KR101404036B1

KR101404036B1 - 망막질환 예방 및 치료에 유용한 이고들빼기 추출물

Info

Publication number: KR101404036B1
Application number: KR1020110101488A
Authority: KR
Inventors: 정상훈; 안홍열; 노주원; 이희주; 김철영; 판철호; 김경아
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2011-10-05
Filing date: 2011-10-05
Publication date: 2014-06-10
Also published as: KR20130037110A

Abstract

본 발명은 이고들빼기(Crepidiastrum denticulatum) 추출물을 유효성분으로 함유하는 망막질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 이고들빼기를 유기용매로 추출하여 제조되는 추출물을 포함하는 망막질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 망막 신경 세포의 퇴화를 보호해 주는 작용을 나타내므로 망막세포의 퇴화와 관련된 녹내장, 노인성황반변성 등 망막질환의 예방 또는 치료용 소재로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

망막질환 예방 및 치료에 유용한 이고들빼기 추출물 {Extract of Crepidiastrum denticulatum for prevention or treatment of retinal diseases}

본 발명은 국화과 식물인 이고들빼기(Crepidiastrum denticulatum)의 추출물을 망막질환 예방 및 치료를 위한 약학 조성물 또는 건강식품으로 이용하는 것에 관한 것이다.

세포자살(apoptosis)이란, 세포괴사(necrosis)와는 구별되는 세포 내의 자발적이고 계획된 세포사(programmed cell death)이고, 세포자살을 유발하는 다양한 기전들이 제시되어 왔다. 대표적인 유발인자로는 산화 스트레스(oxidative stress), 질소산화물 합성효소(nitric oxide synthase), 미토콘드리아(mitochondria)를 매개로 하는 케스페이즈 의존적(caspase-dependent) 또는 비의존적(caspase-independent) 기전 등이 있다. 특히 많은 안질환들이 특정 세포의 세포자살로 인해 발생하는 것으로 알려져 있으며, 그 대표적인 안질환으로는 연령 관련 황반 변성(age related macular degeneration) 및 녹내장(glaucoma)이 있다. 이러한 안질환의 억제 및 치료를 위하여 세포자살을 억제하거나 그 진행을 늦출 수 있는 약제에 대한 연구가 지속적으로 진행되고 있는 실정이다.

눈의 각막, 수정체(렌즈) 및 유리체 등은 혈관이 없는 부위이기 때문에, 여기에 영양분을 공급하고 노폐물을 운반하는 방수라고 하는 물이 존재하고 있다. 그런데 방수는 정상으로 나오는데 반해, 빠져나가는 부분이 망가지게 되면, 방수는 계속 나오기 때문에 눈의 압력은 올라가게 된다. 이렇듯 눈의 압력이 높아지게 되면, 많은 혈액을 공급받아야 하는 눈 속에 혈액이 들어오지 못하게 되며, 약한 부위인 시신경에 지속적인 압력이 가하게 되고, 지속적인 압력을 받은 시신경은 치명적인 손상을 입게 되어 시력 및 시야의 결손을 초래하게 된다. 녹내장(glaucoma)은 이러한 안압의 상승으로 인해 시신경이 눌리거나 혈액 공급에 장애가 생겨 시신경의 기능에 이상을 초래하게 되는 질환으로, 말기에는 시력을 상실하게 되는 심각한 질환이다. 이러한 녹내장은 40세 이상의 성인 가운데 0.5 내지 2%의 빈도로 발병하게 된다. 정상적인 안압이 15 내지 20 mmHg인데 반해, 녹내장이 진행되면 안압이 상승하면서 동공 안쪽이 녹색으로 보이게 된다.

현재 녹내장에 대한 치료는 녹내장의 가장 중요한 위험요소인 안압 상승을 약물이나 수술적인 방법을 이용하여 막는 것이 대부분으로, 녹내장은 완치될 수 없고 평생 약물, 레이저 치료, 수술 등의 방법으로 안압을 조절하여 시신경의 장애를 최소화하는 방법밖에 없다.

