KR101417367B1 - Method for analyzing the activity of the anti-freezing protein and the application thereof - Google Patents

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Abstract

본 발명은 동결방지단백질의 활성 분석 방법에 관한 것으로, 일 말단에 카르복실기를 포함하는 개질부를 금속 나노입자의 표면에 도입하여, 상기 금속 나노입자의 표면을 카르복시기로 개질하는 단계; 실험군으로서, 분석 대상 동결방지단백질을 상기 표면이 개질된 금속 나노입자와 함께 물에 첨가하는 단계; 상기 금속 나노입자와 동결방지단백질이 첨가된 물을 0 ℃ 이하로 냉동시켜 상기 금속 나노입자를 응집시킨 후, 해동시키는 단계; 상기 해동된 물 내에 포함된 상기 금속 나노입자의 응집 정도를 측정하는 단계; 및 상기 측정된 응집 정도를, 분석 대상 동결방지단백질이 포함되지 않은 물을 0 ℃ 이하로 냉동시켜 상기 금속 나노입자를 응집시킨 후 해동시킨 대조군의 금속 나노입자 응집 정도와 비교하는 단계를 포함하는 동결방지단백질의 활성 분석 방법을 제공한다. 본 발명의 동결방지단백질 활성 분석 방법은 종래의 기술에 비하여 보다 간단하고 저렴하면서도 빠르게 동결방지단백질의 활성을 정량 또는 정성적으로 분석할 수 있을 뿐만 아니라, 상기 동결방지단백질의 안정성도 분석할 수 있는 효과가 있다.The present invention relates to a method for analyzing the activity of an anti-freeze protein, comprising the steps of: introducing a modified portion containing a carboxyl group at one end to the surface of metal nanoparticles to modify the surface of the metal nanoparticles to a carboxyl group; As an experimental group, the method comprises the steps of: adding an anti-freeze protein to be analyzed to water together with the surface-modified metal nanoparticles; Freezing the water to which the metal nanoparticles and the anti-freeze protein have been added at a temperature of 0 ° C or less to coagulate the metal nanoparticles and thawing the nanoparticles; Measuring the degree of agglomeration of the metal nanoparticles contained in the thawed water; And freezing the measured degree of aggregation by freezing the water containing no freeze inhibition protein to be analyzed at 0 ° C or less to coagulate the metal nanoparticles and comparing the degree of agglomeration of the metal nanoparticles of the control group, And a method for assaying the activity of an anti-proliferative protein. The anti-freeze protein activity assay method of the present invention is capable of quantitatively or qualitatively analyzing the activity of the anti-freeze protein more simply, inexpensively and rapidly as compared with the conventional technique, and can also analyze the stability of the anti- It is effective.

Description

동결방지단백질의 활성 분석 방법 및 그 응용{Method for analyzing the activity of the anti-freezing protein and the application thereof}[0001] The present invention relates to a method for analyzing the activity of an anti-freeze protein and an application thereof,

본 발명은 동결방지단백질의 활성 분석 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 금속 나노입자의 응집 현상을 이용하여 동결방지단백질의 활성을 분석하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for analyzing the activity of an anti-freeze protein, and more particularly, to a method for analyzing the activity of an anti-freeze protein using aggregation phenomenon of metal nanoparticles.

동결방지단백질은 극지에서 서식하는 생물들이 저온에 적응하기 위한 생체방어기작의 일환으로 생물체에서 합성되어 분비되는 단백질로서, 항동단백질, 동결방지단백질, 저온저항성 단백질, 얼음결합 단백질 등으로 불려진다. 상기 동결방지단백질은 물의 녹는점과 어는점의 차이를 유발하여 물이 얼음으로 결정화되는 것을 방지해주고 얼음이 해동 후 재결정되는 과정을 억제하는 역할을 한다. 특히, 일반적으로 사용되고 있는 항동방지제제(예, 글라이세롤, DMSO, 소비톨 등)와는 달리, 단백질의 일부 구조가 얼음 결정에 직접적으로 결합을 하여 얼음 결정 형성(ice crystallization) 과정에 관여한다. 따라서, 화학제제가 용질 농도에 의존적으로 단순히 어는점 내림의 역할을 하는 반면, 동결방지단백질의 경우 상대적으로 농도에 의존하지 않는 얼음 결정 형성 방지 기작을 가지고 있다. 상기와 같은 동결방지단백질의 특성으로 인하여 얼음 결정에 의해 쉽게 영향을 받을 수 있는 세포를 보존하기 위한 바이오의학 분야, 저온식품의 얼음결정 방지에 적용하기 위한 식품산업분야, 농수산물의 냉해방지를 위한 농수산분야 및 군사분야 등에서 큰 관심을 받고 있다.Anti-freezing protein is a protein synthesized and secreted by living organisms as part of a bioprotective mechanism for polar living organisms to adapt to low temperature. It is called anti-free protein, anti-freeze protein, low temperature resistant protein and ice-binding protein. The anti-freeze protein prevents the water from crystallizing into ice by causing a difference between the melting point and freezing point of water, and suppresses the process of recrystallization after defrosting the ice. Particularly, unlike antiseptic agents (eg, glycerol, DMSO, sorbitol, etc.), which are generally used, some of the proteins are directly involved in the ice crystal crystallization and participate in the process of ice crystallization. Therefore, the chemical agent plays a role of simply freezing point depending on the solute concentration, while the anti-freezing protein has a mechanism of preventing the formation of ice crystals relatively independent of the concentration. In order to preserve cells that can be easily affected by ice crystals due to the characteristics of the above-mentioned anti-freezing proteins, there is a field of biomedicine, a food industry for application to prevention of ice crystals of low temperature foods, And has attracted great interest in the field and the military field.

이러한 동결방지단백질의 활용에 있어, 상기 동결방지단백질의 활성을 분석하는 것이 매우 중요하다. 현재 이용되고 있는 대표적인 동결방지단백질의 활성 분석 방법은 어는점과 녹는점의 차이(Thermal hysteresis, TH)를 측정하는 방법이다(Barrett et al., Int. J. Biochem. Cell B 2001, 33, 105-117. 및 Kristiansen et al., Cryobiology 2005, 51, 262-280.). 그러나, 상기 TH 방법은 자동 온도 조절장치를 통해 영하에서 미세한 온도 변화를 가해 동결방지단백질 주변에 발생하는 얼음 결정 형태를 직접 관찰하여, 변화되는 시점의 온도를 기록하는 방식에 의존하고 있다. 따라서, 특수한 냉각/해동 온도조절 장치와 더불어 나노부피 측정용 삼투압측정기(nanoliter osmometer) 및 현미경 등을 구비해야 하고, 무엇보다 온도에 따른 얼음 결정구조를 장시간 모니터링 해야 하는 어려움 때문에 동결방지단백질의 농도에 따른 활성의 표준곡선을 구하기 위해서는 적어도 하루 이상이 소모되는 큰 문제점이 있다. In utilizing such freeze protection proteins, it is very important to analyze the activity of the freeze protection proteins. A representative method of assaying the activity of freeze-inhibiting proteins currently used is a method of measuring the thermal hysteresis (TH) between freezing point and melting point (Barrett et al., Int. J. Biochem. Cell B 2001, 117. and Kristiansen et al., Cryobiology 2005, 51, 262-280.). However, the TH method relies on a method of directly observing the shape of ice crystals generated around the freeze prevention protein by applying a minute temperature change at a sub-zero temperature through a thermostat, and recording the temperature at the time of the change. Therefore, it is necessary to have a special cooling / thawing temperature control device, a nanoliter osmometer for measurement of nano volume and a microscope, and moreover, it is difficult to monitor the ice crystal structure according to temperature for a long time, There is a problem that at least one day is consumed in order to obtain the standard curve of activity according to the present invention.

따라서, 상기와 같은 종래의 분석 방법에 비해 보다 간단하고 저렴하면서도 안정적으로 동결방지단백질의 활성을 분석할 수 있는 추가적인 기술의 개발이 필요하다.
Therefore, it is necessary to develop an additional technique that can analyze the activity of the anti-freezing protein more simply, inexpensively, and stably than the conventional assay method.

본 발명의 목적은 보다 간단하고 저렴하면서도 안정적으로 동결방지단백질의 활성을 분석하는 방법을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a method for analyzing the activity of an anti-freezing protein in a simpler, less expensive and stable manner.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 일 말단에 카르복실기를 포함하는 개질부를 금속 나노입자의 표면에 도입하여, 상기 금속 나노입자의 표면을 카르복시기로 개질하는 단계; 실험군으로서, 분석 대상 동결방지단백질을 상기 표면이 개질된 금속 나노입자와 함께 물에 첨가하는 단계; 상기 금속 나노입자와 동결방지단백질이 첨가된 물을 0 ℃ 이하로 냉동시켜 상기 금속 나노입자를 응집시킨 후, 해동시키는 단계; 상기 해동된 물 내에 포함된 상기 금속 나노입자의 응집 정도를 측정하는 단계; 및 상기 측정된 응집 정도를, 분석 대상 동결방지단백질이 포함되지 않은 물을 0 ℃ 이하로 냉동시켜 상기 금속 나노입자를 응집시킨 후 해동시킨 대조군의 금속 나노입자 응집 정도와 비교하는 단계를 포함하는 동결방지단백질의 활성 분석 방법을 제공한다.According to an aspect of the present invention, there is provided a method for preparing a metal nanoparticle, comprising: introducing a modified portion containing a carboxyl group at one end to the surface of the metal nanoparticle to modify the surface of the metal nanoparticle to a carboxyl group; As an experimental group, the method comprises the steps of: adding an anti-freeze protein to be analyzed to water together with the surface-modified metal nanoparticles; Freezing the water to which the metal nanoparticles and the anti-freeze protein have been added at a temperature of 0 ° C or less to coagulate the metal nanoparticles and thawing the nanoparticles; Measuring the degree of agglomeration of the metal nanoparticles contained in the thawed water; And freezing the measured degree of aggregation by freezing the water containing no freeze inhibition protein to be analyzed at 0 ° C or less to coagulate the metal nanoparticles and comparing the degree of agglomeration of the metal nanoparticles of the control group, And a method for assaying the activity of an anti-proliferative protein.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 다른 측면은 일 말단에 카르복실기를 포함하는 개질부를 금속 나노입자의 표면에 도입하여, 상기 금속 나노입자의 표면을 카르복시기로 개질하는 단계; 실험군으로서, 억제 대상 동결방지단백질 및 억제제 후보물질을 상기 표면이 개질된 금속 나노입자와 함께 물에 첨가하는 단계; 상기 금속 나노입자, 억제 대상 동결방지단백질 및 억제제 후보물질이 첨가된 물을 0 ℃ 이하로 냉동시켜 상기 금속 나노입자를 응집시킨 후, 해동시키는 단계; 상기 해동된 물 내에 포함된 상기 금속 나노입자의 응집 정도를 측정하는 단계; 상기 측정된 응집 정도를, 억제제 후보물질이 포함되지 않은 물 내에서 응집시킨 대조군의 금속 나노입자 응집 정도와 비교하는 단계; 및 상기 대조군에 비하여 높은 응집 정도를 나타내는 실험군에 포함된 억제제 후보물질을 억제 대상 동결방지단백질의 활성 억제제인 것으로 판단하는 단계를 포함하는 동결방지단백질의 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.According to another aspect of the present invention, there is provided a method for preparing a metal nanoparticle, comprising the steps of: introducing a modified moiety having a carboxyl group at one end to the surface of the metal nanoparticle to modify the surface of the metal nanoparticle to a carboxyl group; As an experimental group, the step of adding an inhibition target freeze preventing protein and an inhibitor candidate substance to water together with the surface-modified metal nanoparticles; Freezing the water to which the metal nanoparticles, the object of inhibition of freezing prevention, and the inhibitor candidate substance are added at a temperature of 0 ° C or less to coagulate the metal nanoparticles and thawing the metal nanoparticles; Measuring the degree of agglomeration of the metal nanoparticles contained in the thawed water; Comparing the measured degree of aggregation with the degree of metal nanoparticle aggregation of a control group aggregated in water not containing an inhibitor candidate material; And determining that the inhibitor candidate contained in the test group exhibiting a higher level of aggregation as compared with the control group is an inhibitor of the inhibition of freeze inhibition protein to be inhibited.

본 발명의 동결방지단백질 활성 분석 방법은 종래의 기술에 비하여 보다 간단하고 저렴하면서도 빠르게 동결방지단백질의 활성을 정량 또는 정성적으로 분석할 수 있을 뿐만 아니라, 상기 동결방지단백질의 안정성도 분석할 수 있는 효과가 있다.The anti-freeze protein activity assay method of the present invention is capable of quantitatively or qualitatively analyzing the activity of the anti-freeze protein more simply, inexpensively and rapidly as compared with the conventional technique, and can also analyze the stability of the anti- It is effective.

다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.However, the effects of the present invention are not limited to the above-mentioned effects, and other effects not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the following description.

