KR101416174B1

KR101416174B1 - 항암 효과를 가지는 포도 식초 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101416174B1
Application number: KR1020120156333A
Authority: KR
Inventors: 장선일; 전인화; 김현수; 한경수; 목지예; 강현주
Original assignee: 한경수; 정읍시; 재단법인 전라북도생물산업진흥원
Priority date: 2012-12-28
Filing date: 2012-12-28
Publication date: 2014-07-14
Also published as: KR20140087211A

Abstract

본 발명은 양질의 포도 식초 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 유기농 포도를 이용하여 제조함으로써 레스베라트롤, 퀘르세틴 및 캄페롤의 함량이 높고 항암 효과가 우수한 식초 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

Description

항암 효과를 가지는 포도 식초 및 이의 제조방법{Grape vinegar having an anti-cancer effect and the method for preparing the same}

식초는 약 4% 정도의 초산을 함유하고 시고 약간의 단 맛이 가미된 조미료의 일종으로 우리가 복용하는 식초의 구분은 순도가 90~95%인 에틸알콜에 석유에서 추출한 빙초산을 가하는 합성 식초, 고구마나 감자 등을 에틸알콜로 발효시켜 제조하는 알콜 양조식초, 및 곡류 또는 과일에 누룩을 첨가시켜 천연발효에 의한 천연발효식초 등 3가지로 구분된다.

천연발효식초는 일반적으로 알콜발효 후 초산발효가 진행되면서 시어지게 되는데, 그 주요성분은 초산으로서 스트레스를 없애주는 부신피질 호르몬의 원료(1)로 이용될 뿐만 아니라 살균과 해독 작용에 중요한 역할을 한다(2, 3). 또한 식초는 각종 아미노산과 유기산을 풍부하게 함유하고 있어 체내에서 알칼리성으로 작용해 산성을 적절히 중화시킨다. 또한 식초에 들어 있는 필수 아미노산은 몸의 저항력을 높이고 알칼리 성분을 저장하는 효과가 있다(1, 2). 더욱이 식초는 이외에 호박산, 사과산, 주석산 등 60종 이상의 유기산이 들어 있는데(4), 이러한 유기산은 강력한 항산화 작용으로 각종 성인병을 예방해준다. 즉, 유기산은 장 안에 생성된 발암 물질이나 유해균이 살 수 없는 환경을 조성해 암은 물론 각종 병원균에 대한 면역력을 높여준다.

최근에 Johnston & Gaas(5)가 식초가 심혈관계질환 개선, 항암작용 및 혈당 조절에 효과가 있음을 보고한 이래 식초의 활용가치는 의학 수준에서 논의되고 있다. 따라서 유용성분이 많이 함유된 식초는 인체 건강 증진에 도움이 되는 것으로서, 식품산업에서 그 가치가 증대되고 있다.

캠벨 어얼리(Campbell Early, Vitis labrusca variety)는 우리나라 포도의 주요 품종으로서 전체 포도 재배 면적의 70%를 차지하고 있는데(6), 이는 우리나라 국내 기후 조건에 매우 적합하고 향이 우수하여 주로 생과로 이용되고 있을 뿐만 아니라 당분의 함량이 14~15%로 과즙으로도 많이 이용되고 있으나, 신맛이 강하여 포도주 등 가공품으로 활용되는 데는 다소의 문제점이 있다(6).

한편, 캠벨 어얼리는 다른 포도종에 비해 레스베라트롤, 퀘르세틴 및 캄페롤이 많이 함유되어 있는 것으로 알려져 있는데(7), 이들 물질은 기후 및 재배 조건에 따라서 그 함량이 다를 수 있다. 일반적인 농가에서 이 품종의 재배는 화학비료와 농약을 사용하여 생산한다. 이러한 방식의 재배로 생산된 포도나 그 부산물을 이용할 경우에는 인체에 해로운 농약성분과 화학성분이 잔류할 수 있기 때문에 특별한 관리가 필요하다는 문제점이 제기될 수 있다. 더욱이 일반적으로 시중에서 판매되는 포도 식초에 사용되는 원료는 생과일로 사용할 수 없는 저 품질의 포도를 주로 이용하고 있기 때문에 양질의 식초를 제공하는데 어려움이 있다. 따라서 화학비료와 농약을 사용하지 않은 유기농법에 의해 생산된 포도 과실 뿐만 아니라 고기능성 성분을 함유하는 포도 송이가지와 잎을 모두 활용할 수 있는 기술 개발이 절실히 요청된다.

또한, 통상적으로 포도즙을 활용하여 알콜발효를 할 때는 주로 과즙, 과피 및 씨 등 총 과실을 액상 분쇄하여 즙을 활용하는데, 이와 같이 알콜발효를 진행하게 되면 레스베라트롤, 퀘르세틴 및 캄페롤 등 폴리페놀의 함량이 낮을 수 있기 때문에 기능성을 높이기 위한 전략적 연구개발의 필요성이 있다.