또한, 녹내장은 망막 신경 세포의 세포자살로 인한 시신경의 손상을 통해서 일어나게 되는데, 이러한 시신경의 손상은 특징적인 녹내장성 시야 손상을 동반한다. 녹내장에서 나타나는 망막 신경 세포의 세포사멸은 세포자살(apoptosis)로 알려져 있으며, 안압을 상승시킨 동물 모델뿐만 아니라 녹내장 환자의 사후 부검을 통해서도 녹내장 환자에서 망막 신경 세포의 세포자살이 관찰되었다 [Quigley HA et al., Invest Ophthalmol Vis Sci., 36, 774-786, 1995; Garcia-Valenzuela E et al., Exp Eye Res., 61, 33-44, 1995]. 세포 내에 세포사멸을 유도하는 기전과 억제하는 기전의 균형에 의하여 세포의 운명이 결정되는데, 녹내장에 있어서는 글루타메이트(glutamate), 사이토크롬 C(cytochrome C), 종양 괴사 인자-알파(TNF-α) 및 Bad(BCL2-antagonist of cell death) 단백질의 증가 또는 발현이 망막 신경 세포를 세포자살에 이르게 하는 것으로 알려져 있으며, 세포 내의 산화 스트레스(oxidative stress)도 녹내장의 중요한 원인으로 알려져 있다. 녹내장에서는 망막 신경 세포가 산화 스트레스를 받아 직접적으로 시신경을 손상에 이르게 할 뿐만 아니라, 방수 유출로를 구성하고 있는 섬유주 세포(trabecular meshwork cell)가 산화 스트레스를 받음으로써, 그 결과 섬유주 세포의 기능저하가 일어나게 되고, 궁극에는 세포자살이 일어나게 되어 안압이 상승하게 된다 [Sacca' SC et al, Arch Ophthalmol., 123, 458-463, 2005; Zhou L et al., J Cell Physiol., 180, 182-189, 1999]. 섬유주 세포의 기능저하는 세포가 고유하게 가지고 있는 방수를 흡수하는 음세포작용(pinocytosis)에 영향을 주게 되어 안압의 상승을 유발하는데, 특히 섬유주 세포의 기능저하가 안압 상승의 주원인으로 알려져 있는 원발성 폐쇄 각 녹내장(primary open angle glaucoma)환자들의 섬유주 세포가 산화 스트레스에 더 취약한 것으로 알려져 있다 [Izzotti A et al., Am. J. Med., 114, 638-646, 2003]. 상기 환자의 방수를 분석한 결과, 총항산화역량(total antioxidant potential)이 유의하게 정상인에 비하여 낮은 것으로 나타났고[Ferreira SM at al., Am J Ophthalmol., 137, 62-69, 2004], 혈장에 산화 스트레스를 조절하는 글루타치온-S-전이효소(Glutachione-S-Transferase)가 증가되어 있음이 관찰되었다 [Yang J et al., Invest Ophthalmol Vis Sci., 42, 1273-1276, 2001]. 또한 최근에는 원발성 개방 각 녹내장 환자들에 있어서 나타나는 섬유주 세포의 손상이 항산화제에 의하여 억제됨이 알려져 있다 [Yuan He et al., Invest Ophthalmol Vis Sci., 49, 1447-1458, 2008]. 이처럼 망막 신경 세포와 섬유주 세포의 세포 자살을 억제하고 상기 세포의 산화 스트레스를 억제하는 것이 새로운 접근방법으로 대두되고 있다.

한편, 이고들빼기(Crepidiastrum denticulatum)는 전국 각지의 산과 들에서 자라는 1 내지 2년생 식물이다. 생육환경은 반그늘 혹은 양지에서 자란다. 키는 30 내지 70 cm이고, 잎은 길이 6 내지 11 cm, 폭 3 내지 7 cm로 어긋나고 끝이 둔하며 불규칙한 톱니가 있다. 꽃은 황색이고 가지 끝과 원줄기 끝에 펼쳐지듯 달리며, 꽃줄기는 꽃이 필 때는 곧게 서지만 핀 다음에는 처진다. 열매는 10 내지 11월경에 맺고 길이는 0.3 내지 0.4 cm로 갈색 또는 흑색이며, 깃털은 백색으로 길이는 0.3 cm 정도이다.

현재까지 보고되어 있는 어떠한 문헌에서도, 이고들빼기 추출물이 망막 신경 세포를 보호하는 약효를 가지고 있음으로써 망막질환을 예방 또는 치료할 수 있는 용도로 사용됨에 대해서는 발표된 바가 없다.

본 발명자들은 한국의 자생 식물을 대상으로 망막 신경 세포 보호제를 검색하던 중, 이고들빼기의 추출물이 산화스트레스를 유도한 망막 신경 세포를 보호하여 세포사멸을 저해하고, 아포프토시스의 저해 효과를 나타내어, 산화스트레스를 유도한 망막 신경 세포의 퇴화로 인한 망막질환의 예방 및 치료를 목적으로 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 망막 신경 세포와 섬유주 세포의 세포사멸 및 산화 스트레스를 저해하는 활성이 우수한 이고들빼기(Crepidiastrum denticulatum)의 추출물을 제공하는데 있다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 이고들빼기(Crepidiastrum denticulatum)의 추출물을 유효성분으로 함유하는 망막질환 예방 및 치료용 조성물을 그 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 이고들빼기(Crepidiastrum denticulatum)의 추출물을 유효성분으로 함유하는 망막질환 예방 및 개선용 건강식품을 그 특징으로 한다.

본 발명의 이고들빼기(Crepidiastrum denticulatum)의 추출물은 산화스트레스로부터 유도한 망막 신경 세포의 퇴화를 보호하는 효과를 나타낸다.

따라서, 이고들빼기(Crepidiastrum denticulatum)의 추출물은 노인성 황반변성, 녹내장 등 망막질환의 예방 및 치료제 또는 기능성 식품 및 의약품 소재로 유용하다.

