KR101402215B1 - 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 ｋｒ―００１ 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 추출물, 상기 배양액 또는 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 잡초 방제용 조성물 - Google Patents
스트렙토마이세스 스코풀리리디스 ｋｒ―００１ 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 추출물, 상기 배양액 또는 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 잡초 방제용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 신규한 균주인 스트렙토마이세스 스코풀리리디스(Streptomyces scopuliridis) KR-001 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 발명의 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주, 및 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 추출물, 상기 배양액 또는 추출물의 분획물이 화본과 잡초, 광엽 잡초 및 난방제 잡초에 우수한 살초력을 발휘하여 유용한 잡초 방제제로 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 신규한 스트렙토마이세스 스코풀리리디스(Streptomyces scopuliridis) 균주 및 상기 균주의 제초제 용도에 관한 것이다.
잡초 혹은 잡풀은 절대적인 것이 아니고 상대적인 개념으로 인간이 농경생활을 시작하면서 발생한 것으로 때와 장소에 적절하지 않은 식물을 말한다. 잡초는 많은 종류가 있고 다양하기 때문에 식물분류학적 분류, 형태학적 분류에 따라 화본과 잡초, 광엽 잡초 및 방동사니과 잡초로 구분하며, 생활형에 따라 일년생잡초, 월년생잡초 및 다년생잡초로 나누고 있다. 그러므로 일반적으로 잡초는 화본과 일년생잡초·다년생잡초, 광엽 일년생잡초·다년생잡초 그리고 방동사니과 일년생잡초·다년생잡초 등으로 분류하거나, 반대로 일년생 화본과 잡초, 광엽 잡초, 방동사니과 잡초 또는 다년생 화본과 잡초, 광엽 잡초, 방동사니과 잡초로 구분한다.
화본과(grasses) 잡초의 줄기에는 잘 구분될 수 있는 마디와 마디 사이가 있고, 잎은 마디로부터 어긋나기로 나 있으며 잎은 줄기를 둘러싸서 보호하는 잎집(leaf sheath)과 잎몸(leaf blade)으로 나누어지는데 잎몸은 좁고 기다란 모양으로 잎맥(leaf vein)이 평행하게 형성된 것이 특징이다. 피, 바랭이, 뚝새풀, 강아지풀, 갈대, 억새 등이 이에 속한다. 방동사니과(sedges)에 속하는 잡초들은 화본과와 비슷한 점이 있으나 대부분 줄기 횡단면이 삼각형 모양이며 잎혀나 잎귀가 없다는 점으로 구분이 된다. 잎은 좁고 능선이 있으며 끝이 뾰족하고 소수에 작은 꽃이 달린다. 방동사니, 너도방동사니, 올방개, 매자기, 올챙이고랭이 등이 속한다. 광엽(broad leaves) 잡초란 화본과 잡초나 방동사니과 잡초에 속하지 않는 식물로서 말 그대로 잎이 비교적 넓은 잡초이다. 잎은 주로 타원형, 난형, 피침형이며 엽맥이 그물처럼 얽혀 있는 것이 특징이다. 우리 주변에서 흔히 발생하는 망초, 토끼풀, 쑥, 냉이, 비름, 물달개비, 가래, 가막사리 등 많은 잡초가 이 범주에 속한다.
가시박(Sciyos angulatus L.)은 북아메리카가 원산지인 박과의 1년생 귀화식물로 국내 강변, 도로변, 철로변, 농경지는 물론 생활주변까지 집단적으로 발생하여 생태계를 심각하게 파괴하고 있는 잡초로서 환경부에서는 야생동식물보호법 시행규칙에 생태계교란 야생식물로 지정하고 있다. 가시박은 생육이 왕성하며 종자 생산량이 많고 군락을 형성하여 자라기 때문에 초본식물은 물론 수목까지 덮어 광합성을 저해하여 고사시키며, 토양 수분 및 질소의 수탈과 교란을 일으켜 기존 식생을 파괴하여 생물 다양성을 변화시킬 뿐만 아니라 종자 표피에 있는 가시 때문에 피부병을 유발하는 등 인·축에게도 직접적으로 피해를 주고 있다. 실제로 현재 가시박은 국내 전 지역에서 분포하고 있으며 점차 분포지역이 확산되어 심각한 피해를 야기하고 있어 이의 방제를 위한 제어기술 개발이 절실히 요구되고 있다.
현재까지 알려진 가시박 제거 방법은 베거나 어린 식물을 뽑는 것인데, 매우 많은 노동력을 필요로 한다. 일부 농경지에 발생한 가시박은 파라쿼트(paraquat)나 글리포새이트(glyphosate)와 같은 비선택성 유기합성 제초제를 사용하면 일부 방제는 가능하지만, 가시박의 주된 발생지 및 군락지가 강변이나 도로변 또는 사람들이 활동하는 생활주변이기 때문에 실제 유기합성 제초제를 이용하는 제어는 현실적으로 매우 제한적일 수밖에 없는 실정이다.
더구나 유기합성 제초제의 연용에 따른 저항성 잡초의 출현 및 생태계에 미칠 잠재적 영향과 환경오염에 대한 문제가 부각되고, 소득향상과 삶의 질을 중시하는 풍토가 조성되면서 친환경 농업에 대한 관심이 높아짐에 따라 합성농약 사용을 저감하기 위한 세계 각국의 규제가 강화되고 있기 때문에 주로 생활주변에서 발생하고 있는 가시박은 기존 유기 합성 제초제를 이용하여 제어하는 것은 더욱 어려운 상황이 되고 있다.
이에, 인·축에 독성이 낮고 자연조건에서 분해가 용이한 천연물 또는 생화학제를 이용하여 가시박을 친환경적으로 방제하는 기술이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
친환경적 제초제에는 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속과 같은 토양 미생물이나 식물에서 기원하는 천연물 유래의 활성물질이 이용되고 있다.
토양 미생물이나 식물 등으로부터 유래하는 천연물 제초제에 대한 외국의 연구사례를 보면, 콜레토리컴 글로이오스포리오이디스(Colletorichum gloeosporioides), 파이토프소라 팔미보라(Phytophthora palmivora), 슈도모나스 글라디올리(Pseudomonas gladioli) 등의 미생물 추출액을 자귀풀이나 담쟁이덩굴, 포아풀 방제용 제초제로의 활용 가능성에 대한 검토가 이루어지고 있고, 식물 유래의 제초활성 물질 탐색연구의 경우에는 식물 유래의 안스라퀴논(anthraquinone), 나프토퀴논(naphthoquinone) 혹은 벤조퀴논(benzoquinone)계 천연 화합물들이 하이드록시페닐피루베이트 디옥시게나제(hydroxyphenylpyruvate dioxygenase, HPPD)를 억제한다는 등 최근의 연구보고가 있다.
이와 같이 천연물 유래의 제초활성 물질을 발굴하고자 하는 노력이 꾸준히 계속되고 있으나, 현재 연구개발이 진행 중인 대부분의 미생물 제초제 또는 식물 유래의 제초제들은 대부분 농경지에 발생하는 잡초를 대상으로 하고 있다.
