KR101403304B1

KR101403304B1 - 스트랩토마이세스 에시디스케비에스 ｊａ（ⅱ）-10 균주, 이를 함유하는 식물 잿빛곰팡이병 방제용 미생물 제제 및 잿빛곰팡이병 방제방법

Info

Publication number: KR101403304B1
Application number: KR1020100097095A
Authority: KR
Inventors: 황경숙; 이은경
Original assignee: 목원대학교 산학협력단
Priority date: 2010-10-06
Filing date: 2010-10-06
Publication date: 2014-06-05
Also published as: KR20120035534A

Abstract

본 발명은 딸기 잿빛곰팡이 병원균에 대해 항균활성을 보이는 스트랩토마이세스 에시디스케비에스 JA(II)-10 균주의 미생물학적 특성에 관한 것으로, 상기 본 발명에 따른 스트랩토마이세스 에시디스케비에스 JA(II)-10 균주를 이용한 식물 잿빛곰팡이병의 방제는 우리나라에서 자생하는 미생물을 이용하여 경제적인 대체효과가 크고, 환경친화적으로 고성능을 가진 방제가 가능하여 작물의 상품성 및 생산성을 증대시킬 수 있는 효과가 크다.

Description

스트랩토마이세스 에시디스케비에스 ＪＡ（Ⅱ）-10 균주, 이를 함유하는 식물 잿빛곰팡이병 방제용 미생물 제제 및 잿빛곰팡이병 방제방법{Streptomyces acidiscabies ＪＡ（Ⅱ）-10, biopesticide comprising the strain against gray mold and control method of gray mold with same}

본 발명은 스트랩토마이세스 에시디스케비에스 JA(II)-10 균주, 이를 함유하는 식물 잿빛곰팡이병 방제용 미생물 균주에 관한 것이다.

잿빛곰팡이병은 지상부에 발생하는 병 중에서 거의 모든 채소와 화훼, 과수에 발생하는 다범성 균으로 주로 과실에 발생하여 많은 피해를 가져오고 있다. 또한 이 균은 수확 후 이차적으로 저장, 운송, 판매 중의 과일류와 채소류에 부패병을 일으킨다.

특히 최근에는 기존의 화학농약에 대한 내성균이 빈번하게 출현하여 화학요법에 의한 방제의 효과가 떨어지고 있는 것이 현실이며, 일부 효과를 갖는 농약의 경우에도 잔류독성문제로 인하여 과실을 수확해야하는 딸기나 오이 등에 있어서는 그 사용이 엄격하게 제한되고 있는 실정이다. 따라서 화학농약을 대체할 수 있는 저독성의 환경친화성 생물농약개발에 관한 연구가 활발히 수행되고 있다.

생물농약으로서 잿빛곰팡이병을 방제하고자하는 노력은 천연물, 미생물 등을 이용한 방법들이 제시되었으며 특히 바실러스속(Bacillus spp .), 트라이코더마속 (Trichoderma spp .), 이스트(yeast) 등을 활용한 미생물농약들이 세계적으로 개발되어 등록되고 있다. 외국의 경우 슈도모나스 시린지(Pseudomonas syringae)를 제제화한 상품명 바이오-세이브 텐(Bio-save 10)을 실용화하여 사용 중이며, 일본의 경우 바실러스 속의 균(Bacillus sp .)을 2003년에 잿빛곰팡이병과 흰가루병 방제제로 상품화하였다. 국내의 경우에도 잿빛곰팡이병균의 균사생장 및 포자발아를 억제하는 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) N1균주를 이용한 잿빛곰팡이병 방제에 관한 연구가 보고되었다.

그러나 많은 연구 사례에도 불구하고 효과가 우수하고 저렴하며 안전한 잿빛곰팡이병 방제용 생물농약은 아직까지 정착되어 있지 않은 실정이다. 따라서 항균 활성이 우수하며 농약으로서의 특성이 안정한 신규 미생물 유전자원의 탐색이 요구되고 있다.