도 1은 망막 신경 세포 RGC-5에 이고들빼기 추출물을 전처리하고, 산화스트레스를 유도한 다음, 세포생존율을 확인하는 MTT 방법을 수행하여, 산화스트레스에 의한 세포사멸에 대하여 이고들빼기의 망막신경절 세포의 보호효과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 망막 신경 세포 RGC-5에 이고들빼기 추출물을 전처리하고, 산화스트레스를 유도한 다음, Hoechst 33342 및 프로피디움 요오드화물을 이용한 이중 염색 후, 이를 형광 현미경을 통해 확인한 사진이다.
A: 대조군,
B: 0.5 mM BSO와 10 mM 글루타메이트만 처리한 그룹,
C: 양성 대조군으로서 N-아세틸-L-시스테인 1 mM을 전처리 후 0.5 mM BSO와 10 mM 글루타메이트를 처리한 그룹,
D, E, F: 각각 10, 1, 0.1 μg/mL의 이고들빼기 추출물을 전처리 하고 0.5 mM BSO와 10 mM 글루타메이트를 처리한 그룹.
도 3은 망막 신경 세포 RGC-5에 이고들빼기 추출물을 전처리하고, 산화 라디칼에 의한 세포의 활성산소의 생성변화를 나타낸 그래프이다.
도 4는 망막 신경 세포 RGC-5에 이고들빼기 추출물을 전처리하고, 산화 스트레스를 유도하여 세포내의 활성산소의 생성변화를 DHE(Dihydroethidium)로 염색한후 이를 Confocal 현미경으로 확인한 사진과 이의 정량 그래프이다.
도 5는 망막 신경 세포 RGC-5에 이고들빼기 추출물을 전처리하고, SNP (sodium nitroprusside)로 유도한 지질과산화의 저해효과를 나타낸 표이다.
도 6은 망막 신경 세포 RGC-5에 이고들빼기 추출물을 전처리하고, 산화스트레스를 유도하여 세포사멸 관련 단백질 발현을 측정한 그림이다.
도 7은 망막 신경 세포 RGC-5에 이고들빼기 추출물을 전처리하고, 산화스트레스를 유도하여 항산화 관련 단백질 발현을 측정한 그림이다.
도 8은 이고들빼기 추출물을 전처리하고 N-메틸-D-아스파테이트(NMDA)로 유도한 흰쥐의 망막세포 사멸을 저해하는 효과를 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin)으로 염색한 망막의 단면을 나타낸 그림이다.
도 9는 이고들빼기 추출물을 전처리하고 N-메틸-D-아스파테이트(NMDA)로 유도한 흰쥐의 망막세포 사멸을 저해하는 효과를 TUNEL로 염색한 망막의 단면을 나타낸 그림이다.

본 발명은 이고들빼기(Crepidiastrum denticulatum)의 추출물을 유효성분으로 함유하는 망막질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 이고들빼기의 추출물은 통상의 천연물 추출방법으로 제조되며, 본 발명은 추출방법에 특별한 제한을 두지는 않는다.

본 발명의 이고들빼기 추출물의 대표적인 제조방법은 하기와 같은 단계를 포함한다:

1) 건조한 이고들빼기(Crepidiastrum denticulatum)를 추출용매로 추출하는 단계;

2) 단계 1)의 추출물을 여과하는 단계; 및

3) 단계 2)의 여과한 추출물을 감압 농축하여 추출물을 제조하는 단계; 및 4) 단계 3)의 추출물을 추가적으로 유기용매로 추출하여 분획물을 제조하는 단계.

상기 추출에 사용되는 이고들빼기(Crepidiastrum denticulatum)는 농가에서 재배한 것, 산들에서 채취한 것 또는 시판되는 것 등 제한 없이 사용될 수 있다. 상기 이고들빼기는 식물 전체를 이용할 수 있고, 잎, 줄기 또는 뿌리를 부분적으로 이용할 수도 있으며, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 추출 용매는 물, 알코올, 아세톤 또는 이들의 혼합물이 사용되며, 바람직하게는 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들 알코올의 혼합물 또는 이들 알코올의 수용액을 사용하며, 더욱 바람직하게는 메탄올, 에탄올, 또는 이의 수용액을 사용하는 것이며, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 추출 용매의 양은 이고들빼기 건조 중량의 1 내지 20배 범위로 함이 바람직하고, 5 내지 10배 범위로 하는 것이 더 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 추출 방법은 열수추출, 침지 추출, 환류 냉각 추출 및 초음파 추출 등의 추출 방법을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 초음파 추출방법으로 1회 내지 5회 추출될 수 있다. 추출시 온도는 10℃ 내지 100℃ 인 것이 바람직하며, 상온인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 추출 시간은 1일 내지 7일인 것이 바람직하고, 3일 내지 7일인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 추출에서는 초임계추출, 아임계추출, 고온추출, 고압추출 또는 초음파추출법 등에 이용되는 추출장치를 이용한 방법 또는 XAD 및 HP-20을 포함한 흡착 수지를 이용하는 방법 등 당업계의 통상적인 추출방법을 사용할 수 있으며, 가온하며 환류 추출 또는 상온에서 추출하는 것이 바람직하나, 이에 한정하는 것은 아니다. 상기 추출 회수는 1 내지 5회인 것이 바람직하며, 3회 반복 추출하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 추출 또는 분획 후에 이루어지는 감압 농축은 진공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조, 상온건조 또는 동결건조할 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

상기 분획물 제조에 이용되는 유기용매는 노르말-헥산, 염화 메틸렌, 에틸아세테이트 또는 노르말-부탄올이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. 상기 분획물은 이고들빼기 추출물을 물에 현탁시킨 후 노르말-헥산, 염화 메틸렌, 에틸아세테이트, 노르말-부탄올 및 물로 순차적으로 계통 분획하여 수득한 노르말-헥산 분획물, 염화 메틸렌 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 노르말-부탄올 분획물 또는 물 분획물 중 어느 하나인 것이 바람직하며, 에틸아세테이트 분획물임이 더욱 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. 상기 분획물은 상기 이고들빼기 추출물로부터 분획 과정을 1 내지 5회, 바람직하게는 3회 반복하여 수득할 수 있고, 분획 후 감압 농축하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 건조된 이고들빼기를 적당한 크기로 분쇄하여 추출용기에 넣고 에탄올 수용액을 가하여 실온에서 방치한 후, 거름종이로 여과한 휘, 여과액을 농출 및 동결건조하여 추출물을 얻었고, 상기 이고들빼기 추출물을 분별깔때기를 이용하여, 노르말-헥산, 염화 메틸렌, 에틸아세테이트, 노르말-부탄올 및 물 분획물로 순차적으로 계통분석하여 이고들빼기 분획물을 제조하였다.