이에, 본 발명자들은 친환경적인 천연물 유래 제초제를 찾고자 노력하던 중, 신규한 스트렙토마이세스 스코풀리리디스(Streptomyces scopuliridis) KR-001 균주를 발견하였고, 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 추출물, 상기 배양액 또는 추출물의 분획물 및 상기 분획물이 화본과 잡초, 광엽 잡초 및 난방제 잡초에 우수한 살초력을 발휘하므로, 천연물 유래 잡초 방제제의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 신규한 스트렙토마이세스 스코풀리리디스(Streptomyces scopuliridis) 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 추출물, 상기 배양액 또는 추출물의 분획물 및 상기 분획물의 활성분획으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 잡초 방제용 제초제 조성물 및 상기 조성물을 이용한 잡초 방제 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 기탁번호 KCTC 12156BP로 기탁된 스트렙토마이세스 스코풀리리디스(Streptomyces scopuliridis) KR-001 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 기탁번호 KCTC 12156BP로 기탁된 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 추출물, 상기 배양액 또는 추출물의 분획물 및 상기 분획물의 활성분획으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 잡초 방제용 제초제 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명은 기탁번호 KCTC 12156BP로 기탁된 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 추출물, 상기 배양액 또는 추출물의 분획물 및 상기 분획물의 활성분획으로 구성된 군에서 어느 하나 이상을 잡초, 이의 종자 또는 이의 서식지에 처리하는 단계를 포함하는 잡초 방제 방법을 제공한다.
본 발명의 기탁번호 KCTC 12156BP로 기탁된 스트렙토마이세스 스코풀리리디스(Streptomyces scopuliridis) KR-001 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 추출물, 상기 배양액 또는 추출물의 분획물 및 상기 분획물의 활성분획은 화본과 잡초, 광엽 잡초, 난방제 잡초 등에 대하여 경엽처리 및 토영처리 결과 유의적인 살초력을 나타내므로, 잡초 방제용 제초제 조성물 및 잡초 방제 방법으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 기탁번호 KCTC 12156BP로 기탁된 스트렙토마이세스 스코풀리리디스(Streptomyces scopuliridis) KR-001 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열에 의한 계통수(phylogenetic tree)를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 균주 배양액의 경엽처리시 제초활성을 농도별로 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 균주 배양액의 각 분획(헥산, 에틸 아세테이트, 부탄올 및 물 분획)의 바랭이에 대한 경엽처리시 제초활성을 농도별로 나타낸 도이다:
Hexane Fr.: 헥산 분획물;
EtOAc Fr.:에틸아세테이트 분획물;
BuOH Fr.:부탄올 분획물;
AQ Fr: 물 분획물;
CK: 음성대조군.
도 4는 본 발명의 균주 배양액의 에틸 아세테이트 분획의 토양처리시 제초효과를 농도별로 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 균주 배양액의 에틸 아세테이트 분획의 경엽처리시 제초활성을 농도별로 나타낸 도이다.
도 6은 온실조건에서 본 발명의 균주의 에틸아세테이트 분획의 경엽처리시 가시박(Sciyos angulatus)에 대한 방제효과를 농도별로 나타낸 도이다.
도 7은 온실조건에서 본 발명의 균주의 에틸아세테이트 분획의 체내 이행을 통한 가시박 방제효과를 나타낸 도이다.
도 8은 포장조건에서 본 발명의 균주의 에틸아세테이트 분획의 경엽처리시 가시박에 대한 방제효과를 나타낸 도이다.
도 9는 포장조건에서의 환삼덩굴(Humulus japonicus Sieb. & Zucc.)에 대한 본 발명의 균주의 에틸아세테이트 분획의 방제효과를 농도별, 분획 처리 후 시간별로 나타낸 도이다.
도 10은 포장조건에서의 쑥(Artemisia princes Pampan)에 대한 본 발명의 균주의 에틸아세테이트 분획의 경엽처리시 방제효과를 농도별, 분획 처리 후 시간별로 나타낸 도이다.
도 11은 포장조건에서의 쇠뜨기(Equisetum arvense L.)에 대한 본 발명의 균주의 에틸아세테이트 분획의 경엽처리시 방제효과를 농도별, 분획 처리 후 시간별로 나타낸 도이다.
도 12는 포장조건에서의 클로버(Trifolium repens L.)에 대한 본 발명의 균주의 에틸아세테이트 분획의 경엽처리시 방제효과를 농도별, 분획 처리 후 시간별로 나타낸 도이다.
도 13은 온실조건에서의 벼, 밀, 보리 등의 화본과 작물 3종과 고추 및 토마토 등 광엽 작물 2종들에 대한 본 발명의 균주의 에틸아세테이트 분획의 농도별 약해를 나타낸 도이다.
도 14는 본 발명의 균주의 에틸아세테이트 분획(EA fr.), 비알라포스(Bialaphos) 및 글루포시네이트(Glufosinate)의 경엽처리에 의한 농도별 살초력을 비교한 도이다.
도 15는 본 발명의 균주의 에틸아세테이트 분획의 HPLC 결과를 나타낸 도이다.
도 16은 본 발명의 균주의 에틸아세테이트의 활성물질분획(EA-1, EA-3, EA-4, EA-5, EA-6 및 EA-7)의 살초력을 나타낸 도이다(EA : Ethyl Acetate fraction).
도 17은 본 발명의 균주의 에틸아세테이트 분획의 HPLC 결과 나타난 EA-3, EA-4 및 EA-5의 경엽처리에 의한 살초력을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 균주 배양액의 경엽처리시 제초활성을 농도별로 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 균주 배양액의 각 분획(헥산, 에틸 아세테이트, 부탄올 및 물 분획)의 바랭이에 대한 경엽처리시 제초활성을 농도별로 나타낸 도이다:
Hexane Fr.: 헥산 분획물;
EtOAc Fr.:에틸아세테이트 분획물;
BuOH Fr.:부탄올 분획물;
AQ Fr: 물 분획물;
CK: 음성대조군.
도 4는 본 발명의 균주 배양액의 에틸 아세테이트 분획의 토양처리시 제초효과를 농도별로 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 균주 배양액의 에틸 아세테이트 분획의 경엽처리시 제초활성을 농도별로 나타낸 도이다.
도 6은 온실조건에서 본 발명의 균주의 에틸아세테이트 분획의 경엽처리시 가시박(Sciyos angulatus)에 대한 방제효과를 농도별로 나타낸 도이다.
도 7은 온실조건에서 본 발명의 균주의 에틸아세테이트 분획의 체내 이행을 통한 가시박 방제효과를 나타낸 도이다.
도 8은 포장조건에서 본 발명의 균주의 에틸아세테이트 분획의 경엽처리시 가시박에 대한 방제효과를 나타낸 도이다.
도 9는 포장조건에서의 환삼덩굴(Humulus japonicus Sieb. & Zucc.)에 대한 본 발명의 균주의 에틸아세테이트 분획의 방제효과를 농도별, 분획 처리 후 시간별로 나타낸 도이다.
도 10은 포장조건에서의 쑥(Artemisia princes Pampan)에 대한 본 발명의 균주의 에틸아세테이트 분획의 경엽처리시 방제효과를 농도별, 분획 처리 후 시간별로 나타낸 도이다.
도 11은 포장조건에서의 쇠뜨기(Equisetum arvense L.)에 대한 본 발명의 균주의 에틸아세테이트 분획의 경엽처리시 방제효과를 농도별, 분획 처리 후 시간별로 나타낸 도이다.