도 1은 상기 동결방지단백질의 활성 분석 방법의 원리를 설명하기 위한 개략도이다.
도 2는 본 발명의 실시예 <1-2-1>에서 제조된 MSA-AuNP 입자의 특성을 확인한 실험 결과로서,
(A)는 MSA-AuNP 입자의 광학적 특성(E520(520 ㎚에서의 흡광도))을 측정하여 Cit-AuNP 입자와 비교한 그래프이고;
(B)는 Cit-AuNP 입자의 표면을 MSA로 개질한 후 수용액의 색 변화를 육안으로 관찰하여 촬영한 사진이고;
(C) 및 (D)는 제조된 MSA-AuNP 입자를 각각 FE-SEM 및 고해상도 FE-SEM으로 관찰한 결과를 촬영한 현미경 사진이다.
도 3은 개질부로서 citrate의 적용 가부를 확인한 실험 결과로서,
(A)는 Cit-AuNP 입자에 냉동 및 해동을 수행한 다음의 플레이트 상에서의 색 변화를 육안으로 관찰하여 촬영한 사진이고;
(B)는 냉동 및 해동 전의 Cit-AuNP 입자의 흡광도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이고;
(C)는 냉동 및 해동 후의 Cit-AuNP 입자의 흡광도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 개질부로서 CM-PEG-SH의 적용 가부를 확인한 실험 결과로서,
(A)는 PEG-AuNP 입자에 냉동 및 해동을 수행한 다음의 플레이트 상에서의 색 변화를 육안으로 관찰하여 촬영한 사진이고;
(B)는 냉동 및 해동 전의 PEG-AuNP 입자의 흡광도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이고;
(C)는 냉동 및 해동 후의 PEG-AuNP 입자의 흡광도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 개질부로서 MSA의 적용 가부를 확인한 실험 결과로서, 냉동 및 해동 전/후의 MSA-AuNP 입자의 흡광도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 동결방지단백질 CnAFP를 이용하여 동결방지 활성의 정량 분석 가부를 확인한 실험 결과로서,
(A)는 MSA-AuNP 입자를 BSA 또는 CnAFP와 함께 냉동 및 해동을 수행한 다음의 플레이트 상에서의 색 변화를 육안으로 관찰하여 촬영한 사진이고;
(B)는 냉동 및 해동 후의 MSA-AuNP 입자의 흡광도 변화를 E650 값에 대한 E520 값의 비율(E520/E650)로 나타낸 그래프이며;
(C)는 BSA와 함께 냉동 및 해동을 수행한 후에 응집된 MSA-AuNP 입자를 관찰하여 촬영한 현미경 사진이고;
(D)는 CnAFP와 함께 냉동 및 해동을 수행한 후에도 응집되지 않고 분산되어 있는 MSA-AuNP 입자를 관찰하여 촬영한 현미경 사진이다.
도 7은 동결방지단백질 LeIBP를 이용하여 동결방지 활성의 정량 분석 가부를 확인한 실험 결과로서,
(A)는 MSA-AuNP 입자를 BSA 또는 LeIBP와 함께 냉동 및 해동을 수행한 다음의 플레이트 상에서의 색 변화를 육안으로 관찰하여 촬영한 사진이고;
(B)는 냉동 및 해동 후의 MSA-AuNP 입자의 흡광도 변화를 E650 값에 대한 E520 값의 비율(E520/E650)로 나타낸 그래프이다.
도 8은 동결방지단백질 LeIBP 및 LeIBP의 돌연변이체를 이용하여 동결방지 활성의 정성 분석 가부를 확인한 실험 결과로서,
(A)는 MSA-AuNP 입자를 BSA, 야생형 LeIBP 및 LeIBP의 돌연변이체와 함께 냉동 및 해동을 수행한 다음의 플레이트 상에서의 색 변화를 육안으로 관찰하여 촬영한 사진이고;
(B)는 냉동 및 해동 전/후의 MSA-AuNP 입자의 흡광도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이며;
(C)는 냉동 및 해동 후의 MSA-AuNP 입자의 흡광도 변화를 E650 값에 대한 E520 값의 비율(E520/E650)로 나타낸 그래프이다.
도 9는 동결방지단백질 CnAFP 및 LeIBP를 이용하여 동결방지단백질의 활성 안정성 분석 가부를 확인한 실험 결과로서,
(A)는 MSA-AuNP 입자를 거친 조건에 각각 0회, 5회 및 10회 노출시킨 CnAFP 및 LeIBP와 함께 냉동 및 해동을 수행한 다음의 플레이트 상에서의 색 변화를 육안으로 관찰하여 촬영한 사진이고;
(B)는 냉동 및 해동 후의 MSA-AuNP 입자의 흡광도 변화를 E650 값에 대한 E520 값의 비율(E520/E650)로 나타낸 그래프이다.1 is a schematic diagram for explaining the principle of the method for analyzing the activity of the anti-freeze protein.
FIG. 2 is a graph showing the results of experiments on the characteristics of the MSA-AuNP particles prepared in Example <1-2-1> of the present invention,
(A) is a graph comparing the optical characteristics (E 520 (absorbance at 520 nm)) of MSA-AuNP particles with Cit-AuNP particles;
(B) is a photograph of the surface of a Cit-AuNP particle after being modified with MSA and then observing the change in color of the aqueous solution visually;
(C) and (D) are micrographs of the MSA-AuNP particles prepared by FE-SEM and FE-SEM, respectively.
FIG. 3 is a result of an experiment in which citrate was applied as a modified part,
(A) is a photograph taken by visually observing a color change on a plate after freezing and thawing of Cit-AuNP particles;
(B) is a graph showing the results of measurement of the absorbance of Cit-AuNP particles before freezing and thawing;
(C) is a graph showing the results of measuring absorbance of Cit-AuNP particles after freezing and thawing.
Fig. 4 shows the results of an experiment in which the applicability of CM-PEG-SH as a modified part was confirmed.
(A) is a photograph taken by visually observing the color change on the plate after freezing and thawing the PEG-AuNP particle;
(B) is a graph showing the results of measurement of the absorbance of PEG-AuNP particles before freezing and thawing;
(C) is a graph showing the results of measurement of the absorbance of PEG-AuNP particles after freezing and thawing.
FIG. 5 is a graph showing the results of measurement of the absorbance of MSA-AuNP particles before and after freezing and thawing as a result of confirming the applicability of MSA as a modifying part.
FIG. 6 shows the results of the quantitative analysis of the freezing-inhibiting activity using the anti-freeze protein Cn AFP,
(A) is a photograph of MSA-AuNP particles taken by visual observation of color change on a plate after freezing and thawing with BSA or Cn AFP;
(B) is a graph showing the change in absorbance of the MSA-AuNP particles after freezing and thawing by the ratio (E 520 / E 650 ) of the E 520 value to the E 650 value;
(C) is a micrograph taken by observing aggregated MSA-AuNP particles after freezing and thawing with BSA;
(D) is a micrograph taken by observing MSA-AuNP particles which are not agglomerated but dispersed even after freezing and thawing together with Cn AFP.
FIG. 7 shows the results of the quantitative analysis of the freezing-inhibiting activity using the anti-freeze protein Le IBP,
(A) is a photograph of MSA-AuNP particles observed by visual observation of color change on a plate after freezing and thawing with BSA or Le IBP;
(B) is a graph showing the change in absorbance of MSA-AuNP particles after freezing and thawing by the ratio of E 520 value to E 650 value (E 520 / E 650 ).
FIG. 8 shows the results of qualitative analysis of freezing inhibition activity using mutants of the anti-freeze proteins Le IBP and Le IBP,
(A) is a photograph showing MSA-AuNP particles observed by visual observation of color change on a plate after freezing and thawing with BSA, wild type Le IBP and Le IBP mutants;
(B) is a graph showing the results of measurement of the absorbance of MSA-AuNP particles before and after freezing and thawing;
(C) is a graph showing the change in absorbance of MSA-AuNP particles after freezing and thawing by the ratio (E 520 / E 650 ) of E 520 value to E 650 value.
FIG. 9 is a graph showing the results of the analysis of the activity stability analysis of the anti-freeze protein using the anti-freezing proteins Cn AFP and Le IBP,
(A) was obtained by visually observing the color change on the plate after freezing and thawing with Cn AFP and Le IBP exposed at 0, 5 and 10 times to MSA-AuNP particles, respectively Picture;
(B) is a graph showing the change in absorbance of MSA-AuNP particles after freezing and thawing by the ratio of E 520 value to E 650 value (E 520 / E 650 ).

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.

1. One. 동결방지단백질의 활성 분석 방법Analysis of the activity of freezing-preventing protein

본 발명의 일 측면은 동결방지단백질의 활성 분석 방법을 제공한다.One aspect of the present invention provides a method for assaying the activity of an anti-freeze protein.

도 1은 상기 동결방지단백질의 활성 분석 방법의 원리를 설명하기 위한 개략도이다.1 is a schematic diagram for explaining the principle of the method for analyzing the activity of the anti-freeze protein.

도 1을 참조하면, 본 발명의 상기 동결방지단백질 활성 분석 방법은 냉동에 의하여 비가역적으로 응집되는 금속 나노입자가 동결방지단백질의 존재하에서 냉동에 의한 응집이 억제되는 현상에 기반하여, 비색법의 방법으로 금속 나노입자의 응집 정도를 측정함으로써 상기 동결방지단백질의 동결방지 활성을 측정한다.Referring to FIG. 1, the method for analyzing the anti-freeze protein activity of the present invention is based on the phenomenon that metal nanoparticles irreversibly aggregated by freezing are inhibited from aggregation due to freezing in the presence of anti-freeze protein, The anti-freezing activity of the anti-freezing protein is measured by measuring the degree of aggregation of the metal nanoparticles.

본 발명의 동결방지단백질 활성 분석 방법은 1) 일 말단에 카르복실기를 포함하는 개질부를 금속 나노입자의 표면에 도입하여, 상기 금속 나노입자의 표면을 카르복시기로 개질하는 단계; 2) 실험군으로서, 분석 대상 동결방지단백질을 상기 단계 1)에서 표면이 개질된 금속 나노입자와 함께 물에 첨가하는 단계; 3) 상기 단계 2)의 금속 나노입자와 동결방지단백질이 첨가된 물을 0 ℃ 이하로 냉동시켜 상기 금속 나노입자를 응집시킨 후, 해동시키는 단계; 4) 상기 단계 3)에서 해동된 물 내에 포함된 상기 금속 나노입자의 응집 정도를 측정하는 단계; 및 5) 상기 단계 4)에서 측정된 응집 정도를, 분석 대상 동결방지단백질이 포함되지 않은 물을 0 ℃ 이하로 냉동시켜 상기 금속 나노입자를 응집시킨 후 해동시킨 대조군의 금속 나노입자 응집 정도와 비교하는 단계를 포함한다.The method for assaying freeze-inhibited protein activity according to the present invention comprises the steps of 1) introducing a modified moiety having a carboxyl group at one end thereof to the surface of metal nanoparticles to modify the surface of the metal nanoparticles to a carboxyl group; 2) as an experimental group, adding an anti-freeze protein to be analyzed to the water together with the surface-modified metal nanoparticles in step 1); 3) freezing the water to which the metal nanoparticles of the step 2) and the anti-freeze protein are added at a temperature of 0 ° C or less to aggregate the metal nanoparticles and thaw them; 4) measuring the degree of aggregation of the metal nanoparticles contained in the water thawed in step 3); And 5) comparing the degree of aggregation measured in the step 4) with the degree of aggregation of the metal nano-particles in the control group in which water freezing the freezing-inhibiting protein to be analyzed is frozen to below 0 ° C and the metal nanoparticles are agglomerated and thawed .

상기 단계 1)은 금속 나노입자가 상기 연결부에 의하여 서로 응집될 수 있도록, 상기 금속 나노입자의 표면을 카르복실기로 개질하는 단계이다.The step (1) is a step of modifying the surface of the metal nanoparticles into a carboxyl group so that the metal nanoparticles can cohere with each other by the connecting portion.

상기 단계 1)의 금속 나노입자는 분석 대상 동결방지단백질의 활성 정도에 따라 냉각에 따른 응집(aggregation) 정도가 달라져, 상기 분석 대상 동결방지단백질의 활성을 간접적으로 나타내는 구성이다. 즉, 상기 금속 나노입자는 동결방지단백질이 존재하지 않는 환경에서는 냉동에 의하여 비가역적으로 응집되지만, 동결방지단백질이 존재하는 환경에서는 냉동에 의한 응집이 억제되고, 상기 동결방지단백질의 활성 정도에 따라 응집되는 정도 또한 달라진다. 따라서, 상기 금속 나노입자를 구성하는 금속은 나노입자로의 제조가 가능하고, 표면 개질이 용이한 종류의 금속이라면 특별히 한정되지 않고 이용될 수 있다. 특히, 상기 금속 나노입자는 금, 은, 구리, 백금, 팔라듐, 니켈 및 철로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상의 혼합금속으로 구성될 수 있다.The metal nanoparticles of the step 1) indirectly exhibit the activity of the anti-freeze protein to be analyzed because the degree of aggregation due to cooling changes according to the activity level of the anti-freeze protein to be analyzed. In other words, the metal nanoparticles are irreversibly aggregated by freezing in an environment free of freezing inhibition protein, but aggregation by freezing is suppressed in the presence of freezing inhibition protein, and depending on the degree of activity of the freezing inhibition protein The degree of cohesion also varies. Therefore, the metal constituting the metal nanoparticles can be used without particular limitation as long as it can be prepared into nanoparticles and the surface of the metal is easily modified. In particular, the metal nanoparticles may be composed of any one or two or more mixed metals selected from the group consisting of gold, silver, copper, platinum, palladium, nickel and iron.

상기 단계 1)의 금속 나노입자는 응집에 의하여 흡광도와 같은 광학적 특성이 변할 수 있도록, 지름이 2 ㎚ 내지 50 ㎚, 보다 바람직하게는 3 ㎚ 내지 30 ㎚의 크기로 구성될 수 있다.The metal nanoparticles in the step 1) may have a diameter ranging from 2 nm to 50 nm, more preferably from 3 nm to 30 nm, such that optical characteristics such as absorbance can be changed by agglomeration.

상기 단계 1)의 금속 나노입자의 표면에는 일 말단에 카르복실기를 포함하는 개질부가 도입된다. 상기 개질부는 상기 금속 나노입자의 냉동에 따른 응집이 다른 종류의 단백질이 아닌 동결방지단백질에 의해서만 특이적으로 억제되도록 하는 구성이다. 금속 나노입자의 냉동에 따른 응집이 상기와 같이 동결방지단백질에 의해서만 특이적으로 억제될 수 있도록 하기 위하여, 상기 개질부는 하나 이상의 탄소가 카르복실기로 치환되고, 일 말단에 티올기(-SH)와 같이 금속 나노입자의 표면에 용이하게 결합될 수 있는 작용기를 갖는 포화 탄화수소 또는 불포화 탄화수소인 것이 바람직하다. 특히, 상기 개질부는 MSA(mercaptosuccinic acid)일 수도 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 citrate나 CM-PEG-SH를 상기 개질부로 이용하면 금속 나노입자의 냉동에 따른 응집이 동결방지단백질에 의해서만 특이적으로 조절되지 않아 본 발명의 동결방지단백질의 활성 측정에는 부적절한 반면, MSA를 개질부로 이용하면 금속 나노입자의 냉동에 따른 응집이 동결방지단백질에 의해서만 특이적으로 조절됨을 확인하였다(도 3 및 도 4 참조).A modified portion containing a carboxyl group is introduced into the surface of the metal nanoparticles in the step 1). The modifying unit is a constitution in which coagulation due to freezing of the metal nanoparticles is specifically suppressed only by a non-cryoprotecting protein other than a different kind of protein. In order to allow the coagulation due to the freezing of the metal nanoparticles to be specifically inhibited by the freeze-preventing protein as described above, the reforming unit may be modified such that at least one carbon is substituted with a carboxyl group and a thiol group (-SH) It is preferably a saturated hydrocarbon or an unsaturated hydrocarbon having a functional group that can be easily bonded to the surface of the metal nanoparticles. In particular, the modifying unit may be MSA (mercaptosuccinic acid). In one embodiment of the present invention, when citrate or CM-PEG-SH is used as the modifying portion, aggregation due to freezing of the metal nanoparticles is not specifically controlled by the freeze-preventing protein, so that the activity of the freeze- On the other hand, it has been found that when MSA is used as a modifying agent, agglomeration due to freezing of metal nanoparticles is specifically controlled by the anti-freezing protein (see FIGS. 3 and 4).

상기 개질부는 상기 금속 나노입자 1몰에 대하여 100몰 내지 500몰의 몰 비율로 상기 금속 나노입자에 도입되는 것이 바람직하고, 상기 개질부는 상기 금속 나노입자 1몰에 대하여 100몰 내지 300몰의 몰 비율로 상기 금속 나노입자에 도입되는 것이 더욱 바람직하다. 상기 개질부가 상기 금속 나노입자 1몰에 대하여 100몰 미만의 비율로 도입되면 냉동에 의해서도 금속 나노입자가 제대로 응집되지 않는 문제가 있고, 상기 개질부가 상기 금속 나노입자 1몰에 대하여 500몰을 초과하는 비율로 도입되면 금속 나노입자가 냉동 및 해동에 상관없이 서로 응집되어 버리는 문제가 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 금 나노입자 1몰에 대하여 MSA를 200몰의 비율로 첨가하여 금속 나노입자의 냉동에 따른 응집이 동결방지단백질에 의해서만 특이적으로 조절됨을 확인하였다(도 3 및 도 4 참조).Preferably, the modifying portion is introduced into the metal nano-particles at a molar ratio of 100 to 500 mol based on 1 mol of the metal nanoparticles, and the modifying portion has a molar ratio of 100 to 300 mol per mol of the metal nano- To the metal nanoparticles. If the reforming moiety is introduced at a ratio of less than 100 moles per mole of the metal nanoparticles, there is a problem that the metal nanoparticles are not agglomerated even by freezing, and when the modified portion is more than 500 moles relative to 1 mole of the metal nanoparticles There is a problem that the metal nanoparticles cohere to each other irrespective of freezing and thawing. In a specific example of the present invention, MSA was added at a rate of 200 moles per mole of gold nanoparticles, and it was confirmed that aggregation upon freezing of the metal nanoparticles was specifically controlled by the anti-freezing protein (FIGS. 3 and 4 Reference).