상기 제조된 이고들빼기 추출물의 망막 신경 세포(RGC-5)의 보호 효과를 측정하기 위하여, 세포 배양한 후, 이고들빼기 추출물을 농도별로 전 처리한 후, 내인성 산화스트레스를 유도하는 0.5 mM BSO와 10 mM 글루타메이트를 37℃에서 24시간 동안 처리한 다음, 세포의 생존율을 확인하기 위해 MTT 방법을 수행하였다. 그 결과, 망막 신경 세포 RGC-5에서 과산화수소에 의해 산화스트레스가 유도되었을 때, 상기 이고들빼기 추출물을 전 처리한 경우 0.5 mM BSO와 10 mM 글루타메이트만 처리한 군에 비교하여 높은 세포 생존율을 나타내었다 [도 1 참조].

이로써, 본 발명의 이고들빼기 추출물은 망막 신경 세포의 세포사멸을 일으키는 산화스트레스에 있어서, 세포 사멸 보호 효과를 가지고 있음을 확인하였다.

또한, 이고들빼기 추출물이 망막 신경 세포(RGC-5)의 세포사멸을 억제하는지 확인하기 위하여, 막 투과성이 있어 살아있는 세포나 죽어있는 세포를 파란색으로 염색시키는 훽스트(Hoechst) 33342와 막 투과성이 없어 죽어있는 세포에만 염색이 되는 프로피디움 요오드화물(propidium iodide, PI)을 사용하여 산화스트레스에 의한 세포사멸을 분석하였다. 그 결과, 망막 신경 세포 RGC-5에 0.5 mM BSO와 10 mM 글루타메이트 처리에 의하여 유도된 세포 사멸에서, 이고들빼기 추출물을 전 처리한 경우, 0.5 mM BSO와 10 mM 글루타메이트만 처리한 군과 비교하여 세포사멸에 의해 염색되는 프로피디움 요오드화물에 의한 형광 적색 표지가 농도 의존적으로 감소함을 확인하였다 [도 2 참조].

또한, 이고들빼기 추출물의 망막 신경 세포(RGC-5)에서 활성산소(Reactive Oxygen Species) 발생을 억제시키는지 확인하기 위해, 활성산소에 해당하는 H₂O₂ 라디칼, OH^-.라디칼 및 O₂ ^-.라디칼을 유도하였고, 그 결과 이고들빼기 추출물은 유의적으로 활성산소 발생을 억제하는 것을 확인하였다 [도 3 참조].

또한, 이고들빼기 추출물이 망막 신경 세포(RGC-5)의 세포사멸을 억제하는지 확인하기 위하여, 막 투과성이 있고 활성산소를 함유하는 세포를 붉은색으로 염색 시키는 DHE(Dihydroethidium)을 사용하여 산화스트레스에 세포내 활성 산소 발생 정도를 분석하였다. 그 결과, 망막 신경 세포 RGC-5에 0.5 mM BSO와 10 mM 글루타메이트 처리에 의하여 유도된 세포 사멸에서, 이고들빼기 추출물을 전 처리한 경우, 0.5 mM BSO와 10 mM 글루타메이트만 처리한 군과 비교하였을 때, 활성산소 발생에 의해 염색되는 DHE(Dihydroethidium)에 의한 형광 적색 표지가 농도 의존적으로 감소함을 확인하였다 [도 4 참조].

따라서, 이고들빼기 추출물은, 산화스트레스에 의한 망막 신경 세포의 세포사멸을 억제하는 효과를 가지고 있음을 확인하였다.

또한, 이고들빼기 추출물의 지질과산화 저해효과를 측정하기 위하여, SNP (sodium nitropurrusid)로 유도한 흰쥐 뇌의 지질과산화양을 TBARS 분석법(thiobarbituric acid reactive substances assay method)으로 측정하였다. 이고들빼기 추출물로 전 처리한 경우, 지질과산화를 농도 의존적으로 감소시켰다 [도 5 참조].

따라서, 이고들빼기 추출물은 지질과산화를 억제함을 확인하였다.

또한 산화스트레스로부터 유도한 세포사멸 및 항산화 관련 단백질의 발현을 확인하기 위하여 웨스턴 블롯팅 어세이를 수행하였다. 이고들빼기 추출물을 전 처리한 경우, 세포사멸 관련 단백질의 발현을 억제시키고, 항산화단백질의 발현을 증가시켰다 [도 6 및 도 7 참조].

또한, 조직학적으로 NMDA로 유도한 흰쥐의 망막의 두께변화를 확인하기 위해 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin)으로 염색하여 망막의 단면을 관찰하였다. 이고들빼기추출물을 전 처리한 경우, 망막의 신경절 세포층(GL)와 속핵층(INL)의 얇아짐을 억제하는 것을 확인하였다 [도 8 참조].

또한, NMDA로 유도한 아포프토시스에 의한 흰쥐의 망막세포 사멸을 TUNEL 염색법을 사용하여 측정하였다. 이고들빼기 추출물을 전 처리했을 때, 아포프토시스에 의한 세포사멸을 억제하는 것을 확인하였다 [도 9 참조].