이에 본 발명자들은 식물 병원균에 길항적인 스트랩토마이세스 에시디스케비에스 미생물 균주를 조릿대 근권토양으로부터 분리하여 항진균성 활성을 갖는 미생물을 분리하고, 이를 대량 배양하여 제조한 배양액을 주요 작물의 병원성 진균에 처리함으로써 딸기 잿빛곰팡이병을 효율적으로 방제할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 작물의 식물병원균에 항진균 활성이 우수하고 잿빛곰팡이병에 우수한 방제효과를 보이는 신규의 미생물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 상기 신규 미생물을 함유하는 무독성의 환경친화적인 식물 잿빛곰팡이병 방제용 미생물 제제 및 잿빛곰팡이병 방제방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 스트랩토마이세스 에시디스케비에스(Streptomyces acidiscabies) 미생물 균주 및 이를 이용한 식물병 방제용 미생물 제제를 제공한다.

보다 상세하게는 조릿대 근권토양으로부터 분리하여 이를 스트랩토마이세스 에시디스케비에스 JA(II)-10으로 명명하고, 이를 대량 배양하여 제조한 배양액을 주요 작물의 병원성 진균에 처리함으로써 딸기 잿빛곰팡이병을 방제하는 생물학적 방제용 미생물 제제 및 상기 미생물 제제를 이용한 잿빛곰팡이병 방제방법을 제공한다.

본 발명의 스트랩토마이세스 에시디스케비에스(Streptomyces acidiscabies) JA(II)-10(KACC 91492P) 균주는 우리나라에서 자생하는 미생물로서 조릿대 근권토양으로부터 분리한 미생물 균주이며, 딸기 잿빛곰팡이 병원균(Botrytis cinerea)의 균사생장을 억제하는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명의 스트랩토마이세스 에시디스케비에스(Streptomyces acidiscabies) JA(II)-10(KACC 91492P) 균주 및 이의 배양액은 딸기 잿빛곰팡이 병병의 대하여 강한 길항작용을 가지는 것을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 조릿대 근권토양으로부터 분리되고, 식물 잿빛곰팡이 병원균에 대하여 항 진균성 활성을 갖는, 스트랩토마이세스 에시디스케비에스(Streptomyces acidiscabies) JA(II)-10(KACC 91492P) 균주를 제공한다.

보다 상세하게는 조릿대의 낙엽층과 근권토양으로부터 딸기 잿빛곰팡이 병원균(Botrytis cinerea)에 대한 항균활성을 갖는 균주를 분리하였으며, 형태적 생화학적 특성 및 염기서열 분석결과(서열번호 1) 스트랩토마이세스 에시디스케비에스(Streptomyces acidiscabies)인 것을 확인할 수 있었다. 도 1 및 3을 참조한다.

상기의 결과로부터 선별 분리된 본 발명의 항균활성 균주를 스트랩토마이세스 에시디스케비에스(Streptomyces acidiscabies) JA(II)-10로 명명하고, 농촌진흥청 한국농업미생물자원센터에 2009년 9월 17일자로 기탁하여 기탁번호 KACC 91492P를 부여받았다.

본 발명은 상기 스트랩토마이세스 에시디스케비에스(Streptomyces acidiscabies) JA(II)-10(KACC 91492P) 균주 또는 상기 스트랩토마이세스 에시디스케비에스(Streptomyces acidiscabies) JA(II)-10(KACC 91492P) 균주의 배양물을 함유하는, 항 진균성 활성을 갖는 식물 잿빛곰팡이병 방제용 미생물 제제를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 미생물 제제는 스트랩토마이세스 에시디스케비에스(Streptomyces acidiscabies) JA(II)-10(KACC 91492P) 균주를 배지에서 성장 발육시키고, 10⁵ cell/㎖로 희석시켜 제조되는 것을 특징하며, 상기 식물 잿빛곰팡이병은 딸기에 발생되는 것을 특징으로 한다.

보다 상세하게는 JA(II)-10 배양액의 상등액을 농도별(원액, 50%, 25, 12.5, 6.25, 0%)로 각각 준비한 후, 상기 농도별로 첨가한 중층배지를 이용하여 잿빛곰팡이 발육을 저해하는 최소농도를 조사하였다. 그 결과, 대조구에서의 잿빛곰팡이 발육 양상과 JA(II)-10 균주의 상등액 첨가 배지에서의 잿빛곰팡이 생장 양상에 큰 차이가 있는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 JA(II)-10 균주의 상등액 첨가 50% 이상의 배지에서는 잿빛곰팡이의 생장이 크게 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 도 8을 참조한다.

