KR101418898B1 - Inhibitors of SARS-coronavirus 3CL Protease for Severe Acute Respiratory Syndrome and Method for screening thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제의 생산 및 그의 활성 저해제에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 효모균에서 재조합 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제를 효율적으로 발현할 수 있는 벡터를 제작하고, 상기 벡터로 형질 전환된 효모균을 배양하여 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제를 생산하는 방법, 상기 방법에 의해 생산된 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제를 이용하여 중증 급성 호흡기 증후군의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법, 상기 스크리닝된 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제 활성 저해제, 사스-코로나 바이러스 3CL protease 활성 저해제를 유효성분으로서 포함하는 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제의 활성 저해용 조성물 및 중증 급성 호흡기 증후군의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to the production of a SARS-coronavirus 3CL protease and an activity inhibitor thereof, and more particularly, to a vector capable of efficiently expressing a recombinant SARS-coronavirus 3CL protease in yeast, A method for producing SARS-coronavirus 3CL protease by culturing a yeast strain of the present invention, a method for screening a prophylactic or therapeutic agent for severe acute respiratory syndrome using the SARS-coronavirus 3CL protease produced by the above method, 3CL protease activity inhibitor, a composition for inhibiting the activity of SARS-coronavirus 3CL protease comprising as an active ingredient a SARS-coronavirus 3CL protease activity inhibitor, and a pharmaceutical composition for preventing or treating severe acute respiratory syndrome.
Description
본 발명은 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제의 생산 및 그의 활성 저해제에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 효모균에서 재조합 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제를 효율적으로 발현할 수 있는 벡터를 제작하고, 상기 벡터로 형질 전환된 효모균을 배양하여 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제를 생산하는 방법, 상기 방법에 의해 생산된 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제를 이용하여 중증 급성 호흡기 증후군의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법, 상기 스크리닝된 사스-코로나 바이러스 3CL protease 활성 저해제, 사스-코로나 바이러스 3CL protease 활성 저해제를 유효성분으로서 포함하는 사스-코로나 바이러스 3CL protease의 활성 저해용 조성물 및 중증 급성 호흡기 증후군의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to the production of SARS-coronavirus 3CL protease and an inhibitor of its activity, and more specifically, a vector capable of efficiently expressing the recombinant SARS-corona virus 3CL protease in yeast, and transformed with the vector A method for producing a SARS-coronavirus 3CL protease by culturing the yeast bacteria, a method for screening a prophylactic or therapeutic agent for severe acute respiratory syndrome using the SARS-corona virus 3CL protease produced by the above method, the screened SARS-corona virus It relates to a composition for inhibiting the activity of a 3CL protease activity inhibitor, a SARS-corona virus 3CL protease activity inhibitor as an active ingredient, and a pharmaceutical composition for preventing or treating severe acute respiratory syndrome.
중증급성 호흡 증후군은 사스-코로나 바이러스(SARS coronavirus, SARS-CoV)가 인간의 호흡기를 침범하여 발생하는 전염병으로 갑작스런 발열, 기침, 호흡곤란이 주 증상이다. 폐렴으로 진행돼 죽음에 이를 수도 있다. 2002년 11월 중국 남부 광둥(廣東)성에서 발생, 홍콩을 거쳐 벨기에를 제외한 유럽 각국과 미국·캐나다 등 북아메리카, 그리고 한국·일본을 제외한 아시아 각국 등 세계 32개국에서 83,000여 명이 감염되었으며, 이 중 10%가 사망하였다. 세계보건기구(WHO)는 사스의 원인병원체를 변종 코로나바이러스로 밝힌 바 있는데, 코로나바이러스는 사람에게서는 경증 또는 중증의 상부 호흡기 질병을 일으키고 동물에게서는 호흡기, 위장관, 간, 신경질환을 일으키는 바이러스다. 코로나 바이러스는 한 가닥의 RNA를 유전물질로 가지고 있는 바이러스이다. 인간에게 감염을 일으키는 형태는 제1혈청형과 제2혈청형이 주로 알려져 있으며, 다른 새로운 종류인 것도 나타나고 있어 새로운 변종의 발생에 대한 예방 및 치료 방법이 필요하다. 바이러스가 전파되는 경로는 아직 완전히 밝혀지지 않았지만 대기 중에 떠다니는 고체나 액체의 미세한 입자에 의해 전파되는 것으로 추측하고 있다. 바이러스인 사스-코로나 바이러스에 노출된 후 2~7일 정도의 잠복기가 지나면 발열, 무력감, 두통, 근육통의 신체 전반에 걸친 증상이 나타난다. 이후 기침과 호흡 곤란 증상이 발생하고 25%의 환자에게서 설사가 동반된다. 심한 경우에는 증상이 2주 이상 지속되며 호흡 기능이 크게 나빠지고 급성 호흡곤란 증후군 및 다기관 부전증으로 진행된다. 사스에 특이적인 치료법은 없다. Severe acute respiratory syndrome is an infectious disease caused by the SARS coronavirus (SARS-CoV) invading the human respiratory system. The main symptoms are sudden fever, cough, and difficulty breathing. It can lead to pneumonia and lead to death. Outbreaks in Guangdong Province in southern China in November 2002, and 83,000 people were infected in 32 countries around the world including Europe excluding Belgium, North America such as the United States and Canada, and Asian countries excluding Korea and Japan through Hong Kong. 10% died. The World Health Organization (WHO) has identified the causative agent of SARS as a variant coronavirus, which causes mild or severe upper respiratory disease in humans and respiratory, gastrointestinal, liver, and neurological diseases in animals. Coronavirus is a virus that has a single strand of RNA as genetic material. As for the forms that cause infection in humans, the first and second serum types are mainly known, and other new types are also appearing, so a method of preventing and treating the occurrence of new strains is required. The path through which the virus spreads is not yet fully known, but it is speculated that it is transmitted by fine particles of solid or liquid floating in the atmosphere. After 2 to 7 days of incubation period after exposure to the virus, SARS-corona virus, fever, weakness, headache, and muscle pain appear throughout the body. Afterwards, coughing and shortness of breath occur, and diarrhea is accompanied in 25% of patients. In severe cases, symptoms persist for more than 2 weeks, respiratory function is greatly deteriorated, and acute respiratory distress syndrome and multi-organ insufficiency develop. There is no specific treatment for SARS.
사스-코로나바이러스의 게놈(유전체) 서열분석 결과, 다른 종류의 코로나바이러스의 복제 활성에 필수적인 단백질분해효소 (protease)와 서열이 매우 유사한 3CL pro의 존재가 밝혀졌다. [Eleouet JF, Rasschaert D, Lambert P, Levy L, Vende P, Laude H.Complete sequence (20 kilobases) of the polyprotein-encoding gene1 of transmissible gastroenteritis virus. Virology 1995; 206: 817-22. Thiel V, Herold J, Schelle B, Siddell SG. Viral replicase gene products suffice for coronavirus discontinuous transcription. J Virol 2001;75:6676-81.]As a result of genomic (genetic) sequencing of SARS-coronavirus, it was found that the existence of 3CL pro is very similar in sequence to protease, which is essential for the replication activity of other coronaviruses. [Eleouet JF, Rasschaert D, Lambert P, Levy L, Vende P, Laude H. Complete sequence (20 kilobases) of the polyprotein-
바이러스의 다단백질 (polyprotein)이 합성된 후 단백질분해효소에 의해 절단되어 각각 독립된 단백질로서 기능을 하게 된다. 이러한 과정은 코로나 바이러스의 복제 주기에 핵심적인 과정으로 바이러스의 단백질분해효소(protease)에 의해 일어난다. SARS-CoV 3CL 프로테아제는 피코나바이러스과(Picornaviridae)의 3C 프로테아제의 명칭을 따라 명명되었으며, 복제효소(replicase) 유전자에 의해 암호화된 다단백질(polyprotein)의 11개 절단부위을 인식, 절단하는 단백질분해효소이다[Yi-Ming Shao, Wen-Bin Yang, Hung-Pin Peng,Min-Feng Hsu, Keng-Chang Tsai, Tun-Hsun Kuo, Andrew H.-J. Wang, Po-Huang Liang, Chun-Hung Lin, An-Suei Yang, and Chi-Huey Wong. Structure-Based Design and Synthesis of Highly Potent SARS-CoV 3CL Protease Inhibitors.ChemBioChem 2007, 8, 1654 1657]. 또한 3CL pro는 코로나바이러스 복제 활성을 조절하는 중요 단백질분해효소로서 핵심 단백질 분해효소 (main protease)로 불린다. After the virus polyprotein is synthesized, it is cleaved by proteolytic enzymes to function as independent proteins. This process is a key process in the replication cycle of the corona virus and is caused by the viral protease. SARS-CoV 3CL protease is named after the name of the 3C protease of the family Picornaviridae , and is a protease that recognizes and cuts 11 cleavage sites of polyproteins encoded by the replicase gene. [Yi-Ming Shao, Wen-Bin Yang, Hung-Pin Peng, Min-Feng Hsu, Keng-Chang Tsai, Tun-Hsun Kuo, Andrew H.-J. Wang, Po-Huang Liang, Chun-Hung Lin, An-Suei Yang, and Chi-Huey Wong. Structure-Based Design and Synthesis of Highly Potent SARS-CoV 3CL Protease Inhibitors. Chem Bio Chem 2007, 8, 1654 1657]. In addition, 3CL pro is an important protease that regulates coronavirus replication activity and is called the main protease.