한편, 본 발명에서는 이고들빼기 추출물이 산화스트레스를 유도한 망막 신경 세포를 보호하고 세포사멸을 저해하며, 아포프토시스의 저해 효과를 나타내어, 망막 신경 세포의 퇴화로 인한 망막 질환의 예방 및 치료용 식, 의약품으로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 이고들빼기의 추출물을 유효성분으로 함유하는 망막질환 예방 및 치료용 식, 의약품용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물 중에 포함되는 유효성분으로서 이고들빼기 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 50 중량%로 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 조성물은 약제의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태, 체중, 연령, 성별, 식이, 배설율, 질환의 중증도, 약물형태, 투여시간, 투여방법, 투여경로 및 투여기간 등에 따라 그 범위가 다양하다. 1일 투여량은 본 발명에 따른 이고들빼기 추출물을 동결 건조하였을 때의 양으로 0.0001 내지 500 ㎎/㎏, 바람직하게는 0.001 내지 100 ㎎/㎏이며, 필요에 따라 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.

본 발명의 조성물을 식품에 적용함에 있어, 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 본 발명의 조성물이 첨가될 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 비스켓, 떡, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강 식품을 모두 포함한다.

본 발명의 이고들빼기 추출물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강기능식품 중의 상기 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 90 중량%로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

그 밖에도 본 발명의 이고들빼기의 추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에도 본 발명의 이고들빼기의 추출물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만, 본 발명의 이고들빼기의 추출물이 첨가제로서 전체 중량을 기준으로 0.1 내지 20 중량%의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이상에서 설명한 바와 같은 본 발명은 하기의 실시예, 실험예 및 제제예에 의해 상세히 설명한다. 단 하기 실시예, 실험예 및 제제예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 실험예 및 제제예에 의해 한정되지 않는다.

[실시예]

실시예. 이고들빼기 추출물의 제조

이고들빼기(Crepidiastrum denticulatum)는 4월 중순(어린순)과 8월 중순(성체)에 강원도 평창 등지에서 채집하였다. 건조된 이고들빼기를 세절한 후 180 g에 2 L의 에탄올을 가하고 3시간동안 가온 환류 추출한 후 추출액을 여과하였다. 추출액을 여과한 후 남은 잔사에 다시 2 L의 에탄올을 가하고 3시간동안 가온 환류 추출하는 방법을 추가로 2회 반복하여 총 추출액 6 L를 수득하였다. 상기 추출액 6 L를 35 ℃에서 감압 농축하여 에탄올 추출물 8.5 g을 수득하였다. 상다. 상기 추출물은 디메틸설폭사이드(DMSO)에 녹인 후, 하기 실험예에서 시료(시료명 D043)로 사용하였다.

[실험예]

실험예 1. 이고들빼기 추출물의 망막 신경 세포(RGC-5) 보호 효과 측정

망막신경절세포(RGC-5)는 Alcon Research, Ltd에서 무상으로 제공받았으며, 10% 우태아 혈청(FBS)과 100 U/mL 페니실린/스트렙토마이신을 포함 한 DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium, Hyclone, USA)를 사용하였다. 75-T 조직배양 플라스크에 37℃에서 5% CO₂, 95% 공기 및 포화 습도하의 항온기에서 배양하였다. 2 내지 3일 후 포화 상태로 자란 세포는 트립신(Trypsin-EDTA) 용액을 사용하여 플라스크로부터 떼어낸 후 계대 배양하였다. 세포를 96웰 배양접시에 분주한 후 24시간 동안 항온기에 넣어 세포를 부착시킨 후 배지를 제거하고, 1%의 저농도 우태아 혈청(FBS)이 포함된 DMEM 배지로 교환하였다. 시료를 산화스트레스를 가하기 1시간 전에 최종농도가 10, 5, 1, 0.1 μg/mL 되게 전 처리 하였다. 0.5 mM BSO와 10 mM glutamate를 37℃에서 24시간 동안 처리 후, 세포 생존율을 확인할 수 있는 간단한 방법으로 세포의 미토콘드리아 탈수소효소(mitochondrial dehydrogenase)에 의해 테트라졸리움 염(tetrazolium salt)인 MTT가 불용성 포마잔(formazan crystal)으로 변화되는 것을 이용한 MTT 방법을 통하여 망막신경절세포의 생존율을 측정하였다.

구체적으로, MTT 방법을 수행하기 위하여, 상기 RGC-5 세포의 처리한 배지를 제거하고 각 웰당 최종농도가 0.5 mg/mL가 되게 MTT 용액을 가한 후 1시간 동안 항온기에 넣어 반응 시켰다. 이후, 각 웰당 디메틸술폭시드(DMSO)를 100 μL씩 처리하고 15분간 흔든 후, 시너지 HT 마이크로플레이트 분석기[Synergy HT Multi-microplate reader(Bio-Tek instruments, Winooski, VT, U.S.A)]로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 망막 신경 세포 RGC-5에서 0.5 mM BSO와 10 mM 글루타메이트 처리에 의해 산화스트레스가 유도된 경우, 이고들빼기 추출물(시료명 D043)은 0.5 mM BSO와 10 mM 글루타메이트만 처리한 군에 비하여, 유의적인 세포 생존율을 보였다 [도 1].

따라서, 이고들빼기 추출물은 산화스트레스로부터 망막 신경 세포를 보호하는 효과를 나타냄을 확인하였다.