본 발명은 따른 미생물 제제를 식물체에 처리하여 식물 잿빛곰팡이 병원균을 방제하는 방법을 제공하며, 상기 식물체는 딸기인 것으로 통상의 방법으로 적용한다.

구체적인 방법으로 본 발명에 따른 상기 미생물 제제는 토양, 작물의 잎, 줄기, 꽃 또는 열매에 살포하는 것으로, 물에 미생물 제제를 희석하여 사용할 수 있으며, 본 발명의 미생물 균주의 항 진균성 활성을 더하기 위하여 엽면살포제 또는 관주살포제 등을 더 포함할 수 있다. 또한, 살포시기는 잿빛곰팡이균이 발병ㆍ증식하기 전 예방적으로 미리 처리하는 것이 방제효과를 더욱 상승시킬 수 있다.

본 발명의 스트랩토마이세스 에시디스케비에스(Streptomyces acidiscabies) JA(II)-10 균주는 각종 작물에 발생하는 잿빛곰팡이병의 원인균에 대하여 탁월한 항 진균성 활성을 가지고 있으며, 특히 딸기에 발생하는 잿빛곰팡이병을 효율적으로 감소시킬 수 있어 생태계 파괴 및 인축 독성 문제를 해소할 수 있는 우수한 다기능의 생물농약 재료로 활용이 가능한 장점이 있다.

본 발명의 스트랩토마이세스 에시디스케비에스(Streptomyces acidiscabies) JA(II)-10 균주는 우리나라에서 자생하는 미생물을 이용하여 경제적인 대체효과가 크고 고성능을 가지고 있어, 작물의 상품성 및 생산성을 증대시킬 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명에 따른 스트랩토마이세스 에시디스케비에스(Streptomyces acidiscabies) JA(II)-10 균주의 딸기 잿빛곰팡이 병원균에 대한 항균력을 조사한 결과이고,
(A: 무처리구, B: JA(II)-10 균주 처리구)
도 2는 본 발명에 따른 스트랩토마이세스 에시디스케비에스(Streptomyces acidiscabies) JA(II)-10 균주의 배양 배지별 콜로니의 형태 및 색상을 조사한 결과이며,
(A: Nutrient Agar, B: Potato Dextrose Agar, C: Corn Meal Agar, D: Starch Casein Agar, E: Oat Meal Agar, F: Yeast Malt Agar)
도 3은 본 발명에 따른 스트랩토마이세스 에시디스케비에스(Streptomyces acidiscabies) JA(II)-10 균주의 16S rDNA 염기서열을 나타낸 것이고,
도 4는 본 발명에 따른 스트랩토마이세스 에시디스케비에스(Streptomyces acidiscabies) JA(II)-10 균주의 계통학적 위치를 확인한 결과이며,
도 5는 본 발명에 따른 스트랩토마이세스 에시디스케비에스(Streptomyces acidiscabies) JA(II)-10 균주에 대한 퀴논종 분석결과를 보여주는 결과이고,
도 6은 본 발명에 따른 스트랩토마이세스 에시디스케비에스(Streptomyces acidiscabies) JA(II)-10 균주의 API-ZYM를 이용한 효소활성의 이용성을 조사한 결과를 보여주는 것이며,
도 7은 본 발명에 따른 스트랩토마이세스 에시디스케비에스(Streptomyces acidiscabies) JA(II)-10 균주에 대한 효소학적 특성을 보여주는 결과이고,
(A: 단백질 분해효소 활성, B: 키틴 분해효소 활성)
도 8은 본 발명에 따른 스트랩토마이세스 에시디스케비에스(Streptomyces acidiscabies) JA(II)-10 균주 배양물의 희석농도에 따른 잿빛곰팡이 억제효과를 확인한 결과이며.
도 9는 기내에서의 본 발명에 따른 스트랩토마이세스 에시디스케비에스(Streptomyces acidiscabies) JA(II)-10 균주를 이용한 딸기 잿빛곰팡이병에 대한 방제효과를 확인한 결과이고,
(A: 무처리구, B: JA(II)-10 균주 처리구)
도 10 노지 육묘포장에서의 본 발명에 따른 스트랩토마이세스 에시디스케비에스(Streptomyces acidiscabies) JA(II)-10 균주를 이용한 딸기 잿빛곰팡이병에 대한 방제효과를 확인한 결과이다.
(A: 무처리구, B: JA(II)-10 균주 처리구, C: 대조약제 처리구)

이하, 하기 실시 예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 하지만, 본 발명은 하기 실시 예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 사상과 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정할 수 있음은 이 분야에서 당업자에게는 명백한 것이다.

