 h, cell viability was determined by MTT assay. [D] cells were treated with 2 mM 2DG, 100 nM apatinate, or a combination thereof for 24 hours. The levels of Mcl-1, Bcl-xL and Bcl-2 were evaluated by Western blot. [E] cells were treated with 1 [mu] M of compound C for 1 hour and incubated for 24 hours with 2 mM 2DG, 100 nM apatanide or a combination thereof. [F and G] cells were treated with AICAR or rapamycin for 24 hours and the cells were recovered. *** p < 0.001.
FIG. 6 shows that Mcl-1 knockdown shows similar cytotoxic effects to the combination treatment of 2DG and apatinate. After transfection with Mcl-1 specific siRNA or control for 24 hours, control siRNA transduced cells were treated with 2 mM 2DG, 100 nM apatinate, or a combination thereof. After 72 hours of incubation, cell viability was assessed by MTT. *** p < 0.001 vs control siRNA Transduced cells.
Figure 7 shows that inhibition of glucose metabolism by combination treatment of 2DG and apatinate does not affect the transcription of Mcl-1. Cells were treated with 2 mM 2DG, 100 nM apatinate, or a combination thereof for 24 hours. Mcl-1 mRNA expression was measured by qRT-PCR. The results were expressed as the ratio of Mcl-1 level to control.
FIG. 8 shows that the down-regulation of Mcl-1 by combination treatment of 2DG and apatineib occurs through translation inhibition of cells. [A and B] cells were treated with 2 mM 2DG, 100 nM apatanide or a combination thereof for 24 hours and treated with 20 μM MG132 for 3 hours or 100 μg / ml CHX for 1 hour. The quantification of Mcl-1 was normalized with [beta] -actin and the results were expressed as the ratio of the level of Mcl-1 to the control. [C] cells were pretreated with 1 [mu] M compound C for 1 hour and incubated with 2 mM 2DG, 100 nM apatanide or a combination thereof for 24 hours. methyl ^7- GTP pull down assay, the association between 4E-BPI and eIF4E was identified by Western blot analysis.
FIG. 9 shows that the down-regulation of Mcl-1 by combination treatment of DG and apatineib occurs through translation inhibition of cells. PC9-GR cells were treated with 2 mM 2DG, 100 nM apatanide, or a combination thereof for 24 hours. The relative amounts of Mcl-1, Bcl-1 and [beta] -actin mRNA in each fraction were expressed as a percentage of total mRNA in the polysome gradient.
Figure 10 shows that 2DG increases anti-tumor activity by apathi- nide in the PC9-GR tumor xenograft model. [A] Mice with PC9-GR xenografts were dosed daily with the drug. Data were expressed as mean ㅁ SE. *** p <0.001 vs control, ### p <0.0001 vs 2DG, +++ p <0.001 vs apathetic. [B] After 5 days of drug treatment, tumor tissues were analyzed by IHC.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .

실시예Example

실험재료 및 실험방법Materials and Experiments

세포 배양Cell culture

NCI-H1975 세포(EGFR L858R/T790M)는 American Type Culture Collection (Manassas, VA)에서 구입하였다. PC9-GR 세포(EGFR delE746_A750/T790M)는 Lee JC(한국원자력의학원)로부터 제공받았다. PC9-GR 세포의 EGFR T790M 돌연변이의 존재를 직접 서열분석(direct sequencing)으로 확인하였다. 상기 두 세포는 10% 소태아 혈청을 함유하는 RPMI 1640(HyClone, Logan, UT)에서 배양하였다.
NCI-H1975 cells (EGFR L858R / T790M) were purchased from the American Type Culture Collection (Manassas, Va.). PC9-GR cells (EGFR delE746_A750 / T790M) were obtained from Lee JC (Korea Atomic Energy Academy). The presence of the EGFR T790M mutation in PC9-GR cells was confirmed by direct sequencing. The two cells were cultured in RPMI 1640 (HyClone, Logan, UT) containing 10% fetal bovine serum.

시약 및 항체Reagents and Antibodies

아파티니브는 Boehringer Ingelheim Pharma(Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co KG, 독일)에서 제공받았다. AICAR(5-aminoimidazole-4-carboxamide 1-β-D-ribofuranoside) 및 사이클로헥사미드(cycloheximide)는 Sigma에서 얻었다. 항-β-액틴 항체는 Santa Cruz Biotechnology로부터 얻었으며, 다른 모든 항체들은 Cell Signaling에서 구입하였다. 모든 다른 시약들은 Calbiochem에서 구입하였다.
Acapaine was obtained from Boehringer Ingelheim Pharma (Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co KG, Germany). AICAR (5-aminoimidazole-4-carboxamide 1-β-D-ribofuranoside) and cycloheximide were obtained from Sigma. Anti-β-actin antibodies were obtained from Santa Cruz Biotechnology, and all other antibodies were purchased from Cell Signaling. All other reagents were purchased from Calbiochem.

세포 생존율 분석Cell survival analysis

약물과 72시간 동안 인큐베이션 한 후, MTT(Amresco, Solon, OH) 0.5 mg/㎖를 배지에 첨가하였다. 생존 가능한 세포의 포르마잔 결정을 100 ㎕ DMSO로 용해하였다. MTT 포르마잔 생성물의 흡광도 값은 마이크로플레이트 리더기로 565 nm에서 확인하였다. 모든 실험은 세 번 반복하여 실시하였다.
After incubation with the drug for 72 hours, 0.5 mg / ml of MTT (Amresco, Solon, OH) was added to the medium. The formazan crystals of viable cells were dissolved in 100 [mu] l DMSO. The absorbance value of MTT formazan product was confirmed at 565 nm with a microplate reader. All experiments were repeated three times.