상기 단계 2)는 상기 단계 1)에서 표면을 개질한 금속 나노입자와 분석 대상 동결방지단백질을 물에 첨가하여 수용액을 형성하는 단계이다.The step 2) is a step of forming an aqueous solution by adding the surface-modified metal nanoparticles and the analysis target anti-freeze protein to water in the step 1).

상기 물은 금속 나노입자를 분산시키는 분산매로서, 냉동에 의하여 상기 물이 얼면서 상기 금속 나노입자를 응집시키게 된다. 즉, 냉동에 의하여 상기 물이 얼음으로 결정화(crystallization)되고, 상기 얼음 결정이 점점 커지게 되면서 상기 물 속에 분산되어 존재하던 금속 나노입자가 서로 충돌하는 횟수가 증가하게 된다. 상기와 같이 잦아지는 상호 충돌에 의하여 상기 금속 나노입자가 응집되고, 나노입자 클러스터(cluster of nanoparticle)를 형성하게 된다. 동결방지단백질은 얼음 재결정화 억제 활성(ice recrystallization inhibition activity)을 가지고 있어서, 냉동에 의하여 형성된 작은 얼음 결정이 해동 후에 다시 더 큰 얼음 결정으로 성장(growth)하는 것을 방지한다. 따라서, 상기 동결방지단백질이 존재하는 환경에서는 냉동에 의해 형성된 작은 얼음 결정이 성장하지 않게 되므로 물 속에 분산되어 있던 나노입자가 서로 충돌하여 응집되는 정도가 적어지게 된다.The water is a dispersion medium for dispersing the metal nanoparticles, and the metal nanoparticles are agglomerated by freezing the water. That is, the water is crystallized into ice by freezing, and the number of times that the metal nanoparticles dispersed in the water collide with each other increases as the ice crystal becomes larger and larger. The metal nanoparticles are agglomerated due to the mutual collision as described above to form a cluster of nanoparticles. The anti-freeze protein has an ice recrystallization inhibition activity, which prevents small ice crystals formed by freezing from growing back into larger ice crystals after thawing. Therefore, in the environment where the freeze protection protein is present, the small ice crystals formed by freezing do not grow, so that the nanoparticles dispersed in the water collide with each other and become less aggregated.

상기 분석 대상 동결방지단백질은 상기 물에 첨가되기 전에 냉동 및 해동을 0회 또는 1회 이상 거친 것일 수 있다. 특히, 상기 분석 대상 동결방지단백질의 활성 안정성 여부를 분석하고자 하는 경우, 상기 분석 대상 동결방지단백질이 물에 첨가되기 전에 상기 동결방지단백지을 1회 이상 냉동 및 해동시키는 것이 바람직하다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 CnAFP와 LeIBP를 상기 물에 첨가하기 전에 5회 및 10회 냉동 및 해동시킴으로써, 상기 두 동결방지단백질의 활성 안정성 정도를 분석하였다(도 9 참조).The anti-freeze protein to be analyzed may be frozen and thawed 0 times or more than once before being added to the water. In particular, when it is desired to analyze the stability of the anti-freeze protein to be analyzed, it is preferable that the freeze-inhibited protein is frozen and thawed at least once before the anti-freeze protein to be analyzed is added to water. In a specific example of the present invention, the degree of activity stability of the two anti-freeze proteins was analyzed by cryopreservation and thawing 5 times and 10 times before adding Cn AFP and Le IBP to the water (see FIG. 9).

상기 단계 3)은 상기 단계 2)의 물을 0 ℃ 이하로 냉동시켜 상기 금속 나노입자를 응집시킨 후, 다시 해동시키는 단계이다.The step 3) is a step of freezing the water of the step 2) at 0 ° C or less to coagulate the metal nanoparticles, and thawing the metal nanoparticles again.

상기 단계 3)의 냉동에 의하여, 상기 단계 2)의 금속 나노입자와 동결방지단백질이 첨가된 물은 냉각되어 얼음으로 결정화되고, 상기 동결방지단백질의 동결방지 활성, 즉 얼음 재결정화 억제 활성의 정도에 따라 상기 물 속에 분산되어 있던 금속 나노입자의 응집 정도가 조절된다. 따라서, 상기와 같이 동결방지단백질의 존재 하에서 상기 금속 나노입자를 응집시키면, 동결방지단백질의 부존재 하에서 일어나는 응집 반응에 비하여 금속 나노입자의 응집 정도가 낮아지게 된다. 또한, 상기 동결방지단백질의 동결방지 활성이 높을수록 금속 나노입자의 응집 정도는 더욱 낮아지게 된다. 따라서, 상기와 같은 금속 나노입자의 응집 정도를 측정함으로써, 상기 분석 대상 동결방지단백질의 활성을 정량적·정성적으로 분석할 수 있다.The metal nanoparticles of step 2) and the water to which the anti-freeze protein is added are cooled and crystallized into ice by the freezing of step 3), and the freezing prevention activity of the anti-freezing protein, that is, the degree of ice- The degree of agglomeration of the metal nanoparticles dispersed in the water is controlled. Therefore, when the metal nanoparticles are aggregated in the presence of the anti-freeze protein as described above, the aggregation degree of the metal nanoparticles becomes lower than that of the aggregation reaction occurring in the absence of the anti-freezing protein. In addition, the degree of aggregation of the metal nanoparticles is further lowered as the freeze-preventing activity of the freeze-preventing protein is higher. Therefore, the activity of the anti-freeze protein to be analyzed can be quantitatively and qualitatively analyzed by measuring the degree of aggregation of the metal nanoparticles as described above.

상기 단계 3)의 냉동 이후에 상기 냉각된 물을 다시 해동시킨다. 상기 단계 3)의 해동에 의하여, 상기 얼음은 다시 물로 액화된다. 그러나, 상기와 같은 얼음의 액화에도 불구하고, 상기 단계 3)의 냉동에 의하여 일단 응집되었던 금속 나노입자는 다시 물 속으로 분산되지 않는다. 즉, 상기 단계 3)의 냉동에 의하여 응집된 상태를 계속 유지하게 되는 것이다.After cooling in step 3), the cooled water is thawed again. By the thawing of step 3), the ice is again liquefied with water. However, despite the liquefaction of ice as described above, the metal nanoparticles once aggregated by freezing in step 3) are not dispersed again into water. That is, the coagulated state is maintained by the freezing of step 3).

상기 단계 3)의 냉동은 -40 ℃ 내지 0 ℃, 바람직하게는 -30 ℃ 내지 -5 ℃, 더욱 바람직하게는 -25 ℃ 내지 -10 ℃의 온도에서 30분 내지 120분, 바람직하게는 40분 내지 100분, 더욱 바람직하게는 50분 내지 80분 동안 수행될 수 있고, 상기 단계 3)의 해동은 10 ℃ 내지 50 ℃, 바람직하게는 20 ℃ 내지 45 ℃, 더욱 바람직하게는 30 ℃ 내지 40 ℃의 온도에서 3분 내지 30분, 바람직하게는 5분 내지 20분, 더욱 바람직하게는 10분 내지 15분 동안 수행될 수 있다. 또한, 상기 단계 3)의 냉동 및 해동은 상기 냉동 및 해동을 1 사이클로 하여 1 사이클 이상 진행될 수 있다.The refrigeration of step 3) is carried out at a temperature of -40 ° C to 0 ° C, preferably -30 ° C to -5 ° C, more preferably -25 ° C to -10 ° C for 30 minutes to 120 minutes, preferably 40 minutes Deg.] C to 50 [deg.] C, preferably 20 [deg.] C to 45 [deg.] C, more preferably 30 [deg.] C to 40 [deg.] C For 3 minutes to 30 minutes, preferably 5 minutes to 20 minutes, more preferably 10 minutes to 15 minutes. In addition, the freezing and thawing in the step 3) may be performed by one cycle or more with the freezing and thawing as one cycle.

상기 단계 4)는 상기 단계 3)에서 응집된 금속 나노입자의 응집 정도를 측정하는 단계이다.The step 4) is a step of measuring the degree of agglomeration of the metal nanoparticles aggregated in the step 3).

상기 단계 4)의 응집 정도 측정은 상기 단계 3)의 응집 반응에 의해 응집된 금속 나노입자의 광학적 특성을 측정함으로써 수행될 수도 있고, 상기 단계 3)의 응집 반응에 의해 응집되지 않고 유리되어 있는 금속 나노입자의 양을 측정함으로써 수행될 수도 있다.The measurement of the degree of cohesion in the step 4) may be performed by measuring the optical characteristics of the metal nanoparticles aggregated by the coagulation reaction in the step 3), or may be carried out by measuring the amount of the metal Or by measuring the amount of nanoparticles.

먼저, 상기 단계 4)의 응집 정도 측정은 상기 단계 3)에서의 응집에 의하여 흡광도의 변화를 나타내는 두 개의 파장에서, 흡광도의 비율을 측정함으로써 수행될 수 있다. 상기 단계 3)의 응집 반응 결과, 금속 나노입자가 많이 응집되면 응집될수록 최대 흡광도를 나타내는 파장의 적색 편이 현상이 나타나고, 최대 흡광도 값도 낮아지게 된다. 상기 최대 흡광도를 나타내는 파장은 상기 금속 나노입자를 구성하는 종류, 상기 금속 나노입자의 크기 또는 상기 금속 나노입자의 모양 등에 의하여 달라질 수 있다.First, the measurement of the degree of aggregation of the step 4) can be performed by measuring the ratio of the absorbance at two wavelengths, which indicate the change of the absorbance by the aggregation in the step 3). As a result of the coagulation reaction in the step 3), when the metal nanoparticles are agglomerated to a large extent, redshift phenomenon of the wavelength exhibiting the maximum absorbance is exhibited and the maximum absorbance value is lowered. The wavelength exhibiting the maximum absorbance may vary depending on the kind of the metal nanoparticles, the size of the metal nanoparticles, or the shape of the metal nanoparticles.

상기 단계 5)는 상기 단계 4)에서 측정된 금속 나노입자의 응집 정도를 이용하여 동결방지단백질의 활성을 분석하는 단계로서, 상기 단계 4)에서 측정된 응집 정도를, 대조군의 금속 나노입자 응집 정도와 비교함으로써 수행된다.The step 5) is a step of analyzing the activity of the anti-freeze protein using the degree of aggregation of the metal nanoparticles measured in the step 4), and the degree of aggregation measured in the step 4) &Lt; / RTI &gt;

상기 단계 5)의 대조군은 상기 단계 2) 및 상기 단계 3)과 동일한 조건에서 동일한 방법으로 수행되되, 분석 대상 동결방지단백질을 포함하지 않고 금속 나노입자의 응집 반응을 일으킨 결과물이다. 상기 대조군에는 분석 대상 동결방지단백질이 포함되지 않기 때문에 냉동에 의해 모든(또는 대부분의) 금속 나노입자가 응집된다.The control in step 5) is performed in the same manner as in step 2) and step 3), but is the result of the aggregation reaction of the metal nanoparticles without the anti-freeze protein to be analyzed. All (or most) of the metal nanoparticles aggregate by freezing because the control does not contain the freeze protection protein to be analyzed.

상기 단계 5)의 대조군에서의 금속 나노입자 응집 정도는 상기 단계 4)와 동일한 조건에서 동일한 방법으로 수행된다.The degree of aggregation of the metal nanoparticles in the control group of the step 5) is carried out in the same manner as in the step 4).

상기 단계 5)의 비교에 의하여, 상기 분석 대상 동결방지단백질에 의해 금속 나노입자의 응집 정도가 어느 정도 감소하는지 측정할 수 있다. 예를 들어, 상기 단계 4)에서 측정된 최대 흡광도가 얼마나 감소하였는지 또는 최대 흡광 파장이 얼마나 길어졌는지 비교함으로써 상기 분석 대상 동결방지단백질에 의해 금속 나노입자의 응집 정도가 어느 정도 감소하는지 측정할 수 있다. 따라서, 상기 단계 5)의 비교에 의하여 상기 분석 대상 동결방지단백질의 효소 활성을 정량적·정성적으로 분석할 수 있다.By comparing the above step 5), it is possible to measure to what extent the degree of aggregation of the metal nanoparticles is reduced by the anti-freeze protein to be analyzed. For example, by comparing how much the maximum absorbance measured in step 4) is decreased or the maximum absorption wavelength is long, it is possible to measure how much the aggregation degree of the metal nanoparticles is reduced by the analysis target freeze-preventing protein . Therefore, by comparing the above-described step 5), it is possible to quantitatively and qualitatively analyze the enzyme activity of the anti-freeze protein to be analyzed.

본 발명의 일 실시예에서는 동결방지단백질인 CnAFP 또는 LeIBP를 반지름 15.8±1.3 ㎚의 MSA-AuNP 입자에 처리하여 냉동 및 해동시킴으로써 동결방지단백질 CnAFP 및 LeIBP의 동결방지 활성을 정량적으로 분석하였다(도 5 내지 도 7 참조). 또한, 야생형 LeIBP 및 상기 LeIBP의 돌연변이체들을 이용하여 상기 돌연변이체들의 동결방지 활성을 정성적으로 분석하였다(도 8 참조). 아울러, 상기 거친 조건에 노출시킨 횟수를 달리한 CnAFP 및 LeIBP의 동결방지 활성 감소 정도를 측정함으로써, 상기 동결방지단백질의 안정성까지 측정하였다(도 9 참조). 상기와 같은 구체적인 실시예를 통하여, 본 발명의 방법은 동결방지단백질의 활성을 정성 및 정량적으로 측정 및 분석할 수 있고, 아울러 상기 동결방지단백질의 활성 안정성까지 측성 및 분석할 수 있음을 확인하였다.
In one embodiment of the present invention, cryoprotecting proteins Cn AFP or Le IBP were treated by freezing and thawing MSA-AuNP particles having a radius of 15.8 ± 1.3 nm to quantitatively analyze the anti-freezing activity of the anti-freezing proteins Cn AFP and Le IBP (See Figs. 5 to 7). In addition, the wild-type Le IBP and the mutants of Le IBP were used to qualitatively analyze the anti-freezing activity of the mutants (see FIG. 8). In addition, the stability of the anti-freeze protein was measured by measuring the degree of decrease in the degree of cryoprotecting activity of Cn AFP and Le IBP with different numbers of exposures to the rough conditions (see FIG. 9). Through the above concrete examples, it has been confirmed that the method of the present invention can qualitatively and quantitatively measure and analyze the activity of the anti-freezing protein, and can measure and analyze the activity stability of the anti-freezing protein.

2. 2. 동결방지단백질의 억제제 스크리닝 방법Methods for Screening of Inhibitors of Antifreeze Proteins

본 발명의 다른 측면은 동결방지단백질의 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.Another aspect of the present invention provides a method of screening for an inhibitor of an anti-freeze protein.