이에 본 발명자들은 레스베라트롤, 퀘르세틴 및 캄페롤 등의 폴리페놀이 많이 함유된 양질의 포도 식초를 제공하고자 하였으며, 유기농법으로 재배한 포도를 이용하여 포도즙을 제조하고, 효모를 이용한 알콜발효를 실행함으로써 당도가 더 높으면서 폴리페놀이 다량 함유한 포도 식초를 제공할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 유기농법으로 재배한 포도와 효모를 이용하여 폴리페놀의 함량 및 당도가 높은 포도 식초 및 상기 포도 식초의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 포도 식초를 함유하는 항암용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 1) 유기농 포도의 포도즙을 준비하는 단계; 2) 포도즙을 저온에서 숙성하는 단계; 3) 숙성한 포도즙을 농축하여 당도를 높이는 단계; 4) 효모(Saccharromyces ellipsoideus)를 접종하여 알콜발효를 실행하는 단계; 5) 초산균(Acetobacter aceti)을 접종하여 초산발효를 실행하는 단계; 및 6) 여과하여 식초를 수득하는 단계;를 포함하는 포도 식초의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 포도 식초를 제공한다.

본 발명에 따라서 제조된 포도 식초는 기존의 포도 식초와 비교하여 당도가 훨씬 높아 기호도가 높으며, 레스베라트롤, 퀘르세틴 및 캄페롤 등의 폴리페놀이 다량 함유되어 있어 우수한 항암 효과를 제공할 수 있다.

도 1은 포도 식초 제조 과정의 공정도를 나타낸 것이다.
도 2는 지표물질에 대하여 얻은 HPLC 핑거프린팅 결과를 나타낸 것으로서, A는 순수 지표물의 피크, B는 추출물의 피크를 나타낸다(1: 레스베라트롤; 2: 퀘르세틴; 3: 캄페롤)
도 3은 지표물질의 결장암 세포주에서 세포 독성 효과를 측정한 결과를 나타낸 것이며, ^*p<0.05, ^**p<0.01과 ^***p<0.001은 대조군과 비교하였다.
도 4는 포도 송이가지 및 잎 에탄올 추출물의 결장암 세포주에서 세포 독성 효과를 측정한 결과를 나타낸 것이며, ^*p<0.05, ^**p<0.01과 ^***p<0.001은 대조군과 비교하였다.
도 5는 포도 송이가지와 잎 에탄올 추출물의 첨가 비율에 따른 포도 식초의 결장암 세포주에서 세포 독성 효과를 측정한 결과를 나타낸 것이며, ^#p<0.001은 정상대조군과 비교하였고, ^*p<0.05, ^**p<0.01과 ^***p<0.001은 송이가지와 잎 추출물의 무첨가 대조군과 비교하였다.
도 6은 초산발효 시 캠벨 어얼리 송이가지와 잎의 추출물의 첨가 비율에 따른 포도 식초의 CT-26 이식 Balb/c마우스에서의 종양 억제 효과를 나타낸 것이며, ^#p<0.001는 정상대조군과 비교하였고, ^*p<0.05, ^**p<0.01 및 ^***p<0.001는 송이가지와 잎 추출물의 무첨가 대조군과 비교하였다.

일반적으로 포도의 당도는 14~18Brix로 다른 곡류에 비해서 높기 때문에 외부 당원을 적게 첨가하더라도 양질의 알콜발효를 진행할 수 있다(6). 또한 포도의 폴리페놀 함량은 100g 당 50~490mg으로 자몽, 오렌지, 복숭아 및 배 등에 비하여 그 함량이 높은 것으로 알려지면서, 기능성 식품으로 활용할 수 있는 연구가 이루어지고 있다(7).

원래 레스베라트롤(3,5,4,9-트리하이드록시-트랜스-스틸벤)은 곰팡이의 감염을 방지하여 식물을 보호하기 위한 식물 항생제로 알려져 있는데(8), 땅콩 및 불루베리 등 다른 식물보다 포도의 껍질, 씨, 송이가지 및 잎 등에 많이 함유되어 있는 물질이다. 반면에 퀘르세틴과 캄페롤은 포도를 비롯한 과일 및 채소류에 많이 함유되어 있는 물질이다(9). 레스베라트롤, 퀘르세틴 및 캄페롤은 폴리페놀계의 천연 화합물로서 항산화 작용을 제공함과 함께 NF-κB(nuclear factor-κB)를 억제함으로써 일산화질소(ntric oxide, NO), 사이클로옥시게나제-2(cyclooxygenase-2, COX-2) 등과 같은 염증매개물질 생성을 억제하여 항염증 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 또한 항암 및 암 예방 효과가 있고, 항바이러스 및 항균효과가 있어 건강식품에 활용되고 있다. 또한, 근래에 활성산소가 암을 비롯한 순환기질환 등 성인병을 유발하거나 악화시키는 주요 원인으로 알려지면서, 활성산소를 제거하기 위한 연구도 늘어나고 있다(10, 11). 활성산소를 제거하는 물질을 항산화제라 하는데, 식용 또는 약용식물로부터 우수한 항산화제를 발굴하려는 연구가 최근에는 활발히 진행되고 있다(12, 13).