케르세틴(quercetin)은 많은 식용식물에 함유되어 있는 플라보노이드(flavonoid)물질이다. 붉은 사과나 양파 껍질, 포도, 베리류의 과일, 양배추, 브로컬리, 녹차 또는 홍차 등에 많이 함유되어 있으며 부작용이 나타나지 않고 항산화기능이 있어 식이보충제나 식품첨가물에 사용되고 있다. 케르세틴은 암이나 동맥경화를 일으키는 활성산소를 억제하는 항산화작용과 알러지성 피부염에 대한 항염증 작용, 전립선염, 심장병, 백내장, 알레르기증상, 기관지염과 천식과 같은 호흡기성 질환을 예방하고 치료에 도움이 될 수 있다고 밝혀졌다. 또한 알츠하이머형 치매나 파킨슨병 등 뇌질환을 예방하는 효과가 있다고 보고되었다. (Behav Brain Res. 2010 Oct 1. Quercetin and rutin prevent scopolamine-induced memory impairment in zebrafish.Richetti SK, Blank M, Capiotti KM, Piato AL, Bogo MR, Vianna MR, Bonan CD.)Quercetin is a flavonoid material contained in many edible plants. Red apples, onion peels, grapes, berries such as fruits, cabbage, broccoli, green tea or black tea are contained in a lot, and they have no side effects and have antioxidant properties, so they are used as dietary supplements or food additives. Quercetin has antioxidant activity that inhibits free radicals that cause cancer or arteriosclerosis, anti-inflammatory activity against allergic dermatitis, prostatitis, heart disease, cataracts, allergic symptoms, and helps to prevent and treat respiratory diseases such as bronchitis and asthma. It turned out that it could be. It has also been reported that it has the effect of preventing brain diseases such as Alzheimer's type dementia and Parkinson's disease. (Behav Brain Res. 2010 Oct 1. Quercetin and rutin prevent scopolamine-induced memory impairment in zebrafish. Richetti SK, Blank M, Capiotti KM, Piato AL, Bogo MR, Vianna MR, Bonan CD.)
이에 본 발명자들은 숙주세포 내에서 사스-코로나 바이러스의 증식을 억제하는 물질을 찾고자 노력한 결과, 최초로 효모균에서 재조합 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제를 효율적으로 발현할 수 있는 벡터를 제작하고, 상기 벡터로 형질 전환된 효모균을 배양하여 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제를 생산하는 방법을 발견 및 핵심 단백질분해효소인 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제(SARS-CoV 3CL pro)의 활성을 억제하는 새로운 화합물을 스크리닝 할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors tried to find a substance that inhibits the growth of SARS-coronavirus in host cells. As a result, for the first time, a vector capable of efficiently expressing the recombinant SARS-coronavirus 3CL protease in yeast was constructed and transformed with the vector. Discovered a method to produce SARS-Coronavirus 3CL protease by culturing the yeast bacteria and found that it can screen for new compounds that inhibit the activity of SARS-CoV 3CL protease, a key protease. And completed the present invention.
본 발명의 목적은 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제의 활성 저해제를 개발하기 위하여, 최초로 효모균에서 재조합 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제를 효율적으로 발현할 수 있는 벡터를 제작하고, 상기 벡터로 형질 전환된 효모균을 배양하여 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.An object of the present invention is to develop a vector capable of efficiently expressing a recombinant SARS-corona virus 3CL protease in yeast for the first time in order to develop an inhibitor of the activity of the SARS-coronavirus 3CL protease, and cultivate the transformed yeast bacteria with the vector. Thus, it is to provide a method of producing the SARS-corona virus 3CL protease.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 생산된 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제를 이용하여 중증 급성 호흡기 증후군의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for screening for prevention or treatment of severe acute respiratory syndrome using the SARS-coronavirus 3CL protease produced by the above method.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 의해 스크리닝된 사스-코로나 바이러스 3CL protease 활성 저해제를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide an inhibitor of SARS-corona virus 3CL protease activity screened by the above method.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 스크리닝 방법에 의해 선별된 화합물 중에서 선택되는 하나 이상의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염, 수화물 또는 에스테르를 유효성분으로서 포함하는, 사스-코로나 바이러스 3CL protease의 활성 저해용 조성물 및 중증 급성 호흡기 증후군의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to inhibit the activity of SARS-corona virus 3CL protease, comprising one or more compounds selected from the compounds selected by the screening method, or a pharmaceutically acceptable salt, hydrate or ester thereof as an active ingredient. It is to provide a composition for use and a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of severe acute respiratory syndrome.
본 발명은 사스-코로나 바이러스 3CL protease의 활성 저해제를 개발하기 위하여, 최초로 효모균에서 재조합 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제를 효율적으로 발현할 수 있는 벡터를 제작하고, 상기 벡터로 형질 전환된 효모균을 배양하여 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제를 생산하는 방법에 관한 것이다.The present invention is to develop a vector capable of efficiently expressing the recombinant SARS-coronavirus 3CL protease in yeast for the first time to develop an inhibitor of the activity of SARS-coronavirus 3CL protease, and by culturing the yeast transformed with the vector, SARS -Relates to a method of producing coronavirus 3CL protease.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제를 이용하여 중증 급성 호흡기 증후군의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.In addition, the present invention relates to a method for screening for prevention or treatment of severe acute respiratory syndrome using the SARS-coronavirus 3CL protease produced by the above method.
또한, 본 발명은 상기 스크리닝 방법에 의해 선별된 화합물 중에서 선택되는 하나 이상의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염, 수화물 또는 에스테르를 유효성분으로서 포함하는, 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제의 활성 저해용 조성물 및 중증 급성 호흡기 증후군의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.In addition, the present invention comprises one or more compounds selected from the compounds selected by the screening method, or a pharmaceutically acceptable salt, hydrate or ester thereof, as an active ingredient, a composition for inhibiting the activity of the SARS-corona virus 3CL protease And it relates to a pharmaceutical composition for the prophylaxis or treatment of severe acute respiratory syndrome.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명의 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제의 생산 방법은 하기의 단계를 포함한다:The production method of the SARS-corona virus 3CL protease of the present invention comprises the following steps:
a) pPICZαA 벡터의 다중 클로닝 위치에 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제 유전자를 도입하여 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제 유전자를 포함하는 재조합 벡터(pPICZαA-3CLpro)를 제작하는 단계; a) constructing a recombinant vector (pPICZαA-3CL pro ) containing the SARS-corona virus 3CL protease gene by introducing the SARS-coronavirus 3CL protease gene into the multiple cloning site of the pPICZαA vector;
b) 상기 a)단계에서 수득된 재조합 벡터로 효모를 형질전환하는 단계; 및b) transforming the yeast with the recombinant vector obtained in step a); And
c) 상기 b)단계에서 수득된 형질전환 효모를 배양하여 배양물로부터 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제를 수득하는 단계.c) culturing the transformed yeast obtained in step b) to obtain a SARS-coronavirus 3CL protease from the culture.
본 발명에 따른 상기 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제 유전자는 서열번호 1에 기재된 염기서열로 이루어지는 것이며, 상기 효모는 피시아 패스토리스(Pichia pastoris)이다. 또한, 본 발명에서 사용한 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제는 인간 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제의 활성도메인을 발현 정제한 것이다.
The SARS-coronavirus 3CL protease gene according to the present invention consists of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, and the yeast is Pichia pastoris . In addition, the SARS-corona virus 3CL protease used in the present invention is an expression and purification of the active domain of the human SARS-corona virus 3CL protease.
또한, 본 발명의 중증 급성 호흡기 증후군의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법은 하기의 단계를 포함한다:In addition, the method of screening for the prevention or treatment of severe acute respiratory syndrome of the present invention includes the following steps:
a) 본 발명에 따른 상기 방법에 의해 생산된 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제를 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제의 기질 및 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제 저해 후보물질과 반응시키는 단계; 및a) reacting the SARS-corona virus 3CL protease produced by the method according to the present invention with a substrate of the SARS-corona virus 3CL protease and a candidate material for inhibiting the SARS-corona virus 3CL protease; And
b) 상기 a)단계의 반응으로부터 수득되는 기질의 분해산물을 정량하여 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제 저해제를 선별하는 단계.b) selecting the SARS-corona virus 3CL protease inhibitor by quantifying the degradation product of the substrate obtained from the reaction of step a).
상기 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제의 기질은 N-말단 및 C-말단에 형광 도너 및 형광 소멸자가 결합되어 있는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 펩타이드이며, 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제의 활성 저해 정도를 알아보기 위하여 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제와 상기 기질만을 양성대조군으로 사용하였다.
The substrate of the SARS-corona virus 3CL protease is a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in which a fluorescent donor and a fluorescent destructor are bound to the N-terminal and C-terminus, and the degree of inhibition of the activity of the SARS-corona virus 3CL protease For viewing, only the SARS-coronavirus 3CL protease and the substrate were used as positive controls.
보다 상세하게는 상기 인간 사스-코로나 바이러스(human SARS-CoV)의 3CL 프로테아제 유전정보를 바탕으로 서열번호 1의 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제 유전자를 합성하였다. 활성 단백질을 발현하기 위하여 pPICZαA(인비트로젠, 미국) 벡터의 다중 클로닝 위치에 도입하여 α-factor signal peptide 바로 뒤에 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제 유전자를 포함하는 재조합 벡터 pPICZαA-3CLpro를 제작하였다(도 3 참조).In more detail, the SARS-corona virus 3CL protease gene of SEQ ID NO: 1 was synthesized based on the 3CL protease genetic information of the human SARS-CoV. In order to express the active protein, a recombinant vector pPICZαA-3CL pro containing the SARS-corona virus 3CL protease gene was constructed immediately after the α-factor signal peptide by introducing it into the multiple cloning site of the pPICZαA (Invitrogen, USA) vector (Fig. 3).
상기 본 발명에 따른 재조합 벡터 pPICZαA-3CLpro를 재조합 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제의 생산을 위하여, 효모균(Pichia pastoris X-33)에 형질전환 후 배양된 배양물을 원심 분리하여 회수된 상등액을 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제 활성을 확인하는데 사용하였으며, 웨스턴 블럿(Western Blot) 분석을 통해 재조합 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제의 크기가 약 42 kDa임을 확인하였다(도 4와 도5 참조).The recombinant vector pPICZαA-3CL pro according to the present invention was used for the production of recombinant SARS-coronavirus 3CL protease, yeast ( Pichia pastoris X-33), the cultured culture was centrifuged and the recovered supernatant was used to confirm the SARS-corona virus 3CL protease activity, and the recombinant SARS-corona virus 3CL protease through Western Blot analysis. It was confirmed that the size of is about 42 kDa (see FIGS. 4 and 5).