도 12는 포장조건에서의 클로버(Trifolium repens L.)에 대한 본 발명의 균주의 에틸아세테이트 분획의 경엽처리시 방제효과를 농도별, 분획 처리 후 시간별로 나타낸 도이다.
도 13은 온실조건에서의 벼, 밀, 보리 등의 화본과 작물 3종과 고추 및 토마토 등 광엽 작물 2종들에 대한 본 발명의 균주의 에틸아세테이트 분획의 농도별 약해를 나타낸 도이다.
도 14는 본 발명의 균주의 에틸아세테이트 분획(EA fr.), 비알라포스(Bialaphos) 및 글루포시네이트(Glufosinate)의 경엽처리에 의한 농도별 살초력을 비교한 도이다.
도 15는 본 발명의 균주의 에틸아세테이트 분획의 HPLC 결과를 나타낸 도이다.
도 16은 본 발명의 균주의 에틸아세테이트의 활성물질분획(EA-1, EA-3, EA-4, EA-5, EA-6 및 EA-7)의 살초력을 나타낸 도이다(EA : Ethyl Acetate fraction).
도 17은 본 발명의 균주의 에틸아세테이트 분획의 HPLC 결과 나타난 EA-3, EA-4 및 EA-5의 경엽처리에 의한 살초력을 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 기탁번호 KCTC 12156BP로 기탁된 스트렙토마이세스 스코풀리리디스(Streptomyces scopuliridis) KR-001 균주를 제공한다.
본 발명에 따른 스트렙토마이세스 스코풀리리디스(Streptomyces scopuliridis) KR-001 균주(이하, KR-001 균주로 기재함)는 한국생명공학연구원(KRIBB)에서 충청북도 청원군 대청호 주변 산림토양으로부터 분리 및 배양을 통해 확보하여 -70℃ 초저온 냉장고(deep freezer)에 동결건조하여 보존하고 있는 균주를 분양받아 사용하였다.
KR-001 균주는 16S rRNA 유전자 상동성 검색에서, 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 RB72T와 99.7% 정도의 상동성을 나타내는 신규한 균주로 확인되었는 바, 이는 스트렙토마이세스 스코풀리리디스(Streptomyces scopuliridis)로 분류되었다.
본 발명자들은 상기 신규한 균주를 스트렙토마이세스 스코풀리리디스(Streptomyces scopuliridis) KR-001로 명명하여 한국생명공학연구원 생명자원센터(KCTC)에 2012년 03월 09일자로 기탁하여 수탁번호 KCTC 12156BP를 부여받았다.
또한, 본 발명은 기탁번호 KCTC 12156BP로 기탁된 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주, 이의 배양물, 상기 배양액의 추출물, 상기 배양액 또는 추출물의 분획물 및 상기 분획물의 활성분획으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 잡초 방제용 제초제 조성물을 제공한다.
상기 균주 배양액의 추출물은 유기용매로의 추출을 통해 얻어질 수 있으며, 바람직하게는 C1 ~ C4 알콜(예: 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), 헥산 및 에틸 아세테이트로 구성된 군으로부터 선택된 유기용매를 단독으로 사용하거나 2종 이상을 순차적으로 사용하여 추출을 수행할 수 있다.
상기 배양액 또는 추출물의 분획물은 헥산, 에틸 아세테이트, 부탄올 및 물을 용매로 사용하여 순차 분획 되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 활성분획은 상기 배양액 또는 추출물의 분획물을 컬럼 크로마토그래피에서 메탄올, 에탄올 또는 이들의 수용액을 용매로 사용하여 6 분 내지 7 분, 8 분 내지 10 분 또는 15 분 내지 20 분에서 용출된 분획이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 잡초는 화본과 잡초, 광엽 잡초, 난방제 잡초로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나가 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 화본과 잡초는 바랭이(Digotaris sanguinalis), 수수(Sorghum bicolor), 개밀(Agropyron smithii) 및 돌피(Echinochloa crus - galli)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나가 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 광엽 잡초는 까마중(Solanum nigrum), 자귀풀(Aeschynomeme indica), 어저귀(Abutilon avicennae), 도꼬마리(Xanthium strumarium) 및 메꽃(Calystegia japonica)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나가 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 난방제 잡초는 방제가 어려운 잡초로 가시박(Sicyos angulatus), 환삼덩굴(Humulus japonicus), 쑥(Artemisia princes), 쇠뜨기(Equisetum arvense) 및 클로버(Trifolium repens)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나가 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 배양액, 이의 추출물, 상기 배양액 또는 추출물의 분획물 또는 상기 분획물의 활성분획은 허비시딘 A(Herbicidin A), 허비시딘 B(Herbicidin B) 및 허비시딘 F(Herbicidin F)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 또는 2 이상이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 잡초 방제용 제초제 조성물은 담체 및/또는 희석제를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어, '담체'는 처리되어야 할 식물 또는 다른 대상체를 대상으로 이의 적용, 또는 이의 저장, 수송 및/또는 취급이 편리하도록 혼합되거나 만들어진 활성 성분을 갖는, 비활성의, 유기 또는 무기 물질을 의미한다. 상기 희석제 또는 담체의 예로는 물, 우유, 에탄올, 광유, 글리세롤을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명자들은 KR-001 균주의 배양액을 농도별로 3종의 화본과 잡초와 5종의 광엽 잡초에 경엽처리하여 살초력이 우수함을 확인하였다(표 3 및 도 2 참조).
본 발명자들은 상기 배양액을 헥산, 에틸 아세테이트, 부탄올 및 물 층으로 분획하여 각 용매별 분획물을 농도별로 4종의 화본과 잡초와 5종의 광엽 잡초에 경엽처리하여 에틸 아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물에서 살초력이 우수함을 확인하였다(표 4 및 도 3 참조).
본 발명자들은 상기 에틸 아세테이트 분획물을 농도별로 4종의 화본과 잡초와 5종의 광엽 잡초에 토양처리 및 경엽처리하여 상기 에틸 아세테이트 분획물의 살초력을 확인하였다(표 5 및 6, 도 4 및 5 참조).
본 발명자들은 상기 에틸 아세테이트 분획물이 온실조건에서 가시박에 경엽처리하여 2000 μg mL-1 및 1000 μg mL-1 농도에서 가시박을 완전하게 방제하였음을 확인하였다(도 6 참조).
본 발명자들은 상기 에틸 아세테이트 분획물이 온실조건에서 체내 이행을 통해 가시박 방제효과가 있음을 확인하였다(도 7 참조).
본 발명자들은 상기 에틸 아세테이트 분획물을 포장조건에서 가시박에 농도별로 경엽처리하여 살초력이 우수함을 확인하였고, 상기 살초력이 시간이 경과함에 따라 증진되어 약효지속성이 뛰어남을 확인하였다(표 7 및 도 8 참조).
본 발명자들은 상기 에틸 아세테이트 분획물을 포장조건에서 난방제 잡초인 환삼덩굴, 쑥, 쇠뜨기, 클로버에 경엽처리하여 우수한 살초력이 있음을 확인하였다(표 8, 도 9, 10, 11 및 12 참조).
본 발명자들은 상기 에틸 아세테이트 분획물을 화본과 작물(벼, 밀, 보리) 및 광엽 작물(고추, 토마토)에 경엽처리하여 대상작물 5종 모두 약해가 유발되어 작물 선택성은 없음을 확인하였다(표 9 및 도 13 참조).