실험예 2. 이고들빼기의 망막 신경 세포(RGC-5)의 세포사멸 저해 효과 측정

이고들빼기 추출물이 망막 신경 세포(RGC-5)의 세포사멸을 저해하는지 확인하기 위하여, 살아있거나 죽은 세포, 즉 전체 세포를 파란색으로 염색하는 훽스트(Hoechst) 33342와 죽은 세포를 빨간색으로 염색하는 프로피디움 요오드화물(propidium iodide, PI)을 이용하여 이중으로 염색한 후 세포분석을 수행하였다.

구체적으로, 세포를 96 웰 배양 접시에 분주하여 부착시킨 후 배지를 저농도의 1% 우태아혈청(FBS)으로 교환하고 이고들빼기 추출물(시료명 D043)을 그 최종농도가 10, 1, 0.1 μg/mL 되게 1시간 동안 전 처리하였다. 이후, 0.5 mM BSO와 10 mM 글루타메이트를 37℃에서 24시간 동안 처리 후, 세포를 차가운 D-PBS로 세척하고, 최종농도가 8 μM의 훽스트(Hoechst) 33342와 1.5 μM의 PI를 세포에 첨가하여 15분간 37℃에서 염색시킨 후, 형광 현미경(fluorescence microscope)을 사용하여 가시화하였다 [도 2].

그 결과, 망막 신경 세포 RGC-5에서 0.5 mM BSO와 10 mM 글루타메이트에 의해 유도된 산화스트레스에 의한 세포 사멸에서, 이고들빼기 추출물으로 전 처리 한 경우 0.5 mM BSO와 10 mM 글루타메이트만 처리한 경우와 비교하였을 때, 세포사멸을 나타내는 프로피디움 요오드화물에 의한 형광 적색 표지가 감소함을 확인하였다[도 2].

따라서, 이고들빼기 추출물은 산화스트레스에 의한 망막 신경 세포의 세포사멸을 저해하는 효과를 나타냄을 확인하였다.

실험예 3. 이고들빼기 추출물의 망막 신경 세포(RGC-5)에서 활성산소(Reactive Oxygen Species) 억제 효과 측정

이고들빼기 추출물의 망막 신경 세포(RGC-5)에서 활성산소 저해효과를 측정하였다. 활성산소종의 생성은 2',7'-디클로로플루오레신 디아세테이트(DCFH-DA, Sigma, USA)가 세포 내로 들어가 활성산소종에 의하여 형광물질인 디클로로플루오레신(DCF)으로 산화되는 것을 이용한 DCFH-DA 분석법으로 조사하였다.

구체적으로, 96 웰 배양접시에서 5.0×10³cells/well의 농도로 세포를 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 1% 우태아혈청(FBS)이 포함된 DMEM 배지로 교환하여 1시간동안 약물을 처리 한 후 10 μM의 DCFH-DA를 15분간 처리하였다. 배지를 제거하고 각각의 활성 산소종인 과산화수소(H₂O₂), 하이드록실 라디칼(OH^-.), 슈퍼옥사이드 라디칼(O₂ ^-.)를 유도하기 위하여 1 mM H₂O₂(H₂O₂ radical), 1 mM H₂O₂와 100 μM Fe(Ⅱ)과염소산염 6수화물(OH^-. radical), 1 mM KO₂(O₂ ^-. radical)를 세포에 30분 간 노출시켜 산화된 디클로로플루오레신(DCF)을 여기파장 485 nm, 방사파장 535 nm에서 형광도를 측정하였다. 그 결과, 이고들빼기 추출물(시료명 D043)을 전 처리한 경우, H₂O₂ 라디칼, OH^-.라디칼 및 O₂ ^-.라디칼만 처리한 경우와 비교하여 망막 신경 세포 RGC-5에서 H₂O₂ 라디칼, OH^-.라디칼 및 O₂ ^-.라디칼에 의해 유도된 산화 라디칼에 의한 활성산소의 증가를 유의적으로 저해함을 확인하였다 [도 3].

실험예 4. 이고들빼기 추출물의 망막 신경 세포(RGC-5)의 세포내 활성산소 발생 억제효과 측정

이고들빼기 추출물이 망막 신경 세포(RGC-5)의 세포내 활성산소 발생을 억제하는지 확인하기 위하여, 막 투과성이 있고 활성산소를 함유하는 세포를 붉은색으로 염색 시키는 DHE(Dihydroethidium)을 사용하여 산화스트레스에 의한 세포내 활성 산소 발생 정도를 분석하였다.

구체적으로, 세포를 96 웰 배양 접시에 분주하여 부착시킨 후 배지를 저농도의 1% 우태아혈청(FBS)으로 교환하고 이고들빼기 추출물(시료명 D043)을 그 최종농도가 10, 5, 0.1 μg/mL이 되게 1시간 동안 전 처리하였다. 이후, 0.5 mM BSO와 10 mM 글루타메이트를 37℃에서 24시간 동안 처리 후, 세포를 차가운 D-PBS로 세척하고, 최종농도가 1 μg/mL의 DHE(dihydroethidium)에 첨가하여 15분간 37℃에서 염색시킨 후, Confocal 형광 현미경(Confocal fluorescence microscope)을 사용하여 가시화하였다 [도 4].

그 결과, 망막 신경 세포 RGC-5에서 0.5 mM BSO와 10 mM 글루타메이트에 의해 유도된 산화스트레스에 의한 세포 사멸에서, 이고들빼기 추출물을 전 처리 한 경우, 0.5 mM BSO와 10 mM 글루타메이트만 처리한 경우와 비교하여 세포내 활성산소 발생을 확인하는 DHE(dihydroethidium)에 의한 형광 적색 표지가 감소함을 확인하였다 [도 4].