본 발명에 따른 재조합 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제의 활성을 확인하기 위하여, 재조합 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제를 형광을 발하는 형광 펩타이드 (fluorogenic peptide) DABCYL-Lys-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-Gln-Ser-Gly-Phe-Arg-Lys-Met-Glu-EDANS(BACHEM, 스위스)을 기질로 하여 45종의 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제의 저해 활성 후보물질과 반응시킨 후 검출된 형광의 세기를 확인하여 효소의 활성을 저해 후보물질이 포함되지 않은 양성 대조군과 비교하여 측정하였다.In order to confirm the activity of the recombinant SARS-coronavirus 3CL protease according to the present invention, a fluorescent peptide that fluoresces the recombinant SARS-coronavirus 3CL protease DABCYL-Lys-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-Gln -Ser-Gly-Phe-Arg-Lys-Met-Glu-EDANS (BACHEM, Switzerland) was reacted with 45 kinds of inhibitory activity candidates for the SARS-coronavirus 3CL protease, and the detected fluorescence intensity was confirmed. Thus, the activity of the enzyme was measured by comparing it with a positive control that did not contain an inhibitory candidate substance.
본 발명에 따른 중증 급성 호흡기 증후군의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 통하여 선별된 화합물 45종을 기재하였다.45 types of compounds selected through the screening method for the prevention or treatment of severe acute respiratory syndrome according to the present invention were described.
(1) 2-[(N-벤질글리실)아미노]-N-(2-에톡시페닐)-5,6-디하이드로-4H-시클로펜타[b]티오펜-3-카복사마이드;(1) 2-[(N-benzylglycyl)amino]-N-(2-ethoxyphenyl)-5,6-dihydro-4H-cyclopenta[b]thiophene-3-carboxamide;
(2) N-(2,5-디메톡시페닐)-6-메틸-2-[(4-피리디닐메틸)아미노]-4,5,6,7-테트라하이드로-1-벤조티오펜-3-카복사마이드;(2) N-(2,5-dimethoxyphenyl)-6-methyl-2-[(4-pyridinylmethyl)amino]-4,5,6,7-tetrahydro-1-benzothiophene-3 -Carboxamide;
(3) N-(5-클로로-2-메톡시페닐)-2-[(2-피리디닐메틸)아미노]-5,6,7,8-테트라하이드로-4H-시클로헵타[b]티오펜-3-카복사마이드;(3) N-(5-chloro-2-methoxyphenyl)-2-[(2-pyridinylmethyl)amino]-5,6,7,8-tetrahydro-4H-cyclohepta[b]thiophene -3-carboxamide;
(4) 4-({[5-(1-나프틸)-4-페닐-4H-1,2,4-트리아졸-3-일]티오}메틸)-1,3-티아졸-2-아민;(4) 4-({[5-(1-naphthyl)-4-phenyl-4H-1,2,4-triazol-3-yl]thio}methyl)-1,3-thiazole-2- Amine;
(5) 1-[2-(디메틸아미노)에틸]-3-하이드록시-5-(4-하이드록시-3-메톡시페닐)-4-(4-이소부톡시-2-메틸벤조일)-1,5-디하이드로-2H-피롤-2-온;(5) 1-[2-(dimethylamino)ethyl]-3-hydroxy-5-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-4-(4-isobutoxy-2-methylbenzoyl)-1 ,5-dihydro-2H-pyrrol-2-one;
(6) 2-[2-아이오도-6-메톡시-4-({[3-(4-모포리닐)프로필]아미노}메틸)페녹시]-N-(2-메틸페닐)아세트아마이드 디하이드로클로라이드;(6) 2-[2-iodo-6-methoxy-4-({[3-(4-morpholinyl)propyl]amino}methyl)phenoxy]-N-(2-methylphenyl)acetamide dihydro Chloride;
(7) N-{4-[2-(2,3-디하이드로-1H-인돌-1-일)-2-옥소에톡시]-3-메톡시벤질}-2-[(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)티오]에탄아민 하이드로클로라이드;(7) N-{4-[2-(2,3-dihydro-1H-indol-1-yl)-2-oxoethoxy]-3-methoxybenzyl}-2-[(1-methyl- 1H-tetrazol-5-yl)thio]ethanamine hydrochloride;
(8) 1-[3-(1H-1,2,3-벤조트리아졸-1-일메틸)-4-메톡시페닐]-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-β-카볼린-3-카복실산;(8) 1-[3-(1H-1,2,3-benzotriazol-1-ylmethyl)-4-methoxyphenyl]-2,3,4,9-tetrahydro-1H-β-ca Boline-3-carboxylic acid;
(9) 4-(4-메톡시페닐)-3-{[2-옥소-2-(1-피롤리디닐)에틸]티오}-5-(2-페닐에틸)-4H-1,2,4-트리아졸; (9) 4-(4-methoxyphenyl)-3-{[2-oxo-2-(1-pyrrolidinyl)ethyl]thio}-5-(2-phenylethyl)-4H-1,2, 4-triazole;
(10) 2-{[4-알릴-5-(5-브로모-2-하이드록시페닐)-4H-1,2,4-트리아졸-3-일]티오}-N-[2-(4-모포리닐)페닐]아세트아마이드;(10) 2-{[4-allyl-5-(5-bromo-2-hydroxyphenyl)-4H-1,2,4-triazol-3-yl]thio}-N-[2-( 4-morpholinyl)phenyl]acetamide;
(11) 2-{[(2-옥소-1,2-디하이드로-4-퀴놀리닐)메틸]티오}-3-페닐-5,6,7,8-테트라하이드로[1]벤조티에노[2,3-d]피리미딘-4(3H)-온;(11) 2-{[(2-oxo-1,2-dihydro-4-quinolinyl)methyl]thio}-3-phenyl-5,6,7,8-tetrahydro[1]benzothieno [2,3-d]pyrimidin-4(3H)-one;
(12) 2-[(2-에틸-6,6-디메틸-5,8-디하이드로-6H-피라노[4',3':4,5]티에노[2,3-d]피리미딘-4-일)티오]-N-(1-메틸-3-페닐프로필)아세트아마이드;(12) 2-[(2-ethyl-6,6-dimethyl-5,8-dihydro-6H-pyrano[4',3':4,5]thieno[2,3-d]pyrimidine -4-yl)thio]-N-(1-methyl-3-phenylpropyl)acetamide;
(13) 2-[(4-옥소-3-페닐-3,4,5,6,7,8-헥사하이드로[1]벤조티에노[2,3-d]피리미딘-2-일)티오]-N-(테트라하이드로-2-퓨라닐메틸)아세틸아마이드;(13) 2-[(4-oxo-3-phenyl-3,4,5,6,7,8-hexahydro[1]benzothieno[2,3-d]pyrimidin-2-yl)thio ]-N-(tetrahydro-2-furanylmethyl)acetylamide;
(14) 에틸 2-[({5-[(4-플루오로벤조일)아미노]-1-페닐-1H-피라졸-4-일}카보닐)아미노]벤조에이트;(14) ethyl 2-[({5-[(4-fluorobenzoyl)amino]-1-phenyl-1H-pyrazol-4-yl}carbonyl)amino]benzoate;
(15) N-[2-(2-퓨로일아미노)-3-(3-니트로페닐)아크릴로일]페닐알라닌;(15) N-[2-(2-furoylamino)-3-(3-nitrophenyl)acryloyl]phenylalanine;
(16) N-{1-({[3-(디메틸아미노)프로필]아미노}카보닐)-2-[5-(3-니트로페닐)-2-퓨릴]비닐}-4-메틸벤즈아마이드;(16) N-{1-({[3-(dimethylamino)propyl]amino}carbonyl)-2-[5-(3-nitrophenyl)-2-furyl]vinyl}-4-methylbenzamide;
(17) 이소프로필 4-({5-[2-(4-메틸-3-니트로페닐)-2-옥소에톡시]-5-옥소펜타노일}아미노)벤조에이트;(17) Isopropyl 4-({5-[2-(4-methyl-3-nitrophenyl)-2-oxoethoxy]-5-oxopentanoyl}amino)benzoate;
(18) 2-(4-클로로-2-메틸-5-{[(3-니트로페닐)아미노]설포닐}페녹시)-N-시클로헥실아세트아마이드;(18) 2-(4-chloro-2-methyl-5-{[(3-nitrophenyl)amino]sulfonyl}phenoxy)-N-cyclohexylacetamide;
(19) 2-{[4-(4-클로로페닐)-5-(4-모포리닐메틸)-4H-1,2,4-트리아졸-3-일]티오}-N-(3-시아노-4,5,6,7-테트라하이드로-1-벤조티엔-2-일)아세트아마이드;(19) 2-{[4-(4-chlorophenyl)-5-(4-morpholinylmethyl)-4H-1,2,4-triazol-3-yl]thio}-N-(3-sia No-4,5,6,7-tetrahydro-1-benzothien-2-yl)acetamide;