본 발명자들은 상기 에틸 아세테이트 분획물, 비알라포스(Bialapos) 및 글루포시네이트(Glufosinate)를 동일한 농도로 경엽처리하여 살초력을 상호비교하였을 때, 에틸 아세테이트 분획물은 비알라포스와 글루포시네이트와 대등한 살초력이 있음을 확인하였다(도 14 참조).
본 발명자들은 상기 에틸 아세테이트 분획물의 활성물질을 컬럼 크로마토그래피에서 메탄올, 에탄올 또는 이들의 수용액을 용매로 사용하여 용출되는 분획을 검출하였다(도 15 참조). 상기 검출된 분획에서 허비시딘 A(Herbicidine A), 허비시딘 B(Herbicidine B) 및 허비시딘 F(Herbicidine F)를 분리하였다. 또한, 상기 검출된 분획, 즉 활성 분획의 살초력이 우수함을 확인하였다(도 16 및 17 참조).
따라서, 본 발명의 기탁번호 KCTC 12156BP로 기탁된 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주, 이의 배양물, 상기 배양액의 추출물, 상기 배양액 또는 추출물의 분획물 및 상기 분획물의 활성분획은 화본과 잡초, 광엽 잡초, 난방제 잡초에 대하여 우수한 살초력을 나타내므로 잡초 방제용 제초제 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 기탁번호 KCTC 12156BP로 기탁된 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 추출물, 상기 배양액 또는 추출물의 분획물 및 상기 분획물의 활성분획으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 잡초, 이의 종자 또는 이의 서식지에 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 잡초 방제 방법을 제공한다.
본 발명자들은 상기 배양액, 용매별 분획물, 에틸 아세테이트 분획물을 식물에 경엽처리하거나 토양에 처리할 수 있다. 이러한 상기 배양액, 용매별 분획물, 에틸 아세테이트 분획물은 분말, 거친 분말(coarse dust), 미세 과립(micro granule), 과립, 수화성 분말(wettable powder), 유제(emulsifiabl concentrate), 액체 용제, 현탁 농축물, 물 분해 과립 또는 오일 현탁액의 형태일 수 있다. 상기 배양액, 용매별 분획물, 에틸 아세테이트 분획물은 식물의 줄기와 잎에 직접 살포하는 경엽처리나 토양에 적용하는 토양처리 결과 화본과 잡초, 광엽 잡초, 난방제 잡초에 대하여 우수한 살초력이 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 기탁번호 KCTC 12156BP로 기탁된 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 추출물, 상기 배양액 또는 추출물의 분획물 및 상기 분획물의 활성분획은 경엽처리하거나 토양처리하는 경우 살초력이 뛰어나므로, 잡초, 이의 종자 또는 이의 서식지에 처리하는 잡초 방제 방법으로 유용하게 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1> 균주의 분리
충청북도 청원군 대청호 주변 산림토양으로부터 분리하여 HV 한천(Humic acid-Vitamin) 배지를 사용하였고, 세균 및 곰팡이의 생육을 억제하기 위하여 적정한 농도의 사이클로헥사마이드(cyclohexamide) 또는 날리딕스산(nalidixic acid)을 첨가하여 사용하였다. 토양시료 각 1 g을 멸균한 생리식염수 10 ml에 첨가하고 볼텍스(vortex)로 충분히 혼합한 후, 각 시료를 분리용 배지에 100 ul씩 도말하고 28℃에서 일정기간 동안 배양하며 관찰하였다. 배양기간 동안 주기적으로 배양상태를 관찰하며 배양된 콜로니를 새로운 배지에 접종하여 단일 콜로니를 순수 분리한 후 현미경으로 관찰하면서 선별하였으며, 방선균 분리배지 및 배양조건은 하기와 같다(표 1).
순수분리한 각 균주는 한천(agar) 배지상에서 배양한 후 균체를 모아 20% 멸균 글리세롤에 현탁하여 -70℃ 초저온 냉장고 상에서 보존하였다. 또한, 장기보존을 위해 동결건조 보존을 실시하였는데, 분리된 각 균주를 고체 배지에서 배양한 후 멸균한 10% 탈지유(skim milk)에 현탁하고 동결건조하여 4℃ 이하에 보존하였다.
| 미생물 | 분리배지 및 조성 | pH | 배양온도 | 배양기간 |
| 방선균 |
HV 한천 (g/ℓ) ·부식산(Humic acid) 1 ·Na2HPO4 0.5 ·KCl 1.71 ·MgSO47H2O 0.05 ·FeSO47H2O 0.01 ·CaCO3 0.02 ·한천 18 |
pH 7.2 |
28℃ |
7-30 일 |
<
실시예
2> 균주의 동정
상기 <실시예 1> 에서 분리한 균주의 동정을 위하여 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 수행하였다.
구체적으로, 균주의 16S rRNA 유전자의 염기서열을 얻기 위하여 콜로니(colony) PCR을 수행하였다. 단일 콜로니로부터 이쑤시개를 이용해서 채취하여 PCR-premix(iNtRON Biotechnology, Korea)와 혼합 후 27f와 1492r 프라이머를 이용하여 16S rRNA 유전자를 증폭하였다. 증폭된 PCR산물은 Wizard PCR prep 키트(Promega, Medison, WI, USA)을 사용하여 정제한 후, 마크로젠(Daejon, Korea)에 의뢰하여 염기서열을 얻었다. 염기서열은 NCBI의 BLSAT을 이용하여 GenBank 데이터베이스와 염기서열을 비교하였다. CLUSTAL X으로 염기서열을 정렬하고, PHYDIT program version 3.0을 사용하여 neighbour-joining tree를 작성하였다. 균주의 16S rRNA 유전자의 염기서열(서열번호: 1)을 neighbour-joining 알고리즘을 바탕으로 분석하였다.
그 결과, 본 균주는 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 RB72T와 99.7% 정도의 상동성을 나타내는 신규한 균주임을 알 수 있었다(도 1). 본 발명에서 사용한 균주는 스트렙토마이세스 스코풀리리디스(Streptomyces scopuliridis) 균주로 동정되었다. 상기 균주를 스트렙토마이세스 스코풀리리디스(Streptomyces scopuliridis) KR-001로 명명하고 2012년 03월 09일자로 한국생명공학연구원 생명자원센터에 기탁번호 KCTC 12156BP호로서 기탁하였다.
<
실시예
3>
스트렙토마이세스
스코풀리리디스
KR
-001 균주 배양액의 농도별
경엽처리시
활성 측정
상기 <실시예 1>로부터 수득한 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주 배양액의 경엽처리시 활성을 측정하기 위하여 하기와 같은 방법을 실험을 진행하였다.
구체적으로, 500 ml의 배플드(baffled) 플라스크에 베넷(Bennet) 액체 배지 500 ml를 넣고 전배양 한 배양액을 1% 접종하여 27℃, 180 rpm에서 7일간 배양한 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주 배양액의 상징액을 취하여 1, 1/2, 1/4 농도로 희석하여(Tween-20 0.1% 포함) 3종의 화본과 잡초(바랭이, 수수, 돌피)와 5종의 광엽 잡초(까마중, 자귀풀, 어저귀, 도꼬마리, 메꽃)를 대상으로 폿트당 14 ml량으로 경엽처리하여 5일 후에 살초력을 외형적인 증상 및 약효를 약해 기준표에 의해 달관조사를 통해 평가하였다. 이때, 베넷 배지의 조성 성분은 하기 [표 2]에 나타내었다.