아넥신 V/프로피디움 요오드화물 염색을 이용한 세포 사멸 분석Analysis of apoptosis using annexin V / propidium iodide staining

아넥신 V/프로피디움 요오드화물(PI) 이중염색을 제조사(BD Pharmigen, San Diego, CA)의 지시에 따라 수행하였다. 간략히 설명하면, 세포를 1X 결합 버퍼에서 아넥신 V/PI와 함께 15분간 인큐베이션하고, 유세포 분석기(BD Biosciences, San Jose, CA)로 분석하였다. WinMDI 2.9 소프트웨어(Salk Institute, La Jolla, CA)를 사용하여 데이터 처리를 하였다.
Annexin V / propidium iodide (PI) double staining was performed according to the manufacturer's instructions (BD Pharmigen, San Diego, Calif.). Briefly, cells were incubated with Annexin V / PI in 1X binding buffer for 15 minutes and analyzed with a flow cytometer (BD Biosciences, San Jose, Calif.). Data was processed using WinMDI 2.9 software (Salk Institute, La Jolla, Calif.).

세포 내 ATP 분석Intracellular ATP analysis

ATP 비색 분석 키트(ATP colorimetric assay kit; Abcam, Cambridge, MA)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 세포 내 ATP를 측정하였다. 간략히 설명하면, 원심분리(13,000 rpm, 5분, 4℃) 후 세포 용해물을 ATP 반응 혼합물과 함께 30분 동안 인큐베이션 하였다. 각 웰 안의 혼합물의 흡광도 값은 마이크로플레이트 리더기로 570 nm에서 확인하였다. ATP 농도를 표준 곡선을 이용하여 계산하고, 세포수에 대하여 정규화(normalization)하였다.
Intracellular ATP was measured using the ATP colorimetric assay kit (Abcam, Cambridge, Mass.) According to the manufacturer's instructions. Briefly, cell lysates were incubated with the ATP reaction mixture for 30 minutes after centrifugation (13,000 rpm, 5 min, 4 ° C). The absorbance values of the mixtures in each well were confirmed at 570 nm with a microplate reader. ATP concentration was calculated using a standard curve and normalized to the number of cells.

락테이트(Lactate) 생산 분석Lactate production analysis

락테이트 분석 키트(lactate assay kit; Biovision, Mountain View, CA)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 락테이트 생산을 측정하였다. 간략히 설명하면, 원심분리(13,000 rpm, 15분, 4℃) 후 락테이트 어세이 버퍼로 세포 배양배지를 희석하고, 락테이트 반응 혼합물과 30분 동안 혼합하였다. 각 웰 안의 혼합물의 흡광도 값은 마이크로플레이트 리더기로 570 nm에서 확인하였다. 락테이트 농도를 표준 곡선을 이용하여 계산하고, 세포수에 대하여 정규화 하였다.
Lactate production was measured according to the manufacturer's instructions using a lactate assay kit (Biovision, Mountain View, Calif.). Briefly, after centrifugation (13,000 rpm, 15 min, 4 ° C), the cell culture medium was diluted with lactate assay buffer and mixed with the lactate reaction mixture for 30 minutes. The absorbance values of the mixtures in each well were confirmed at 570 nm with a microplate reader. The lactate concentration was calculated using a standard curve and normalized to the number of cells.

일시적 형질도입(Transient transfection)Transient transfection

pUseAkt-CA(myristoylated constitutively active Akt) 플라스미드는 Lee JC(한국원자력의학원)로부터 제공받았다. 리포펙타민^TM2000(Invitrogen)을 사용하여 제조사의 지시에 따라 형질도입을 수행하였다. 간략히 설명하면, 상기 시약을 이용하여 세포들을 DNA(1.5 μg/웰)로 형질도입하고, 신선한 성장 배지로 교체하여 주었다. 24시간 후, 세포에 약물을 처리하였다.
The pUseAkt-CA (myristoylated constitutively active Akt) plasmid was obtained from Lee JC (Korea Atomic Science Institute). Transformation was performed using lipofectamine ^TM 2000 (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions. Briefly, cells were transfected with DNA (1.5 μg / well) using the above reagents and replaced with fresh growth medium. After 24 hours, the cells were treated with the drug.

웨스턴 블랏 분석Western blot analysis

세포 용해물을 제조하고, 동량의 단백질을 SDS-PAGE로 분별하고, 니트로셀룰로스 막(BioRAD)으로 옮겼다. 5% 탈지유로 막을 블락하고, 4℃에서 하룻밤 동안 항체와 함께 인큐베이션 하였다. HRP-결합된 이차항체와 ECL 화학발광 검출 시스템(Amersham-Pharmacia Biotech)을 사용하여 단백질을 검출하였다.
Cell lysates were prepared, equal amounts of protein were separated by SDS-PAGE and transferred to a nitrocellulose membrane (BioRAD). Membranes were blocked with 5% skim milk and incubated with the antibody overnight at 4 < 0 > C. Proteins were detected using an HRP-conjugated secondary antibody and an ECL chemiluminescence detection system (Amersham-Pharmacia Biotech).