본 발명의 동결방지단백질 활성 분석 방법은 1') 일 말단에 카르복실기를 포함하는 개질부를 금속 나노입자의 표면에 도입하여, 상기 금속 나노입자의 표면을 카르복시기로 개질하는 단계; 2') 실험군으로서, 억제 대상 동결방지단백질 및 억제제 후보물질을 상기 단계 1')에서 표면이 개질된 금속 나노입자와 함께 물에 첨가하는 단계; 3') 상기 단계 2')의 금속 나노입자, 억제 대상 동결방지단백질 및 억제제 후보물질이 첨가된 물을 0 ℃ 이하로 냉동시켜 상기 금속 나노입자를 응집시킨 후, 해동시키는 단계; 4') 상기 단계 3')에서 응집된 금속 나노입자의 응집 정도를 측정하는 단계; 5') 상기 단계 4')에서 측정된 응집 정도를, 억제제 후보물질이 포함되지 않은 물 내에서 응집시킨 대조군의 금속 나노입자 응집 정도와 비교하는 단계; 및 6') 상기 대조군에 비하여 높은 응집 정도를 나타내는 실험군에 포함된 억제제 후보물질을 억제 대상 동결방지단백질의 동결방지 활성 억제제인 것으로 판단하는 단계를 포함한다.The method for assaying freeze-inhibited protein activity of the present invention comprises the steps of: introducing a modified moiety containing a carboxyl group at the terminal end of 1 ') to the surface of metal nanoparticles to modify the surface of the metal nanoparticles to a carboxyl group; 2 ') As an experimental group, the step of adding the inhibition target anti-freeze protein and inhibitor candidate to the water together with the surface-modified metal nanoparticles in step 1 ' 3 ') freezing the water to which the metal nanoparticles, inhibition target anti-freeze protein and inhibitor candidate material of the step 2' are added at 0 ° C or less to aggregate the metal nanoparticles and thaw them; 4 ') measuring the aggregation degree of the aggregated metal nanoparticles in the step 3'); 5 ') comparing the degree of aggregation measured in step 4' with the degree of metal nanoparticle aggregation of the control group aggregated in water not containing an inhibitor candidate material; And 6 ') determining that the inhibitor candidate contained in the test group exhibiting a higher degree of aggregation as compared with the control group is a cryoprotectant activity inhibitor of the inhibition target anti-freeze protein.

상기 단계 1'), 단계 3') 및 단계 4')에 관해서는 상기 "1. 동결방지단백질의 활성 분석 방법 " 항목에서 설명한 바와 동일하다. 따라서 이에 관해서는 상기 "1. 동결방지단백질의 활성 분석 방법 " 항목의 설명을 원용하여 상세한 설명은 생략하도록 하고, 이하에서는 상기 동결방지단백질의 억제제 스크리닝 방법에 특이적인 구성에 대해서만 설명한다.The steps 1 '), 3') and 4 ') are the same as those described in the item " 1. Method for assaying the activity of the anti-freeze protein ". Therefore, a description of the item " 1. Method for analyzing the activity of the anti-freezing protein " is omitted, and a detailed description thereof will be omitted. In the following, only the constitution specific to the method for screening the inhibitor for the anti-freeze protein will be described.

상기 단계 2')에서 상기 단계 1')에서 제조된 금속 나노입자는 억제 대상 동결방지단백질 및 억제제 후보물질이 포함된 물 내에서 응집된다. 상기 "1. 동결방지단백질의 활성 분석 방법 "에서의 단계 2)와는 달리 억제제 후보물질이 추가적으로 첨가되기 때문에 상기 억제 대상 동결방지단백질이 상기 억제제 후보물질에 의해 영향을 받게 된다. 예를 들어, 첨가된 억제제 후보물질이 실제로 동결방지단백질의 동결방지 활성을 억제하는 물질이라면, 동결방지단백질에 의한 얼음 재결정화 억제반응이 저해될 것이고, 결국 금속 나노입자는 응집될 것이다. 반대로, 첨가된 억제제 후보물질이 실제로 동결방지단백질의 동결방지 활성에 영향을 미치지 않는 물질이라면, 동결방지단백질에 의한 얼음 재결정화 억제 반응은 저해되지 않게 되고, 결국 금속 나노입자는 응집되지 않을 것이다. The metal nanoparticles prepared in the step 1 ') in the step 2') are agglomerated in the water containing the inhibition target anti-freeze protein and the inhibitor candidate. Unlike the two steps) in "Method 1 activity assay of anti-freeze protein" since the candidate inhibitor it is further added to the suppression target antifreeze protein is affected by the inhibitor candidate. For example, if the added inhibitor candidate is indeed a substance that inhibits the cryoprotectant activity of the cryoprotectant protein, the inhibition of the ice recrystallization inhibition by the cryoprotectant protein will be inhibited and eventually the metal nanoparticles will aggregate. Conversely, if the added inhibitor candidate substance is a substance that does not actually affect the cryoprotecting activity of the cryoprotectant protein, the inhibition of the ice recrystallization inhibition by the cryoprotectant protein will not be inhibited and the metal nanoparticles will not aggregate.

상기 단계 3')에서는 상기 "1. 동결방지단백질의 활성 분석 방법 "에서의 단계 3)과 같이 상기 단계 2')에서 형성된 수용액을 냉동 및 해동시킨다.In the step 3 '), the aqueous solution formed in the step 2') is frozen and thawed as in step 3) of the above-mentioned " 1. Method for assaying the activity of the anti-freezing protein ".

상기 단계 4')에서는 상기 "1. 동결방지단백질의 활성 분석 방법 "에서의 단계 4)와 같이 상기 단계 3')에서 응집된 금속 나노입자의 응집 정도를 측정한다.In the step 4 '), the degree of agglutination of the aggregated metal nanoparticles is measured in the step 3') as in the above-mentioned step 4) of " 1. Method for assaying the activity of the anti-freeze protein ".

상기 단계 5') 및 단계 6')에서는 상기 단계 4')에서 측정된 금속 나노입자의 응집 정도를 대조군과 비교하여 동결방지단백질 억제제를 스크리닝하는 단계이다.In the step 5 ') and the step 6'), the degree of aggregation of the metal nanoparticles measured in the step 4 ') is compared with the control group to screen the anti-freeze protein inhibitor.

상기 단계 5')의 대조군은 상기 단계 3')과 동일한 조건에서 동일한 방법으로 수행되되, 억제제 후보물질을 포함하지 않고 금속 나노입자의 응집 반응을 일으킨 결과물이다. 상기 대조군에는 억제제 후보물질이 포함되지 않기 때문에 동결방지단백질이 동결방지 활성에 영향을 받지 않고, 동결방지단백질에 의한 얼음 재결정화 억제 반응은 저해되지 않게 되어, 결국 금속 나노입자의 응집 반응이 일어나지 않게 된다.The control in step 5 ') is performed in the same manner as in step 3'), but is a result of causing aggregation reaction of metal nanoparticles without inhibitor candidate material. Since the inhibitor candidate is not included in the control group, the anti-freezing protein is not affected by the anti-freezing activity, and the inhibition reaction of the ice recrystallization by the anti-freeze protein is not inhibited. As a result, the aggregation reaction of the metal nanoparticles does not occur do.

상기 단계 6')은 상기 단계 5')의 비교 결과에 기초하여, 대조군보다 응집 정도가 높게 나타나는 실험군은 동결방지단백질의 억제제가 포함되어 있기 때문인 것으로 간주하여 상기 대조군보다 응집 정도가 높게 나타나는 실험군에 포함된 억제제 후보물질을 억제 대상 동결방지단백질의 효소 활성 억제제인 것으로 판단한다.Based on the results of the above step 5 '), it is considered that the test group in which the degree of cohesion is higher than that of the control group is considered to be due to the inhibitor of the anti-freeze protein, It is judged that the contained inhibitor candidate substance is an enzyme activity inhibitor of the antifreeze protein to be inhibited.

상기 단계 6')에서 응집 정도가 높다는 것은 반복 실험에 의해 통계적인 유의성을 가지는 정도로 높은 것이 바람직하다.
In the step 6 '), it is preferable that the degree of coagulation is as high as that having statistical significance by repeated experiment.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples.

단, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
It is to be understood, however, that the following examples are intended to assist the understanding of the present invention and are not intended to limit the scope of the present invention.

금속 나노입자의 응집 조건 분석Analysis of Coagulation Conditions of Metal Nanoparticles

<1-1> <1-1> 금속 나노입자의 합성Synthesis of metal nanoparticles

먼저, 단백질분해효소의 활성 측정에 이용될 금속 나노입자를 합성하였다. 다양한 금속 중에서도 나노입자로의 제조가 용이한 금(Au)을 이용하였고, Grabar 등(Anal. Chem. (1995) 67, 735??743)의 문헌에 공지된 방법에 따라 나노입자를 제조하였다. 보다 구체적으로, 1 mM 농도의 사염화금(HAuCl4ㆍ3H2O)(Sigma-Aldrich, 미국) 원액(stock solution) 20 ㎖를 50 ㎖의 증류수에 넣고 지속적으로 교반시켜, 최종 농도 300 nM의 작업용액(working solution)을 만들었다. 상기 작업용액에 30 mM의 시트르산나트륨(C6H5Na3O7ㆍ2H2O)(Sigma-Aldrich, 미국) 2 ㎖을 첨가(사염화금 몰 수 : 시트르산나트륨 몰 수 = 1 : 200)하여 최종 농도가 600 nM인 Cit-AuNP 용액을 형성하였다. 상기 Cit-AuNP 용액을 끓이면서 교반시키고, 상기 교반 중인 용액을 상온에서 냉각시킨 다음, 상기 교반 중인 용액에 300 mM 농도의 수소화붕소나트륨(NaBH4)(Sigma-Aldrich, 미국) 원액(stock solution) 100 ㎕를 빠르게 넣고 교반시켜 금 이온을 빠르게 환원시키고 콜로이드화함으로써, 'Cit-AuNP 입자'를 제조하였다. 상기와 같이 제조된 'Cit-AuNP 입자'를 Microcon YM-100 centrifugal filter unit(100 kDa MWCO)를 이용하여 5000g에서 5분 동안 원심분리하여 정제하였다. First, metal nanoparticles to be used for the measurement of protease activity were synthesized. Among various metals, gold (Au), which is easy to manufacture as nanoparticles, was used and nanoparticles were prepared according to the method known from the literature of Grabar et al. (Anal. Chem. (1995) 67, 735-743). More specifically, 20 ml stock solution (1 mM concentration) of HAuCl 4 .3H 2 O (Sigma-Aldrich, USA) was added to 50 ml of distilled water and stirred continuously to give a final concentration of 300 nM A working solution was made. To the working solution was added 2 ml of 30 mM sodium citrate (C 6 H 5 Na 3 O 7 .2H 2 O) (Sigma-Aldrich, USA) (molar ratio of tetrachloromethane: sodium citrate = 1: 200) A Cit-AuNP solution having a final concentration of 600 nM was formed. The cit-AuNP solution was boiled and stirred, and the stirred solution was cooled at room temperature. To the stirred solution was added a stock solution 100 mM of sodium borohydride (NaBH 4 ) (Sigma-Aldrich, USA) &Lt; tb &gt;&lt; tb &gt;&lt; tb &gt; The thus-prepared 'Cit-AuNP particles' were purified by centrifugation at 5000 g for 5 minutes using a Microcon YM-100 centrifugal filter unit (100 kDa MWCO).

상기와 같이 정제된 Cit-AuNP 입자를 Cary 60 UV-Vis (Agilent Technologies, 미국) 및 FE-SEM(field emission scanning electron microscope)(S-4800, Hitachi, 일본)로 관찰한 결과, 반지름이 16.9±1.0 ㎚인 금 나노입자가 제조되었음을 확인하였다. The thus-purified Cit-AuNP particles were observed with Cary 60 UV-Vis (Agilent Technologies, USA) and FE-SEM (S-4800, Hitachi, Japan) It was confirmed that gold nanoparticles of 1.0 nm were prepared.

<1-2> <1-2> 카르복실기를 갖는 개질부로 금속 나노입자의 표면 개질Surface modification of metal nanoparticles with a modified moiety having a carboxyl group

<1-2-1> <1-2-1> MSA(mercaptosuccinic acid)로 금속 나노입자의 표면 개질Surface modification of metal nanoparticles with mercaptosuccinic acid (MSA)

상기 실시예 <1-1>에서 제조되어 상온에서 냉각된 Cit-AuNP 용액에, 30 mM의 MSA(mercaptosuccinic acid)(Sigma-Aldrich, 미국) 2 ㎖을 첨가(사염화금 몰 수 : 시트르산나트륨 몰 수 : MSA 몰 수 = 1 : 200 : 200)하고, 상온에서 1시간 동안 교반시켰다. 상기 교반 중인 용액에 300 mM 농도의 수소화붕소나트륨(NaBH4)(Sigma-Aldrich, 미국) 원액(stock solution) 100 ㎕를 빠르게 넣고 교반시켜 금 이온을 빠르게 환원시키고 콜로이드화함으로써, 'MSA-AuNP 입자'를 제조하였다. 상기와 같이 제조된 'MSA-AuNP 입자'를 Microcon YM-100 centrifugal filter unit(100 kDa MWCO)를 이용하여 5000g에서 5분 동안 원심분리하여 정제하였다. 2 ml of 30 mM MSA (mercaptoccinic acid) (Sigma-Aldrich, USA) was added to the Cit-AuNP solution prepared in Example <1-1> cooled at room temperature (molar amount of tetrachloromethane: : Number of moles of MSA = 1: 200: 200) and stirred at room temperature for 1 hour. To the stirred solution, 100 μl of 300 mM sodium borohydride (NaBH 4 ) (Sigma-Aldrich, USA) stock solution was rapidly added and stirred to rapidly reduce the gold ion and colloid the MSA-AuNP particles '. The MSA-AuNP particles thus prepared were centrifuged at 5000 g for 5 minutes using a Microcon YM-100 centrifugal filter unit (100 kDa MWCO).

상기와 같이 제조된 MSA-AuNP 입자를 Cary 60 UV-Vis (Agilent Technologies, 미국) 및 FE-SEM(field emission scanning electron microscope)(S-4800, Hitachi, 일본)로 관찰한 결과, 반지름이 15.8±1.3 ㎚인 금 나노입자가 제조되었음을 확인하였다(도 2의 (A) 내지 (D)). The MSA-AuNP particles prepared as described above were observed with Cary 60 UV-Vis (Agilent Technologies, USA) and FE-SEM (S-4800, Hitachi, Japan) It was confirmed that gold nanoparticles having a particle diameter of 1.3 nm were produced (Fig. 2 (A) to (D)).

<1-2-2> <1-2-2> CM-PEG-SH(carboxymethyl-polyethyleneglycol-thiol)로 금속 나노입자의 표면 개질Surface modification of metal nanoparticles with CM-PEG-SH (carboxymethyl-polyethyleneglycol-thiol)

상기 실시예 <1-1>에서 제조되어 상온에서 냉각된 Cit-AuNP 용액에, 12 nM의 CM-PEG-SH(carboxymethyl-polyethylene-thiol)(Sigma-Aldrich, 미국) 20 ㎖을 첨가(사염화금 몰 수 : 시트르산나트륨 몰 수 : CM-PEG-SH 몰 수 = 1 : 200 : 200)하고, 상온에서 2시간 동안 교반시켰다. 상기 교반 중인 용액에 300 mM 농도의 수소화붕소나트륨(NaBH4)(Sigma-Aldrich, 미국) 원액(stock solution) 100 ㎕를 빠르게 넣고 교반시켜 금 이온을 빠르게 환원시키고 콜로이드화함으로써, 'PEG-AuNP 입자'를 제조하였다. 상기와 같이 제조된 'MSA-AuNP 입자'를 Microcon YM-100 centrifugal filter unit(100 kDa MWCO)를 이용하여 5000g에서 5분 동안 원심분리하여 정제하였다.Twenty milliliters of 12 nM CM-PEG-SH (carboxymethyl-polyethylene-thiol) (Sigma-Aldrich, USA) was added to the Cit-AuNP solution prepared in Example <1-1> Number of moles: number of moles of sodium citrate: number of moles of CM-PEG-SH = 1: 200: 200) and stirred at room temperature for 2 hours. To 100 μl of a stock solution of 300 mM sodium borohydride (NaBH 4 ) (Sigma-Aldrich, USA) was quickly added to the stirred solution and stirred to rapidly reduce and colloid gold ions to form a PEG-AuNP particle '. The MSA-AuNP particles thus prepared were centrifuged at 5000 g for 5 minutes using a Microcon YM-100 centrifugal filter unit (100 kDa MWCO).