그 결과, 도 2 및 표 3에 나타낸 바와 같이, 배양액 원액에서의 8개 초종에 대한 살초력은 90% 내지 100%이었고, 1/2 농도에서도 70% 내지 100%이었다. 대상 잡초 중에서 바랭이, 까마중, 자귀풀 등에 대한 살초력이 상대적으로 강하게 발현되었다. 배양액 처리 후 시간이 경과 할수록 살초력이 증가되어 약효지속 효과가 있었으며, 주요 증상은 고사(burndown)이었고, 1/4 농도에서는 일부 화본과 초종이 자색으로 변하였음을 확인할 수 있었다(표 3 및 도 2).
| 조성 성분 | g/L |
| 글루코스(Glucose) | 10 |
| 효모 추출물(Yeast extract) | 1 |
| 펩톤(Peptone) | 2 |
| 육추출물(Beef extract) | 1 |
| Rate (folds) |
살초력(%) | |||||||
| 바랭이 | 수수 | 돌피 | 까마중 | 자귀풀 | 어저귀 | 도꼬마리 | 메꽃 | |
| 1 | 100 | 90 | 95 | 100 | 100 | 100 | 100 | 95 |
| 1/2 | 100 | 80 | 70 | 100 | 100 | 70 | 90 | 80 |
| 1/4 | 95 | 50 | 20 | 80 | 100 | 50 | 70 | 20 |
바랭이(DIGSA, Digotaris sanguinalis), 수수(SORBI, Sorghum bicolor), 돌피(ECGCG, Echinochloa crus - galli), 까마중(SOLNI, Solanum nigrum), 자귀풀(AESIN, Aeschynomeme indica), 어저귀(ABUTH, Abutilon avicennae), 도꼬마리(XANSI, Xanthium strumarium), 메꽃(CAGEH, Calystegia japonica)
<
실시예
4>
스트렙토마이세스
스코풀리리디스
KR
-001 균주 배양액의 용매
분획별
경엽처리시 활성 측정
상기 <실시예 3>으로부터 수득한 배양액의 용매 분획별 살초력을 측정하기 위하여 하기와 같이 실험을 진행하였다.
구체적으로, 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주 배양액을 헥산, 에틸 아세테이트, 부탄올 및 물 층으로 분획하였다. 바랭이를 대상으로 각 용매별 분획물을 8 μg mL-1, 16 μg mL-1, 32 μg mL-1, 63 μg mL-1, 125 μg mL-1, 250 μg mL-1 및 500 μg mL-1 농도로 경엽처리하여 5일 후에 살초력을 외형적인 증상 및 약효를 약해 기준표에 의해 달관조사를 통해 평가하였다.
그 결과, 도 3 및 표 4에 나타낸 바와 같이, 헥산과 물 층에서는 전혀 활성이 없었고, 에틸 아세테이트와 부탄올 층에서 활성이 발현되었는데, 특히 에틸 아세테이트 층에서 가장 강력한 살초력을 확인하였다. 에틸 아세테이트 8 μg mL-1, 16 μg mL-1, 32 μg mL-1, 63 μg mL-1, 125 μg mL-1, 250 μg mL-1 및 500 μg mL-1 농도에서의 바랭이에 대한 살초력은 각각 80%, 90%, 95%, 100%, 100%, 100% 및 100%로 강력한 살초력이 나타났음을 확인할 수 있었다. 이때, 각 용매 분획별 활성물질의 수율은 헥산 분획 0.03%, 에틸 아세테이트 분획 3.61%, 부탄올 분획 17.84%, 물 분획 73.67%인 것을 확인하였다(표 4 및 도 3).
| 용매 층 | 살초력(%) | ||||||
| 500(μg mL-1) | 250 | 125 | 63 | 32 | 16 | 8 | |
| 헥산 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 에틸 아세테이트 | 100 | 100 | 100 | 100 | 95 | 90 | 80 |
| 부탄올 | 80 | 70 | 50 | 20 | 0 | 0 | 0 |
| 물 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
<
실시예
5>
스트렙토마이세스
스코풀리리디스
KR
-001 균주 배양액의
분획물의
토양처리시 효과 측정
상기 <실시예 4>로부터 수득한 본 발명의 균주 배양액의 분획물의 토양처리효과를 측정하기 위하여 하기와 같이 실험을 진행하였다.
구체적으로, 처리 1일 전에 4종의 화본과 잡초(바랭이, 수수, 돌피, 개밀)와 5종의 광엽 잡초(까마중, 자귀풀, 어저귀, 도꼬마리, 메꽃)를 파종하여 온실조건(30/20±5℃, Light/Dark=14/10시간)에서 관리 후, 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주 배양액의 에틸 아세테이트 분획을 2000 μg mL-1, 1000 μg mL-1, 500 μg mL-1, 250 μg mL-1, 125 μg mL-1 농도로 조제하여 분무처리하였으며, 처리 15일 후에 외형적인 증상 및 약효를 약해 기준표에 의해 달관조사(0% 내지 100%)하였다.
그 결과, 도 4 및 표 5에 나타낸 바와 같이, 에틸 아세테이트 분획 2000 μg mL-1 농도에서의 대상잡초 종에 대한 살초력은 95% 내지 100%이었으며, 1000 μg mL-1 농도에서도 수수와 어저귀를 제외한 전 초종에 대해 완전한 방제활성(100%)을 나타내었다. 2000 μg mL-1 및 1000 μg mL-1 농도에서 수수와 어저귀의 경우에 지상부로 출현은 되었지만 고사되었고, 다른 초종은 지상부로 출현하지 않았는데 이러한 현상은 각 잡초 종자 발아 후, 처리 층을 통과하면서 에틸 아세테이트 분획에 접촉되어 고사된 것으로 추측하였다. 실험대상 초종 중 바랭이, 개밀, 까마중, 도꼬마리, 메꽃은 500 μg mL-1 농도에서 완전 고사되었고, 개밀은 250 μg mL-1, 메꽃은 125 μg mL-1 농도에서도 완전 고사하여 가장 감수성이 좋은 종임을 확인할 수 있었다(도 4 및 표 5).
| 농도 (μg mL-1) |
살초력(%) | ||||||||
| 바랭이 | 수수 | 돌피 | 개밀 | 까마중 | 자귀풀 | 어저귀 | 도꼬마리 | 메꽃 | |
| 2000 | 100 | 95 | 100 | 100 | 100 | 100 | 95 | 100 | 100 |
| 1000 | 100 | 95 | 100 | 100 | 100 | 100 | 90 | 100 | 100 |
| 500 | 100 | 20 | 70 | 100 | 100 | 40 | 40 | 100 | 100 |
| 250 | 90 | 0 | 0 | 100 | 70 | 0 | 30 | 80 | 100 |
| 125 | 50 | 0 | 0 | 50 | 60 | 0 | 0 | 0 | 100 |
| 62.5 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
<
실시예
6>
스트렙토마이세스
스코풀리리디스
KR
-001 균주 배양액
분획물의
경엽처리시
활성 측정
상기 <실시예 4>로부터 수득한 본 발명의 균주 배양액의 분획물의 경엽처리시 활성을 측정하기 위하여 하기와 같이 실험을 진행하였다.