본 발명은 레스베라트롤, 퀘르세틴 및 캄페롤이 다량 함유되어 있는 포도를 원료를 한 포도 식초에 관한 것으로서, 기존의 포도 식초보다 당도가 더 높으면서 폴리페놀류 화합물의 함량은 더 높아서 기호성 뿐만 아니라 기능성의 측면에서 모두 우수한 포도 식초에 관한 것이다.

본 발명의 식초는 천연발효식초로서, 알콜발효 단계와 초산발효 단계를 거쳐서 제조되며, 구체적으로는 다음과 같은 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되며, 개략적인 제조 공정도를 도 1에 나타내었다.

1) 유기농 포도의 포도즙을 준비하는 단계;

2) 포도즙을 저온에서 숙성하는 단계;

3) 숙성한 포도즙을 농축하여 당도를 높이는 단계;

4) 효모(Saccharromyces ellipsoideus)를 접종하여 알콜발효를 실행하는 단계;

5) 초산균(Acetobacter aceti)을 접종하여 초산발효를 실행하는 단계; 및

6) 여과하여 식초를 수득하는 단계.

본 발명에서는 양질의 포도 식초를 제공하기 위하여, 유기농 재배법으로 생산된 당도가 높은 포도를 선정하여 포도즙을 제조한다. 보다 구체적으로, 본 발명에서는 포도의 종류로서 마스캇 베리에이, 거봉, 세네카 및 캠벨 어얼리를 이용하며, 이들 포도를 50:30:10:10의 중량비율로 혼합하여 포도즙을 제조한다. 포도즙 제조에는 포도의 껍질과 포도씨도 모두 포함한다. 또한, 본 발명에서 이용하는 각 종류의 포도의 당도는 마스캇 베리에이(머루포도) 17~19Brix, 거봉 17~18 Brix, 세네카(청포도) 17~19 Brix, 캠벨 어얼리 14~15 Brix임이 바람직하다. 포도즙의 제조방법으로는 특별히 제한되지는 않으며, 일반적인 과즙 제조방법을 이용할 수 있다.

제조한 포도즙은 함유되어 있는 주석산을 제거하기 위하여 숙성 과정을 거치게 된다. 이는 주석산이 유통과정에서 침전물을 형성하게 되어 음용하는데 문제점을 야기하기 때문이다. 상기 포도즙의 숙성 과정은 주석산이 충분히 침전될 수 있는 기간 동안 이루어지며, 이에 제한되는 것은 아니지만 바람직하게는 20~35일간, 보다 바람직하게는 30일 동안 이루어진다. 또한, 숙성은 포도즙의 맛과 향을 유지하고 변질을 방지할 수 있는데 적당한 저온에서 이루어지며, 이에 제한되는 것은 아니지만 바람직하게는 4℃ 이하, 바람직하게는 0℃에서 이루어진다.

숙성 과정을 거친 후, 최종 생성되는 포도 식초의 당도를 높이기 위하여 숙성한 포도즙을 농축하여 당도가 24 Brix 이상이 되게 한다.

그 다음 알콜발효를 진행시키는데, 포도에 자연적으로 서식하는 잡균의 생성을 억제하고, 단기간에 효과적으로 알콜발효물을 제조하기 위하여 효모(Saccharromyces ellipsoideus)를 활용하며, 발효 후의 알콜농도가 6.2~6.5%가 되도록 발효시킨다. 이 때 효모는 알콜발효용 포도즙 1mL 당 10⁴CFU/mL의 농도로 접종하며, 25~30℃에서, 바람직하게는 26℃에서 4~6일 동안, 바람직하게는 6일 동안 배양한다.

초산발효를 진행하기 전에, 기능성 물질 고함유 발효물을 얻기 위하여, 레스베라트롤, 퀘르세틴 및 캄페롤이 다량 함유되어 있는 캠벨 어얼리 송이가지와 잎의 추출물을 첨가하여 최종 알콜 농도가 7%가 되도록 적정한다. 이 때, 레스베라트롤, 퀘르세틴 및 캄페롤 등은 알콜에 가용성이므로, 알콜농도가 높은 에탄올을 사용하는 것이 바람직하지만, 기타 플라보노이드 계열의 다른 화합물도 추출될 수 있도록 수분이 첨가된 에탄올을 사용하여 포도 송이가지와 잎의 추출물을 얻을 수 있으며, 바람직하게는 50~80%, 보다 바람직하게는 80%의 에탄올을 사용할 수 있다. 또한, 상기 포도 송이가지와 잎 추출물의 제조는 상온, 보다 바람직하게는 18~22℃의 온도에서 실시하는 것이 좋다.