MethylMethyl ⁷⁷ -GTP sepharose 4B pull-down 분석-GTP sepharose 4B pull-down analysis

세포 용해물 450 ㎍을 50 ㎕ methyl⁷-GTP sepharose 4B bead(Amersham Biosciences)와 함께 4℃에서 두 시간 동안 인큐베이션 하였다. 비드를 세척하고, 2X 샘플 버퍼에서 끓였다. SDS-PAGE 분리 후, 4E-BPI와 eIF4E의 연관성을 웨스턴 블랏으로 검출하였다.
450 [mu] g of cell lysate was incubated with 50 [mu] l of methyl ^7- GTP sepharose 4B bead (Amersham Biosciences) at 4 [deg.] C for two hours. The beads were washed and boiled in 2X sample buffer. After SDS-PAGE separation, the association of 4E-BPI with eIF4E was detected by Western blot.

qRT-PCRqRT-PCR

SYBR 녹색 검출 프로토콜을 사용하여 7500 실시간 PCR 시스템((Applied Biosystems)으로 qRT-PCR을 실시하였다. 사용한 프라이머 서열은 다음과 같다:QRT-PCR was performed on a 7500 real-time PCR system (Applied Biosystems) using the SYBR green detection protocol. The primer sequences used were as follows:

Mcl-1: (F) 5'-GGACATCAAAAACGAAGACG-3'(서열목록 제1서열), (R) 5'-GCAGCTTTCTTGGTTTATGG-3'(서열목록 제2서열);Mcl-1: (F) 5'-GGACATCAAAAACGAAGACG-3 '(SEQ ID No. 1), (R) 5'-GCAGCTTTCTTGGTTTATGG-3' (SEQ ID No. 2);

Bcl-2: (F) 5'-ATGTGTGTGGAGAGCGTCAACC-3'(서열목록 제3서열), (R) 5'-TGAGCAGAGTCTTCAGAGACAGCC-3'(서열목록 제4서열);Bcl-2: (F) 5'-ATGTGTGTGGAGAGCGTCAACC-3 '(SEQ ID No. 3), (R) 5'-TGAGCAGAGTCTTCAGAGACAGCC-3' (SEQ ID No. 4);

β-actin: (F) 5'-CTGGAACGGTGAAGGTGACA-3'(서열목록 제5서열); (R) 5'-AAGGGACTTCCTGTAACAATGCA -3'(서열목록 제6서열).
? -actin: (F) 5'-CTGGAACGGTGAAGGTGACA-3 '(SEQ ID No. 5); (R) 5'-AAGGGACTTCCTGTAACAATGCA -3 '(SEQ ID No. 6).

이종이식 실험(Xenograft studies)Xenograft studies

모든 암컷 무흉선 BALB-c/nu 마우스(5-6 주령; Orient Bio, 한국)는 연세대학교 의과대학의 동물 연구 위원회 지침에 따라 다루었으며, 모든 시설은 AAALAC (association of assessment and accreditation of laboratory animal care)에 의하여 승인받았다. PC9-GR 세포(5 X 10⁶)를 마우스에 피하 주사하였다. 종양 부피가 약 70 mm³에 도달한 후 마우스들을 대조군(vehicle control), 아파티니브 단독군, 2DG 단독군 또는 아파티니브와 2DG의 조합군으로 각 군마다 6마리의 마우스를 분배하였다. 아파티니브를 0.4% 트윈 80이 함유된 0.5% (w/v) 메틸셀룰로오스에서 현탁하고, 가비지(gavage)로 하루 한번 5 mg/kg을 경구 투여하였다. 2DG를 식염수에 용해하고, 500 mg/kg의 하루 투여량으로 복강 내 투여하였다. 캘리퍼(caliper)를 사용하여 2일 간격으로 종양 크기를 측정하였다. 각 그룹의 평균 종양 부피를 하기 prolate spheroid 식에 따라 계산하여 mm³으로 표시하였다.All female athymic BALB-c / nu mice (5-6 weeks of age, Orient Bio, Korea) were treated according to the guidelines of the Animal Research Council of the Yonsei University College of Medicine and all facilities were accredited by AAALAC ). PC9-GR cells (5 × 10 ⁶ ) were subcutaneously injected into mice. After the tumoral volume reached about 70 mm ³ , mice were divided into 6 groups of vehicle control, apatinate-naïve group, 2DG-alone group, or combination of apatinib and 2DG in each group. Afpanib was suspended in 0.5% (w / v) methylcellulose containing 0.4% Tween 80 and administered orally 5 mg / kg once a day with gavage. 2DG was dissolved in saline and administered intraperitoneally at a daily dose of 500 mg / kg. Tumor size was measured at 2-day intervals using a caliper. The average tumor volume of each group was calculated according to the following prolate spheroid formula and expressed as mm ³ .

[수학식][Mathematical Expression]

종양 부피 = 0.523 × 대 직경 × (소 직경)²
Tumor volume = 0.523 x large diameter x (small diameter) ²

면역조직화학(Immunohistochemistry, IHC)Immunohistochemistry (IHC)

종양을 파라핀 포메하고, 절단하였다(4 ㎛). 조직 단편들을 탈파라핀하고, 에탄올에 적신 후, 0.01 mol/ℓ시트르산 나트륨 버퍼(pH 6.0)에서 마이크로파 처리를 한 다음 3% H₂O₂에서 10분 동안 인큐베이션 하였다. 1% BSA이 함유된 PBS에서 10분간 인큐베이션 한 후, 단편들을 마우스 항-PCNA 단일클론항체(1:300 희석), 래빗 항-p-AMPKα-T172 단일클론항체(1:100 희석), 래빗 항-p-mTOR-S2448 단일클론항체(1:100 희석) 및 래빗 항-Mcl-1 단일클론항체(1:100 희석)와 함께 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션 하였다. 페록시다아제-결합된 이차항체와 인큐베이션 한 후, 다이아미노벤지딘(diaminobenzidine)을 사용하여 페록시다아제 활성을 확인하였다.
The tumor was cut with paraffin pore (4 쨉 m). Tissue fractions were deparaffinized and wetted with ethanol, microwaved in 0.01 mol / l sodium citrate buffer (pH 6.0) and incubated in 3% H ₂ O ₂ for 10 min. After incubation in PBS containing 1% BSA for 10 minutes, the fragments were incubated with mouse anti-PCNA monoclonal antibody (1: 300 dilution), rabbit anti-p-AMPKa-T172 monoclonal antibody (1: p-mTOR-S2448 monoclonal antibody (1: 100 dilution) and rabbit anti-Mcl-1 monoclonal antibody (1: 100 dilution) overnight at 4 占 폚. After incubation with a peroxidase-conjugated secondary antibody, peroxidase activity was confirmed using diaminobenzidine.