이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.

[실시예 1] 유용 미생물 JA(II)-10 균주의 분리 및 동정

조릿대의 낙엽층과 근권토양으로부터 분리한 83개의 방선균을 이용하여 딸기 잿빛곰팡이 병원균(Botrytis cinerea)에 대한 항균활성 균주를 선발하였다. 항균활성검정은 방선균을 먼저 선택배지(PDA 배지)에 접종한 후, 24시간 후에 딸기 잿빛곰팡이 병원균을 대치 배양하여, 한 달 후 활성을 확인하였다. 대치 배양 후 방선균 주위에 형성된 생육저지대(Growth Inhibitor Clear Zone)의 길이를 측정하여 잿빛곰팡이병원균(Botrytis cinerea)에 대한 억제율을 산출하였다.

그 결과 조릿대의 낙엽과 근권토양으로부터 분리한 방선균 83개의 균주 중 79개의 균주(96%)가 딸기 잿빛곰팡이 병원균에 대한 항균활성능을 나타내어 조릿대 근권토양 내에는 잿빛곰팡이 병원균에 대하여 항균력을 나타내는 방선균이 다수 분포해있음을 확인할 수 있었으며, 그 중 유용 미생물 균주를 선별하여 JA(II)-10이라고 명명하였다.

상기 대치 배양법으로 검정한 뒤 방선균과 사이의 생육저지대를 측정하여 억제율을 계산하였다. 그 결과 도 1에서 확인할 수 있듯이, 상기 선별된 JA(II)-10 방선균을 접종하고, 딸기 잿빛곰팡이 병원균을 대치 배양한 뒤, 1주일이 경과하면 딸기 잿빛곰팡이 병원균에서 균사가 자라기 시작하는데, JA(II)-10 균주 처리구는 방선균이 대치 배양하지 않은 대조구에 비해 균사의 성장이 대체적으로 느렸으며, 접종 30일 후, 대조구는 페트리디쉬 전체에 균사가 퍼진 반면, JA(II)-10 균주 처리구에서는 균사가 페트리디쉬 끝까지 퍼지지 못하여 68.3%의 항균활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

[실시 예 2] 유용 미생물 JA ( II )-10의 형태적 생화학적 특성조사

1) JA(II)-10 균주의 형태적 특성 조사

상기 실시 예 1에서 선별된 JA(II)-10 균주의 형태학적 특성을 검토하기 위하여, Yeast-extract Malt-extract agar(International Streptomyces Project, ISP 2), Oatmeal agar(ISP 3), Inorganic salts starch agar(ISP 4)배지, Nutrient agar(ISP 8), Corn Meal Agar(CMA) 그리고 PDA(Potato Dextrose Agar 배지에서 15일 동안 배양 후 생육 정도(growth), 포자형성(sporulation), 기균사(aerial mycelium), 기중균사(substrate mycelium)와 색소의 생성 여부(soluble pigment)를 관찰하였다. 각각의 배지는 1ℓ 기준으로 ISP 2(YMA 배지)는 Yeast 4 g, malt extract 10 g, glucose 4 g으로 제조하였으며, ISP 3(OA배지)는 Oatmeal 20 g, ISP 4(SCA 배지)로 Starch 10g, Casein 1g, MgSO₄7H₂0 1.02g, K₂HPO₄ 0.5 g, ISP 8(NA 배지)로 Beef extract 10 g, Peptone 10 g, sodium chloride 5 g으로 제조하였다. PDA 배지는 Potato 200 g , glucose 20 g, CA 배지는 Corm meal 30 g으로 조정하여 사용하였으며, 각각의 배양 배지에 28℃에서 1주일간 배양하면서 기균사와 기중균사, 색소형성능을 관찰하였다.

그 결과, 도 2의 결과에서 확인할 수 있듯이 JA(Ⅱ)-10 균주는 Yeast-extract Malt-extract agar, Oatmeal agar, Inorganic salts starch agar, Nutrient agar, CMA 그리고 PDA의 배지에서 모두 생육이 가능한 것을 확인할 수 있었다.