그 다음, 초산발효를 위하여, 초산균(Acetobacter aceti)을 알콜발효액 1mL 당 10⁴CFU의 농도로 접종하고, 쉐이커 배양기를 이용하여 잘 교반되도록 하여 20~25℃에서, 바람직하게는 25℃에서 15~21일 동안, 바람직하게는 15일 동안 배양하여 초산발효를 한다. 그 다음 제조된 포도 식초의 감미를 증진시키기 위하여, 캠벨 어얼리를 제외한 포도즙 혼합물을 첨가한다. 상기 포도즙 혼합물은 바람직하게 마스캇 베리에이, 거봉 및 세네카를 이용하며, 이들 포도를 50:40:10의 중량비율로 혼합하여 제조한 것이다. 포도즙 혼합물의 첨가 후, 혼합된 발효물을 여과함으로써(예를 들어, 1μm 카터리지 필터를 이용) 맑은 포도 식초를 수득한다. 이렇게 얻은 식초는 당도가 4 Brix 이상 10 Brix 이하이고 pH는 4.0~4.5, 바람직하게는 pH 4.5가 된다.

상기 방법으로 제조한 포도 식초는 기호성의 증진을 위하여, 당업계에서 통상적으로 사용하는 식품 첨가제 등을 추가적으로 첨가함으로써 감미를 조정할 수 있다.

상기한 방법으로 제조한 본 발명의 포도 식초는 기존의 포도 식초와 비교하여 당도가 높아서 기호성이 우수하며, 섭취가 보다 용이하게 이루어질 수 있게 할 수 있다. 또한, 기존에는 포도 식초의 제조시 주로 포도 과육, 껍질 및 씨를 이용하였지만, 본 발명의 포도 식초 제조방법은 기존에 이용하지 않았던 레스베라트롤이 다량 함유되어 있는 포도 송이가지와 잎도 함께 이용함으로써 기능성 성분의 함량을 높이고, 버려지는 부분을 최소화시켜 포도 원료를 보다 효율적으로 사용할 수 있게 한다.

또한, 본 발명은 포도 식초를 함유하여 항암 또는 암 예방 효과가 있는 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 이에 제한되는 것은 아니지만, 결장암, 방광암, 직장암, 유방암, 간암, 위암 등의 암 세포에 효과적으로 작용한다. 상기 조성물은 본 발명에 따른 포도 식초를 조성물 총 중량에 대하여 0.5~30중량%의 양으로 함유할 수 있으며, 제형, 사용방법 및 사용목적에 따라서 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 인간을 포함한 동물에 적용될 수 있으며, 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 경로로 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물의 투여량은 투여방법, 복용자의 연령, 성별, 환자의 중증도, 상태, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 병용되는 약물을 고려하여 결정할 수 있으며, 예를 들어 이에 한정되는 것은 아니지만 1일 유효성분을 기준으로 하였을 때 0.1mg/kg(체중) 내지 500mg/kg(체중)의 양으로, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다.

또한, 본 발명은 포도 식초를 함유하여 항암 또는 암 예방 효과가 있는 식품 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 본 발명에 따른 포도 식초를 조성물 총 중량에 대하여 0.5~30중량%의 양으로 함유할 수 있으며, 제형, 사용방법 및 사용목적에 따라서 통상적으로 사용하는 담체, 부형제 또는 희석제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물의 예로는 식품, 식품첨가제, 음료 또는 음료첨가제를 들 수 있으며, 예를 들어, 이에 한정되는 것은 아니지만 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본 발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영아식 또는 유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실,채소류 음료, 두유류, 발효음료류, 아이스크림류 등), 천연조미료, 비타민 복합제, 알코올 음료, 주류 및 그 밖의 건강보조식품류를 포함한다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.

이하, 본 발명의 내용을 실시예 및 시험예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니고, 당업계에서 통상적으로 주지된 변형, 치환 및 삽입 등을 수행할 수 있으며, 이에 대한 것도 본 발명의 범위에 포함된다.

[참고예 1] 재료

1. 포도

캠벨 어얼리, 마스캇 베리에이, 거봉 및 세네카 등 포도는 2012년 8~9월에 본 출원인(한스올가닉 농장, 정읍시, 전북, 대한민국)이 유기농법으로 재배한 포도를 포도즙 재료로 사용하였다.

2. 포도 송이가지와 잎

본 출원인인 한스올가닉에서 생산된 포도잎은 2012년 6~7월 사이에 포도 순따기로 채취하였으며, 포도 송이가지는 2012년 9월에 포도즙을 만들기 위해서 필요한 포도를 제외한 부산물을 사용하였다.