(20) N-[(5-{[2-(시클로헥실아미노)-2-옥소에틸]티오}-4-페닐-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)메틸]-2-플루오로벤즈아마이드;(20) N-[(5-{[2-(cyclohexylamino)-2-oxoethyl]thio}-4-phenyl-4H-1,2,4-triazol-3-yl)methyl]-2 -Fluorobenzamide;
(21) N-[(5-{[2-(벤질아미노)-2-옥소에틸]티오}-4-페닐-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)메틸]-4-메톡시벤즈아마이드;(21) N-[(5-{[2-(benzylamino)-2-oxoethyl]thio}-4-phenyl-4H-1,2,4-triazol-3-yl)methyl]-4- Methoxybenzamide;
(22) 1-페닐-2-({4-페닐-5-[(8-퀴놀리닐옥시)메틸]-4H-1,2,4-트리아졸-3-일}티오)에타논;(22) 1-phenyl-2-({4-phenyl-5-[(8-quinolinyloxy)methyl]-4H-1,2,4-triazol-3-yl}thio)ethanone;
(23) 에틸 6-메틸-2-({[(1-페닐-1H-테트라졸-5-일)티오]아세틸}아미노)-4,5,6,7-테트라하이드로티에노[2,3-c]피리딘-3-카복실레이트;(23) Ethyl 6-methyl-2-({[(1-phenyl-1H-tetrazol-5-yl)thio]acetyl}amino)-4,5,6,7-tetrahydrothieno[2,3 -c]pyridine-3-carboxylate;
(24) 에틸 2-({[(5-에틸-5H-[1,2,4]트리아지노[5,6-b]인돌-3-일)티오]아세틸}아미노)-6-메틸-4,5,6,7-테트라하이드로티에노[2,3-c]피리딘-3-카복실레이트;(24) Ethyl 2-({[(5-ethyl-5H-[1,2,4]triazino[5,6-b]indol-3-yl)thio]acetyl}amino)-6-methyl-4 ,5,6,7-tetrahydrothieno[2,3-c]pyridin-3-carboxylate;
(25) 에틸 5-(아미노카보닐)-2-({[7-클로로-8-메틸-2-(2-피리디닐)-4-퀴놀리닐]카보닐}아미노)-4-메틸-3-티오펜카복실레이트;(25) Ethyl 5-(aminocarbonyl)-2-({[7-chloro-8-methyl-2-(2-pyridinyl)-4-quinolinyl]carbonyl}amino)-4-methyl- 3-thiophenecarboxylate;
(26) 4-[(2,4-디메틸-1,3-티아졸-5-일)카보닐]-3-하이드록시-1-[3-(4-모포리닐)프로필]-5-(3-니트로페닐)-1,5-디하이드로-2H-피롤-2-온;(26) 4-[(2,4-dimethyl-1,3-thiazol-5-yl)carbonyl]-3-hydroxy-1-[3-(4-morpholinyl)propyl]-5-( 3-nitrophenyl)-1,5-dihydro-2H-pyrrol-2-one;
(27) N-{1-({[3-(디메틸아미노)프로필]아미노}카보닐)-2-[5-(2-니트로페닐)-2-퓨릴]비닐}-4-메틸벤즈아마이드;(27) N-{1-({[3-(dimethylamino)propyl]amino}carbonyl)-2-[5-(2-nitrophenyl)-2-furyl]vinyl}-4-methylbenzamide;
(28) N-(1-{[2-(4-하이드록시-3,5-디메톡시벤질리덴)하이드라지노]카보닐}-2-페닐비닐)벤즈아마이드;(28) N-(1-{[2-(4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzylidene)hydrazino]carbonyl}-2-phenylvinyl)benzamide;
(29) 2-({2-[1-(2-메톡시에틸)-2,5-디메틸-1H-피롤-3-일]-2-옥소에틸}티오)-5,6-디메틸-3-페닐티에노[2,3-d]피리미딘-4(3H)-온;(29) 2-({2-[1-(2-methoxyethyl)-2,5-dimethyl-1H-pyrrol-3-yl]-2-oxoethyl}thio)-5,6-dimethyl-3 -Phenylthieno[2,3-d]pyrimidin-4(3H)-one;
(30) 2-{[4-(4-클로로페닐)-5-(4-모포리닐메틸)-4H-1,2,4-트리아졸-3-일]티오}-N-(4-페닐-1,3-티아졸-2-일)아세트아마이드;(30) 2-{[4-(4-chlorophenyl)-5-(4-morpholinylmethyl)-4H-1,2,4-triazol-3-yl]thio}-N-(4-phenyl -1,3-thiazol-2-yl)acetamide;
(31) N-(4-페닐-1,3-티아졸-2-일)-2-({5-[(5,6,7,8-테트라하이드로-2-나프탈레닐옥시)메틸]-1,3,4-옥사디아졸-2-일}티오)아세트아마이드;(31) N-(4-phenyl-1,3-thiazol-2-yl)-2-({5-[(5,6,7,8-tetrahydro-2-naphthalenyloxy)methyl] -1,3,4-oxadiazol-2-yl}thio)acetamide;
(32) 2-{[5-(2-페닐에틸)-5H-[1,2,4]트리아지노[5,6-b]인돌-3-일]티오}-N-(5-프로필-1,3,4-티아디아졸-2-일)아세트아마이드;(32) 2-{[5-(2-phenylethyl)-5H-[1,2,4]triazino[5,6-b]indol-3-yl]thio}-N-(5-propyl- 1,3,4-thiadiazol-2-yl)acetamide;
(33) 2-{[4-(1,3-디옥소-1,3-디하이드로-2H-이소인돌-2-일)부타노일]아미노}-N-(2-퓨릴메틸)-5,6-디하이드로-4H-시클로펜타[b]티오펜-3-카복사마이드;(33) 2-{[4-(1,3-dioxo-1,3-dihydro-2H-isoindol-2-yl)butanoyl]amino}-N-(2-furylmethyl)-5, 6-dihydro-4H-cyclopenta[b]thiophene-3-carboxamide;
(34) 2-{[3-(1,3-디옥소-1,3-디하이드로-2H-이소인돌-2-일)프로파노일]아미노}-N-(테트라하이드로-2-퓨라닐메틸)-4,5,6,7-테트라하이드로-1-벤조티오펜-3-카복사마이드;(34) 2-{[3-(1,3-dioxo-1,3-dihydro-2H-isoindol-2-yl)propanoyl]amino}-N-(tetrahydro-2-furanyl Methyl)-4,5,6,7-tetrahydro-1-benzothiophene-3-carboxamide;
(35) 4-{2-(벤조일아미노)-3-[(3-하이드록시프로필)아미노]-3-옥소-1-프로펜-1-일}페닐 4-메틸벤젠설포네이트;(35) 4-{2-(benzoylamino)-3-[(3-hydroxypropyl)amino]-3-oxo-1-propen-1-yl}phenyl 4-methylbenzenesulfonate;
(36) N-(2-퓨릴메틸)-2-{[5-(4-모포리닐)-1,2,3,4-테트라하이드로피리미도[4',5':4,5]티에노[2,3-c]이소퀴놀린-8-일]티오}아세트아마이드;(36) N-(2-furylmethyl)-2-{[5-(4-morpholinyl)-1,2,3,4-tetrahydropyrimido[4',5':4,5]thieno [2,3-c]isoquinolin-8-yl]thio}acetamide;
(37) 2-{[4-옥소-3-(2-페닐에틸)-4,6-디하이드로-3H-스피로[벤조[h]퀴나졸린-5,1'-시클로헥산]-2-일]티오}아세트아마이드;(37) 2-{[4-oxo-3-(2-phenylethyl)-4,6-dihydro-3H-spiro[benzo[h]quinazolin-5,1'-cyclohexane]-2-yl ]Thio}acetamide;
(38) N,N'-1,4-부탄디일비스(5-메틸-3-페닐-4-이속사졸카복사마이드);(38) N,N'-1,4-butanediylbis(5-methyl-3-phenyl-4-isoxazolecarboxamide);
(39) 에틸 5-페닐-2-({[(1-페닐-1H-테트라졸-5-일)티오]아세틸}아미노)-3-티오펜카복실레이트;(39) ethyl 5-phenyl-2-({[(1-phenyl-1H-tetrazol-5-yl)thio]acetyl}amino)-3-thiophenecarboxylate;
(40) 2-{[3-(벤질설포닐)-2-하이드록시프로필]티오}-4,6-디페닐니코티노니트릴;(40) 2-{[3-(benzylsulfonyl)-2-hydroxypropyl]thio}-4,6-diphenylnicotinonitrile;
(41) N-[1-({[2-(1H-인돌-3-일)에틸]아미노}카보닐)-2-(3-니트로페닐)비닐]-2-티오펜카복사마이드;(41) N-[1-({[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]amino}carbonyl)-2-(3-nitrophenyl)vinyl]-2-thiophenecarboxamide;
(42) N-1,3-벤조디옥솔-5-일-2-{3-[2-(5-니트로-2,6-디옥소-1,2,3,6-테트라하이드로-4-피리미디닐)비닐]-1H-인돌-1-일}아세트아마이드;(42) N-1,3-benzodioxol-5-yl-2-{3-[2-(5-nitro-2,6-dioxo-1,2,3,6-tetrahydro-4- Pyrimidinyl)vinyl]-1H-indol-1-yl}acetamide;
(43) 3,4-비스{[(벤질티오)아세틸]아미노}벤조산;(43) 3,4-bis{[(benzylthio)acetyl]amino}benzoic acid;
(44) 2-(1,3-벤조옥사졸-2-일티오)-N'-[2-옥소-1-(1-피롤리디닐메틸)-1,2-디하이드로-3H-인돌-3-일리덴]아세토하이드라지드; 및(44) 2-(1,3-benzoxazol-2-ylthio)-N'-[2-oxo-1-(1-pyrrolidinylmethyl)-1,2-dihydro-3H-indole- 3-ylidene]acetohydrazide; And
(45) 2-(3,4-디하이드록시페닐)-3,5,7-트리하이드록시-4H-크로멘-4-온.(45) 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxy-4 H -chromen-4-one.