또한, 상기의 배지에서 보듯 기균사와 포자가 모두 형성 되었으며, Yeast-extract Malt-extract agar, Inorganic salts starch agar, Oatmeal agar, CMA 그리고 PDA 배지에서는 밝은 회색(light gray with white), Nutrient agar 배지에서는 흰색(white)을 나타내었다. 기중균사는 갈색(brown), 흰색(white), 아이보리색(ivory) 등 3가지 색상을 나타내었으며, 모든 배지에서는 색소를 형성하지 않는 것을 확인할 수 있었다.

2) JA (Ⅱ)-10 균주의 분자계통학적 분석

JA(Ⅱ)-10 균주의 분자계통학적 분석을 위하여 DNA를 추출하여 Polymerase Chain Reation을 이용하였으며, ABI PRISM 310 Genetic Analyser(Applied Biosystems)를 사용하여 16S rDNA(약 1500 bp) 염기서열을 결정하였고, 상동성(homology)은 DDBJ/ NCBI/GenBank database의 BLAST program을 이용하여 비교하였다. 각 염기서열의 상동성은 alignment Clustal X algorithm를 이용하여 병렬로 정렬하였으며, 계통도의 작성은 근린 결합법에 의거하여 결정하였다

JA(II)-10의 16S rDNA 염기서열(1,224 bp)을 분석한 결과 도 3(서열번호 1)의 염기서열을 확인할 수 있었으며, 상기 JA(II)-10의 16S rDNA 염기서열을 기초로한 RDP/NCBI/GenBank database의 BLAST program을 이용하여 분자계통학적 위치를 비교 검토한 결과, 도 4에서 확인할 수 있듯이 Streptomyces acidiscabies ATCC49003^T D63865와 상동성 99.7%를 보여 스트랩토마이세스 에시디스케비에스(Streptomyces acidiscabies)로 동정되었다.

3) JA (Ⅱ)-10 균주의 화학분류

JA(Ⅱ)-10 균주의 화학분류를 위하여 JA(Ⅱ)-10 균주의 균체 지방산조성을 분석하였다.

JA(II)-10의 세포지방산 조성을 조사하기 위하여 TSA(Trypticase Soy Broth Agar, Difco) 배지 50 ㎖에 접종하여 28℃에서 5일 동안 배양한 후, 8000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 균체를 수거하였다. 수거한 균체의 50 mg(wet weight)을 teflon lined screw cap tube에 옮긴 후, Ikemoyo ＆ Miyagawa의 방법에 의해 균체지방산을 메틸에스테르(methyl ester)화하고 추출하였다. 균체 50 mg에 NaOH 1 ㎖을 혼합하여, 100℃에서 30분간 중탕하여 세포막의 지질로부터 균체 지방산을 분리한 후, HCl 2 ㎖을 첨가한 뒤 80℃에서 10분간 중탕하여 지방산에 메틸에스테르를 형성하였다.

Hexane-tert-butylmethyleter 1.25 ㎖을 첨가하고 10분간 교반한 뒤 상층액을 취하여 지방산을 수용층에서 유기층으로 전이시켰다. NaOH 3 ㎖과 함께 10분간 교반하고 이물질을 제거하기 위하여 saturated NaCl로 정제하였다. 정제된 지방산을 0.5 ㎖ 추출하여 GC Vial에 옮겼다. 지방산 methyl ester의 분석에는 Microbial Identification System(Midi;Microbial ID, Inc., Newark. U,S,A)을 이용하여 분석하였다(Stead, 1992).

상기 표 1에서도 확인할 수 있듯이, JA(II)-10의 균체 지방산 조성을 조사한 결과, 주요 지방산으로는 C16:0(14.78%), iso-C15:0(11.28%) 그리고 anteiso-C15:0(19.67%)으로 확인하였으며, 13:0 iso, 14:0 iso, 15:0 iso, 15:0 anteiso, 16:0 iso, 17:0 iso 그리고 17:0 anteiso의 다양한 분지형 지방산을 갖는 것으로 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과는 분지형 지방산은 그람양성 세균인 방선균 속에서 나타나는 주요 지방산 성분과도 일치하였다.