통계 분석Statistical analysis

인 비트로 결과를 mean ± SD로 표시하였고, 인 비보 결과는 mean ± SE로 표시하였다. 그룹간의 통계적 유의성을 결정하기 위하여 Student's t-test를 실시하였고, p < 0.05를 통계적으로 유의성 있는 값으로 고려하였다.
In vitro results were expressed as mean ± SD, and in vivo results were expressed as mean ± SE. Student's t-test was performed to determine statistical significance between groups, and p <0.05 was considered to be statistically significant.

실험결과Experiment result

해당과정의 억제는 EGFR T790M 돌연변이를 갖는 비소세포폐암 세포의 아파티니브에 대한 민감도를 증진시킨다.Inhibition of this process enhances the sensitivity of apoptinib to non-small cell lung cancer cells with the EGFR T790M mutation.

본 발명자들은 먼저 MTT 분석을 통하여 글루코스 대사의 억제가 아파티니브-유도된 세포독성을 증진시킬 수 있는지를 확인하였다. 해당과정을 억제시키기 위하여 2DG(2-deoxy-D-glucose)를 사용하였다. 2DG는 글루코스의 비-대사형태이며, 해당과정의 1차 속도조절 단계의 억제제로서 알려져 있다(Wu M, et al. Am J Physiol Cell Physiol. 2007;292:C125-36). 그 결과, 2DG 처리는 용량 의존적으로 세포 생존율을 감소시켰으며, H1975 및 PC9-GR 세포에서 아파티니브에 대한 민감도를 현저하게 증진시켰다(도 1의 A). 또한, 2DG 처리는 아파티니브에 의한 세포사를 증진시켰다(도 1의 B).The present inventors first confirmed by MTT analysis that inhibition of glucose metabolism can promote apapnibe-induced cytotoxicity. 2DG (2-deoxy-D-glucose) was used to inhibit the process. 2DG is a non-metabolic form of glucose and is known as an inhibitor of the primary rate-controlling step of the process (Wu M, et al ., Am J Physiol Cell Physiol . 2007; 292: C 125-36). As a result, 2DG treatment reduced cell survival in a dose-dependent manner and markedly enhanced sensitivity to apatinate in H1975 and PC9-GR cells (Fig. 1A). In addition, 2DG treatment enhanced apoptotic cell death (Fig. 1B).

나아가 도 2에 나타난 바와 같이, H1975 및 PC9-GR을 포함하는 비소세포폐암 세포에서 2DG 또는 아파티니브 단독 처리에 의하여 시간 의존적으로 세포 성장이 억제되었다. 2DG와 아파티니브의 병용은 시간 의존적으로 세포 성장을 상승적으로(synergistically) 억제하였으며, 세포수 역시 감소시켰다. 암세포와는 반대로, NHBE 및 MRC5를 포함하는 정상 세포에서는 세포 성장이 2DG 또는 아파티니브 단독 처리에 의하여 거의 억제되지 않았다. 세포 성장에 대한 병용의 억제 효과는 암세포에서 관찰된 것 보다 훨씬 낮았다. 상기의 실험결과는 2DG와 아파티니브의 병용처리가 암세포 선택적으로 세포독성을 나타냄을 의미한다.
Furthermore, as shown in Fig. 2, cell growth was inhibited in a time-dependent manner by 2DG or apatinate alone treatment in non-small cell lung cancer cells including H1975 and PC9-GR. The combination of 2DG and apatinate inhibited cell growth synergistically in a time-dependent manner and also reduced the number of cells. Contrary to cancer cells, in normal cells containing NHBE and MRC5, cell growth was hardly inhibited by 2DG or apatinate alone treatment. The inhibitory effect of the combination on cell growth was much lower than that observed in cancer cells. The above experimental results indicate that the combination treatment of 2DG and apatinebine selectively cytotoxic to cancer cells.

2DG 및 아파티니브의 병용은 암세포의 대사를 방해하고 ATP 고갈을 유도한다.The combination of 2DG and apatinate inhibits the metabolism of cancer cells and induces ATP depletion.

2DG 처리가 해당과정을 억제하는지 확인하기 위하여 세포 내 ATP 분석 및 락테이트(호기적 해당의 생산물) 분석을 실시하였다. 2DG 단독 처리는 H1975 및 PC9-GR 세포에서 세포 내 ATP 수준과 락테이드 생산의 현저한 감소를 초래하였다. 흥미롭게도, 아파티니브 단독 처리 역시 상기 두 세포에서 세포 내 ATP 양과 락테이트 수준을 감소시켰다. 2DG 및 아파티니브의 병용처리는 상승적으로 ATP 고갈을 유도하고, 락테이트 생산을 감소시켰다(도 3). 이러한 실험결과는 2DG 및 아파티니브의 병용처리가 암세포에서 글루코스 대사를 효과적으로 억제할 수 있음을 보여준다.Intracellular ATP analysis and lactate (product of aerobic equivalent) analysis were performed to confirm that 2DG treatment inhibited the process. 2DG alone resulted in a significant reduction in intracellular ATP levels and lactate production in H1975 and PC9-GR cells. Interestingly, apatinate alone treatment also reduced intracellular ATP levels and lactate levels in both cells. Combined treatment of 2DG and apatinate resulted in synergistic induction of ATP depletion and reduced lactate production (FIG. 3). These experimental results show that the combined treatment of 2DG and apatineib can effectively inhibit glucose metabolism in cancer cells.