상기 45종의 화합물들은 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제의 활성 저해효과를 나타내는 바, 3CL protease의 역할과 연관되고 3CL protease의 선별적 저해를 필요로 하는 질병의 예방 및 치료제로 유용하게 사용될 수 있으며, 특히 상기 질병은 중증 급성 호흡기 증후군을 포함한다. 즉, 본 발명은 유효성분으로서, 상기 화합물 중에서 선택되는 하나 이상의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염, 수화물 또는 에스테르를 포함하는, 중증 급성 호흡기 증후군의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.The 45 compounds show the inhibitory effect on the activity of the SARS-coronavirus 3CL protease, which is associated with the role of 3CL protease and can be usefully used as a preventive and therapeutic agent for diseases requiring selective inhibition of 3CL protease. The disease includes severe acute respiratory syndrome. That is, the present invention relates to a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of severe acute respiratory syndrome, comprising one or more compounds selected from the above compounds, or a pharmaceutically acceptable salt, hydrate or ester thereof, as an active ingredient.
또한, 본 발명은 유효성분으로서, 상기 화합물 중에서 선택되는 하나 이상의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염, 수화물 또는 에스테르를 포함하는, 사스-코로나 바이러스 3CL protease의 활성 저해용 조성물에 관한 것이다.
In addition, the present invention relates to a composition for inhibiting the activity of SARS-coronavirus 3CL protease, including one or more compounds selected from the above compounds as an active ingredient, or a pharmaceutically acceptable salt, hydrate or ester thereof.
*본 발명에 따른 상기 화학식의 화합물, 또는 이들의 혼합 화합물은 단독으로 또는 약제학적으로 허용되는 담체(carrier)와 함께 약제학적 조성물에 포함되어 중증 급성 호흡기 증후군 치료제로서 사용될 수 있다. * The compound of the above formula or a mixed compound thereof according to the present invention may be included in a pharmaceutical composition alone or together with a pharmaceutically acceptable carrier and used as a treatment for severe acute respiratory syndrome.
상기 화합물을 사스-코로나바이러스 증식 억제제로 사용하는 경우, 1 ㎍/㎏ 체중 내지 50 ㎎/㎏ 체중의 1일 용량으로 투여하는 것이 바람직하지만, 이는 투여대상의 연령, 성별, 식이, 건강상태, 상태의 중증도, 투여방법, 투여시간, 약제혼합 등에 따라 투약 양은 증감될 수 있다.When the above compound is used as an inhibitor of SARS-coronavirus growth, it is preferable to administer it in a daily dose of 1 μg/kg body weight to 50 mg/kg body weight, but this is the age, sex, diet, health status, and condition of the subject to be administered. The dosage amount can be increased or decreased depending on the severity of, administration method, administration time, drug mixing, and the like.
상기 약제학적 조성물은 경구, 직장, 코, 폐, 국소, 경피, 저장기(intracisternal), 복강 내, 질 및 비경구(피하, 근육 내, 관부 내(intrathecal), 정맥 내 및 피부 내를 포함) 경로와 같은 임의의 적합한 경로로 투여되기 위해 구체적으로 제형화 될 수 있으며, 바람직하게는 경구 경로로 투여한다. 바람직한 경로는 치료되는 대상의 일반적인 조건 및 연령, 치료되는 조건의 성질 및 선택되는 활성 성분에 따라 달라질 것이다. The pharmaceutical composition is oral, rectal, nasal, pulmonary, topical, transdermal, intracisternal, intraperitoneal, vaginal and parenteral (including subcutaneous, intramuscular, intrathecal, intravenous and intradermal) It can be specifically formulated to be administered by any suitable route such as route, and is preferably administered by oral route. The preferred route will depend on the general conditions and age of the subject being treated, the nature of the condition being treated and the active ingredient selected.
상기 약제학적 조성물은 임의의 적합한 경로, 예를 들어 정제(tablet), 캡슐, 파우더, 과립, 펠렛, 구내정, 당의정, 환약 또는 정제(lozenge), 수성 또는 비-수성 액체 내에 있는 용액 또는 현탁액, 또는 수중유 또는 유중수 액체 에멀젼, 엘릭시르, 시럽 등의 형태로 경구 또는 주사액의 형태인 비경구 투여될 수 있다. 비경구 투여용 다른 약학적 조성물은 분산액, 현탁액 또는 에멀젼 뿐만 아니라 사용하기 전의 멸균 주사용액 또는 분산액 내에 구성되는 멸균 파우더를 포함한다. 데폿(depot) 주사 제형물 또한 본 발명의 영역 내에 있는 것으로 여겨진다. 다른 적합한 투여형태는 좌약, 스프레이, 연고, 크림, 젤, 흡입제, 피부패치 등을 포함한다. 상기 조성물을 제조하기 위해서는 당해 기술분야에 공지된 방법이 이용될 수 있고, 또한 당해 기술 분야에서 일반적으로 이용되는 임의의 약학적으로 허용 가능한 담체 희석제, 부형제 또는 다른 첨가제가 이용될 수 있다. The pharmaceutical composition can be by any suitable route, for example tablets, capsules, powders, granules, pellets, oral tablets, dragees, pills or lozenges, solutions or suspensions in aqueous or non-aqueous liquids, Alternatively, it may be administered parenterally in the form of an oil-in-water or water-in-oil liquid emulsion, elixir, syrup, or the like, or in the form of an injection solution. Other pharmaceutical compositions for parenteral administration include dispersions, suspensions or emulsions, as well as sterile powders which are constituted in sterile injectable solutions or dispersions prior to use. Depot injection formulations are also believed to be within the scope of the present invention. Other suitable dosage forms include suppositories, sprays, ointments, creams, gels, inhalants, skin patches, and the like. In order to prepare the composition, a method known in the art may be used, and any pharmaceutically acceptable carrier diluent, excipient, or other additive generally used in the art may be used.
상기의 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로오스, 메틸 히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시 벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 조성물은 방부제, 안정도 개선 물질, 점도 개선이나 조절 물질, 용해도 개선 물질, 감미료, 염료, 미감 개선 화합물, 삼투압을 변화시키는 염, 완충액, 항-산화제 등을 추가로 함유할 수 있다. The above carriers are commonly used in formulation, and are lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, gum acacia, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrroly. Don, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methyl hydroxybenzoate, propyl hydroxy benzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, and the like, but are not limited thereto. The composition may further contain a preservative, a stability improving substance, a viscosity improving or controlling substance, a solubility improving substance, a sweetener, a dye, a taste improving compound, a salt for changing the osmotic pressure, a buffer solution, an anti-oxidant, and the like.
상기 화합물들은, 목적하는 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제의 활성 저해효과를 나타내는 한, 유리 화합물, 약제학적으로 허용되는 염, 수화물을 포함한 용매화물, 에스테르, 입체이성체의 어떠한 형태로도 사용가능하며, 이들은 모두 본 발명의 범위 내에 속하는 것이다. 본 발명에서 약제학적으로 허용되는 염은 약제학적으로 허용되는 산 부가염을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻어지는 것일 수 있다. 구체적인 예로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 들 수 있다.The above compounds can be used in any form of free compounds, pharmaceutically acceptable salts, solvates including hydrates, esters, and stereoisomers, as long as they exhibit an inhibitory effect on the activity of the desired SARS-coronavirus 3CL protease. All are within the scope of the present invention. Pharmaceutically acceptable salts in the present invention may include pharmaceutically acceptable acid addition salts. Pharmaceutically acceptable acid addition salts include inorganic acids such as hydrochloric acid, nitric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, nitrous acid or phosphorous acid, and aliphatic mono and dicarboxylates, phenyl-substituted alkanoates, hydroxyal acids. It may be obtained from non-toxic organic acids such as canoates and alcandioates, aromatic acids, aliphatic and aromatic sulfonic acids. Specific examples include sulfate, pyrosulfate, bisulfate, sulfite, bisulfite, nitrate, phosphate, monohydrogen phosphate, dihydrogen phosphate, metaphosphate, pyrophosphate chloride, bromide, iodide, fluoride, acetate , Propionate, decanoate, caprylate, acrylate, formate, isobutyrate, caprate, heptanoate, propiolate, oxalate, malonate, succinate, suberate, sebacate, fumarate , Maleate, butine-1,4-dioate, hexane-1,6-dioate, benzoate, chlorobenzoate, methylbenzoate, dinitro benzoate, hydroxybenzoate, methoxybenzoate, phthalate, Terephthalate, benzenesulfonate, toluenesulfonate, chlorobenzenesulfonate, xylenesulfonate, phenylacetate, phenylpropionate, phenylbutyrate, citrate, lactate, β-hydroxybutyrate, glycolate, malate, tart Rate, methanesulfonate, propanesulfonate, naphthalene-1-sulfonate, naphthalene-2-sulfonate or mandelate.
본 발명에 따르면, 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제 유전자를 pPICZαA 벡터의 다중 클로닝 위치에 도입한 후 효모를 형질전환 및 배양함으로써 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제를 수득할 수 있으며, 생산된 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제를 이용하여 시험관 내에서 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제 저해 후보물질의 활성을 측정 평가하여 저해 활성이 우수한 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제 저해제를 효율적으로 스크리닝할 수 있으며, 그 결과 환경에 존재하는 다수의 화학물질에 대하여 부작용을 최소화 하면서 중증 급성 호흡기 증후군 관련 질환을 억제하는 특정 화학물질을 보다 간편하고 신속한 생물학적 방법으로 판별하여 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제의 활성을 효율적으로 저해하는 45종의 화합물을 새로이 밝혀내었다. 본 발명에 따른 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제 활성 저해 화합물은 중증 급성 호흡기 증후군 예방 또는 치료용으로 유용하게 활용될 수 있다.According to the present invention, the SARS-corona virus 3CL protease can be obtained by introducing the SARS-corona virus 3CL protease gene into the multiple cloning site of the pPICZαA vector and then transforming and culturing the yeast, and the produced SARS-corona virus 3CL protease By measuring and evaluating the activity of the SARS-coronavirus 3CL protease inhibitory candidate in vitro using, it is possible to efficiently screen the SARS-coronavirus 3CL protease inhibitor with excellent inhibitory activity, and as a result, a number of chemical substances present in the environment In addition, 45 compounds that effectively inhibit the activity of the SARS-coronavirus 3CL protease were newly identified by identifying specific chemicals that suppress severe acute respiratory syndrome-related diseases while minimizing side effects using a simpler and quicker biological method. The SARS-coronavirus 3CL protease activity inhibitory compound according to the present invention may be usefully used for preventing or treating severe acute respiratory syndrome.