3) JA(Ⅱ)-10 균주의 Quinone 종분석

이소프레노이드 퀴논(Isoprenoid Quinone) 분자종의 동정은 Collin과 Jones의 방법을 이용하여 SCA배지에서 2주일간 배양한 균체를 회수한 후, 동결건조기(Eyela, Japan)를 이용하여 제조하였다. 건조균체 400 ㎎에 클로로프롬 : 메탄올(2:1) 용액을 20 ㎖을 넣고 24시간 동안 처리하여 이소프레노이드 퀴논을 추출하였다. 상기 추출액 중의 균체 성분은 여과지를 이용하여 여과한 후, 여과액을 vacuum rotary evaporator(Eyela, Japan)에서 30분 동안 농축하였다. evaporator flask에 아세톤 4 ㎖을 넣고 이소프레노이드 퀴논을 용해하여 순수한 질소(N₂) 가스로 3번 농축하였다. 이소프레노이드 퀴논 농축액을 유비퀴논(ubiquinone)과 메나퀴논(menaquinone)의 standard와 함께 TLC(Merck Kiesel-gel 60 F254, 20×20, 0.5 mm thickness) 플레이트에 spot하였다. 석유 벤젠(petroleum benzene)/디에틸에테르(diethyl ether) (9:1) 전개액 100 ㎖을 전개조에 넣고 전개액이 TLC 플레이트의 윗부분에서 약 3 cm정도까지 되도록 전개한 후 UV 254 nm에서 확인하였다. 각 퀴논 밴드를 면도칼로 긁어내어 튜브e에 옮기고 아세톤 1 ㎖을 넣고 용해한 후, 0.42 ㎛ syringe filter로 여과하였다. 여과된 아세톤 추출액을 질소(N₂) 가스로 농축하였다. 퀴논종의 분석은 표준물질과 함께 5C18 컬럼(4.6×150 mm; Nacalai Tesqu)을 이용하여 HPLC(Shimadzu, Japan)로 분석하였다(Collins, M.D. and D. Jones., 1981).

그 결과, 상기 표 2 및 도 5의 결과에서도 확인할 수 있듯이, JA(II)-10의 퀴논종은 TLC로 전개한 뒤 UV 254 ㎚에서 메나퀴논(Mena Quinone)의 밴드와 동일 위치 선상에서 표준물질과 비교한 결과, 메나퀴논으로 동정되었으며 HPLC 분석 상에서 MK-9(H4)이 3.79%, MK-9(H6)이 54.58% 그리고 MK-9(H8)이 40.3%를 함유하고 있는 것을 확인할 수 있었다.

5) JA ( II )-10의 생리학적 특성

JA(II)-10 균주의 효소활성을 검사하기 위하여 API ZYM kit를 이용하여 Zym을 분석하였다. JA(II)-10 균주의 single colony를 증류수에 현탁하여, 수분이 유지되고 있는 스트립의 큐플에 접종한 후 37℃에서 4시간 암흑상태로 배양하였다. 4시간 경과 후 ZYM A와 ZYM B 시약을 각각의 큐플에 한 방울씩 접종하여 5분 경과 후 반응 결과를 -/+로 판독하였다.

그 결과 Esterase, Esterase Lipase, Leucine arylamidase, Valine arylamidase, Crystine arylamidase, Trypsin, α-chymotrypsin, Acid phospatase, Naphtol-AS-BI-phosphohydrolase에서 양성반응을 보이는 것으로 나타났다.

6) JA(II)-10 균주의 효소학적 특성조사

가. 단백질 분해 효소 활성 검정

단백질 분해효소 활성 검정은 1/10로 희석한 육즙영양한천배지(Nutrient Broth, NB)를 기초배지로하여 1%의 무지방우유(skim milk)를 첨가하고 순수 분리된 JA(II)-10 균주를 접종한 후, 28℃에서 7일간 배양하여 고체배지 위에 형성된 기질 분해대(clear zone)를 통하여 프로테아제(protease) 생산능력을 조사하였다.

무지방우유가 포함된 배지(Skim milk agar)상에서 1주일 동안 배양한 결과, 도 7의 A에서도 확인할 수 있듯이 반경 1.5 cm의 기질 분해대가 형성되는 것을 통하여 단백질 분해 효소를 생성하는 것을 확인할 수 있었다.

나. 키틴 분해 효소 활성 검정

키틴 분해능을 실험하기 위해 1/10로 희석한 육즙영양한천배지(NB)에 1% 콜로이달 키틴(colloidal chitin)을 첨가한 평판배지를 사용하였다. 키틴 분해능은 상기의 평판배지에 순수 분리된 JA(II)-10 균주를 접종한 후 28℃에서 7일간 배양하여 고체배지 위에 형성된 기질 분해대(clear zone)를 통하여 키틴 분해능을 확인하였다.