상기와 같이 제조된 MSA-AuNP 입자를 Cary 60 UV-Vis (Agilent Technologies, 미국) 및 FE-SEM(field emission scanning electron microscope)(S-4800, Hitachi, 일본)로 관찰한 결과, 반지름이 15.8±1.3 ㎚인 금 나노입자가 제조되었음을 확인하였다. The MSA-AuNP particles prepared as described above were observed with Cary 60 UV-Vis (Agilent Technologies, USA) and FE-SEM (S-4800, Hitachi, Japan) It was confirmed that gold nanoparticles having a diameter of 1.3 nm were produced.

<1-3> <1-3> 동결방지단백질의 발현 및 정제Expression and purification of anti-freeze protein

<1-3-1> <1-3-1> CnCn AFP 단백질의 발현 및 정제Expression and purification of AFP protein

저온에서 활성을 가지는 남극 규조류 Chaetoceros neogracile에서 유래한 동결방지단백질인 CnAFP를 E. coli에서 발현시킨 다음, 정제하여 수득하였다. 보다 구체적으로는 다음과 같다.Antarctic diatoms Chaetoceros having activity at low temperature Cn AFP, a freezing-prevention protein derived from neogracile , was expressed in E. coli and purified. More specifically, it is as follows.

서열번호 1의 염기서열을 갖는 CnAFP 유전자를 pColdⅠ 벡터(다카라, 일본)의 kpnⅠ/HindⅢ 사이트에 삽입하여, 상기 CnAFP 단백질이 6×His-tag의 C-말단에 연결되어 발현될 수 있도록 하였다. 상기 CnAFP 단백질이 삽입된 pColdⅠ 벡터를 E.coli에 형질전환시키고, 10 ℃ 내지 15 ℃의 온도에서 IPTG(isopropyl-l-thio-β-d-galactopyranoside)가 처리된 배지에서 배양하여 상기 CnAFP 단백질의 발현을 유도한 다음, 상기 E.coli 세포를 하베스트(harvest)하였다. 상기와 같이 수득된 E.coli의 세포 펠렛(cell pellet)을 동일 부피의 세포 용해 완충용액(cell lysis buffer)(0.5 M의 NaCl이 포함된 20 mM의 Tris-Cl(pH 8.0))로 세척한 후, 초음파(Branson, 미국)로 파쇄하고, 20000×g로 4 ℃에서 20분 동안 원심분리하였다. 상기와 같이 원심분리된 상층액을 버리고, 남겨진 펠렛을 펠렛 용해 완충용액(pellet lysis buffer)(1 mM의 EDTA 및 100 mM의 NaCl이 포함된 50 mM의 Tris-Cl(pH 8.0))으로 재현탁하였다. 상기 재현탁액에 봉입체(inclusion body) 안정화 완충용액 Ⅰ(1 mM의 EDTA, 100 mM의 NaCl, 8 M의 우레아 및 0.1 M의 PMSF가 포함된 50 mM의 Tris-Cl(pH 8.0)) 및 봉입체 안정화 완충용액 Ⅱ(1 mM의 EDTA 및 100 mM의 NaCl이 포함된 50 mM의 KH2PO4(pH 10.7))를 처리하여 봉입체 내의 단백질을 폴딩되지 않게 하였다. 상기 두 완충용액이 처리된 재현탁액을 초고속 원심분리(high-speed centrifugation)하여 수용성 분획을 수득하고, 상기 수용성 분획을 재폴딩 완충용액(50 mM의 Tris-Cl(pH 8.0))으로 희석하면서 폴딩되지 않았던 단백질이 원래의 구조를 형성하도록 재폴딩시켰다. 상기와 같이 재폴딩된 CnAFP 단백질을 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피(Qiagen, 독일)로 정제하여, 동결방지단백질 CnAFP를 수득하였다. The CnAFP gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 was inserted into the kpnI / HindIII site of the pCold I vector (Takara, Japan) to allow the Cn AFP protein to be linked to the C-terminus of the 6xHis-tag to be expressed. CnAFP the protein is inserted into a vector and transformed into E.coli pColdⅠ, by culturing in a process IPTG (isopropyl-l-thio- β-d-galactopyranoside) at a temperature of 10 ℃ to 15 ℃ medium the Cn AFP protein And then the E. coli cells were harvested. The cell pellet of E. coli thus obtained was washed with an equal volume of cell lysis buffer (20 mM Tris-Cl (pH 8.0) containing 0.5 M NaCl) , Sonicated (Branson, USA), and centrifuged at 20000 x g for 20 min at 4 &lt; 0 &gt; C. The centrifuged supernatant was discarded and the remaining pellet was resuspended in pellet lysis buffer (50 mM Tris-Cl (pH 8.0) containing 1 mM EDTA and 100 mM NaCl) Respectively. To the resuspension was added the inclusion body stabilization buffer I (50 mM Tris-Cl (pH 8.0) containing 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 8 M urea and 0.1 M PMSF) and inclusion body stabilization by processing the buffer ⅱ (of 1 mM of EDTA and 100 mM NaCl in the 50 mM comprises KH 2 PO 4 (pH 10.7) ) was no longer folding of proteins in the inclusion bodies. The two buffer solutions were subjected to high-speed centrifugation to obtain a water-soluble fraction, and the water-soluble fraction was diluted with refolding buffer (50 mM Tris-Cl (pH 8.0) The protein that was not refolded was refolded to form the original structure. The refolded CnAFP protein was purified by Ni-NTA affinity chromatography (Qiagen, Germany) to obtain an anti-freeze protein Cn AFP.

<1-3-2> <1-3-2> LeLe IBP 단백질 및 그 돌연변이체의 발현 및 정제Expression and purification of IBP protein and its mutants

저온에서 활성을 가지는 남극 효모 Leucosporidium에서 유래한 동결방지단백질인 LeIBP 및 상기 LeIBP 단백질의 돌연변이체를 E.coli에서 발현시킨 다음, 정제하여 수득하였다. 보다 구체적으로는 다음과 같다.The anti-freeze protein Le IBP derived from the Antarctic yeast Leucosporidium active at low temperature and the mutant of the Le IBP protein were expressed in E. coli and purified. More specifically, it is as follows.

서열번호 2의 염기서열을 갖는 야생형 LeIBP의 유전자 및 상기 LeIBP의 돌연변이체 유전자들(서열번호 3의 염기서열을 갖는 S147Y&A234Y, 서열번호 4의 염기서열을 갖는 T65Y, 서열번호 5의 염기서열을 갖는 S43Y 및 서열번호 6의 염기서열을 갖는 A234Y)을 각각 pET-28a 벡터(Novagen, 미국)에 클로닝하고, 상기 pET-28a 벡터를 E.coli 스트레인 BL21-DE3(Invitrogen, 미국)에 형전전환시켰다. 상기 형질전환체를 20 ㎍/㎖ 농도의 카라마이신(karamycin)이 포함된 LB 배지로 37 ℃의 온도에서 배양하였다. 상기 E.coli 배양체에 1mM의 IPTG(isopropyl-l-thio-β-d-galactopyranoside)를 처리하고 30 ℃의 온도에서 24시간 동안 배양하여 상기 LeIBP 및 LeIBP 돌연변이체들의 발현을 유도한 다음, 상기 E.coli 세포를 하베스트(harvest)하였다. 상기와 같이 수득된 E.coli의 세포 펠렛(cell pellet)을 50 mM의 NaH2PO4, 300 mM의 NaCl 및 5 mM의 이미다졸(imidazole)로 재현탁한 다음, 초음파(Branson, 미국)로 파쇄하고, 12000 rpm으로 4 ℃에서 1시간 동안 원심분리하여 세포 용해물(cell lysate)를 수득하였다. 상기와 같이 수득한 세포 용해물을 Ni-NTA 아가로즈 칼럼에 로딩하여 25 칼럼 부피의 50 mM의 NaH2PO4, 300 mM의 NaCl 및 5 mM의 이미다졸(imidazole)로 세척하였다. 상기 칼럼에 부착된 단백질을 50 mM의 NaH2PO4(pH 8.5), 300 mM의 NaCl 및 300 mM의 이미다졸(imidazole)이 포함된 일루션 완충용액(elution buffer)으로 일루션하고, Superdex-200 칼럼(Amersham, 미국)으로 젤 필터링함으로써 동결방지단백질 LeIBP 및 상기 LeIBP 단백질의 돌연변이체를 수득하였다.The gene of the wild type Le IBP having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 and the mutant genes of Le IBP (S147Y & A234Y having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, T65Y having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, And pET-28a vector was transfected into the E. coli strain BL21-DE3 (Invitrogen, USA). The pET-28a vector was cloned into pET-28a vector (Novagen, USA) . The transformant was cultured at 37 占 폚 in LB medium containing 20 占 퐂 / ml of caramycin. The E. coli cultures were treated with 1 mM IPTG (isopropyl-1-thio-β-d-galactopyranoside) and cultured at 30 ° C. for 24 hours to induce expression of the Le IBP and Le IBP mutants. The E. coli cells were harvested. The cell pellet of E. coli thus obtained was resuspended in 50 mM NaH 2 PO 4 , 300 mM NaCl and 5 mM imidazole, and then disrupted by sonication (Branson, USA) And centrifuged at 12000 rpm for 1 hour at 4 DEG C to obtain a cell lysate. The cell lysate thus obtained was loaded on a Ni-NTA agarose column and washed with 25 column volumes of 50 mM NaH 2 PO 4 , 300 mM NaCl and 5 mM imidazole. The protein attached to the column was eluted with an elution buffer containing 50 mM NaH 2 PO 4 (pH 8.5), 300 mM NaCl and 300 mM imidazole, and eluted with a Superdex-200 column (Amersham, USA) to obtain a freeze-protection protein Le IBP and a mutant of the Le IBP protein.

<1-4> <1-4> 동결방지단백질이 존재하는 조건에서만 응집이 억제되는 개질부의 조건 확인Identification of the conditions of the modified part inhibiting aggregation only in the presence of freeze-inhibiting protein

<1-4-1> <1-4-1> 개질부로서 citrate의 적용가능 여부 확인Check whether citrate is applicable as a modification part

금속 나노입자의 표면을 개질하는 개질부로서 citrate의 적용가능성을 확인하기 위하여, 상기 실시예 <1-1>에서 제조한 Cit-AuNP 입자를 하기 표 1과 같은 조건에서 냉동 및 해동시켰다.In order to confirm the applicability of citrate as a modifying part for modifying the surface of metal nanoparticles, Cit-AuNP particles prepared in Example <1-1> were frozen and thawed under the conditions shown in Table 1 below.

제1 레인The first lane 제2 레인Second lane 제3 레인Third lane Cit-AuNP 입자(2 nM, 100 ㎕) Cit-AuNP particles (2 nM, 100 [mu] l) ○○ ○○ ○○ BSABSA (( bovinebovine serumserum albuminalbumin )(1 μM, 10 ㎕) ) (1 [mu] M, 10 [mu] l) XX ○○ XX 실시예 <1-3-2>의 In Example < 1-3-2 > LeLe IBP(1 μM, 10 ㎕) IBP (1 [mu] M, 10 [mu] l) XX XX ○○ 물water 100 ㎕100 μl 90 ㎕90 μl 90 ㎕90 μl

상기 냉동 및 해동은 각각 -20 ℃의 온도에서 1시간, 37 ℃의 온도에서 10분의 조건으로 1 사이클 반복되었고, 10 사이클 째의 해동이 진행된 후 UV-Vis 분광기로 520 ㎚에서의 흡광도(E520)를 측정하여 금 나노입자의 응집 여부를 확인하였다(도 3의 (A)).The above freezing and thawing were repeated one cycle at a temperature of -20 ° C for 1 hour and at a temperature of 37 ° C for 10 minutes. After the 10th cycle of thawing proceeded, the absorbance at 520 nm (E 520 ) were measured to confirm whether gold nanoparticles aggregated (FIG. 3A).

그 결과, 상기 냉동 및 해동의 사이클을 진행하기 전에는 제1 내지 제3 레인 모두에서 520 ㎚에서의 흡광도가 최대값을 나타내어 Cit-AuNP가 응집되지 않는 것으로 확인되었다(도 3의 (B)). 그러나, 상기 냉동 및 해동의 사이클이 진행된 후에는 제1 레인에서 520 ㎚에서의 흡광도가 현저히 감소하여 상기 냉동에 의하여 Cit-AuNP가 비가역적으로 응집되는 반면, BSA 또는 LeIBP가 첨가된 제2 및 제3 레인에서는 520 ㎚에서의 흡광도가 최대값을 나타내어 상기 냉동에 의하여 Cit-AuNP가 응집되지 않는 것으로 확인되었다(도 3의 (C)).As a result, it was confirmed that Cit-AuNP did not aggregate (FIG. 3 (B)) because the absorbance at 520 nm showed the maximum value in all of the first to third lanes before the cycle of the freezing and thawing proceeded. However, after the above-described freezing and thawing cycles, the absorbance at 520 nm in the first lane is significantly reduced and the Cit-AuNP irreversibly flocculates by the freezing, while the second and third BSA or LeIBP- 3 lane exhibited the maximum absorbance at 520 nm and it was confirmed that Cit-AuNP did not aggregate by the freezing (Fig. 3 (C)).

<1-4-2> <1-4-2> 개질부로서 CM-PEG-SH의 적용가능 여부 확인Confirmation of applicability of CM-PEG-SH as a modified part

금속 나노입자의 표면을 개질하는 개질부로서 CM-PEG-SH의 적용가능성을 확인하기 위하여, 상기 실시예 <1-2-2>에서 제조한 PEG-AuNP 입자를 하기 표 2와 같은 조건에서 냉동 및 해동시켰다.In order to confirm the applicability of CM-PEG-SH as a modifying part for modifying the surface of metal nanoparticles, the PEG-AuNP particles prepared in Example <1-2-2> were subjected to freezing And thawed.

제1 레인The first lane 제2 레인Second lane 제3 레인Third lane PEG-AuNP 입자(2 nM, 100 ㎕) PEG-AuNP particles (2 nM, 100 [mu] l) ○○ ○○ ○○ BSABSA (( bovinebovine serumserum albuminalbumin )(1 μM, 10 ㎕) ) (1 [mu] M, 10 [mu] l) XX ○○ XX 실시예 <1-3-2>의 In Example < 1-3-2 > LeLe IBP(1 μM, 10 ㎕) IBP (1 [mu] M, 10 [mu] l) XX XX ○○ 물water 100 ㎕100 μl 90 ㎕90 μl 90 ㎕90 μl

상기 냉동 및 해동은 각각 -20 ℃의 온도에서 1시간, 37 ℃의 온도에서 10분의 조건으로 1 사이클 반복되었고, 10 사이클 째의 해동이 진행된 후 UV-Vis 분광기로 520 ㎚에서의 흡광도(E520)를 측정하여 금 나노입자의 응집 여부를 확인하였다(도 4의 (A)).The above freezing and thawing were repeated one cycle at a temperature of -20 ° C for 1 hour and at a temperature of 37 ° C for 10 minutes. After the 10th cycle of thawing proceeded, the absorbance at 520 nm (E 520 ) was measured to confirm whether the gold nanoparticles were aggregated (FIG. 4 (A)).

그 결과, 상기 냉동 및 해동의 사이클을 진행하기 전에는 제1 내지 제3 레인 모두에서 520 ㎚에서의 흡광도가 최대값을 나타내어 PEG-AuNP가 응집되지 않는 것으로 확인되었다(도 4의 (B)). 그리고, 상기 냉동 및 해동의 사이클이 진행된 후에도 제1 내지 제3 레인 모두에서 520 ㎚에서의 흡광도가 최대값을 나타내어 상기 냉동에 의해서도 PEG-AuNP가 응집되지 않는 것으로 확인되었다(도 4의 (C)).As a result, it was confirmed that PEG-AuNP did not aggregate (FIG. 4 (B)) because the absorbance at 520 nm was the maximum value in all of the first to third lanes before proceeding with the cycle of freezing and thawing. After the above-mentioned freezing and thawing cycles, the absorbances at 520 nm in all of the first to third lanes showed a maximum value, and it was confirmed that the PEG-AuNP did not aggregate even by the freezing (Fig. 4C) ).