3. 알콜 및 초산발효 균주

효모균주인 싸카로마이세스 엘립소이데우스(Saccharromyces ellipsoideus)와 초산균인 아세토박터 아세티(Acetobacter aceti)는 생명자원센터(대전, 대한민국)로부터 구입하였다. 싸카로마이세스 엘립소이데우스는 YM 배지(증류수 1L 당 3g 효모 추출물, 3g 맥아 추출물, 5g 펩톤, 및 10g 덱스트로스 함유)를 사용하여 배양하였고, 아세토박터 아세티는 YPM 배지(증류수 1L당 5g 효모 추출물, 3g 펩톤, 및 25g 매니톨을 함유)를 사용하여 배양하였으며, 각각 26℃ 조건하에서 충분이 배양하여 알콜발효와 초산발효의 균주로서 사용하였다.

[참고예 2] 포도 식초의 제조

1. 포도 잎과 송이가지의 에탄올 추출물 제조

채취한 포도 잎과 송이가지를 수돗물에 잘 세척하고 증류수에 최종적으로 10분간 침지시킨 후 물기를 제거하고 25~30℃에서 잘 건조시켰다. 건조된 잎과 송이가지는 잘게 마쇄하여 각각 500g씩 정량하여 80% 에탄올(순도 99%, 머크사, 독일) 5,000mL에서 7일간 침지하여 추출물을 제조하였다. 제조한 에탄올 추출물은 함량을 측정하기 위해서 각각 500mL을 취하여 감압으로 농축하여 최종적으로 70℃ 동결건조기를 활용하여 사용하였으며, 나머지 용액은 초산발효시 에탄올 농도와 기능성 성분의 함유를 위하여 사용하였다.

2. 포도즙의 제조

수확한 포도는 수돗물을 활용하여 잘 세척한 후 물을 충분히 제거한 다음 제경기를 사용하여 송이가지로부터 포도알을 분리하였다. 알콜발효와 초산발효 후 원료로 사용하기 위한 포도 품종의 배합은 표 1에 나타내었다.

품종	배합비율(%)
품종	알콜발효용	초산발효후 첨가용
마스캇 베리에이	50	50
거봉	30	40
세네카	10	10
캠벨 어얼리	10	-

분리 배합한 포도알은 과즙은 물론 기능성 물질이 함유된 껍질과 씨가 잘게 부숴지도록 마쇄기를 활용하였으며, 혼합액은 스팀탱크내에서 75℃에서 2시간 동안 저온 살균하면서 혼합액 중의 씨와 껍질의 성분이 충분히 추출되게 하였다. 가열한 혼합액은 필터프레스로(1000mesh포)로 압착하여 알콜발효의 원료인 포도즙을 제조하였다. 제조한 포도즙은 살균한 20~200L의 저장용기에 위생적으로 담아 패킹하였으며, 저장용기를 0℃의 저온 창고에서 30일가량 숙성하였다. 숙성한 포도즙은 1μm 카터리지 필터를 활용하여 여과하였으며, 포도즙을 80℃에서 30분 살균하여 저온 창고에서 보관하면서 알콜발효 원료로 사용하였다.

3. 알콜발효

알콜발효용 포도즙의 당도를 높이기 위하여 당도가 24Brix가 되도록 농축하여 농축액에 농축액 1mL 당 10⁴CFU/mL의 농도로 싸카로마이세스 엘립소이데우스를 접종하고 26℃에서 약 6일간 배양하여 알콜 농도가 6.2~6.4%에 도달되도록 한 다음, 최종 알콜발효액 10L을 얻었으며, 이를 초산발효 원료로 사용하였다. 당도의 측정은 당도계(ATAGO, 일본)을 활용하였고, 알콜농도의 측정은 에탄올 분석 키트(abcam, UK)를 활용하여 측정하였다.

4. 초산발효

상기에서 얻어진 알콜발효액 1L에 송이가지와 잎 에탄올 추출액(상기 1.에서 제조한 원 추출액의 부피를 1/3로 농축하여 사용)을 1:1의 비율로 조정하고 1%, 2.5%, 5%, 10% 등 4가지로 구분하여 알콜발효액 1mL 당 10⁴CFU/mL의 농도로 아세토박터 아세티를 접종하고 25℃ 쉐이킹 인큐베이터에서 pH 4.5가 되도록 약 15일간 배양하였다. 산의 농도는 M530p pH meter(Nova Analytics사, 미국)를 사용하여 측정하였다.

[시험예 1] 품종별 유기농 포도의 당도 조사

본 발명의 실험에서 사용하는 품종별 유기농 포도의 당도를 알아보기 위하여 당도를 조사하였다. 당도의 측정은 당도계(ATAGO, 일본)을 사용하여 측정하였고, 측정 결과는 하기 표 2에 나타내었다.