1% 콜로이달 키틴을 첨가한 평판배지에서 키틴분해능을 확인한 결과, 도 7의 B에서도 확인할 수 있듯이 프로테아제(protease)보다 비교적 늦게 투명환이 형성되었으나 JA(II)-10 균주는 키틴을 분해하는 효소 역시 생성하는 것을 확인할 수 있었다,

[실험예 1] 스트랩토마이세스 에시디스케비에스 JA(II)-10 균주의 항균활성 최소농도 검정

JA(II)-10 배양액의 상등액을 농도별로 각각 준비한 후, PDA(Difco Potato Dextrose Agar) 배지와 중층배지에 상기 농도별로 첨가하여 배지를 제조하였다. PDA 배지는 Difco에서 제조한 Potato Dextrose Agar 배지를 사용하였으며, 중층배지는 JA(II)-10 배양액의 상등액을 농도별(원액, 50%, 25, 12.5, 6.25, 0%)로 로 준비한 후 PDA 배지와 혼합하여 제조하였다. 배양된 잿빛곰팡이 균사는 스프레더로 긁어 멸균수 10 ㎖에 현탁한 후 농도별로 제조된 중층배지에 100㎕씩 접종하여 10일 후 잿빛곰팡이 발육을 저해하는 최소농도를 조사하였다.

그 결과, 도 8에서 확인할 수 있듯이 대조구에서의 잿빛곰팡이 발육 양상과 JA(II)-10 균주의 상등액 첨가 배지에서의 잿빛곰팡이 생장 양상에는 큰 차이가 있는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 JA(II)-10 균주의 상등액 첨가 50% 이상의 배지에서는 잿빛곰팡이의 생장이 크게 억제되는 것으로 나타나 JA(II)-10 균주의 상등액 첨가에 따른 잿빛곰팡이 억제를 보이는 최소농도는 50%인 것을 확인하였다.

[실험예 2] 스트랩토마이세스 에시디스케비에스 JA(II)-10의 작물에 따른 잿빛곰팡이병 방제효과 조사

1) JA(II)-10 균주의 기내 약효 평가

시험 포장에서의 딸기 과실에서의 잿빛곰팡이에 대한 JA(II)-10 균주의 길항효과를 알아보기 위하여 잿빛곰팡이 방제 약제를 처리하지 않고 친환경 재배된 딸기를 논산딸기시험장으로부터 분양받아 시험 재료로 사용하였다.

상기 분양받은 딸기를 잿빛곰팡이의 자연발생을 유도하기 위하여 세척과정을 거치지 않고 10과씩 3반복으로 준비된 투명 케이스에 딸기가 겹치지 않도록 배치하였다. 대조구는 멸균수로 충분히 스프레이하여 처리하였으며, JA(II)-10 균체 처리구는 균체가 덩어리지지 않게 균일하게 분쇄 후 혼합하여 충분히 스프레이 하였다. 각각의 처리구는 온도가 23℃로 조정된 배양실에서 일주일간 배양한 후 각각의 처리구에 따라 잿빛곰팡이에 감염된 이병과실을 카운팅하여 효과를 검증하였다.

각각의 처리구별로 균체액을 처리한 후 5일간의 이병증상을 확인한 결과, 도 9에서도 확인할 수 있듯이, 접종 3일경부터 병이 발생되기 시작하였으며 심한 증상은 접종 5일경부터 심하게 나타났는데 JA(II)-10 균체 처리구에서는 대조구에 비해 잿빛곰팡이에 대한 발병이 크게 감소하는 경향을 보였다.

2) JA(II)-10 균주의 포장 약효 시험

본 발명의 JA(II)-10 균주의 딸기잿빛곰팡이 방제 효과를 검증하기 위하여 포장 실증시험을 실시하였다. 시험지는 충남농업기술원 논산딸기시험장 시험포장에서 처리구 당 30주를 대상으로 실시하였다.

잿빛곰팡이 접종 균주는 PDA 배지에서 균사가 넓게 퍼진 플레이트 4장을 준비한 후 일정량의 증류수를 넣고 균사 부분만 스프레더를 이용하여 조심스럽게 긁어모았다. 그 후 접종 농도가 10⁵cell/㎖이 되도록 PDB 용액으로 조정하여 잿빛곰팡이 인위발병을 위한 접종원으로 사용하였다.