따라서, 이고들빼기 추출물은 산화스트레스에 의한 세포내 활성 산소 발생 정도를 저해하는 효과를 나타냄을 확인하였다.

실험예 5. 이고들빼기 추출물의 SNP로 유도한 흰쥐 뇌의 지질과산화 저해효과

이고들빼기 추출물의 SNP로 유도한 흰쥐 뇌의 지질과산화 저해효과를 MDA(malondialdehyde)를 지표로 하는 티오바르비투린산 반응물질(TBARS; Thiobarbituric acid reactive substance)을 측정하였다.

구체적으로, 적출한 뇌를 뇌 부피의 10배의 차가운 식염수(pH 7.0)에 분쇄한 후 4 ℃에서 원심분리(1000 g)를 한 상층액을 깨끗한 시험관에 옮겨 담은 후, Bio-Rad Protein 분석방법을 사용하여 단백질의 농도를 정량하였다. 상층액을 시험관에 0.5 mL씩 옮겨 담고 농도별로 조제한 각 이고들빼기 시료(0.31, 0.62, 1.25, 2.50 μg/mL)를 넣어주고 37℃ 항온조에서 5분간 인큐베이션을 한 후 20 μM SNP (sodium nitroprusside)를 최종 부피가 1 mL 되게 넣어 37℃ 항온조에서 30분간 인큐베이션 하였다.

위의 산화 반응물에 8.1% w/vol SDS, 0.8% TBA와 20% v/v 아세트산(pH 3.5)을 가하고 잘 혼합한 후 90 내지 95℃의 수조에서 30분간 가열한 후 실온까지 식혔다. 혼탁도를 줄이기 위해 n-부탄올:피리딘 (15:1 v/v)을 넣고 혼합하여 원심분리한 후 상층액의 흡광도를 532 nm에서 측정하였다.

그 결과, 이고들빼기 추출물(시료명 D043)을 전 처리한 경우, SNP로 유도한 지질과산화를 농도 의존적으로 감소시킴을 확인하였다 [도 5].

실험예 6. 이고들빼기 추출물의 세포사멸과 항산화 관련 단백질 발현활성 측정

이고들빼기 추출물의 세포사멸(apoptosis)과 항산화에 관련된 단백질 발현에 미치는 영향을 측정하기 위하여 망막 신경세포(RGC-5)를 대상으로 웨스턴블라팅 어세이를 수행하였다.

구체적으로, DMEM/10% FBS 용액을 망막 신경세포배양액과 혼합하여 세포의 수를 4×10⁴cells/mL로 조제한 후에 60 mm 접시에 5 mL씩 처리하여 5% CO₂/37℃의 조건에서 배양하였다. 세포가 안정화 된 후에 이고들빼기 추출물(시료명 D043)을 0, 1, 5, 10 μg/mL의 농도로 처리하고 24시간 동안 5% CO₂및 37℃의 조건에서 배양하였다. 배양 종료 후 세포 용해액(cell lysate)으로부터 단백질을 추출하여 세포사멸과 항산화 항원을 붙여 분석하였다 [도 6 및 도 7].

도 6 및 도 7에 나타난 바와 같이, 이고들빼기 추출물을 처리한 경우, 세포사멸 단백질의 발현을 억제시키고, 항산화 단백질의 발현을 증가시켰다.

그 결과, 이고들빼기 추출물은 세포사멸 단백질을 억제시키고 항산화 단백질의 활성을 증가시키는 효과적인 세포사멸 보호효과를 가지는 것으로 판명되었다.

실험예 7. 이고들빼기 추출물의 NMDA로 유도한 흰쥐의 망막퇴화 보호효과

이고들빼기 추출물의 NMDA로 유도한 흰쥐의 망막퇴화보호효과를 측정하였다.

구체적으로, 2% 럼푼 주사액과 졸레틸을 혼합하여 1 ml/kg 근육 주사 하여 마취시킨 후 NMDA (5 nmol/eye)를 멸균한 헤밀턴(Hamilton) 주사기에 33-G 주사침을 사용하여 상비측 평면부를 통해 안구에 2μL씩 유리체내로 주입하였다. 주입 후에 감염을 예방하기 위해 0.5% 비가목스 점안액(ALcon Laboratoriss, Inc.)을 한 방울 점안 하였다. 대조군에서는 같은 용량의 0.01 M PBS를 주입하였다. 좌안은 NMDA를 주사하였고 우안은 대조군으로 하여 동량의 PBS를 유리체내에 주사하였다. 조직학적으로 망막의 두께 변화 관찰을 위해 NMDA를 주입 후 7일 째 안구를 적출하였다. 적출한 안구는 안구부피의 10배가 되는 10% 포르말린에 넣어 상온에서 하루 동안 고정시켰다. 망막 절편을 만든 후 헤마톡실린과 에오신 염색을 실시하였다. 슬라이드 위의 조직을 아세트산을 이용하여 고정하고, 헤마톡실린으로 핵을 염색한 후 에오신으로 세포질을 염색하였다. 광학 현미경을 사용하여 100배로 망막의 두께 변화를 관찰하였다. 또한 TUNEL에 반응하는 지를 측정하기 위하여, 24시간 후에 각각 안구적출을 시행하였다. 안구 적출 후 안구의 약 2/3 되는 부위에서 절개 후 수정체와 유리체를 제거하고 망막을 분리하였다. 분리한 망막조직은 절편을 만들어 4% 파라포름알데히드(pH 7.4)에 20분 동안 고정한 후 PBS로 세척했다. In situ cell death detection kit인 POD (Roche, Mannheim, Germany)를 이용하여 세포내 internucleosomally cleaved DNA의 노출된 3'-OH 그룹에 결합하여 표지되는 TdTmediated dUTP nick end labeling (TUNEL)로 염색하여 직접적으로 아포프토시스가 일어나는 세포의 발현 위치와 정도를 관찰하였다.