구체적으로, 4종의 화본과 잡초(바랭이, 수수, 돌피, 개밀)와 5종의 광엽 잡초(까마중, 자귀풀, 어저귀, 도꼬마리, 메꽃)를 파종하여 온실조건에서 9일 동안 생육시킨 후, 상기 <실시예 4>로부터 수득한 본 발명의 균주 배양액의 에틸 아세테이트 분획을 약제조제액(50% 아세톤, Tween-20 0.1% 포함)으로 2000 μg mL-1, 1000 μg mL-1, 500 μg mL-1, 250 μg mL-1, 125 μg mL-1, 62.5 μg mL-1 농도가 되도록 희석 조제하여 분무경엽 처리하였고, 처리 12일 후에 외형적인 증상 및 약효를 약해 기준표에 의해 달관조사(0% 내지 100%)하였다.
그 결과, 도 5 및 표 6에 나타낸 바와 같이, 2000 μg mL-1 및 1000 μg mL-1 처리농도에서의 9종 잡초에 대한 살초력은 95% 내지 100%로 강력한 활성을 나타내었으며, 500 μg mL-1 농도에서도 80% 내지 100%로 우수하였다. 약제처리 초기에 외형적인 증상이 발현되어 처리일자가 경과함에 따라 효과가 증가되어 발현되었고, 약제처리 10일 이후에도 살초력이 유지되어 잔효지속성이 있음을 확인할 수 있었다. 주요 증상은 처리 초기에 수침상이 형성되었다가 시간이 경과하면서 고사되어 결국 낙엽화되었다. 250 μg mL-1 이하 농도에서도 초종에 따라서는 강력한 살초력을 나타내었는데 수수, 까마중, 자귀풀은 62.5 μg mL-1 농도에서도 95% 이상의 살초력을 나타냄을 확인할 수 있었다(도 5 및 표 6).
| 농도 (μg mL-1) |
살초력(%) | ||||||||
| 바랭이 | 수수 | 돌피 | 개밀 | 까마중 | 자귀풀 | 어저귀 | 도꼬마리 | 메꽃 | |
| 2000 | 95 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 1000 | 95 | 100 | 95 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 500 | 90 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 95 | 100 | 100 |
| 250 | 80 | 100 | 60 | 90 | 100 | 100 | 70 | 100 | 100 |
| 125 | 50 | 100 | 40 | 90 | 100 | 100 | 40 | 90 | 100 |
| 62.5 | 40 | 95 | 20 | 80 | 95 | 100 | 30 | 90 | 70 |
<
실시예
7>
스트렙토마이세스
스코풀리리디스
KR
-001 균주 배양액
분획물의
온실조건에서의 가시박(
Sicyos angulatus
)에 대한
경엽처리
방제효과 확인
상기 <실시예 4>로부터 수득한 본 발명의 균주 배양액의 분획물의 온실조건에서의 가시박(Sicyos angulatus)에 대한 경엽처리시 방제효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 실험을 진행하였다.
구체적으로, 온실조건에서 3 엽기까지 생육시킨 가시박에 상기 에틸 아세테이트 분획을 2000 μg mL-1 및 1000 μg mL-1 농도로 경엽처리하여 7일 후에 달관조사하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 경엽처리 후, 24시간이 경과하면서 외형적인 증상이 발현되기 시작하여 5일이 지나면서 2000 μg mL- 1와 1000 μg mL-1 농도에서 모두 가시박이 완전하게 억제되었음을 확인할 수 있었다(도 6).
<
실시예
8>
스트렙토마이세스
스코풀리리디스
KR
-001 균주 배양액의
분획물의
온실조건에서의 체내 이행을 통한
가시박
방제효과 확인
상기 <실시예 4>로부터 수득한 본 발명의 균주 배양액의 분획물의 온실조건에서의 체내 이행을 통한 가시박 방제효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 실험을 진행하였다.
구체적으로, 온실조건에서 가시박을 파종하여 3 엽이 전개되었을 때, 3 엽 줄기에 1000 μg mL-1 농도로 상기 조제한 에틸 아세테이트 분획물을 거즈에 적셔서 알루미늄 호일로 실링(sealing)하여 국부처리 한 다음, 암 조건에서 24시간 두어 식물체 내로 충분히 흡수되도록 하였다. 처리 24시간 후, 거즈 및 알루미늄 호일을 제거하고 동일한 온실조건에서 관리하면서 매일 이행 여부를 관찰하다가 처리 6일 후에 달관조사하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 국부처리 후 2일이 경과하면서 외형적인 증상이 발현되기 시작하였고, 6일 후에 무처리 가시박은 7 엽까지 전개되었으나, 처리된 가시박에서는 4 엽까지만 전개되었을 뿐만 아니라 상위엽인 4 엽과 하위엽인 2 엽의 주변으로부터 고사가 진행되고 있음을 확인할 수 있었다. 따라서 에틸 아세테이트 분획물은 상향이행과 하향이행이 동시에 이루어지는 것을 확인하였다(도 7).
<
실시예
9>
스트렙토마이세스
스코풀리리디스
KR
-001 균주 배양액의
분획물의
포장조건에서의
가시박에
대한
경엽처리시
방제효과 확인
상기 <실시예 4>로부터 수득한 본 발명의 균주 배양액의 분획물의 포장조건에서의 가시박에 대한 경엽처리시 방제효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 실험을 진행하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 4>로부터 수득한 본 발명의 균주 배양액의 에틸 아세테이트 분획은 환경부에서“생태계교란 야생식물”로 지정한 환경위해 식물인 가시박에 대해 온실조건에서 강력한 방제효과가 있음을 확인한바, 실제 포장조건에서의 현장적용평가를 실시하였다. 포장시험 장소는 경기도 양평군 개군면 앙덕리 31-15번지 소재의 앙덕리 마을회관 앞 남한강변 지역이었으며, 시험기간은 2011년 09월 22일부터 2011년 10월 06일까지 수행하였다. 약제처리시 가시박 생육상황은 10 엽기 내지 15 엽기로 길이는 2 m 내지 3 m이었으며, 처리 구획은 1 m × 1 m로 하여 각 농도별로 300 mL씩 처리하였다. 상기 에틸 아세테이트 분획의 최종 농도가 2000 μg mL-1 및 4000 μg mL-1 농도가 되도록 칭량하여 소량의 아세톤으로 용해시킨 후 약제조제액(50% 아세톤, Tween-20 0.1% 포함)으로 희석조제하였고, 처리 5일, 8일 및 14일 후에 육안으로 달관조사하였다.