도 1은 본 발명에 따른 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제 유전자의 염기서열을 나타낸 것이고,
도 2는 본 발명에 따른 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제 유전자의 아미노산 서열을 나타낸 것이고,
도 3은 본 발명에 따른 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제 유전자를 포함하는 재조합 벡터(pPICZαA-3CLpro)의 개별지도를 나타낸 것이고,
도 4는 본 발명에 따른 정제된 재조합 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이며,
도 5는 본 발명에 따른 정제된 재조합 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제의 웨스턴 블럿(Western Blot) 결과를 나타낸 것이다.1 shows the nucleotide sequence of the SARS-corona virus 3CL protease gene according to the present invention,
Figure 2 shows the amino acid sequence of the SARS-corona virus 3CL protease gene according to the present invention,
Figure 3 shows a separate map of the recombinant vector (pPICZαA-3CL pro ) containing the SARS-corona virus 3CL protease gene according to the present invention,
Figure 4 shows the SDS-PAGE result of the purified recombinant SARS-corona virus 3CL protease according to the present invention,
5 shows the results of Western Blot of the purified recombinant SARS-corona virus 3CL protease according to the present invention.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are for illustrative purposes only, and it will be apparent to those of ordinary skill in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples.
[[ 실시예Example 1] 유전자 확보 및 재조합 발현 벡터 구축 1] Securing genes and constructing recombinant expression vectors
사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제(SARS-CoV 3CL protease)의 유전정보(도 1 참조)를 바탕으로 서열번호 1의 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제 유전자를 합성하였다. 활성 단백질을 발현하기 위하여 pPICZαA(인비트로젠, 미국) 벡터의 다중 클로닝 위치에 도입하여 α-factor signal peptide 바로 뒤에 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제 유전자를 포함하는 재조합 벡터 pPICZαA-3CLpro를 제작하였다. pPICZαA-3CLpro는 도 3에 나타낸 바와 같은 개열지도를 갖는다.
The SARS-corona virus 3CL protease gene of SEQ ID NO: 1 was synthesized based on the genetic information of the SARS-CoV 3CL protease (see FIG. 1). In order to express the active protein, a recombinant vector pPICZαA-3CL pro containing the SARS-corona virus 3CL protease gene was constructed by introducing it into the multiple cloning site of the pPICZαA (Invitrogen, USA) vector. pPICZαA-3CL pro has a cleavage map as shown in FIG. 3.
[[ 실시예Example 2] 효모균의 형질전환 2] Transformation of yeast
준비된 컴피턴트 세포인 효모균 Pichia pastoris GS115 (인비트로젠, 미국)에 240㎕ 50% 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol) 3350, 36㎕의 1M LiCl, 25 ㎕의 단일가닥 salmon sperm DNA(2 mg/ml) 그리고 상기 실시예 1에서 얻은 재조합 pPICZαA-3CLpro DNA(5㎍)를 넣고 1분 동안 격렬하게 혼합하였다. DNA를 삽입하기 위하여 30℃에서 25분 동안 방치 한 후 42 ℃에서 25분 동안 열충격을 가하였다. 그 후, 원심 분리하여 세포만 회수한 후 이를 다시 1 ㎖의 YPD 배지[1%(w/v) 효모 추출 액, 2%(w/v) 펩톤, 2%(w/v) 포도당]을 넣어주고 30℃에서 1시간동안 배양하였다. 이 배양액을 제오신(Zeocin, 100 ㎍/㎖)이 첨가된 YPD 고체배지에서 30℃에서 이틀 동안 배양하였다.
Prepared competent cells, yeast Pichia 240 µl 50% polyethylene glycol 3350, 36 µl 1M LiCl, 25 µl single-stranded salmon sperm DNA (2 mg/ml) in pastoris GS115 (Invitrogen, USA) and the recombinant obtained in Example 1 pPICZαA-3CL pro DNA (5 μg) was added and mixed vigorously for 1 minute. In order to insert the DNA, it was left at 30° C. for 25 minutes and then thermal shock was applied at 42° C. for 25 minutes. Then, after collecting only the cells by centrifugation, 1 ml of YPD medium [1% (w/v) yeast extract, 2% (w/v) peptone, 2% (w/v) glucose] was added again. And incubated at 30° C. for 1 hour. The culture solution was incubated for two days at 30° C. in YPD solid medium to which zeocin (100 μg/ml) was added.
[[ 실시예Example 3] 재조합 사스-코로나바이러스 3 3] Recombinant SARS-coronavirus 3 CLCL 프로테아제의 생산 Production of protease
상기 실시예 2에서 배양된 형질전환 균주를 BMGY[1%(w/v) 효모 추출액, 2%(w/v) 펩톤, 100 mM 인산칼륨, pH 6.0, 1.34% yeast nitrogen base with ammonium sulfate without amino acids, 4 x 10-5 % Biotin, 1%(w/v)글리세롤] 배지에서 28℃에서 18시간 배양하였다. 상기 배양물을 원심 분리하여 회수한 세포를 BMMY[1%(w/v) 효모 추출액, 2%(w/v) 펩톤, 100 mM 인산칼륨, pH 6.0, 1.34% yeast nitrogen base with ammonium sulfate without amino acids, 4 x 10-5 % Biotin, 0.5%(w/v)메탄올] 배지에 OD 600이 1.0이 되도록 현탁한 후, 28℃에서 4일 동안 배양하였다. 효소 발현을 위해 최종농도 1.0% 메탄올을 24시간마다 배양액에 첨가하였다. 얻어진 배양액의 상등액을 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제 활성을 확인하는데 사용하였다. 본 발명에 따른 재조합 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제는 도 2에 나타낸 바와 같이 세린을 시작으로 306개의 아미노산으로 구성되며, C-말단에는 6개의 히스티딘 택(Histidine tag)이 붙어있어 단백질 정제가 용이하다.
The transformed strain cultured in Example 2 was BMGY [1% (w/v) yeast extract, 2% (w/v) peptone, 100 mM potassium phosphate, pH 6.0, 1.34% yeast nitrogen base with ammonium sulfate without amino. acids, 4 x 10 -5 % Biotin, 1% (w/v) glycerol] in culture medium at 28° C. for 18 hours. The cells recovered by centrifuging the culture were BMMY [1% (w/v) yeast extract, 2% (w/v) peptone, 100 mM potassium phosphate, pH 6.0, 1.34% yeast nitrogen base with ammonium sulfate without amino. acids, 4 x 10 -5 % Biotin, 0.5% (w/v) methanol] was suspended in a medium with an OD 600 of 1.0, followed by incubation at 28° C. for 4 days. For enzyme expression, a final concentration of 1.0% methanol was added to the culture medium every 24 hours. The supernatant of the obtained culture medium was used to confirm the SARS-corona virus 3CL protease activity. The recombinant SARS-coronavirus 3CL protease according to the present invention is composed of 306 amino acids starting with serine as shown in FIG. 2, and 6 histidine tags are attached to the C-terminus, so that protein purification is easy.
[[ 실시예Example 4] 재조합 사스-코로나 바이러스 3 4] Recombinant SARS-corona virus 3 CLCL 프로테아제의 분리 정제 Isolation and purification of protease
상기 실시예 3에서 얻어진 2 ℓ의 배양 상등액으로부터 재조합 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제를 다음과 같은 방법으로 순수하게 분리 정제하였다. 한외여과막(ultrafiltration membrane)을 이용하여 배양 상등액의 완충액을 20 mM Tris-Cl buffer (pH 7.5)로 교환하였다. 이를 암모늄설페이트((NH4)2SO4) 침전 분획방법을 이용하여 60, 70, 80, 그리고 85% 암모늄설페이트((NH4)2SO4)를 첨가하면서 상등액의 단백질을 분리하였다. 각 암모늄설페이트 분획에서 얻어진 단백질 침전물을 회수하여 20 mM Tris-Cl (pH 7.5) 완충용액에 녹이고 염을 제거하기 위해 5 ℓ의 20 mM Tris-Cl (pH 7.5) 완충용액에 24시간 동안 투석을 실시하였다. 정제 효소의 활성은 하기 실시예 5와 동일한 방법으로 활성을 측정하였다.Recombinant SARS-coronavirus 3CL protease was purified from the 2 L culture supernatant obtained in Example 3 in the following manner. The buffer of the culture supernatant was exchanged with 20 mM Tris-Cl buffer (pH 7.5) using an ultrafiltration membrane. The protein of the supernatant was separated while adding 60, 70, 80, and 85% ammonium sulfate ((NH 4 ) 2 SO 4 ) using ammonium sulfate ((NH 4 ) 2 SO 4) precipitation fractionation method. The protein precipitate obtained from each ammonium sulfate fraction was recovered and dissolved in 20 mM Tris-Cl (pH 7.5) buffer solution, and dialysis was performed in 5 L of 20 mM Tris-Cl (pH 7.5) buffer solution for 24 hours to remove salts. I did. The activity of the purified enzyme was measured in the same manner as in Example 5 below.