품종	당도 Brix
마스캇 베리에이	17.5±2.3
거봉	18.2±1.7
세네카	15.5±1.2
캠벨 어얼리	14.3±1.1
혼합포도액¹ ⁾	17.1±2.6

¹⁾표 1과 같은 비율로 조성된 혼합 포도액

상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 마스캇 베리에이와 거봉의 당도가 다른 2가지 품종에 비하여 높았고 이들을 표 1에 제시한 비율로 혼합하였을 때 당도는 17.1±2.6 Brix로 조사되었다.

그러나 알콜발효를 효과적으로 수행하기 위해서는 당도를 높일 필요성이 있으나, 본 연구에서는 철저히 외부의 포도당이나 설탕을 첨가하지 않기 위해서 혼합포도액을 농축함으로써 당도가 24 Brix가 되도록 조정하였다.

[시험예 2] 레스베라트롤, 퀘르세틴 및 캄페롤의 함량 조사

일반적으로 포도의 껍질과 씨의 레스베라트롤, 퀘르세틴 및 캄페롤 함량이 품종별로 다르고 비교적 씨에 함량이 높지만 100g당 이들 폴리페놀류의 함량이 0.5~10mg(9) 불과하므로 껍질, 씨 및 포도즙 모두를 혼합하여 섭취한다 해도 기능을 발휘하는데 한계가 있다. 따라서 본 실험은 레스베라트롤, 퀘르세틴 및 캄페롤의 함량을 높이기 위하여 캠벨 어얼리 송이가지와 잎에서 에탄올로 상기 물질들을 추출하고 이 물질의 함량을 조사하였다.

우선, 캠벨 어얼리의 송이가지와 잎의 에탄올 추출물에 함유된 레스베라트롤, 퀘르세틴 및 캄페롤의 추출물 함량을 HPLC(Agilent 1200 series with MWD(Multi-Wavelength Detector)) 핑거프린팅 방법을 활용하여 측정하였으며, 레스베라트롤, 퀘르세틴 및 캄페롤 지표물질은 Sigma-Ardrich사(CA, USA)로부터 구입하여 활용하였다. 지표물질에 대하여 얻은 HPLC 핑거프린팅 결과는 도 2에 나타내었다.

도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 포도 송이가지와 잎 추출물에는 다량의 레스베라트롤, 퀘르세틴 및 캄페롤이 포함되어 있음을 알 수 있다.

그 다음, 캠벨 어얼리의 송이가지 및 잎 생중량 100g당 포함되어 있는 레스베라트롤, 퀘르세틴 및 캄페롤의 함량을 측정하였다. 그 결과는 하기 표 3에 나타내었다.

상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 레스베라트롤의 경우 송이가지가 잎보다 다소 높았지만 큰 차이가 없었다. 그러나 퀘르세틴 및 캄페롤의 함량은 잎에서 송이가지보다 그 함량이 높았다.

[시험예 3] 포도 송이가지와 잎의 에탄올 추출물의 첨가 비율에 따른 레스베라트롤, 퀘르세틴 및 캄페롤의 함량 조사

본 실험에서는 초산발효시에 첨가한 캠벨 어얼리의 송이가지와 잎의 에탄올 첨가 비율에 따른 레스베라트롤, 퀘르세틴 및 캄페롤의 함량 변화를 측정하였다. 상기 참고예 2의 4.에 기재한 바와 같이 알콜발효액 1L에 포도 송이가지와 잎 에탄올 추출액을 1:1의 비율로 조정하고 0%(알콜발효 원액), 1%, 2.5%, 5%, 10%로 함량을 변화시키면서 레스베라트롤, 퀘르세틴 및 캄페롤의 함량 변화를 측정하였으며, 그 결과는 하기 표 4에 나타내었다(단위: mg).

상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 대조군(첨가량 0%, 알콜발효 원액)의 레스베라트롤, 퀘르세틴 및 캄페롤 함량은 각각 0.171±0.002, 2.113±0.008 및 1.089±0.009로 매우 낮았다. 이는 알콜발효물의 경우 포도 씨와 껍질을 포함한 생과즙으로 이루어진 것으로서, 포도 씨와 껍질에 존재하는 레스베라트롤, 퀘르세틴 및 캄페롤의 함량이 상대적으로 낮기 때문이다.

그러나 실험군에서는 시료 100g 당 초산발효 시 캠벨 어얼리 송이가지와 잎의 추출물의 첨가 비율에 따라 레스베라트롤, 퀘르세틴 및 캄페롤 함량이 높아졌다. 이러한 결과는 레스베라트롤, 퀘르세틴 및 캄페롤 등의 폴리페놀 물질은 알콜발효 및 초산발효 과정에서도 안정하며, 캠벨 어얼리 송이가지와 잎의 추출물을 첨가함으로써 레스베라트롤, 퀘르세틴 및 캄페롤의 함량을 효과적으로 증가시킬 수 있음을 제시한다.