그 결과, 도 8 및 표 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 균주 배양액의 에틸 아세테이트 분획의 포장조건에서의 가시박에 대한 살초력은 약제처리 후 시간이 경과함에 따라 증진되고, 약효지속성이 뛰어난 것으로 나타났는데, 4000 μg mL-1 농도에서 처리 5일, 8일 및 14일 후의 가시박 방제효과는 각각 50%, 90% 및 100%이었으며, 2000 μg mL-1에서의 방제효과는 각각 40%, 70% 및 80%이었다. 통상 천연물 유래의 제초활성 물질은 속효성이어서 약제 처리 수 시간 내에 약효가 발현되기 시작하며, 약효지속기간이 짧아서 약제 처리 후 일정기간이 경과하면 재생되는 것이 일반적인 현상으로 알려져 있는데, 상기 에틸 아세테이트 분획은 2주일 후에도 살초력이 유지되어 약효지속성이 우수한 특성을 확인할 수 있었다. 또한, 약제가 처리된 잎 아랫부분에 위치한 줄기가 모잘록병과 같이 부러지는 현상을 고려할 때 약제가 처리된 잎은 물론이고 아래 줄기 쪽으로 이행하는 것으로 판단하였다(도 8 및 표 7)
| 농도 (μg mL-1) |
살초력(%) | ||
| 5 DAT | 8 DAT | 14 DAT | |
| 4000 | 50 | 90 | 100 |
| 2000 | 40 | 70 | 80 |
DAT: Days after treatment(약제처리 후 일수)
<
실시예
10>
스트렙토마이세스
스코풀리리디스
KR
-001 균주 배양액
분획물의
난방
제 잡초(환삼덩굴, 쑥, 쇠뜨기, 클로버)에 대한
경엽처리시
방제효과
상기 <실시예 4>로부터 수득한 본 발명의 균주 배양액의 분획물의 포장조건에서의 환삼덩굴이나 쑥, 쇠뜨기 또는 클로버와 같은 방제가 어려운 잡초에 대한 방제효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 실험을 진행하였다.
구체적으로, 시험은 대전광역시 유성구 한국화학연구원 포장주변에서 시험 대상 잡초가 자생하고 있는 지역을 선정하여 수행하였으며, 시험기간은 2011년 10월 4일부터 2011년 10월 16일이었다. 처리 구획은 1 m x 1 m로 하여 각 농도별로 200 mL씩 처리하였다. 상기 <실시예 4>로부터 수득한 본 발명의 균주 배양액의 에틸 아세테이트 분획의 최종 처리농도가 2000 μg mL-1 및 4000 μg mL-1 농도가 되도록 칭량하여 소량의 아세톤으로 용해시킨 후 약제조제액(50% 아세톤, Tween-20 0.1% 포함)으로 희석조제하여 처리하였다. 약제처리 후 환삼덩굴은 5일, 10일, 15일 후, 쑥과 쇠뜨기는 5일, 8일, 10일 후, 클로버는 4일, 8일, 12일 후에 육안으로 달관조사하였다.
<10-1> 환삼덩굴(
Humulus
japonicus
) 방제효과 확인
도 9 및 표 8에 나타낸 바와 같이, 상기 <실시예 4>로부터 수득한 본 발명의 균주 배양액의 에틸 아세테이트 분획은 환삼덩굴(Humulus japonicus)에 대해 뛰어난 방제효과를 나타냈는데, 2000 μg mL-1 및 4000 μg mL-1 농도에서 처리 5일 후에는 각각 40% 및 30% 정도의 방제효과 나타내다가 이후 급속하게 효과가 진전되어 10일 후에는 각각 100%와 95%, 15일 후에는 처리농도 모두 100%의 살초력을 나타내었다(표 8 및 도 9). 가시박에서 나타났던 현상과 동일하게 처리 후 시간이 경과하면서 살초력이 계속 증가되어 처리 15일 이후까지 살초력이 유지되어 약효지속효과가 지속되는 특성이 있음을 확인할 수 있었다.
| 농도 (μg mL-1) |
살초력(%) | |||
| 환삼덩굴 | 쑥 | 쇠뜨기 | 클로버 | |
| 4000 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 2000 | 100 | 100 | 100 | |
<10-2> 쑥(
Artemisia
princeps
) 방제효과 확인
도 10 및 표 8에 나타낸 바와 같이, 상기 <실시예 4>로부터 수득한 본 발명의 균주 배양액의 에틸 아세테이트 분획은 쑥(Artemisia princeps)에 대해 뛰어난 방제효과를 나타냈는데, 2000 μg mL-1 및 4000 μg mL-1 농도에서 쑥에 대하여 완전한 방제효과를 나타내었는데, 처리 3일이 지나면서 효과가 발현되기 시작하여 5일 후에는 4000 μg mL-1 농도에서는 완전하게 방제되었고, 2000 μg mL-1 농도에서도 80%이었다가 8일 후에는 두 농도 모두 100%로 나타나 살초력이 유지되고 있음을 확인할 수 있었다(표 8 및 도 10).
<10-3> 쇠뜨기(
Equisetum
arvense
) 방제효과 확인
도 11 및 표 8에 나타낸 바와 같이, 상기 <실시예 4>로부터 수득한 본 발명의 균주 배양액의 에틸 아세테이트 분획은 쇠뜨기(Equisetum arvense)에 대해 뛰어난 방제효과를 나타냈는데, 약효발현이 매우 빨라서 처리 5일 후에 4000 μg mL-1 및 2000 μg mL-1 농도에서 각각 95%와 90%의 살초력을 나타내었고, 8일 이후에는 완전고사되었다(표 8 및 도 11).
<10-4> 클로버(
Trifolium
repens
) 방제효과 확인
도 12 및 표 8에 나타낸 바와 같이, 상기 <실시예 4>로부터 수득한 본 발명의 균주 배양액의 에틸 아세테이트 분획은 클로버(Trifolium repens)에 대해 뛰어난 방제효과를 나타냈는데, 처리 4일이 지나면서 잎에 반점이 형성되어 진행되다가 8일 이후에 잎이 완전하게 고사되고 12일 이후에는 줄기까지 고사되어 약효발현 속도가 빠를 뿐만 아니라 살초력이 유지되고 있음을 확인하였다(표 8 및 도 12).
<
실시예
11>
스트렙토마이세스
스코풀리리디스
KR
-001 균주 배양액
분획물의
온실조건에서의 작물선택성 평가
상기 <실시예 4>로부터 수득한 본 발명의 균주 배양액의 분획물의 작물선택성을 평가하기 위하여 하기와 같이 실험을 진행하였다.
구체적으로, 가시박을 포함한 다양한 종류의 잡초에 대한 탁월한 살초력을 확인한 상기 <실시예 4>로부터 수득한 본 발명의 균주 배양액의 에틸 아세테이트 분획의 작물선택성을 확인하였다. 대상작물은 벼, 밀, 보리 등의 화본과 작물 3종과 고추 및 토마토 등 광엽 작물 2종이었으며, 처리 당시, 각각의 작물의 생육상황은 벼 3.5 엽, 밀 1.2 엽, 보리 1 엽, 고추 7.3 엽, 토마토 4.4 엽이었다. 처리농도는 4000 μg mL-1, 2000 μg mL-1, 1000 μg mL-1, 500 μg mL-1, 250 μg mL-1 및 125 μg mL-1이었고, 처리 14일 후에 작물에 대한 약해 정도를 육안으로 달관조사하였다.