본 발명에 따른 재조합 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제의 존재를 확인하기 위하여 12% 폴리아크릴아미드 젤 상에서 30 mA의 조건으로 전기영동 하였다. 전기영동이 끝난 후, 젤을 염색 용액(쿠마시에 브릴리언트 블루 R-250 1 g, 아세트산 100 ㎖, 메탄올 450 ㎖, 증류수, 450 ㎖)으로 염색하고, 탈색용액(메탄올 100 ㎖, 아세트산 10 ㎖, 증류수 800 ㎖) 300 ㎖를 3 내지 5회 교환해주면서 탈색하였다.In order to confirm the presence of the recombinant SARS-coronavirus 3CL protease according to the present invention, electrophoresis was performed on a 12% polyacrylamide gel under a condition of 30 mA. After the electrophoresis was completed, the gel was stained with a dyeing solution (1 g of Coomasie Brilliant Blue R-250, 100 ml of acetic acid, 450 ml of methanol, distilled water, 450 ml), and a bleaching solution (100 ml of methanol, 10 ml of acetic acid, Distilled water (800 ml)) 300 ml was decolorized while exchanging 3 to 5 times.
도 4의 결과에서도 확인할 수 있듯이, 단백질의 크기는 바이오레드(Bio-Rad)사(미국)의 표준 단백질[레인 M, 크기 마커(미오신, 200 kDa; β-갈락토시다제, 116 kDa; 포스포릴라아제(phosporylase) b, 97.4 kDa; 소 혈청 알부민(BSA), 66 kDa; 난백알부민, 45 kDa; 카보닉 언하이드라제, 31 kDa; 트립신 저해제, 21.5 kDa)]을 기준으로 결정하였고, 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제의 크기는 약 42 kDa임을 확인하였다. 레인 1 은 발효 후 상등액, 레인 2는 정제된 단백질의 샘플이다.As can be seen from the results of Figure 4, the size of the protein is a standard protein (Lane M, size marker (myosin, 200 kDa; β-galactosidase, 116 kDa; force) of Bio-Rad (USA) Phosporylase b, 97.4 kDa; bovine serum albumin (BSA), 66 kDa; egg white albumin, 45 kDa; carbonic anhydrase, 31 kDa; trypsin inhibitor, 21.5 kDa)]. It was confirmed that the size of the SARS-corona virus 3CL protease was about 42 kDa.
도 5의 결과에서도 확인할 수 있듯이, 재조합 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제는 C-말단에 6개의 히스티딘 택(Histidine tag)이 붙어있어 이와 반응하는 항-His 항체(anti-His antibody)를 이용한 웨스턴 블럿(Western Blot) 분석을 통해 재조합 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제를 확인하였다.
As can be seen from the results of FIG. 5, the recombinant SARS-coronavirus 3CL protease has six histidine tags attached to the C-terminus and reacts with Western blot using an anti-His antibody (anti-His antibody). Western Blot) analysis confirmed the recombinant SARS-coronavirus 3CL protease.
[ 실시예 5] 재조합 사스-코로나 바이러스 3 CL 프로테아제에 대한 저해활성을 갖는 화합물의 선별 [ Example 5] Selection of compounds having inhibitory activity against recombinant SARS-coronavirus 3 CL protease
(1) 재조합 사스-코로나 바이러스 3(1) Recombinant SARS-coronavirus 3 CLCL 프로테아제에 대한 활성 조사 Protease activity investigation
사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제 분석에 이용되는 기질은 사스-코로나 바이러스 복제효소(SARS-CoV replicase) 유전자에 의해 합성된 다단백질 (pp1ab)에 존재하는 절단 부위를 모방하여 디자인된 합성 펩타이드(DABCYL-Lys-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-Gln-Ser-Gly-Phe-Arg-Lys-Met-Glu-EDANS ,Bachem, 스위스)이다. 이 기질에는 형광 도너인 EDANS와 형광 소멸자인 DABCYL이 결합되어 있다[Matayoshi, E.D., Wang, G.T., Kraff, G.A. and Erickson, J. Novel fluorogenic substrates for assaying retroviral proteases by resonance energy transfer. Science. 247: 954-958(1990)]. 형광은 기질이 절단되어 EDANS 그룹이 DABCYL 그룹으로부터 분리되었을 때만 확인이 된다[Luker, K.E., Francis, S.E., Gluzman, I.Y. and Goldberg. Kinetic analysis of plasmepsin I and II aspartic protease of the Plasmodium falciparum digestive vacuole. Mol. Biochem. Parasitol. 79:71-78(1996)]. The substrate used in the SARS-corona virus 3CL protease assay is a synthetic peptide (DABCYL-Lys) designed by mimicking the cleavage site present in the polyprotein (pp1ab) synthesized by the SARS-CoV replicase gene. -Thr-Ser-Ala-Val-Leu-Gln-Ser-Gly-Phe-Arg-Lys-Met-Glu-EDANS, Bachem, Switzerland). The fluorescent donor EDANS and the fluorescence deactivator DABCYL are bound to this substrate [Matayoshi, E.D., Wang, G.T., Kraff, G.A. and Erickson, J. Novel fluorogenic substrates for assaying retroviral proteases by resonance energy transfer. Science. 247: 954-958 (1990)]. Fluorescence is confirmed only when the substrate is cleaved and the EDANS group is separated from the DABCYL group [Luker, K.E., Francis, S.E., Gluzman, I.Y. and Goldberg. Kinetic analysis of plasmepsin I and II aspartic protease of the Plasmodium falciparum digestive vacuole. Mol. Biochem. Parasitol. 79:71-78 (1996)].
재조합 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제의 활성을 확인하기 위하여, 기질을 최종농도20 μM 농도로 20 mM Tris 완충액(pH 7.5)에 녹여 사용하였다. 상기 실시예 4에서 수득한 재조합 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제 3㎍을 45종의 저해 활성 후보물질(최종농도 100 μM)과 혼합하여 25℃에서 25분 반응시킨 후, 반응 산물은 형광 마이크로 플레이트 리더 SpectraMax Gemini XPS (Molecular Devices, USA) 기기를 이용하여 형광 세기(흡수(exitation) 355 nm, 방출(emission) 538 nm)를 측정하여 모니터 하였다. 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제에 의해 기질이 분해됨에 따라 형광세기가 증가하게 되는데 이를 이용하여 저해 후보물질들에 대한 활성저해를 측정하였다.In order to confirm the activity of the recombinant SARS-coronavirus 3CL protease, the substrate was dissolved in 20 mM Tris buffer (pH 7.5) at a final concentration of 20 μM and used. 3 μg of the recombinant SARS-coronavirus 3CL protease obtained in Example 4 was mixed with 45 inhibitory activity candidates (final concentration 100 μM) and reacted at 25° C. for 25 minutes, and the reaction product was a fluorescent microplate reader SpectraMax. The fluorescence intensity (exitation 355 nm, emission 538 nm) was measured and monitored using a Gemini XPS (Molecular Devices, USA) instrument. As the substrate is degraded by the SARS-corona virus 3CL protease, the fluorescence intensity increases, and the activity inhibition of the inhibitory candidates was measured using this.
재조합 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제 활성 저해를 비교하기 위하여, 저해 활성 물질 첨가 없이 단지 재조합 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제와 기질만을 포함하는 반응액을 대조군으로 사용하였다.In order to compare the inhibition of the recombinant SARS-coronavirus 3CL protease activity, a reaction solution containing only the recombinant SARS-corona virus 3CL protease and substrate was used as a control without addition of an inhibitory active substance.
54종의 활성 저해 후보물질 중 우수한 활성저해를 나타내는 화합물을 선별하고자 하였고 하기 표 1에 화학물질들의 명칭 및 상대적 활성저해를 나타내었다. 활성 저해의 기준은 저해 활성 물질을 첨가하지 않았을 때의 재조합 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제의 활성저해를 0%라 하고 화합물 첨가 후의 저해 효과에 의해 나타나는 활성을 %로 표시하였다. 즉 더 높은 %의 수치는 더 높은 효소 저해 특성을 나타낸다.It was attempted to select a compound that exhibits excellent activity inhibition among 54 candidates for activity inhibition, and the names and relative activity inhibition of the chemical substances are shown in Table 1 below. As a criterion for inhibition of activity, inhibition of the activity of the recombinant SARS-coronavirus 3CL protease when the inhibitory active substance was not added was 0%, and the activity exhibited by the inhibitory effect after addition of the compound was expressed in %. In other words, higher percentage values indicate higher enzyme inhibitory properties.
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상기 표 1에 나타낸 45종의 화합물들 중 재조합 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제의 활성 저해가 높은 화합물 8종(화합물 4, 5, 16, 26, 27, 28, 36 및 45)을 선별하여 하기 표 2에 50% 저해 농도(IC50)를 기재하였으며, 화합물 16의 경우 IC50값은 38.88 μM으로 사스-코로나 바이러스 3CL 프로테아제에 대한 저해 활성이 가장 좋은 것으로 확인되었다.Among the 45 compounds shown in Table 1, 8 compounds (Compounds 4, 5, 16, 26, 27, 28, 36 and 45) having high inhibition of the activity of the recombinant SARS-corona virus 3CL protease were selected, and the following Table 2 The 50% inhibitory concentration (IC 50 ) was described in, and for compound 16, the IC 50 value was 38.88 μM, which was confirmed to have the best inhibitory activity against the SARS-coronavirus 3CL protease.