상기 준비된 딸기식물체에 잿빛곰팡이 접종하기 위하여 딸기 묘에서 꽃이 개화한 부분과 과실 부분에 골고루 접종액이 흘러내릴 정도로 충분히 분무해 준 후 잿빛곰팡이 발병이 원활하게 유도되게 하기 위하여 포장 환경을 다습하게 유지해 주었다.

상기 잿빛곰팡이 인위접종 일주일 후 감염 여부를 확인하였다. 일반적으로 접종 후 2일이면 식물체 내로 침투하는 것으로 알려져 있지만 육안으로의 병징 확인은 일주일 정도 지나야 정확한 증상을 확인할 수 있었다.

본 실험에서도 일주일 경과 후 잿빛곰팡이 감염 양상을 조사한 결과 빨리 감염된 묘는 개화부분에 반점 증상을 나타내어 인위발병이 이루어진 것으로 볼 수 있었다.

상기의 예비시험을 바탕으로 처리구는 대조구(멸균수)와 JA(II)-10, 대조약제 처리구(Ecozet)로 총 3처리구로 처리구 당 딸기 식물체 30주를 대상으로 동일한 접종 방법으로 일주일 간격으로 총 3회 접종한 후 잿빛곰팡이에 감염된 이병과실을 조사하여 방제효과를 검증하였다.

JA(II)-10 균주는 10 ㎖ SCB 배지에 2일간 전배양 된 JA(II)-10 균주를 1000 ㎖의 SCB 배지가 든 5000 ㎖ 삼각플라스크에 넣어 충분히 본배양 하였다. 배양 일주일 된 배양액의 균체를 침강시켜 균체를 모은 후, 멸균수로 2회 세척하여 배지성분을 제거하였다. 뭉쳐있는 균체를 풀어주기 위하여 골고루 분쇄 후 혼합하여 잿빛곰팡이가 인위 접종된 딸기 식물체에 처리하였다. 대조약제(Ecozet)는 500배액으로 희석하여 동일한 방법으로 처리하였다.

준비된 딸기묘 30주를 하나의 처리구로 구분하여 앞쪽부터 대조구(멸균수), 대조약제 처리구 그리고 JA(II)-10 처리구로 배치한 후 준비된 각각의 처리액으로 일주일 간격으로 3회 접종한 후 각각의 이병과율, 방제가 그리고 병확산 면적 조사(AUDPC)를 조사하였다.

그 결과 도 10 및 하기 표 4에서도 확인할 수 있듯이, 본 발명의 항균활성 JA(II)-10 균주에 대한 딸기 잿빛곰팡이병의 억제효과는 대조구의 이병과율이 19.9%인 반면 JA(II)-10 균주 처리구에서 8.3%의 이병과율을 보였으며, 통계학적으로 유의성이 있는 것을 확인할 수 있었다.

또한 방제가 조사에 있어서도 대조약제의 33.3에 비해 58.3으로 우수한 방제 효과를 나타내었으며, 병확산 면적 조사(AUDPC)에서도 대조구의 391, 대조약제의 234에 비해 144로 크게 감소하는 것으로 나타나 JA(II)-10 균주 처리에 의해 잿빛곰팡이병 억제효과는 우수한 것을 확인할 수 있었다.

농업생명공학연구원

KACC91492

20090917

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스트랩토마이세스 에시디스케비에스(Streptomyces acidiscabies) JA(II)-10(KACC 91492P) 균주 또는 스트랩토마이세스 에시디스케비에스(Streptomyces acidiscabies) JA(II)-10(KACC 91492P) 균주의 배양물을 함유하는, 딸기 잿빛곰팡이병의 병원균(Botrytis cinerea)에 대하여 항 진균성 활성을 갖는 딸기 잿빛곰팡이병 방제용 미생물 제제.
제 3항에 있어서,
상기 미생물 제제는 스트랩토마이세스 에시디스케비에스(Streptomyces acidiscabies) JA(II)-10(KACC 91492P) 균주를 배지에서 성장 발육시키고, 10⁵cell/㎖ 농도로 제조되는 것을 특징으로 하는 항 진균성 활성을 갖는 딸기 잿빛곰팡이병 방제용 미생물 제제.
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