다음으로, 아파티니브가 어떻게 암세포의 글루코스 대사를 억제하는지 조사하였다. PI3K/Akt 신호전달경로는 해당과정의 양성적 조절자로서 알려져 있다(Elstrom RL, et al. Cancer Res. 2004;64:3892-9). 아파티니브는 ErbB 패밀리의 차단(blockade)을 통한 Akt 활성 억제 효과를 가지고 있음이 알려져 있다( Takezawa K, et al. Mol Cancer Ther. 2010;9:1647-56). 따라서, Akt가 아파티니브에 의해 유도된 해당과정의 억제와 관련되어 있는지 조사하였다. 도 4에 나타난 바와 같이, H1975 및 PC9-GR 세포에서 Akt는 아파티니브 단독 처리에 의하여 두드러지게 불활성화 되었으나, 2DG 단독 처리에 의해서는 그렇지 않았다. 상기 두 세포에서 myr-AKT의 강화된 발현에 의한 상시적 Akt 활성화의 유도는 아파티니브 단독 및 아파티니브와 2DG의 병용처리의 억제 효과를 Akt 활성화 및 ATP 생산에서 없어지게 하였다. 이러한 실험결과는 아파티니브에 의한 해당과정의 억제가 Akt 활성의 억제를 통하여 매개됨을 나타낸다.
Next, we examined how apapanib suppresses glucose metabolism in cancer cells. The PI3K / Akt signaling pathway is known to be a positive regulator of the process (Elstrom RL, et al . Cancer Res . 2004; 64: 3892-9). It is known that apapnib has an inhibitory effect on Akt activity through blockade of the ErbB family (Takezawa K, et al . Mol Cancer Ther . 2010; 9: 1647-56). Thus, we investigated whether Akt is associated with inhibition of the corresponding process induced by apapanib. As shown in Fig. 4, in the H1975 and PC9-GR cells, Akt was significantly inactivated by treatment with apatinate, but not with 2DG alone. Induction of normal Akt activation by enhanced expression of myr-AKT in both cells resulted in the inhibition of apoptinib alone and in combination with apatinib and 2DG in Akt activation and ATP production. These results indicate that the inhibition of the process by apapanib is mediated through the inhibition of Akt activity.

2DG 및 아파티니브의 병용에 의한 세포독성은 AMPK/mTOR/Mcl-1 신호전달경로의 조절에 의하여 매개된다.Cytotoxicity by combination of 2DG and apatinate is mediated by modulation of the AMPK / mTOR / Mcl-1 signaling pathway.

AMPK는 세포의 AMP/ATP 비를 증가시키는 자극에 의하여 활성화되는 것으로 알려져 있다(El Mjiyad N, et al. Oncogene. 2011;30:253-64). 따라서, 2DG 및 아파티니브에 의하여 유도된 ATP 고갈이 AMPK를 활성화할 수 있는지 조사하였다. H1975 및 PC-9GR 세포에서, 2DG 및 아파티니브의 병용은 AMPK의 현저한 활성화를 유도하였다(도 5a 및 5b). AMPK 억제제(compound C)의 처리는 상기 두 세포에서 2DG 및 아파티니브의 병용처리에 의하여 유도된 세포 생존율의 감소를 방지하였으며, 이는 2DG 및 아파티니브 병용의 상승적 세포독성이 AMPK 활성화에 의하여 매개됨을 시사한다(도 5a 및 5b). AMPK 활성화가 종양 세포의 세포독성을 매개할 수 있는지를 확인하기 위하여 AICAR 및 AMPK 억제제를 사용하였다. H1975 및 PC9-GR 세포에서, AICAR 처리는 용량 의존적으로 세포 생존율을 현저하게 감소시켰다(각 도 5의 C). 상기의 실험결과는 2DG 및 아파티니브의 병용처리는 EGFR T790M을 갖는 NSCLC 세포에서 AMPK 활성화를 통하여 세포독성을 야기함을 보여준다. AMPK is known to be activated by stimulation that increases the AMP / ATP ratio of cells (El Mjiyad N, et al . Oncogene . 2011; 30: 253-64). Therefore, we investigated whether ATP depletion induced by 2DG and apatinate could activate AMPK. In H1975 and PC-9GR cells, the combination of 2DG and apatinate induced significant activation of AMPK (FIGS. 5A and 5B). Treatment of the AMPK inhibitor (compound C) prevented the reduction of cell survival induced by the combination of 2DG and apatinate in the two cells, suggesting that synergistic cytotoxicity of 2DG and apathetic combination was mediated by AMPK activation (Figs. 5A and 5B). AICAR and AMPK inhibitors were used to determine whether AMPK activation could mediate cytotoxicity of tumor cells. In H1975 and PC9-GR cells, AICAR treatment significantly decreased cell viability in a dose-dependent manner (C in Figure 5). The above experimental results show that the combination treatment of 2DG and apatinate causes cytotoxicity through AMPK activation in NSCLC cells with EGFR T790M.