<1-4-3> <1-4-3> 개질부로서 MSA의 적용가능 여부 확인Check whether MSA is applicable as a modification part

금속 나노입자의 표면을 개질하는 개질부로서 MSA의 적용가능성을 확인하기 위하여, 상기 실시예 <1-2-1>에서 제조한 MSA-AuNP 입자를 하기 표 3과 같은 조건에서 냉동 및 해동시켰다.MSA-AuNP particles prepared in Example <1-2-1> were frozen and thawed under the conditions shown in Table 3 below in order to confirm applicability of MSA as a modifying part for modifying the surface of metal nanoparticles.

제1 레인The first lane 제2 레인Second lane 제3 레인Third lane MSA-AuNP 입자(2 nM, 100 ㎕) MSA-AuNP particles (2 nM, 100 [mu] l) ○○ ○○ ○○ BSA(bovine serum albumin)(3 μM, 10 ㎕) BSA (bovine serum albumin) (3 [mu] M, 10 [mu] l) XX ○○ XX 실시예 <1-3-1>의 In Example < 1-3-1 > CnCn AFP(3 μM, 10 ㎕) AFP (3 [mu] M, 10 [mu] l) XX XX ○○ 물water 100 ㎕100 μl 90 ㎕90 μl 90 ㎕90 μl

상기 냉동 및 해동은 각각 -20 ℃의 온도에서 1시간, 37 ℃의 온도에서 10분의 조건으로 1 사이클 반복되었고, 10 사이클 째의 해동이 진행된 후 UV-Vis 분광기로 520 ㎚에서의 흡광도(E520)를 측정하여 금 나노입자의 응집 여부를 확인하였다.The above freezing and thawing were repeated one cycle at a temperature of -20 ° C for 1 hour and at a temperature of 37 ° C for 10 minutes. After the 10th cycle of thawing proceeded, the absorbance at 520 nm (E 520 ) were measured to confirm whether gold nanoparticles aggregated.

그 결과, 상기 냉동 및 해동의 사이클을 진행하기 전에는 제1 레인의 MSA-AuNP 입자는 520 ㎚에서의 흡광도가 최대값을 나타내어 MSA-AuNP가 응집되어 있지 않는 것으로 확인되었다(도 5의 실선). 그러나, 냉동 및 해동의 사이클을 진행시킨 후에는 상기 제1 레인에서 520 ㎚에서의 흡광도가 현저히 감소하여 상기 냉동에 의하여 MSA-AuNP가 비가역적으로 응집되는 것으로 확인되었다(도 5의 쇄선). 또한, 냉동 및 해동의 사이클이 진행된 후의 상기 제2 레인에서도 520 ㎚에서의 흡광도가 현저히 감소하여, BSA의 존재에도 불구하고 냉동에 의하여 MSA-AuNP가 비가역적으로 응집되는 것으로 확인되었다(도 5의 점선). 그러나, 상기 제3 레인에서는 냉동 및 해동의 사이클이 진행된 후에도 520 ㎚에서의 흡광도가 최대값을 나타내어, 상기 냉동에도 불구하고 상기 동결방지단백질 CnAFP에 의하여 MSA-AuNP가 응집되지 않는 것으로 확인되었다(도 5의 이점 쇄선).As a result, it was confirmed that the MSA-AuNP particles of the first lane exhibited the maximum absorbance at 520 nm before proceeding with the cycle of freezing and thawing (solid line in FIG. 5). However, after the cycle of freezing and thawing proceeded, the absorbance at 520 nm in the first lane was remarkably decreased, and it was confirmed that MSA-AuNP irreversibly aggregated by the freezing (chain line in FIG. 5). In addition, the absorbance at 520 nm remarkably decreased in the second lane after the cycle of freezing and thawing proceeded, and it was confirmed that MSA-AuNP irreversibly coagulated by freezing despite the presence of BSA (FIG. 5 dotted line). However, in the third lane, even after the cycle of the freezing and thawing proceeded, the absorbance at 520 nm showed the maximum value, and it was confirmed that the MSA-AuNP did not aggregate by the freeze protection protein CnAFP despite the freezing 5, the dashed line).

<1-4-4> <1-4-4> 개질부의 조건Condition of the modified part

상기와 같은 실시예 <1-4-1> 내지 <1-4-3>의 결과와 같이, 상기 실시예 <1-1>에서 제조된 Cit-AuNP 및 상기 실시예 <1-2-2>에서 제조된 PEG-AuNP는 동결방지단백질이 아닌 다른 단백질(예, BSA)의 존재하에서도 냉동에 의한 응집이 억제되었다. 상기와 같은 결과로부터, 상기 citrate 및 CM-PEG-SH는 동결방지단백질의 활성을 측정하기 위해 금속 나노입자의 표면에 도입되는 개질부로서 적합하지 않음을 알 수 있다. 반면, 상기 실시예 <1-2-1>에서 제조된 MSA-AuNP는 동결방지단백질이 존재하는 경우에만 냉동에 의한 금 나노입자의 응집이 억제되었다. 상기와 같은 결과로부터, MSA 또는 상기 MSA와 같이 양 말단이 적어도 하나 이상의 티올(thiol)기와 적어도 하나 이상의 카르복실(carboxyl)기로 치환된 알킬이 동결방지단백질의 활성을 측정하기 위해 금속 나노입자의 표면에 도입되는 개질부로서 적합함을 알 수 있다.
As shown in the results of Examples 1-4-1 to 1-4-3, Cit-AuNP prepared in Example 1-1 and Example 1-2-2, PEG-AuNP produced by the present invention was inhibited from aggregation by freezing even in the presence of a protein other than the anti-freeze protein (e.g., BSA). From the above results, it can be seen that citrate and CM-PEG-SH are not suitable as a modification part to be introduced on the surface of metal nanoparticles in order to measure the activity of the anti-freeze protein. On the other hand, the MSA-AuNP prepared in Example <1-2-1> inhibited aggregation of gold nanoparticles due to freezing only in the presence of the anti-freezing protein. From the above results, it has been found that, in order to measure the activity of the anti-freeze protein, at least one thiol group and at least one carboxyl group substituted with at least one carboxyl group, such as MSA or MSA, As shown in FIG.

금속 나노입자의 응집성이 기초한 동결방지단백질의 활성 분석Activity analysis of anti-freeze proteins based on cohesiveness of metal nanoparticles

상기 실시예 <1-4>에서 확인한 바와 같은 금속 나노입자의 응집성이 동결방지단백질의 활성 분석, 특히 활성의 정량 분석에 이용될 수 있는지 여부를 확인하였다.It was confirmed whether the cohesiveness of the metal nanoparticles as identified in the above Example <1-4> could be used for the activity analysis of the anti-freeze protein, in particular, the quantitative analysis of the activity.

<2-1> <2-1> 동결방지단백질 Anti-freeze protein CnCn AFP의 활성 분석Activity analysis of AFP

동결방지단백질로 알려진 CnAFP의 활성 분석이 가능한지 여부를 측정하기 위하여, 도 6의 (A)와 같이, 상기 실시예 <1-2-1>에서 제조한 MSA-AuNP 입자를 BSA 또는 상기 실시예 <1-3-1>에서 수득한 CnAFP와 함께 하기 표 4와 같은 조건에서 냉동 및 해동시켰다.6A, MSA-AuNP particles prepared in Example <1-2-1> were dissolved in BSA or in the same manner as in Example (1) to determine whether the activity of Cn AFP, Cn AFP obtained in < 1-3-1 > was frozen and thawed under the conditions shown in Table 4 below.

웰 넘버Well number 1-11-1 1-21-2 1-31-3 1-41-4 1-51-5 1-61-6 1-71-7 MSA-AuNP 입자MSA-AuNP particles
(2 nM, 100 ㎕) (2 nM, 100 [mu] l) ○○ ○○ ○○ ○○ ○○ ○○ ○○ BSABSA
(bovine serum albumin)(bovine serum albumin)
(10 ㎕) (10 [mu] L) 0 μM0 μM 0.1 μM0.1 μM 0.3 μM0.3 μM 0.5 μM0.5 μM 0.8 μM0.8 μM 1.0 μM1.0 [mu] M 2.0 μM2.0 μM 물water 100 ㎕100 μl 90 ㎕90 μl 90 ㎕90 μl 90 ㎕90 μl 90 ㎕90 μl 90 ㎕90 μl 90 ㎕90 μl 웰 넘버Well number 2-12-1 2-22-2 2-32-3 2-42-4 2-52-5 2-62-6 2-72-7 MSA-AuNP 입자MSA-AuNP particles
(2 nM, 100 ㎕) (2 nM, 100 [mu] l) ○○ ○○ ○○ ○○ ○○ ○○ OO 실시예 <1-3-1>의In Example < 1-3-1 >
CnCn AFPAFP
(10 ㎕) (10 [mu] L) 0 μM0 μM 0.1 μM0.1 μM 0.3 μM0.3 μM 0.5 μM0.5 μM 0.8 μM0.8 μM 1.0 μM1.0 [mu] M 2.0 μM2.0 μM 물water 100 ㎕100 μl 90 ㎕90 μl 90 ㎕90 μl 90 ㎕90 μl 90 ㎕90 μl 90 ㎕90 μl 90 ㎕90 μl

상기 냉동 및 해동은 각각 -20 ℃의 온도에서 1시간, 37 ℃의 온도에서 10분의 조건으로 1 사이클 반복되었고, 10 사이클 째의 해동이 진행된 후 UV-Vis 분광기로 520 ㎚에서의 흡광도(E520) 및 650 ㎚에서의 흡광도(E650)를 측정하여 E650 값에 대한 E520 값의 비율(E520/E650)을 산출함으로써 상기 MSA-AuNP 입자의 응집 여부를 확인하였다.The above freezing and thawing were repeated one cycle at a temperature of -20 ° C for 1 hour and at a temperature of 37 ° C for 10 minutes. After the 10th cycle of thawing proceeded, the absorbance at 520 nm (E 520 ) and the absorbance at 650 nm (E 650 ) were measured to determine the ratio of the E 520 value to the E 650 value (E 520 / E 650 ) to confirm whether the MSA-AuNP particles aggregated.

그 결과, 도 6의 (B)에 도시된 바와 같이, BSA를 처리한 웰에서는 상기 BSA의 농도에 상관없이 E520/E650 값이 거의 일정하게 나타나는 반면, CnAFP를 처리한 웰에서는 상기 CnAFP의 농도가 증가할수록 E520/E650 값이 점점 증가함을 확인하였다.As a result, as shown in (B) of Figure 6, whereas in the wells treated with BSA appears to E 520 / E 650 value is substantially constant irrespective of the concentration of the BSA, the wells treated with the Cn AFP the Cn As the concentration of AFP increased, the value of E 520 / E 650 increased gradually.

상기와 같은 결과로부터, BSA가 존재하는 경우에는 상기 BSA의 처리 농도에 상관없이 MSA-AuNP 입자가 냉동에 의하여 모두 응집(도 6의 (C))되는 반면, CnAFP가 존재하는 경우에는 MSA-AuNP 입자가 응집되지 않고(도 6의 (D)), 상기 CnAFP의 농도가 높아질수록 MSA-AuNP 입자의 응집 정도가 감소함을 알 수 있다.If the results from the described above, BSA is present, a, Cn, while the AFP ((C) in Fig. 6) both by the MSA-AuNP particles regardless of the concentration of the BSA freezing coagulation, if any, the MSA- AuNP particles are not agglomerated (FIG. 6 (D)). As the concentration of Cn AFP increases, the agglomeration degree of MSA-AuNP particles decreases.

<2-2> <2-2> 동결방지단백질 Anti-freeze protein LeLe IBP의 활성 분석Activity analysis of IBP

동결방지단백질로 알려진 LeIBP의 활성 분석이 가능한지 여부를 측정하기 위하여, 도 7의 (A)와 같이, 상기 실시예 <1-2-1>에서 제조한 MSA-AuNP 입자를 BSA 또는 상기 실시예 <1-3-2>에서 수득한 LeIBP와 함께 하기 표 5와 같은 조건에서 냉동 및 해동시켰다.In order to determine whether the activity of Le IBP known as the anti-freezing protein is possible, the MSA-AuNP particles prepared in Example <1-2-1> Were frozen and thawed together with the Le IBP obtained in < 1-3-2 > under the conditions shown in Table 5 below.

웰 넘버Well number 1-11-1 1-21-2 1-31-3 1-41-4 1-51-5 1-61-6 1-71-7 MSA-AuNP 입자MSA-AuNP particles
(2 nM, 100 ㎕) (2 nM, 100 [mu] l) ○○ ○○ ○○ ○○ ○○ ○○ ○○ BSABSA
(bovine serum albumin)(bovine serum albumin)
(10 ㎕) (10 [mu] L) 0 μM0 μM 1 μM1 [mu] M 4 μM4 μM 6 μM6 μM 8 μM8 μM 10 μM10 μM 20 μM20 μM 물water 100 ㎕100 μl 90 ㎕90 μl 90 ㎕90 μl 90 ㎕90 μl 90 ㎕90 μl 90 ㎕90 μl 90 ㎕90 μl 웰 넘버Well number 2-12-1 2-22-2 2-32-3 2-42-4 2-52-5 2-62-6 2-72-7 MSA-AuNP 입자MSA-AuNP particles
(2 nM, 100 ㎕) (2 nM, 100 [mu] l) ○○ ○○ ○○ ○○ ○○ ○○ ○○ 실시예 <1-3-2>의In Example < 1-3-2 >
LeLe IBPIBP
(10 ㎕) (10 [mu] L) 0 μM0 μM 1 μM1 [mu] M 4 μM4 μM 6 μM6 μM 8 μM8 μM 10 μM10 μM 20 μM20 μM 물water 100 ㎕100 μl 90 ㎕90 μl 90 ㎕90 μl 90 ㎕90 μl 90 ㎕90 μl 90 ㎕90 μl 90 ㎕90 μl

상기 냉동 및 해동은 각각 -20 ℃의 온도에서 1시간, 37 ℃의 온도에서 10분의 조건으로 1 사이클 반복되었고, 10 사이클 째의 해동이 진행된 후 UV-Vis 분광기로 520 ㎚에서의 흡광도(E520) 및 650 ㎚에서의 흡광도(E650)를 측정하여 E650 값에 대한 E520 값의 비율(E520/E650)을 산출함으로써 상기 MSA-AuNP 입자의 응집 여부를 확인하였다.The above freezing and thawing were repeated one cycle at a temperature of -20 ° C for 1 hour and at a temperature of 37 ° C for 10 minutes. After the 10th cycle of thawing proceeded, the absorbance at 520 nm (E 520 ) and the absorbance at 650 nm (E 650 ) were measured to determine the ratio of the E 520 value to the E 650 value (E 520 / E 650 ) to confirm whether the MSA-AuNP particles aggregated.

그 결과, 도 7의 (B)에 도시된 바와 같이, BSA를 처리한 웰에서는 상기 BSA의 농도에 상관없이 E520/E650 값이 거의 일정하게 나타나는 반면, LeIBP를 처리한 웰에서는 상기 CnAFP의 농도가 증가할수록 E520/E650 값이 점점 증가함을 확인하였다.As a result, as shown in FIG.'S 7 (B), whereas in the wells treated with BSA displayed the E 520 / E 650 value, regardless of the concentration of the BSA substantially constant, in the wells treated with Le IBP the Cn As the concentration of AFP increased, the value of E 520 / E 650 increased gradually.