그 결과, 도 13 및 표 9에 나타낸 바와 같이, 대상작물 5종 모두 약해가 유발되어 작물 선택성은 없는 것을 확인하였다. 특히, 광엽 작물인 고추와 토마토에서 심한 약해가 유발되었는데, 토마토의 경우에는 처리한 전 농도범위에서 100%의 약해가 유발되어 가장 심하였으며, 고추에서도 처리범위에서 70% 내지 100%의 약해가 유발되었다. 화본과 작물에서는 광엽 작물에 비해 상대적으로 약해가 다소 낮게 발현되었으나 보리의 경우에는 처리농도 범위에서 50% 내지 80%이었으며, 벼와 밀에서는 30% 이하의 약해 만이 발현되어 상대적으로 낮았다. 따라서 방선균 유래의 제초활성물질은 작물 선택성이 없기 때문에 비선택적으로 사용되어야 할 것을 확인하였다(도 13 및 표 9).
| 작물 | 약해(%) | |||||
| 4000(μg mL-1) | 2000 | 1000 | 500 | 250 | 125 | |
| 벼 | 30 | 30 | 10 | 10 | 5 | 0 |
| 밀 | 30 | 30 | 30 | 20 | 20 | 20 |
| 보리 | 80 | 80 | 80 | 70 | 60 | 50 |
| 고추 | 90 | 90 | 90 | 90 | 80 | 70 |
| 토마토 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
<
실시예
12>
스트렙토마이세스
스코풀리리디스
KR
-001 균주 배양액
분획물과
대조화합물의
살초력
비교
상기 <실시예 4>로부터 수득한 배양액의 분획물의 살초력을 확인하기 위하여, 비알라포스(Bialaphos) 및 글루포시네이트(Glufosinate)의 살초력을 상호 비교하였다.
구체적으로, 표면적 350 cm2 플라스틱 사각 폿트에 원예용 상토를 담은 후, 바랭이를 포함한 화본과 잡초 4종, 까마중을 포함한 광엽 잡초 3종을 각각 파종하여 온실조건(25±3℃, 14/10h = Light/dark)에서 파종 15일 후에 배양액의 에틸 아세테이트 분획, 비알라포스(Bialaphos) 및 글루포시네이트(Glufosinate)를 약제조제액(아세톤 50%, Tween-20 0.1% 포함)으로 250, 500 및 1000 μg mL-1 농도가 되도록 희석조제하여 14 ml/pot량으로 경엽처리하여 13일 후에 살초력을 달관조사하였다.
그 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이, 상기 <실시예 4>로부터 수득한 본 발명의 균주 배양액의 에틸 아세테이트 분획과 비알라포스(Bialaphos) 및 글루포시네이트(Glufosinate)는 250 μg mL-1, 500 μg mL-1 및 1000 μg mL-1 농도에서 대등한 수준의 살초력을 나타냈음을 확인하였다(도 14). 따라서 본 발명의 균주 배양액의 에틸 아세테이트분획의 살초력은 대조화합물인 비알라포스(Bialaphos) 또는 글루포시네이트(Glufosinate)와 유사하다고 판단된다.
<
실시예
13>
스트렙토마이세스
스코풀리리디스
KR
-001 균주 배양액의
분획물의
제초 활성물질 확인
상기 <실시예 4>로부터 수득한 본 발명의 균주 배양액의 분획물의 제초 활성물질을 확인하기 위해 하기와 같이 실험을 진행하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 4>로부터 수득한 본 발명의 균주 배양액의 에틸 아세테이트 분획에 대하여 HPLC를 진행하였다. 분석조건은 다음과 같다(표 10).
그 결과, Rt. 6분 50초, 9분 10초 그리고 15분 30초에 피크(Peak)를 확인하였다(도 15).
| 용매(Solvent) | 40% MeOH |
| 컬럼(Column) | C-18 |
| 온도 | 40℃ |
| 플로우(Flow) | 1ml/min |
| UV | 254 nm |
<
실시예
14>
스트렙토마이세스
스코풀리리디스
KR
-001 균주 배양액의 에틸 아세테이트 활성물질분획의 화합물 및
살초력
확인
상기 <실시예 12>로부터 수득한 Rt. 6분50초, 9분 10초 및 15분 30초의 화합물 및 이의 살초력을 확인하기 위하여 하기와 같이 실험을 진행하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 12>로부터 수득한 Rt. 6분50초, 9분 10초 및 15분 30초의 화합물을 상기의 분석조건(표 10)으로 Prep-HPLC를 실시하여, fr. 1 - 7로 나누었다. 각 분획을 바랭이를 대상으로 112.5 μg mL-1, 225 μg mL-1, 450 μg mL-1 및 900 μg mL-1 농도로 경엽처리하여 5일 후에 살초력을 외형적인 증상 및 약효를 약해 기준표에 의해 달관조사를 통해 평가하였다.
그 결과, 도 16에 나타낸 바와 같이, fr. 3번, 4번 및 5에서 우수한 살초력을 확인하였다. 우수한 살초력을 보인 fr. 3번, 4번 및 5번을 분리 정제한 후 문헌과의 데이터 비교를 통해 Rt. 6분 50초, 9분 10초 및 15분 30초의 구조를 Herbicidin B, Herbicidin A 및 Herbicidin F로 확정하였다(The Journal of Antibiotics 1982, 35 1711-1714.)(도 16).
서열목록 전자파일 첨부
Claims (10)
- 기탁번호 KCTC 12156BP로 기탁된 스트렙토마이세스 스코풀리리디스(Streptomyces scopuliridis) KR-001 균주.
- 기탁번호 KCTK 12156BP로 기탁된 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 분획물 및 상기 분획물의 활성분획으로 구성된 군으로 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하고, 상기 배양액의 분획물을 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물을 용매로 사용하여 순차 분획된 것인 잡초 방제용 제초제 조성물.
- 삭제
- 제 2항에 있어서 상기 활성분획은 상기 배양액 분획물을 컬럼 크로마토그래피에서 메탄올, 에탄올 또는 이들의 수용액을 용매로 사용하여 6 분 내지 7 분, 8 분 내지 10 분 또는 15 분 내지 20 분에서 용출된 분획인 것을 특징으로 하는 잡초 방제용 제초제 조성물.
- 제 2항에 있어서, 상기 잡초는 화본과 잡초, 광엽 잡초 또는 난방제 잡초인 것을 특징으로 하는 잡초 방제용 제초제 조성물.
- 제 5항에 있어서, 상기 화본과 잡초는 바랭이(Digotaris sanguinalis), 수수(Sorghum bicolor), 개밀(Agropyron amithii) 및 돌피(Echinochloa crus - galli)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 잡초 방제용 제초제 조성물.
- 제 5항에 있어서, 상기 광엽 잡초는 까마중(Solanum nigrum), 자귀풀(Aeschynomeme indica), 어저귀(Abutilon avicennae), 도꼬마리(Xanthium strumarium) 및 메꽃(Calystegia japonica)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 잡초 방제용 제초제 조성물.
- 제 5항에 있어서, 상기 난방제 잡초는 가시박(Sicyos angulatus), 환삼덩굴(Humulus japonicus), 쑥(Artemisia princeps), 쇠뜨기(Equisetum arvense) 및 클로버(Trifolium repens)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 잡초 방제용 제초제 조성물.
- 기탁번호 KCTC 12156BP로 기탁된 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 분획물 및 상기 분획물의 활성분획으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 잡초, 이의 종자 또는 이의 서식지에 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 잡초 방제 방법.
- 제 9항에 있어서, 상기 잡초는 화본과 잡초, 광엽 잡초 또는 난방제 잡초인 것을 특징으로 하는 잡초 방제 방법.
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