항-아폽토시스 Bcl-2 패밀리 단백질의 유지가 대사 스트레스 하에서의 생존에 중요한 역할을 하고 있음이 알려져 있다(Wensveen FM, et al. Apoptosis. 2011;16:708-21). 따라서, 2DG 및 아파티니브의 병용이 Mcl-1, Bcl-2 및 Bcl-xL과 같은 항-아폽토시스 Bcl-2 패밀리 단백질의 발현수준에 영향을 미치는지를 조사하였다. 2DG 단독 또는 아파티니브 단독 처리는 PC9-GR 세포에서 Mcl-1 수준을 감소시켰고, 2DG와 아파티니브의 병용처리는 상승적으로 Mcl-1 수준을 감소시켰다. 그러나, 2DG와 아파티니브의 단독 및 병용처리는 Bcl-2 또는 Bcl-xL 수준에는 영향을 미치지 않았다(도 5). Mcl-1의 유지가 세포 생존에 중요함을 확인하기 위하여 siMcl-1를 이용한 Mcl-1 넉다운이 암세포의 생존율을 감소시킬 수 있는지 조사하였다. MTT 분석은 siMcl-1 처리에 의하여 H1975 및 PC9-GR 세포에서 2DG와 아파티니브의 병용처리와 유사하게 세포 성장이 현저히 억제하였다(도 6). 이러한 실험결과는 2DG와 아파티니브의 병용처리에 의한 Mcl-1의 하향조절이 EGFR T790M을 갖는 NSCLC 세포의 성장 억제에 중요함을 의미한다.It is known that the maintenance of anti-apoptotic Bcl-2 family protein plays an important role in the survival under metabolic stress (Wensveen FM, et al . Apoptosis . 2011; 16: 708-21). Thus, we investigated whether the combination of 2DG and apatapnib affect the expression levels of anti-apoptotic Bcl-2 family proteins such as Mcl-1, Bcl-2 and Bcl-xL. 2DG alone or treatment with apatinate reduced Mcl-1 levels in PC9-GR cells, and the combination of 2DG and apatinate reduced synergistic Mcl-1 levels. However, the treatment with 2DG and apatinate alone or in combination did not affect Bcl-2 or Bcl-xL levels (Fig. 5). To confirm that maintenance of Mcl-1 is important for cell survival, we investigated whether siRNA-1 knockdown could reduce the survival rate of cancer cells. MTT assay significantly inhibited cell growth similar to the combination treatment of 2DG and apatinate in H1975 and PC9-GR cells by siMcl-1 treatment (Fig. 6). These results indicate that down-regulation of Mcl-1 by combination treatment of 2DG and apatineib is important for inhibiting the growth of NSCLC cells with EGFR T790M.

다음으로, Mcl-1의 하향조절이 2DG와 아파타나브의 처리에 따라 AMPK/mTOR 신호전달경로의 변화를 통하여 매개되는지를 조사하였다. 도 5에 나타난 바와 같이, 2DG와 아파티니브의 병용처리는 H1975 및 PC9-GR 세포에서 상승적으로 AMPK 활성화와 Mcl-1 하향조절을 유도하였다. 또한, 2DG와 아파티니브의 병용처리에 따라 mTOR 억제가 나타났다. 2DG와 아파티니브에 의한 mTOR 억제 및 Mcl-1 하향조절은 compound C의 존재하에서 현저하게 회복되었다. 상기 두 세포에서, AICAR 처리는 용량 의존적으로 mTOR를 억제하고, Mcl-1 수준을 감소시켰다(도 5a의 E 및 도 5b의 F). 또한, 라파마이신(mTOR 억제제) 처리는 H1975 및 PC9-GR 세포에서 Mcl-1 수준을 감소시켰다(도 5a의 F 및 도 5b의 G). 이러한 실험결과는 2DG와 아파티니브의 병용처리에 의한 해당과정의 억제에 따른 AMPK 활성화 및 mTOR 억제가 Mcl-1의 하향조절을 초래하나, 다른 Bcl-2 항-아폽토시스 인자는 하향발현 시키지 않음을 나타낸다.
Next, we examined whether down-regulation of Mcl-1 is mediated through changes in the AMPK / mTOR signaling pathway following treatment with 2DG and apatanav. As shown in FIG. 5, the combination treatment of 2DG and apatinate induced synergistic AMPK activation and down-regulation of Mcl-1 in H1975 and PC9-GR cells. In addition, mTOR inhibition was shown by combination treatment of 2DG and apatinate. MTOR inhibition and Mcl-1 downregulation by 2DG and apatinate were significantly restored in the presence of compound C. In these two cells, AICAR treatment inhibited mTOR in a dose-dependent manner and decreased Mcl-1 levels (Fig. 5A E and Fig. 5B F). In addition, rapamycin (mTOR inhibitor) treatment reduced Mcl-1 levels in H1975 and PC9-GR cells (F in Figure 5a and G in Figure 5b). These results indicate that AMPK activation and mTOR inhibition result in down-regulation of Mcl-1, but not down-expression of other Bcl-2 anti-apoptotic factors, by inhibition of the process by the combination of 2DG and apatinate .

Mcl-1은 2DG와 아파티니브의 병용처리에 의한 해당과정 억제에 따른 번역 메커니즘을 통하여 하향조절된다.Mcl-1 is down-regulated through the translational mechanism by the inhibition of the corresponding process by the combination treatment of 2DG and apatinate.

도 7에 나타난 바와 같이, Mcl-1 mRNA 수준은 2DG 또는 아파티니브 단독 혹은 병용처리에 의하여 영향을 받지 않으며, 이러한 결과는 Mcl-1 수준은 전사 수준에서 조절되지 않음을 의미한다. Mcl-1 조절의 중심 메커니즘이 유비퀴틴-매개된 프로테아솜 분해라는 사실이 알려져 있음을 고려하여(Zhong Q, et al. Cell. 2005;121:1085-95), 프로테아솜 억제제(MG132)의 존재하에서 Mcl-1 단백질 수준을 모니터링 하였다. H1975 및 PC9-GR 세포에서, MG132 처리 후의 Mcl-1 수준의 상대적인 변화는 비록 2DG와 아파티니브의 병용처리에서 MG132 처리에서 보다 Mcl-1 단백질 수준이 낮았으나, 2DG 또는 아파티니브 단독 혹은 이의 병용처리에서 차이가 없었다(각 도 8의 A). 또한, 2DG, 아파티니브 또는 이의 병용처리에 의한 Mcl-1의 반감기는 단백질 생합성 억제제(cycloheximide)의 존재하에서 가속화되지 않았다(각 도 8의 B). 상기의 실험결과는 2DG와 아파티니브의 병용처리에 의한 Mcl-1 수준의 현저한 감소는 전사 및 번역 후 조절에 의한 것이 아님을 보여준다.As shown in FIG. 7, the level of Mcl-1 mRNA is not affected by treatment with 2DG or apatinate alone or in combination, which means that the level of Mcl-1 is not regulated at the transcription level. (Zhong Q, et al . Cell . 2005; 121: 1085-95), that the central mechanism of Mcl-1 regulation is ubiquitin-mediated proteasome degradation Lt; RTI ID = 0.0 > Mcl-1 < / RTI > In H1975 and PC9-GR cells, the relative change in Mcl-1 levels after treatment with MG132, although the level of Mcl-1 protein was lower than in MG132 treatment in combination with 2DG and apatinate, There was no difference in the combination treatment (Fig. 8A). In addition, the half-life of Mcl-1 by 2DG, apatinate or its combination treatment was not accelerated in the presence of a protein biosynthesis inhibitor (B in Fig. 8B). The above experimental results show that a significant decrease in Mcl-1 levels by combination treatment of 2DG and apatinate is not due to transcriptional and post-translational regulation.