따라서 본 발명은 항암 효과를 발휘할 수 있는 양질의 기능성 식초를 제조하는 방법을 제공하는 한편, 특히 포도 송이가지와 잎은 포도재배과정과 가공과정에서 폐기되는 물질임을 감안할 때 산업적으로 포도 송이가지와 잎을 이용하여 고부가가치를 얻을 수 있는 매우 우수한 제조방법을 제공하는 것이다.

[시험예 4] 암세포주에서의 세포 독성 평가

본 실험은 항암 효과에 대한 지표물질의 효과를 알아보기 위하여 결장암 세포주에서 레스베라트롤, 퀘르세틴 및 캄페롤의 세포 독성 효과를 세포 생존율을 측정함으로써 확인하였다.

본 실험에서 사용된 암세포주인 결장암(CT-26) 세포는 American Type Culture Collection(ATCC, Rockville, MD, USA)으로부터 구입하였다. 세포는 10% 열처리된 소태아혈청(FBS)과 1% 페니실린/스트렙토마이신이 함유된 RPMI 1640 배지에서 충분히 배양한 후 웰 당 1×10⁴세포를 접종한 다음 실험군에는 레스베라트롤, 퀘르세틴 및 캄페롤(각각 50μM)을 처리하고, 대조군에는 아무것도 처리하지 않으며, 24시간 후에 MTT(디메틸티아졸-2-일-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드(Dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyltetrazolium bromide)) 법으로 세포생존율을 측정하였다. MTT용액(0.5mg/mL)을 웰 당 100μl를 첨가하고 다시 4시간 동안 배양하였다. 그 후 96웰 플레이트를 800rpm에서 3분간 원심시키고 100μL DMSO를 첨가하여 용해시킨 다음 MTT-포르마잔 생성물을 570nm에 흡수되는 빛의 양을 측정함으로써 결정하였다. 결과는 도 3에 나타내었다.

도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 레스베라트롤은 결장암 세포주에 대한 세포 독성 효과가 퀘르세틴과 캄페롤보다 우수하였다. 이러한 결과는 이전 연구자들의 보고(14)와 유사하였다.

따라서 본 연구에서는 항암 효과를 높이기 위해서 송이가지와 잎 에탄올 추출물을 1:1비율로 결정하였다.

그 다음, 캠벨 어얼리의 송이가지 및 잎 에탄올 추출물의 세포 독성 효과를 확인하였다. 이는 상기한 측정방법과 동일한 방법을 사용하였으며, 다만 실험군에 레스베라트롤, 퀘르세틴 및 캄페롤을 처리하는 대신 에탄올 추출물을 25μg/mL, 50μg/mL, 100μg/mL 및 200μg/mL으로 처리하였다. 결과는 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 포도 송이가지 및 잎 추출물의 암세포에 대한 독성이 추출물의 농도에 의존적으로 증가하였다. 그러나 송이가지 추출물과 잎 추출물 사이에는 유의한 세포 독성 차이가 없었다.

[시험예 5] 포도 송이가지와 잎의 에탄올 추출물의 첨가 비율에 따른 포도 식초의 암세포주에서의 세포 독성 평가

본 실험은 항암 효과에 대한 캠벨 어얼리 송이가지와 잎의 에탄올 추출물의 첨가 비율에 따른 포도 식초의 효과를 알아보기 위하여 결장암 세포주에서 세포 독성 효과를 세포 생존율을 측정함으로써 확인하였다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 100μg/mL의 캠벨 어얼리 송이가지와 잎의 추출물에서 유의한 암세포주 생존율 억제 효과를 보인 점을 감안하여 초산발효 시 1.0~10.0%의 농도로 캠벨 어얼리 송이가지와 잎의 추출물을 첨가하여 발효한 후 각 첨가군을 감압농축과 동결건조에 의한 추출물의 농도를 모두 100μg/mL로 고정하였다. 그리고, 실험군에 상기 캠벨 어얼리 송이가지와 잎의 추출물의 첨가 비율을 변화시켜 준비한 발효물의 동결건조물을 100μg/mL로 처리하는 것 이외에는 상기 시험예 4와 동일한 방법을 이용하여 1.0~10.0%첨가 비율에 따른 암세포주의 세포 독성을 조사하였다. 결과는 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 정상대조군에 비해서 송이가지 및 잎 무첨가 초산발효 추출물 대조군은 유의하게 세포 생존율이 억제되어 암세포 성장 억제에 효과적임을 알 수 있다. 또한, 1.0% 첨가 실험군에서는 무첨가 추출물 대조군에 비해서 차이가 없지만, 2.5% 첨가군부터는 농도에 의존적으로 암세포주 성장 억제에 대한 효과가 우수함을 확인할 수 있다.

[시험예 6] 암동물모델에서 식초 추출물의 항암 효과 평가

본 실험은 결장암 세포주을 활용하여 초산발효 시 캠벨 어얼리 송이가지와 잎의 추출물의 첨가 비율에 따른 초산발효 추출물의 종양매스 억제효과를 알아보았다.