그 결과, 망막퇴화를 NMDA로 유도하였을 때, 망막의 신경절 세포층(Ganglion Cell Layer, GL)과 속핵층(Inner Nuclear Layer, INL)이 얇아짐을 확인하였으며, 이고들빼기 추출물(시료명 D043)을 전 처리한 경우, 망막 층의 얇아짐을 억제함을 확인하였다 [도 8]. 또한 아포프토시스에 의한 세포사멸을 확인하기 위해 NMDA로 유도하였을 때, TUNEL에 양성으로 반응하는 세포가 늘어났으며, 이고들빼기 추출물을 전 처리한 경우, TUNEL 양성세포가 유의적으로 감소함을 확인함으로써, 아포프토시스에 의한 세포사멸을 억제함을 확인하였다 [도 9].

상기한 실험예의 결과로부터, 본 발명의 이고들빼기 추출물은 망막 신경 세포의 보호 및 망막 질환의 치료 효과를 나타내므로, 망막질환의 예방 및 치료용 의약품, 또는 망막질환의 예방 및 개선용 건강식품에 활성물질로 유용하다.

[제제예]

하기 제제예는 이고들빼기 추출물을 유효성분으로 포함하는 의약품 또는 건강기능식품 제조를 위한 제제예를 예시한 것이며, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

제제예 1. 약학적 제제의 제조

1-1. 산제의 제조

이고들빼기 추출물 2 g

유당 1 g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

1-2. 정제의 제조

이고들빼기 추출물 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

1-3. 캡슐제의 제조

이고들빼기 추출물 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

1-4. 주사제의 제조

이고들빼기 추출물 100 ㎎

만니톨 180 ㎎

Na₂HPO₄ㆍ2H₂O 26 ㎎

증류수 2974 ㎎

통상적인 주사제의 제조방법에 따라, 상기 성분들을 제시된 함량으로 함유시켜 주사제를 제조하였다.

제제예 2. 건강기능식품의 제조

2-1. 음료의 제조

꿀 522 ㎎

치옥토산아미 5 ㎎

니코틴산아미드 10 ㎎

염산리보플라빈나트륨 3 ㎎

염산피리독신 2 ㎎

이노시톨 30 ㎎

오르트산 50 ㎎

이고들빼기 추출물 0.48∼1.28 ㎎

물 200 ㎖

상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 음료를 제조하였다.

2-2. 츄잉껌의 제조

껌베이스 20 중량%

설탕 76.36∼76.76 중량%

이고들빼기 추출물 0.24∼0.64 중량%

후르츠향 1 중량%

물 2 중량%

상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 츄잉껌을 제조하였다.

2-3. 캔디의 제조

설탕 50∼60 중량%

물엿 39.26∼49.66 중량%

이고들빼기 추출물 0.24∼10.64 중량%

오렌지향 0.1 중량%

상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 캔디를 제조하였다.

2-4. 밀가루 식품의 제조

본 발명에 따른 이고들빼기 추출물 5 중량부를 밀가루 100 중량부에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

2-5. 유제품(dairy products)의 제조

본 발명에 따른 이고들빼기 추출물 5 내지 10 중량부를 우유 100 중량부에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

2-6. 선식의 제조

현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입고 60 메쉬의 분말로 제조하였다. 검은콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다. 상기에서 제조한 곡물류 및 종실류와 본 발명에 따른 이고들빼기의 추출물 을 다음과 같은 비율로 배합하여 제조하였다.

현미 30 중량%

율무 20 중량%

보리 25 중량%

들깨 7 중량%

검정콩 7 중량%

검은깨 7 중량%

이고들빼기 추출물 3 중량%

영지 0.5 중량%

지황 0.5 중량%

Claims

이고들빼기(Crepidiastrum denticulatum) 추출물을 유효성분으로 포함하는 망막질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물로,
상기 망막질환은 연령 관련 황반 변성 또는 녹내장인, 약학적 조성물.
삭제
제 1 항에 있어서,
상기 추출물은 이고들빼기(Crepidiastrum denticulatum)를 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 아세톤 또는 이들의 혼합 용매로 추출한 것인, 약학적 조성물.
제 3 항에 있어서,
상기 알코올은 메탄올 또는 에탄올인, 약학적 조성물.
이고들빼기(Crepidiastrum denticulatum) 추출물을 유효성분으로 함유하는, 망막질환의 예방 및 개선용 건강식품 조성물로,
상기 망막질환은 연령 관련 황반 변성 또는 녹내장인, 건강식품 조성물.
삭제
제 5 항에 있어서,
상기 추출물은 이고들빼기(Crepidiastrum denticulatum)를 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 아세톤 또는 이들의 혼합 용매로 추출한 것인, 건강식품 조성물.
제 7 항에 있어서,
상기 알코올은 메탄올 또는 에탄올인, 건강식품 조성물.