다음으로, 2DG 및 아파티니브에 의한 Mcl-1 하향조절이 번역 수준에서 조절되는지를 조사하였다. 번역 억제(translational inhibition)에 의한 Mcl-1 하향조절의 가능성은 mRNA의 5′cap 구조와 유사한 methyl⁷-GTP sepharose 4B bead를 사용한 실험에 의하여 지지되었다. 각 도 8의 C에 나타난 바와 같이, methyl⁷-GTP pull-down 분석은 번역 억제자인 4E-BP1의 결합이 2DG와 아파티니브의 병용처리에 의하여 상승적으로 증가되었으며, compound C의 첨가에 의하여 현저하게 감소되었으며, 이러한 결과는 2DG와 아파티니브의 병용에 의한 번역 억제가 AMPK 의존적 방식으로 일어남을 의미한다. 해당과정의 억제가 Mcl-1 번역을 특이적으로 차단하는지 확인하기 위하여, PC9-GR 세포에서 2DG 또는 아파티니브 단독 혹은 병용처리에 따른 Mcl-1의 폴리솜 분포(polysome distribution)를 모티터링 하였다. 도 9에 나타난 바와 같이, 폴리솜과 연합된 Mcl-1 mRNA의 양은 2DG와 아파티니브의 병용처리에 의하여 현저하게 감소하였다. 동일한 조건에서, 대조군 mRNA(β-액틴) 또는 Bcl-2의 폴리솜 분포는 Mcl-1과 비교하여 크게 영향 받지 않았다. 이러한 실험결과는 Bcl-2 패밀리 중에서 Mcl-1은 2DG와 아파티니브의 병용처리에 의하여 번역 수준에서 특이적으로 하향조절 됨을 의미한다.
Next, we examined whether the down-regulation of Mcl-1 by 2DG and apatamin was regulated at the translation level. The possibility of down-regulation of Mcl-1 by translational inhibition was supported by an experiment using a methyl ^7- GTP sepharose 4B bead similar to the 5'cap structure of mRNA. As shown in FIG. 8C, methyl ^7- GTP pull-down analysis showed that the binding of 4E-BP1, a translational inhibitor, was synergistically increased by the combination treatment of 2DG and apatinate, This result implies that the inhibition of translation by the combination of 2DG and apatineib occurs in an AMPK-dependent manner. In order to confirm whether the inhibition of the process specifically blocked Mcl-1 translation, the polysome distribution of Mcl-1 was monitored by 2DG or apatinate alone or in combination with PC9-GR cells . As shown in Fig. 9, the amount of Mcl-1 mRNA associated with polysomes was significantly reduced by the combination treatment of 2DG and apatinate. Under the same conditions, the distribution of the polysomes of control mRNA (beta -actin) or Bcl-2 was not significantly affected compared to Mcl-1. These results indicate that Mcl-1 in the Bcl-2 family is specifically down-regulated at the translation level by the combination of 2DG and apatinate.

2DG 첨가는 PC9-GR 이종이식 모델에서 아파티니브의 항-종양 활성을 상승적으로 증진시킨다.2DG additionally synergistically enhances the anti-tumor activity of apapanib in the PC9-GR xenograft model.