<110> Industry Foundation of Chonnam National University <120> Inhibitors of SARS-coronavirus 3CL Protease for Severe Acute Respiratory Syndrome and Method for screening thereof <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 918 <212> DNA <213> SARS-coronavirus 3CL Protease <400> 1 agtggattca gaaaaatggc cttcccaagt ggaaaagttg agggttgtat ggttcaggtc 60 acatgcggta ctactactct taacggtttg tggcttgatg acacagttta ctgtccaaga 120 catgtcattt gcaccgctga agatatgttg aaccctaatt atgaggactt gcttatcaga 180 aagtcaaacc atagttttct tgttcaagcc ggaaatgttc agttgagagt cattggtcac 240 tcaatgcaaa actgtttgct tagattgaag gttgatacca gtaacccaaa gactcctaag 300 tacaagttcg ttagaatcca accaggacag actttctctg tcttggcatg ttacaatgga 360 tctccatccg gtgtttatca gtgcgctatg agacctaacc atactattaa gggttctttc 420 ttgaatggtt cttgcggatc cgttggtttt aacatcgatt acgactgtgt ctccttctgc 480 tatatgcatc acatggaact tccaaccgga gtccacgctg gtactgactt ggagggaaaa 540 ttttacggtc ctttcgttga tagacaaact gcccaggctg ccggaacaga cactacaatt 600 accttgaatg ttcttgcatg gttgtatgca gctgtcatca acggagatag atggtttttg 660 aatagattca ccactacact taacgacttc aatttggttg ctatgaagta caactacgaa 720 ccattgactc aagatcacgt cgacattctt ggacctttgt cagctcagac aggtatcgcc 780 gttcttgata tgtgtgccgc attgaaagag ttgcttcaaa acggaatgaa tggtagaact 840 attttgggta gtacaatcct tgaggatgag tttacccctt ttgatgttgt tagacagtgt 900 tcaggagtta cttttcag 918 <210> 2 <211> 306 <212> PRT <213> SARS-coronavirus 3CL Protease <400> 2 Ser Gly Phe Arg Lys Met Ala Phe Pro Ser Gly Lys Val Glu Gly Cys 1 5 10 15 Met Val Gln Val Thr Cys Gly Thr Thr Thr Leu Asn Gly Leu Trp Leu 20 25 30 Asp Asp Thr Val Tyr Cys Pro Arg His Val Ile Cys Thr Ala Glu Asp 35 40 45 Met Leu Asn Pro Asn Tyr Glu Asp Leu Leu Ile Arg Lys Ser Asn His 50 55 60 Ser Phe Leu Val Gln Ala Gly Asn Val Gln Leu Arg Val Ile Gly His 65 70 75 80 Ser Met Gln Asn Cys Leu Leu Arg Leu Lys Val Asp Thr Ser Asn Pro 85 90 95 Lys Thr Pro Lys Tyr Lys Phe Val Arg Ile Gln Pro Gly Gln Thr Phe 100 105 110 Ser Val Leu Ala Cys Tyr Asn Gly Ser Pro Ser Gly Val Tyr Gln Cys 115 120 125 Ala Met Arg Pro Asn His Thr Ile Lys Gly Ser Phe Leu Asn Gly Ser 130 135 140 Cys Gly Ser Val Gly Phe Asn Ile Asp Tyr Asp Cys Val Ser Phe Cys 145 150 155 160 Tyr Met His His Met Glu Leu Pro Thr Gly Val His Ala Gly Thr Asp 165 170 175 Leu Glu Gly Lys Phe Tyr Gly Pro Phe Val Asp Arg Gln Thr Ala Gln 180 185 190 Ala Ala Gly Thr Asp Thr Thr Ile Thr Leu Asn Val Leu Ala Trp Leu 195 200 205 Tyr Ala Ala Val Ile Asn Gly Asp Arg Trp Phe Leu Asn Arg Phe Thr 210 215 220 Thr Thr Leu Asn Asp Phe Asn Leu Val Ala Met Lys Tyr Asn Tyr Glu 225 230 235 240 Pro Leu Thr Gln Asp His Val Asp Ile Leu Gly Pro Leu Ser Ala Gln 245 250 255 Thr Gly Ile Ala Val Leu Asp Met Cys Ala Ala Leu Lys Glu Leu Leu 260 265 270 Gln Asn Gly Met Asn Gly Arg Thr Ile Leu Gly Ser Thr Ile Leu Glu 275 280 285 Asp Glu Phe Thr Pro Phe Asp Val Val Arg Gln Cys Ser Gly Val Thr 290 295 300 Phe Gln 305 <110> Industry Foundation of Chonnam National University <120> Inhibitors of SARS-coronavirus 3CL Protease for Severe Acute Respiratory Syndrome and Method for screening thereof <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 918 <212> DNA <213> SARS-coronavirus 3CL Protease <400> 1 agtggattca gaaaaatggc cttcccaagt ggaaaagttg agggttgtat ggttcaggtc 60 acatgcggta ctactactct taacggtttg tggcttgatg acacagttta ctgtccaaga 120 catgtcattt gcaccgctga agatatgttg aaccctaatt atgaggactt gcttatcaga 180 aagtcaaacc atagttttct tgttcaagcc ggaaatgttc agttgagagt cattggtcac 240 tcaatgcaaa actgtttgct tagattgaag gttgatacca gtaacccaaa gactcctaag 300 tacaagttcg ttagaatcca accaggacag actttctctg tcttggcatg ttacaatgga 360 tctccatccg gtgtttatca gtgcgctatg agacctaacc atactattaa gggttctttc 420 ttgaatggtt cttgcggatc cgttggtttt aacatcgatt acgactgtgt ctccttctgc 480 tatatgcatc acatggaact tccaaccgga gtccacgctg gtactgactt ggagggaaaa 540 ttttacggtc ctttcgttga tagacaaact gcccaggctg ccggaacaga cactacaatt 600 accttgaatg ttcttgcatg gttgtatgca gctgtcatca acggagatag atggtttttg 660 aatagattca ccactacact taacgacttc aatttggttg ctatgaagta caactacgaa 720 ccattgactc aagatcacgt cgacattctt ggacctttgt cagctcagac aggtatcgcc 780 gttcttgata tgtgtgccgc attgaaagag ttgcttcaaa acggaatgaa tggtagaact 840 attttgggta gtacaatcct tgaggatgag tttacccctt ttgatgttgt tagacagtgt 900 tcaggagtta cttttcag 918 <210> 2 <211> 306 <212> PRT <213> SARS-coronavirus 3CL Protease <400> 2 Ser Gly Phe Arg Lys Met Ala Phe Pro Ser Gly Lys Val Glu Gly Cys 1 5 10 15 Met Val Gln Val Thr Cys Gly Thr Thr Thr Leu Asn Gly Leu Trp Leu 20 25 30 Asp Asp Thr Val Tyr Cys Pro Arg His Val Ile Cys Thr Ala Glu Asp 35 40 45 Met Leu Asn Pro Asn Tyr Glu Asp Leu Leu Ile Arg Lys Ser Asn His 50 55 60 Ser Phe Leu Val Gln Ala Gly Asn Val Gln Leu Arg Val Ile Gly His 65 70 75 80 Ser Met Gln Asn Cys Leu Leu Arg Leu Lys Val Asp Thr Ser Asn Pro 85 90 95 Lys Thr Pro Lys Tyr Lys Phe Val Arg Ile Gln Pro Gly Gln Thr Phe 100 105 110 Ser Val Leu Ala Cys Tyr Asn Gly Ser Pro Ser Gly Val Tyr Gln Cys 115 120 125 Ala Met Arg Pro Asn His Thr Ile Lys Gly Ser Phe Leu Asn Gly Ser 130 135 140 Cys Gly Ser Val Gly Phe Asn Ile Asp Tyr Asp Cys Val Ser Phe Cys 145 150 155 160 Tyr Met His His Met Glu Leu Pro Thr Gly Val His Ala Gly Thr Asp 165 170 175 Leu Glu Gly Lys Phe Tyr Gly Pro Phe Val Asp Arg Gln Thr Ala Gln 180 185 190 Ala Ala Gly Thr Asp Thr Thr Ile Thr Leu Asn Val Leu Ala Trp Leu 195 200 205 Tyr Ala Ala Val Ile Asn Gly Asp Arg Trp Phe Leu Asn Arg Phe Thr 210 215 220 Thr Thr Leu Asn Asp Phe Asn Leu Val Ala Met Lys Tyr Asn Tyr Glu 225 230 235 240 Pro Leu Thr Gln Asp His Val Asp Ile Leu Gly Pro Leu Ser Ala Gln 245 250 255 Thr Gly Ile Ala Val Leu Asp Met Cys Ala Ala Leu Lys Glu Leu Leu 260 265 270 Gln Asn Gly Met Asn Gly Arg Thr Ile Leu Gly Ser Thr Ile Leu Glu 275 280 285 Asp Glu Phe Thr Pro Phe Asp Val Val Arg Gln Cys Ser Gly Val Thr 290 295 300 Phe Gln 305
Claims (2)
(16)
N-{1-({[3-(디메틸아미노)프로필]아미노}카보닐)-2-[5-(3-니트로페닐)-2-퓨릴]비닐}-4-메틸벤즈아마이드;
(27)
N-{1-({[3-(디메틸아미노)프로필]아미노}카보닐)-2-[5-(2-니트로페닐)-2-퓨릴]비닐}-4-메틸벤즈아마이드;
(28)
N-(1-{[2-(4-하이드록시-3,5-디메톡시벤질리덴)하이드라지노]카보닐}-2-페닐비닐)벤즈아마이드.A pharmaceutical composition for preventing or treating severe acute respiratory syndrome comprising, as an active ingredient, an active ingredient of a SARS-coronavirus 3CL protease activity inhibitor selected from the following compounds:
(16)
N- {1 - ({[3- (dimethylamino) propyl] amino} carbonyl) -2- [5- (3-nitrophenyl) -2-furyl] vinyl} -4-methylbenzamide;
(27)
N- {1 - ({[3- (dimethylamino) propyl] amino} carbonyl) -2- [5- (2-nitrophenyl) -2-furyl] vinyl} -4-methylbenzamide;
(28)
N- (1 - {[2- (4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzylidene) hydrazino] carbonyl} -2-phenylvinyl) benzamide.
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Non-Patent Citations (3)
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| Bioorg. Med. Chem. Lett. 2005. Vol. 15, pp. 3058-3062 * |
| Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 2009. Vol. 19, pp. 4538-4541 * |
| Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 2009. Vol. 19, pp. 4538-4541* |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11603552B2 (en) | 2020-07-20 | 2023-03-14 | Mesa Photonics, LLC | Method for pathogen identification |
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