상기와 같은 결과로부터, BSA가 존재하는 경우에는 상기 BSA의 처리 농도에 상관없이 MSA-AuNP 입자가 냉동에 의하여 모두 응집되는 반면, LeIBP가 존재하는 경우에는 MSA-AuNP 입자가 응집되지 않고, 상기 LeIBP의 농도가 높아질수록 MSA-AuNP 입자의 응집 정도가 감소함을 알 수 있다.From the above results, when BSA is present, the MSA-AuNP particles aggregate by freezing regardless of the treatment concentration of the BSA, whereas when Le IBP is present, the MSA-AuNP particles do not aggregate, As the concentration of Le IBP increases, the degree of aggregation of MSA-AuNP particles decreases.

<2-3> <2-3> 동결방지단백질의 활성 분석 가부Activity analysis of anti-freezing protein

상기 실시예 <2-1> 및 <2-2>에서 확인한 바와 같이, 금속 나노입자의 응집성을 이용하여 동결방지단백질의 활성을 분석할 수 있음을 알 수 있다. 또한, 상기 금속 나노입자의 냉동에 따른 응집의 정도가 첨가되는 동결방지단백질의 농도에 따라 달라지는 바, 상기와 같은 금속 나노입자를 이용하여 동결방지단백질의 활성에 대한 정량 분석이 가능함을 알 수 있다.
As can be seen from the above Examples <2-1> and <2-2>, it can be seen that the activity of the anti-freezing protein can be analyzed using the cohesiveness of the metal nanoparticles. In addition, the extent of coagulation of the metal nanoparticles upon freezing varies depending on the concentration of the added anti-freeze protein, and it is possible to quantitatively analyze the activity of the anti-freeze protein using the metal nanoparticles as described above .

동결방지단백질의 활성에 대한 정성 분석 가능 여부Is it possible to qualitatively analyze the activity of the anti-freezing protein?

상기 실시예 <1-4>에서 확인한 바와 같은 금속 나노입자의 응집성이 동결방지단백질의 활성 분석, 특히 활성의 정성 분석에 이용될 수 있는지 여부를 확인하였다.It was confirmed whether the cohesiveness of the metal nanoparticles as identified in the above Example <1-4> can be used for the activity analysis of the anti-freeze protein, in particular, the qualitative analysis of the activity.

상기와 같은 정성 분석의 가능 여부를 확인하기 위하여, 상기 실시예 <1-2-1>에서 제조한 MSA-AuNP 입자에 상기 실시예 <1-3-2>에서 수득한 야생형 LeIBP와 상기 야생형 LeIBP와는 동결방지 활성이 다른 것으로 알려진 LeIBP의 돌연변이체들(S147Y&A234Y, T65Y, S43Y 및 A234Y)을 첨가하고, 하기 표 6과 같은 건에서 냉동 및 해동시켜 상기 MSA-AuNP 입자의 응집 정도를 확인하였다. 상기 LeIBP 돌연변이체들의 동결방지 활성은 야생성 LeIBP의 동결방지 활성(100%) 대비 S147Y&A234Y는 23%, T65Y는 28%, S43Y는 35%, A234Y는 47%인 것으로 알려져 있다.In order to confirm the above qualitative analysis, the MSA-AuNP particles prepared in Example <1-2-1> were mixed with the wild type Le IBP obtained in Example <1-3-2> Le IBP than the addition of the mutant of the antifreeze activity Le IBP known to be different (S147Y & A234Y, T65Y, S43Y and A234Y), which was frozen and thawed in cases such as the following Table 6 verify the aggregation degree of the MSA-AuNP particles Respectively. The anti-freezing activity of the Le IBP mutants is known to be 23% for S147Y & A234Y, 28% for T65Y, 35% for S43Y, and 47% for A234Y compared to the freezing inhibition activity (100%) of wild Le IBP.

웰 넘버Well number 1One 22 33 44 55 66 MSA-AuNP 입자MSA-AuNP particles
(2 nM, 100 ㎕) (2 nM, 100 [mu] l) ○○ ○○ ○○ ○○ ○○ ○○ 단백질protein
(5 μM, 10 ㎕) (5 [mu] M, 10 [mu] l) BSABSA S147Y&A234Y S147Y & A234Y T65YT65Y S43YS43Y A234YA234Y 야생형 LeIBPWild type Le IBP 물water 90 ㎕90 μl 90 ㎕90 μl 90 ㎕90 μl 90 ㎕90 μl 90 ㎕90 μl 90 ㎕90 μl

상기 냉동 및 해동은 각각 -20 ℃의 온도에서 1시간, 37 ℃의 온도에서 10분의 조건으로 1 사이클 반복되었고, 10 사이클 째의 해동이 진행된 후 UV-Vis 분광기로 520 ㎚에서의 흡광도(E520) 및 650 ㎚에서의 흡광도(E650)를 측정하여 E650 값에 대한 E520 값의 비율(E520/E650)을 산출함으로써 상기 MSA-AuNP 입자의 응집 여부를 확인하였다.The above freezing and thawing were repeated one cycle at a temperature of -20 ° C for 1 hour and at a temperature of 37 ° C for 10 minutes. After the 10th cycle of thawing proceeded, the absorbance at 520 nm (E 520 ) and the absorbance at 650 nm (E 650 ) were measured to determine the ratio of the E 520 value to the E 650 value (E 520 / E 650 ) to confirm whether the MSA-AuNP particles aggregated.

그 결과, 얼음 결합 자리 구조가 변형된 돌연변이체들은 ①그 동결방지 활성에 의존적으로 MSA-AuNP 입자의 색 변화(적색 편이)를 유도하고(도 8의 (A)), ②그 동결방지 활성에 의존적으로 520 ㎚에서의 흡광도(E520)가 줄어들며(도 8의 (B)), ③E520/E650 값이 상기 단백질들의 동결방지 활성 비율과 일치하여 산출되었다(도 8의 (C)).As a result, mutants having modified ice-binding site structure induce color change (red shift) of MSA-AuNP particles depending on its freezing prevention activity (FIG. 8 (A)), The absorbance at 520 nm (E 520 ) was decreased (FIG. 8 (B)), and the value of E 520 / E 650 was calculated in accordance with the ratio of freezing prevention activity of the proteins (FIG.

상기와 같은 결과로부터, 금속 나노입자의 응집성을 이용하여 동결방지단백질의 활성을 정성적으로 분석할 수 있음을 알 수 있다.
From the above results, it can be seen that the activity of the anti-freeze protein can be qualitatively analyzed using the cohesiveness of the metal nanoparticles.

동결방지단백질의 안정성 분석 가능 여부Is it possible to analyze the stability of the anti-freezing protein?

상기 실시예 <1-4>에서 확인한 바와 같은 금속 나노입자의 응집성이 동결방지단백질 활성의 정량 및 정성 분석 외에, 상기 동결방지단백질의 안정성에 대한 분석에도 이용될 수 있는지 여부를 확인하였다.It was confirmed whether the cohesiveness of the metal nanoparticles as identified in the above Example <1-4> could be used for the analysis of the stability of the anti-freeze protein as well as quantitative and qualitative analysis of the anti-freeze protein activity.

상기와 같은 동결방지단백질의 안정성 분석에 대한 가능 여부를 확인하기 위하여, 상기 실시예 <1-3-1> 및 <1-3-2>에서 각각 수득한 CnAFP 및 야생형 LeIBP을 거친 조건(-20ㅀC에서 1시간 및 37 ㅀC에서 10분)에 노출시키는 사이클을 5회 또는 10회 반복시킨 후, 상기 실시예 <1-2-1>에서 제조한 MSA-AuNP 입자에 처리하고, 하기 표 7과 같은 건에서 냉동 및 해동시켜 상기 MSA-AuNP 입자의 응집 정도를 확인하였다. In order to confirm the possibility of the stability analysis of the above-mentioned anti-freezing proteins, Cn AFP and wild type Le IBP obtained in each of Examples <1-3-1> and <1-3-2> -20 ㅀ C for 1 hour and 37 ㅀ C for 10 minutes) was repeated 5 times or 10 times, and the MSA-AuNP particles prepared in Example <1-2-1> were treated, The agglomeration degree of the MSA-AuNP particles was confirmed by freezing and thawing in the case shown in Table 7 below.

웰 넘버Well number 1-11-1 1-21-2 1-31-3 MSA-AuNP 입자MSA-AuNP particles
(2 nM, 100 ㎕) (2 nM, 100 [mu] l) ○○ ○○ ○○ 실시예 <1-3-1>의In Example < 1-3-1 >
CnCn AFP(200 nM, 10 ㎕)AFP (200 nM, 10 [mu] L)
거친 조건에 노출 사이클 횟수 Number of exposure cycles in harsh conditions 0 사이클0 cycle 5 사이클5 cycles 10 사이클10 cycles 물water 90 ㎕90 μl 90 ㎕90 μl 90 ㎕90 μl 웰 넘버Well number 2-12-1 2-22-2 2-32-3 MSA-AuNP 입자MSA-AuNP particles
(2 nM, 100 ㎕) (2 nM, 100 [mu] l) ○○ ○○ ○○ 실시예 <1-3-2>의 In Example < 1-3-2 >
LeLe IBP(1 μM,IBP (1 [mu] M, 10 ㎕)10 [mu] L)
거친 조건에 노출 사이클 횟수 Number of exposure cycles in harsh conditions 0 사이클0 cycle 5 사이클5 cycles 10 사이클10 cycles 물water 90 ㎕90 μl 90 ㎕90 μl 90 ㎕90 μl

상기 냉동 및 해동은 각각 -20 ℃의 온도에서 1시간, 37 ℃의 온도에서 10분의 조건으로 1 사이클 반복되었고, 10 사이클 째의 해동이 진행된 후 UV-Vis 분광기로 520 ㎚에서의 흡광도(E520) 및 650 ㎚에서의 흡광도(E650)를 측정하여 E650 값에 대한 E520 값의 비율(E520/E650)을 산출함으로써 상기 MSA-AuNP 입자의 응집 여부를 확인하였다.The above freezing and thawing were repeated one cycle at a temperature of -20 ° C for 1 hour and at a temperature of 37 ° C for 10 minutes. After the 10th cycle of thawing proceeded, the absorbance at 520 nm (E 520 ) and the absorbance at 650 nm (E 650 ) were measured to determine the ratio of the E 520 value to the E 650 value (E 520 / E 650 ) to confirm whether the MSA-AuNP particles aggregated.

그 결과, CnAFP는 거친 조건에 노출되는 사이클의 수가 증가할수록 MSA-AuNP 입자의 응집에 의한 색 변화가 유도되었으나, LeIBP는 거친 조건에 노출되는 사이클의 수가 증가하여도 MSA-AuNP 입자의 응집에 의한 색 변화가 유도되지 않았다(도 9의 (A)). 즉, CnAFP는 거친 조건에 노출되는 사이클의 수가 증가할수록 동결방지 활성이 감소하는 반면, LeIBP는 거친 조건에 노출되는 사이클의 수가 증가함에도 동결방지 활성이 일정하게 유지되었다(도 9의 (B)).As a result, Cn AFP induced color change due to agglomeration of MSA-AuNP particles as the number of cycles exposed to rough conditions increased. However, Le IBP did not cause agglomeration of MSA-AuNP particles even when the number of cycles exposed to rough conditions increased. (Fig. 9 (A)). That is, as the number of cycles exposed to the harsh conditions of Cn AFP decreased, the degree of freezing inhibition decreased, while that of Le IBP remained constant even though the number of cycles exposed to rough conditions increased )).

상기와 같은 결과로부터, LeIBP 단백질이 CnAFP 단백질보다 동결방지 활성의 관점에서 더욱 안정함을 알 수 있고, 금속 나노입자의 응집성을 이용하여 동결방지단백질 활성의 안정성 또한 분석할 수 있음을 알 수 있다.
From the above results, it can be seen that the Le IBP protein is more stable in view of the anti-freezing activity than the Cn AFP protein, and the stability of the anti-freeze protein activity can also be analyzed by using the cohesiveness of the metal nanoparticles have.

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 예시적으로 설명하였으나, 본 발명의 범위는 상기와 같은 특정 실시예에만 한정되지 아니하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 특허청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능할 것이다.
While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the scope of the invention is not limited to the disclosed exemplary embodiments. It will be possible to change it appropriately.