2DG와 아파티니브의 병용 치료에 따른 항-종양 활성을 조사하기 위하여, PC9-GR이 이식된 무흉성 누드 마우스를 대조군, 2DG, 아파티니브 또는 이의 조합으로 처리하였다. 30일 동안의 아파티니브 단독치료는 대조군과 비교하여 종양의 성장을 지연시켰다. 2DG 단독치료는 두드러진 항-종양 활성을 보이지 못했다. 특히, 2DG와 아파티니브의 병용처리는 현저한 종양 억제를 나타내었다(도 10의 A). 또한, 2DG와 아파티니브 병용처리의 상승적인 항-종양 활성을 PCNA(세포 증식 마커)에 대한 IHC 염색으로 확인하였다(도 10의 B). 인 비트로 결과와 마찬가지로, 2DG와 아파티니브의 병용처리에 의하여 mTOR 및 Mcl-1에 대한 염색은 현저하게 감소하였으나, p-AMPK 염색은 뚜렷하게 증가하였다. 상기의 인 비트로 및 인 비보 실험결과는, 글루코스 대사가 EGFR T790M 돌연변이를 갖는 비소세포폐암에서 아파티니브의 민감성(susceptibility) 증진을 위한 유망한 치료적 타겟임을 보여준다.
In order to investigate anti-tumor activity following combination therapy of 2DG and apatinate, PC9-GR transplanted anhid nude mice were treated with control, 2DG, apatinate, or a combination thereof. Treatment with apatinate alone for 30 days delayed tumor growth compared with the control group. 2DG monotherapy showed no significant anti-tumor activity. In particular, the combination treatment of 2DG and apatinate showed significant tumor suppression (Fig. 10A). In addition, synergistic anti-tumor activity of 2DG and apapanibe combination treatment was confirmed by IHC staining for PCNA (cell proliferation marker) (Fig. 10B). Similar to in vitro results, the combined treatment of 2DG and apatinate resulted in a marked decrease in staining for mTOR and Mcl-1, but a marked increase in p-AMPK staining. The above in vitro and in vivo experimental results show that glucose metabolism is a promising therapeutic target for enhancing the susceptibility of apapnib in non-small cell lung cancer with EGFR T790M mutation.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the same is by way of illustration and example only and is not to be construed as limiting the scope of the present invention. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University JE UK Inc. <120> Compositions for preventing or treating non-small cell lung cancer having synergistically therapeutic effects <130> PN120693 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> foward primer for Mcl-1 <400> 1 ggacatcaaa aacgaagacg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Mcl-1 <400> 2 gcagctttct tggtttatgg 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> foward primer for Bcl-2 <400> 3 atgtgtgtgg agagcgtcaa cc 22 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Bcl-2 <400> 4 tgagcagagt cttcagagac agcc 24 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> foward primer for beta-actin <400> 5 ctggaacggt gaaggtgaca 20 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for beta-actin <400> 6 aagggacttc ctgtaacaat gca 23 <110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University JE UK Inc. <120> Compositions for preventing or treating non-small cell lung cancer having synergistically therapeutic effects <130> PN120693 <160> 6 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> foward primer for Mcl-1 <400> 1 ggacatcaaa aacgaagacg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Mcl-1 <400> 2 gcagctttct tggtttatgg 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> foward primer for Bcl-2 <400> 3 atgtgtgtgg agagcgtcaa cc 22 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Bcl-2 <400> 4 tgagcagagt cttcagagac agcc 24 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> foward primer for beta-actin <400> 5 ctggaacggt gaaggtgaca 20 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for beta-actin <400> 6 aagggacttc ctgtaacaat gca 23

Claims

(a) 2DG(2-Deoxy-D-glucose) 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염; 및 (b) 아파티니브(afatinib), 다코미티니브(dacomitinib), CI-1033(Canertinib), HKI-272(Neratinib) 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 비소세포폐암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
(a) 2DG (2-Deoxy-D-glucose) or a pharmaceutically acceptable salt thereof; And (b) non-small cell lung cancer comprising afatinib, dacomitinib, CI-1033 (Canertinib), HKI-272 (Neratinib) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient &Lt; / RTI >

제 1 항에 있어서, 상기 비소세포폐암은 EGFR(epidermal growth factor receptor)의 엑손 19번 내의 결실 돌연변이 또는 엑손 21번의 점돌연변이를 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
The composition of claim 1, wherein the non-small cell lung cancer has a deletion mutation in exon 19 or an exon 21 mutation in epidermal growth factor receptor (EGFR).

제 2 항에 있어서, 상기 비소세포폐암은 EGFR의 엑손 20번의 T790M 돌연변이를 추가적으로 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
3. The composition of claim 2, wherein the non-small cell lung cancer additionally has a T790M mutation in exon 20 of EGFR.

제 1 항에 있어서, 상기 비소세포폐암은 게피티니브(gefitinib) 또는 엘로티니브(erlotinib)에 대하여 내성을 나타내는 것을 특징으로 하는 조성물.
The composition of claim 1, wherein the non-small cell lung cancer is resistant to gefitinib or erlotinib.

제 1 항에 있어서, 상기 비소세포폐암은 편평세포암, 선암 또는 큰세포암인 것을 특징으로 하는 조성물.
The composition of claim 1, wherein the non-small cell lung cancer is squamous cell carcinoma, adenocarcinoma or large cell carcinoma.

제 1 항에 있어서, 상기 2DG는 아파티니브, 다코미티니브, CI-1033(Canertinib), HKI-272(Neratinib) 또는 이들의 약학적으로 허용되는 염에 대한 비소세포폐암의 민감성(sensitivity)을 상승적으로(synergistically) 증가시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
2. The method according to claim 1, wherein the 2DG has a sensitivity to non-small cell lung cancer to apatnib, dakomitinib, CI-1033 (Canertinib), HKI-272 (Neratinib) or a pharmaceutically acceptable salt thereof Gt; synergistically < / RTI >

(a) 2DG(2-Deoxy-D-glucose) 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염; 및 (b) 아파티니브, 다코미티니브, CI-1033(Canertinib), HKI-272(Neratinib) 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 EGFR 티로신 키나아제 억제제에 대한 비소세포폐암의 내성 저해용 조성물.
(a) 2DG (2-Deoxy-D-glucose) or a pharmaceutically acceptable salt thereof; And (b) an EGFR tyrosine kinase inhibitor comprising apapnibe, dakomitinib, CI-1033 (Canertinib), HKI-272 (Neratinib) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient. / RTI >

제 7 항에 있어서, 상기 비소세포폐암은 EGFR의 엑손 20번의 T790M 돌연변이에 의하여 가역적 EGFR 티로신 키나아제 억제제에 대하여 내성을 나타내는 것을 특징으로 하는 조성물.
8. The composition of claim 7, wherein said non-small cell lung cancer is resistant to a reversible EGFR tyrosine kinase inhibitor by the T790M mutation of exon 20 of EGFR.

제 8 항에 있어서, 상기 가역적 EGFR 티로신 키나아제 억제제는 게피티니브 또는 엘로티니브인 것을 특징으로 하는 조성물.9. The composition of claim 8, wherein the reversible EGFR tyrosine kinase inhibitor is goitinib or erotinib.