암모델의 유도를 위하여 암컷 Balb/c계 마우스(6주령)를 중앙실험동물(주)(서울시, 대한민국)에서 구입하였고, 사료와 물을 충분히 공급하면서 1주일간 순화시킨 후 실험에 사용하였다. 사육환경은 낮과 밤의 주기를 12시간씩 하였고, 온도(20~22℃)와 습도(50~60%)는 일정하게 유지하였다. 암 모델을 확립하기 위하여 CT-26(2×10⁵)를 오른쪽 배 피하에 접종하고 사육하였다. 초산발효 시 캠벨 어얼리 송이가지와 잎의 추출물의 첨가 비율에 따른 포도 식초의 종양부피 억제효과를 알아보기 위하여 암세포를 접종하기 3일 전부터 송이가지와 잎 첨가 포도 식초(1.0-10%)를 하루에 1회씩 경구투여하였으며, 최종 종양메스는 암세포 접종 후 15일에 디지털 캘리퍼(Mitutoyo, Japan)를 사용하여 측정하였다. 결과는 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, CT-26을 접종한 정상 대조군의 경우 종양의 부피가 매우 증가하였으나, 무첨가 포도 식초 투여 대조군의 경우 유의하게 종양의 부피가 줄어드는 효과가 있었다. 또한, 1.0% 첨가 실험군에서는 무첨가 추출물 대조군에 비해서 차이가 없지만, 2.5% 첨가군부터는 농도에 의존적으로 암세포의 성장 억제에 대한 효과가 우수함을 확인할 수 있다.

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Claims

1) 유기농 포도의 포도즙을 준비하는 단계;
2) 포도즙을 저온에서 숙성하는 단계;
3) 숙성한 포도즙을 농축하여 당도를 높이는 단계;
4) 효모(Saccharromyces ellipsoideus)를 접종하여 알콜발효를 실행하는 단계;
5) 캠벨 어얼리 송이가지와 잎의 에탄올 추출물을 첨가하는 단계;
6) 초산균(Acetobacter aceti)을 접종하여 초산발효를 실행하는 단계; 및
7) 여과하여 식초를 수득하는 단계;
를 포함하는 포도 식초의 제조방법.

제1항에 있어서, 상기 유기농 포도는 마스캇 베리에이, 거봉, 세네카 및 캠벨 어얼리임을 특징으로 하는 포도 식초의 제조방법.

제2항에 있어서, 상기 마스캇 베리에이, 거봉, 세네카 및 캠벨 어얼리는 50:30:10:10의 중량비율로 사용됨을 특징으로 하는 포도 식초의 제조방법.

제1항에 있어서, 저온 숙성은 0℃에서 20~35일 동안 이루어짐을 특징으로 하는 포도 식초의 제조방법.

제1항에 있어서, 농축된 포도즙은 당도가 24 Brix 이상임을 특징으로 하는 포도 식초의 제조방법.

제1항에 있어서, 상기 알콜발효 후의 알콜농도는 6.2~6.5%임을 특징으로 하는 포도 식초의 제조방법.

제1항에 있어서, 상기 효모는 포도즙 1mL 당 10⁴CFU/mL의 농도로 접종되어, 4~6일 동안 25~30℃에서 배양됨을 특징으로 하는 포도 식초의 제조방법.

삭제

제1항에 있어서, 상기 에탄올 추출물의 첨가에 의하여 최종 알콜 농도를 7%로 적정함을 특징으로 하는 포도 식초의 제조방법.

제1항에 있어서, 상기 초산균(Acetobacter aceti)은 알콜발효액 1mL 당 10⁴CFU/mL의 농도로 접종되어, 15~21일 동안 20~25℃에서 배양함을 특징으로 하는 포도 식초의 제조방법.

제1항에 있어서, 상기 초산발효 후 마스캇 베리에이, 거봉 및 세네카의 포도즙 혼합물을 첨가함을 특징으로 하는 포도 식초의 제조방법.

제11항에 있어서, 상기 마스캇 베리에이, 거봉 및 세네카는 50:40:10의 중량비율로 사용됨을 특징으로 하는 포도 식초의 제조방법.

제1항에 있어서, 수득한 식초는 당도가 4 Brix 이상 10 Brix 이하이고, pH 4.0~4.5임을 특징으로 하는 포도 식초의 제조방법.

제1항 내지 제7항 및 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 포도 식초.

제14항의 포도 식초를 포함하는 포도 식초 조성물.

제15항에 있어서, 상기 포도 식초는 조성물 총 중량에 대하여 0.5~30중량%의 양으로 포함됨을 특징으로 하는 포도 식초 조성물.

제15항에 있어서, 상기 조성물은 결장암에 항암효과가 있음을 특징으로 하는 포도 식초 조성물.

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