<110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University <120> Method for analyzing the activity of the anti-freezing protein and the application thereof <130> HY120047N <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 846 <212> DNA <213> Chaetoceros neogracile <400> 1 atgagtctta ttacaattaa tcataccctc gttgtaaccg ccctactatt cgctgcagtg 60 gcacttctag gagtaccaat ggcagagggt ctccgtcagg agaaacgtgg aggtcttagg 120 cgtcagctcg atgacgaacc actatctgct gtcaagctac tcacagcagg aaggtttgcc 180 attttgacaa aaactggtgt gacgaccacc ggtccaacag atctgaaagg tgatatgggc 240 acgagtccta tcacaggcgc ggccatcacg ggatttggtt tgattacgga tcccagcgat 300 accactttct ccacatcctc ccttgtgaca ggacaggtat tcgcatcaga ctacacatcc 360 cccacaccca atatgctaac tgtagcagtc ctcgacatgc aggccgcata tgttgatgct 420 gcaggccgcc ctgaccccga ctacgttgag cttggtgctg gaaacattga gggcctcact 480 cttgaacctg gcctatacaa gtgggggact gatgtcggct tcaccaacag tctcaccttc 540 gatggttctg acactgatat ttggatcttg cagatcgatg gggatgtcac agcaggaagc 600 ggtgcaaaag tcaaactcat taacgatgcc aaggctgaga acatcttttg gcagattgcg 660 ggcaagactg atctaggcac cacgtcccat gttgagggtg tgttcctctg tagcacagca 720 atcactttca aaactggaag cagcatgaat ggtgctgcac tagcacagac agcagtcacg 780 ttggattccg ctacgatcgt gaaggagtcc gtatgcgatg tggatgttgg gtgtgtggca 840 ccaaac 846 <210> 2 <211> 784 <212> DNA <213> Leucosporidium. sp. AY30 <400> 2 atgtctctcc tctcgattat caccatcgga ctcgccggtc tcggaggcct tgtcaacgga 60 cagcgcgacc tctccgtcga gctcggagtc gcttccaact ttgccatcct cgctaaggca 120 ggcatctcaa gcgtccctga ctcagcgatc cttggcgaca ttggagtgtc gcccgccgcc 180 gccacctaca tcactggctt cggtctcacc caggactcca gcaccacgta cgcgacctct 240 ccccaggtca ccggtttgat ctacgctgca gactactcga ctcctactcc caactacctc 300 gccgccgccg ttgccaacgc cgagactgcc tacaaccagg ccgccggatt cgtcgacccc 360 gacttcctcg agcttggagc tggtgaactt agggaccaga cccttgttcc tggactctac 420 aagtggacgt cctcggtctc ggttcctacc gacctcacct ttgagggaaa cggcgacgcc 480 acctgggttt tccagatcgc tggaggcctc agccttgccg acggtgttgc cttcaccctc 540 gctggcggag cgaactcgac caacatcgcg ttccaggtcg gtgacgacgt caccgtcgga 600 aagggagctc acttcgaggg tgtcctcctc gccaagcgct tcgtcaccct ccagaccggc 660 tcgtccctca acggtcgcgt cttgagtcag accgaggtcg ctctccagaa ggccaccgtc 720 aactctccct tcgtccctgc ccccgaggtc gtccagaagc gctcgaacgc ccgccagtgg 780 cttt 784 <210> 3 <211> 784 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide sequence coding for S147Y&A234Y mutant of LeIBP <400> 3 atgtctctcc tctcgattat caccatcgga ctcgccggtc tcggaggcct tgtcaacgga 60 cagcgcgacc tctccgtcga gctcggagtc gcttccaact ttgccatcct cgctaaggca 120 ggcatctcaa gcgtccctga ctcagcgatc cttggcgaca ttggagtgtc gcccgccgcc 180 gccacctaca tcactggctt cggtctcacc caggactcca gcaccacgta cgcgacctct 240 ccccaggtca ccggtttgat ctacgctgca gactactcga ctcctactcc caactacctc 300 gccgccgccg ttgccaacgc cgagactgcc tacaaccagg ccgccggatt cgtcgacccc 360 gacttcctcg agcttggagc tggtgaactt agggaccaga cccttgttcc tggactctac 420 aagtggacgt cctcggtcta tgttcctacc gacctcacct ttgagggaaa cggcgacgcc 480 acctgggttt tccagatcgc tggaggcctc agccttgccg acggtgttgc cttcaccctc 540 gctggcggag cgaactcgac caacatcgcg ttccaggtcg gtgacgacgt caccgtcgga 600 aagggagctc acttcgaggg tgtcctcctc gccaagcgct tcgtcaccct ccagaccggc 660 tcgtccctca acggtcgcgt cttgagtcag accgaggtct atctccagaa ggccaccgtc 720 aactctccct tcgtccctgc ccccgaggtc gtccagaagc gctcgaacgc ccgccagtgg 780 cttt 784 <210> 4 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ggccaccgtc 720 aactctccct tcgtccctgc ccccgaggtc gtccagaagc gctcgaacgc ccgccagtgg 780 cttt 784 <210> 6 <211> 784 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide sequence coding for A234Y mutant of LeIBP <400> 6 atgtctctcc tctcgattat caccatcgga ctcgccggtc tcggaggcct tgtcaacgga 60 cagcgcgacc tctccgtcga gctcggagtc gcttccaact ttgccatcct cgctaaggca 120 ggcatctcaa gcgtccctga ctcagcgatc cttggcgaca ttggagtgtc gcccgccgcc 180 gccacctaca tcactggctt cggtctcacc caggactcca gcaccacgta cgcgacctct 240 ccccaggtca ccggtttgat ctacgctgca gactactcga ctcctactcc caactacctc 300 gccgccgccg ttgccaacgc cgagactgcc tacaaccagg ccgccggatt cgtcgacccc 360 gacttcctcg agcttggagc tggtgaactt agggaccaga cccttgttcc tggactctac 420 aagtggacgt cctcggtctc ggttcctacc gacctcacct ttgagggaaa cggcgacgcc 480 acctgggttt tccagatcgc tggaggcctc agccttgccg acggtgttgc cttcaccctc 540 gctggcggag cgaactcgac caacatcgcg ttccaggtcg gtgacgacgt caccgtcgga 600 aagggagctc acttcgaggg tgtcctcctc gccaagcgct tcgtcaccct ccagaccggc 660 tcgtccctca acggtcgcgt cttgagtcag accgaggtct atctccagaa ggccaccgtc 720 aactctccct tcgtccctgc ccccgaggtc gtccagaagc gctcgaacgc ccgccagtgg 780 cttt 784 <110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University <120> Method for analyzing the activity of the anti-freezing protein          and the application thereof <130> HY120047N <160> 6 <170> Kopatentin 1.71 <210> 1 <211> 846 <212> DNA <213> Chaetoceros neogracile <400> 1 atgagtctta ttacaattaa tcataccctc gttgtaaccg ccctactatt cgctgcagtg 60 gcacttctag gagtaccaat ggcagagggt ctccgtcagg agaaacgtgg aggtcttagg 120 cgtcagctcg atgacgaacc actatctgct gtcaagctac tcacagcagg aaggtttgcc 180 attttgacaa aaactggtgt gacgaccacc ggtccaacag atctgaaagg tgatatgggc 240 acgagtccta tcacaggcgc ggccatcacg ggatttggtt tgattacgga tcccagcgat 300 accactttct ccacatcctc ccttgtgaca ggacaggtat tcgcatcaga ctacacatcc 360 cccacaccca atatgctaac tgtagcagtc ctcgacatgc aggccgcata tgttgatgct 420 gcaggccgcc ctgaccccga ctacgttgag cttggtgctg gaaacattga gggcctcact 480 cttgaacctg gcctatacaa gtgggggact gatgtcggct tcaccaacag tctcaccttc 540 gatggttctg acactgatat ttggatcttg cagatcgatg gggatgtcac agcaggaagc 600 ggtgcaaaag tcaaactcat taacgatgcc aaggctgaga acatcttttg gcagattgcg 660 ggcaagactg atctaggcac cacgtcccat gttgagggtg tgttcctctg tagcacagca 720 atcactttca aaactggaag cagcatgaat ggtgctgcac tagcacagac agcagtcacg 780 ttggattccg ctacgatcgt gaaggagtcc gtatgcgatg tggatgttgg gtgtgtggca 840 ccaaac 846 <210> 2 <211> 784 <212> DNA <213> Leucosporidium. sp. AY30 <400> 2 atgtctctcc tctcgattat caccatcgga ctcgccggtc tcggaggcct tgtcaacgga 60 cagcgcgacc tctccgtcga gctcggagtc gcttccaact ttgccatcct cgctaaggca 120 ggcatctcaa gcgtccctga ctcagcgatc cttggcgaca ttggagtgtc gcccgccgcc 180 gccacctaca tcactggctt cggtctcacc caggactcca gcaccacgta cgcgacctct 240 ccccaggtca ccggtttgat ctacgctgca gactactcga ctcctactcc caactacctc 300 gccgccgccg ttgccaacgc cgagactgcc tacaaccagg ccgccggatt cgtcgacccc 360 gacttcctcg agcttggagc tggtgaactt agggaccaga cccttgttcc tggactctac 420 aagtggacgt cctcggtctc ggttcctacc gacctcacct ttgagggaaa cggcgacgcc 480 acctgggttt tccagatcgc tggaggcctc agccttgccg acggtgttgc cttcaccctc 540 gctggcggag cgaactcgac caacatcgcg ttccaggtcg gtgacgacgt caccgtcgga 600 aagggagctc acttcgaggg tgtcctcctc gccaagcgct tcgtcaccct ccagaccggc 660 tcgtccctca acggtcgcgt cttgagtcag accgaggtcg ctctccagaa ggccaccgtc 720 aactctccct tcgtccctgc ccccgaggtc gtccagaagc gctcgaacgc ccgccagtgg 780 cttt 784 <210> 3 <211> 784 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide sequence coding for S147Y & A234Y mutant of LeIBP <400> 3 atgtctctcc tctcgattat caccatcgga ctcgccggtc tcggaggcct tgtcaacgga 60 cagcgcgacc tctccgtcga gctcggagtc gcttccaact ttgccatcct cgctaaggca 120 ggcatctcaa gcgtccctga ctcagcgatc cttggcgaca ttggagtgtc gcccgccgcc 180 gccacctaca tcactggctt cggtctcacc caggactcca gcaccacgta cgcgacctct 240 ccccaggtca ccggtttgat ctacgctgca gactactcga ctcctactcc caactacctc 300 gccgccgccg ttgccaacgc cgagactgcc tacaaccagg ccgccggatt cgtcgacccc 360 gacttcctcg agcttggagc tggtgaactt agggaccaga cccttgttcc tggactctac 420 aagtggacgt cctcggtcta tgttcctacc gacctcacct ttgagggaaa cggcgacgcc 480 acctgggttt tccagatcgc tggaggcctc agccttgccg acggtgttgc cttcaccctc 540 gctggcggag cgaactcgac caacatcgcg ttccaggtcg gtgacgacgt caccgtcgga 600 aagggagctc acttcgaggg tgtcctcctc gccaagcgct tcgtcaccct ccagaccggc 660 tcgtccctca acggtcgcgt cttgagtcag accgaggtct atctccagaa ggccaccgtc 720 aactctccct tcgtccctgc ccccgaggtc gtccagaagc gctcgaacgc ccgccagtgg 780 cttt 784 <210> 4 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Claims (14)

MSA(mercaptosuccinic acid)를 금속 나노입자의 표면에 도입하여, 상기 금속 나노입자의 표면을 카르복시기로 개질하는 단계;
실험군으로서, 분석 대상 동결방지단백질을 상기 표면이 개질된 금속 나노입자와 함께 물에 첨가하는 단계;
상기 금속 나노입자와 동결방지단백질이 첨가된 물을 0 ℃ 이하로 냉동시켜 상기 금속 나노입자를 응집시킨 후, 해동시키는 단계;
상기 해동된 물 내에 포함된 상기 금속 나노입자의 응집 정도를 측정하는 단계; 및
상기 측정된 응집 정도를, 분석 대상 동결방지단백질이 포함되지 않은 물을 0 ℃ 이하로 냉동시켜 상기 금속 나노입자를 응집시킨 후 해동시킨 대조군의 금속 나노입자 응집 정도와 비교하는 단계를 포함하는 동결방지단백질의 활성 분석 방법.Introducing MSA (mercaptosuccinic acid) onto the surface of the metal nanoparticles to modify the surface of the metal nanoparticles to a carboxyl group;
As an experimental group, the method comprises the steps of: adding an anti-freeze protein to be analyzed to water together with the surface-modified metal nanoparticles;
Freezing the water to which the metal nanoparticles and the anti-freeze protein have been added at a temperature of 0 ° C or less to coagulate the metal nanoparticles and thawing the nanoparticles;
Measuring the degree of agglomeration of the metal nanoparticles contained in the thawed water; And
And freezing the water to a temperature not higher than 0 ° C to coagulate the metal nanoparticles and comparing the degree of aggregation with the degree of aggregation of the metal nanoparticles of the control group thawed, A method for analyzing the activity of a protein. 제1항에 있어서, 상기 금속 나노입자는 금, 은, 구리, 백금, 팔라듐, 니켈 및 철로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상의 혼합금속으로 구성된 것을 특징으로 하는 동결방지단백질의 활성 분석 방법.The method according to claim 1, wherein the metal nanoparticles are composed of one or more mixed metals selected from the group consisting of gold, silver, copper, platinum, palladium, nickel and iron . 제1항에 있어서, 상기 금속 나노입자는 지름이 3 ㎚ 내지 30 ㎚인 것을 특징으로 하는 동결방지단백질의 활성 분석 방법.The method according to claim 1, wherein the metal nanoparticles have a diameter of 3 nm to 30 nm. 삭제delete 제1항에 있어서, 상기 MSA(mercaptosuccinic acid)는 금속 나노입자 1몰에 대하여 100몰 내지 500몰의 몰 비율로 상기 금속 나노입자에 도입되는 것을 특징으로 하는 동결방지단백질의 활성 분석 방법.2. The method according to claim 1, wherein the mercaptoccinic acid (MSA) is introduced into the metal nanoparticles at a molar ratio of 100 to 500 mol based on 1 mol of the metal nanoparticles. 제1항에 있어서, 상기 동결방지단백질은 1회 이상 반복적으로 냉동 및 해동을 거친 후에 상기 물에 첨가되는 것을 특징으로 하는 동결방지단백질의 활성 분석 방법.The method according to claim 1, wherein the anti-freeze protein is added to the water after repeatedly freezing and thawing at least once. 제1항에 있어서, 상기 냉동은 -40 ℃ 내지 0 ℃의 온도에서 30분 내지 120분 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 동결방지단백질의 활성 분석 방법.The method according to claim 1, wherein the freezing is performed at a temperature of -40 ° C to 0 ° C for 30 minutes to 120 minutes. 제1항에 있어서, 상기 해동은 10 ℃ 내지 50 ℃의 온도에서 3분 내지 30분 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 동결방지단백질의 활성 분석 방법.The method according to claim 1, wherein the thawing is carried out at a temperature of 10 ° C to 50 ° C for 3 minutes to 30 minutes. 제1항에 있어서, 상기 응집 정도의 측정은 응집에 의하여 흡광도의 변화가 일어나는 두 개의 파장에서 흡광도의 비율을 측정함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 동결방지단백질의 활성 분석 방법.The method according to claim 1, wherein the measurement of the degree of cohesion is performed by measuring the ratio of absorbance at two wavelengths at which the absorbance changes by coagulation. MSA(mercaptosuccinic acid)를 금속 나노입자의 표면에 도입하여, 상기 금속 나노입자의 표면을 카르복시기로 개질하는 단계;
실험군으로서, 억제 대상 동결방지단백질 및 억제제 후보물질을 상기 표면이 개질된 금속 나노입자와 함께 물에 첨가하는 단계;
상기 금속 나노입자, 억제 대상 동결방지단백질 및 억제제 후보물질이 첨가된 물을 0 ℃ 이하로 냉동시켜 상기 금속 나노입자를 응집시킨 후, 해동시키는 단계;
상기 해동된 물 내에 포함된 상기 금속 나노입자의 응집 정도를 측정하는 단계;
상기 측정된 응집 정도를, 억제제 후보물질이 포함되지 않은 물 내에서 응집시킨 대조군의 금속 나노입자 응집 정도와 비교하는 단계; 및
상기 대조군에 비하여 높은 응집 정도를 나타내는 실험군에 포함된 억제제 후보물질을 억제 대상 동결방지단백질의 활성 억제제인 것으로 판단하는 단계를 포함하는 동결방지단백질의 억제제 스크리닝 방법.Introducing MSA (mercaptosuccinic acid) onto the surface of the metal nanoparticles to modify the surface of the metal nanoparticles to a carboxyl group;
As an experimental group, the step of adding an inhibition target freeze preventing protein and an inhibitor candidate substance to water together with the surface-modified metal nanoparticles;
Freezing the water to which the metal nanoparticles, the object of inhibition of freezing prevention, and the inhibitor candidate substance are added at a temperature of 0 ° C or less to coagulate the metal nanoparticles and thawing the metal nanoparticles;
Measuring the degree of agglomeration of the metal nanoparticles contained in the thawed water;
Comparing the measured degree of aggregation with the degree of metal nanoparticle aggregation of a control group aggregated in water not containing an inhibitor candidate material; And
And determining that the inhibitor candidate contained in the test group exhibiting a high level of aggregation as compared with the control group is an inhibitor of the inhibition of the freeze inhibition protein to be inhibited. 제10항에 있어서, 상기 금속 나노입자는
금, 은, 구리, 백금, 팔라듐, 니켈 및 철로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상의 혼합금속으로 구성되고,
지름이 3 ㎚ 내지 30 ㎚인 것을 특징으로 하는 동결방지단백질의 억제제 스크리닝 방법.The method of claim 10, wherein the metal nanoparticles
And is composed of any one or two or more mixed metals selected from the group consisting of gold, silver, copper, platinum, palladium, nickel and iron,
And a diameter of from 3 nm to 30 nm. 삭제delete 제10항에 있어서,
상기 냉동은 0 ℃ 내지 -40 ℃의 온도에서 30분 내지 2시간 동안 수행되고,
상기 해동은 10 ℃ 내지 37 ℃의 온도에서 5분 내지 30분 동안 수행되며,
상기 냉동 및 해동은 1회 이상 반복되는 것을 특징으로 하는 동결방지단백질의 억제제 스크리닝 방법.11. The method of claim 10,
The freezing is carried out at a temperature of 0 ° C to -40 ° C for 30 minutes to 2 hours,
The thawing is performed at a temperature of 10 캜 to 37 캜 for 5 minutes to 30 minutes,
Wherein the freezing and thawing is repeated one or more times. 제10항에 있어서, 상기 응집 정도의 측정은 응집에 의하여 흡광도의 변화가 일어나는 두 개의 파장에서 흡광도의 비율을 측정함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 동결방지단백질의 억제제 스크리닝 방법.
11. The method of claim 10, wherein the measurement of the degree of cohesion is performed by measuring the ratio of absorbance at two wavelengths at which the absorbance changes by coagulation.
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