KR101400900B1 - A composition for differentiating natural killer cell or enhancing natural killer cell activation containing tanshinone as active ingredient - Google Patents
A composition for differentiating natural killer cell or enhancing natural killer cell activation containing tanshinone as active ingredient Download PDFInfo
- Publication number
- KR101400900B1 KR101400900B1 KR1020120007819A KR20120007819A KR101400900B1 KR 101400900 B1 KR101400900 B1 KR 101400900B1 KR 1020120007819 A KR1020120007819 A KR 1020120007819A KR 20120007819 A KR20120007819 A KR 20120007819A KR 101400900 B1 KR101400900 B1 KR 101400900B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- cells
- natural killer
- differentiation
- tanshinone
- hematopoietic stem
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- E—FIXED CONSTRUCTIONS
- E06—DOORS, WINDOWS, SHUTTERS, OR ROLLER BLINDS IN GENERAL; LADDERS
- E06B—FIXED OR MOVABLE CLOSURES FOR OPENINGS IN BUILDINGS, VEHICLES, FENCES OR LIKE ENCLOSURES IN GENERAL, e.g. DOORS, WINDOWS, BLINDS, GATES
- E06B3/00—Window sashes, door leaves, or like elements for closing wall or like openings; Layout of fixed or moving closures, e.g. windows in wall or like openings; Features of rigidly-mounted outer frames relating to the mounting of wing frames
- E06B3/54—Fixing of glass panes or like plates
- E06B3/58—Fixing of glass panes or like plates by means of borders, cleats, or the like
- E06B3/5807—Fixing of glass panes or like plates by means of borders, cleats, or the like not adjustable
- E06B3/5821—Fixing of glass panes or like plates by means of borders, cleats, or the like not adjustable hooked on or in the frame member, fixed by clips or otherwise elastically fixed
- E06B3/5828—Fixing of glass panes or like plates by means of borders, cleats, or the like not adjustable hooked on or in the frame member, fixed by clips or otherwise elastically fixed on or with auxiliary pieces
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
- A61K31/34—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having five-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom, e.g. isosorbide
- A61K31/343—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having five-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom, e.g. isosorbide condensed with a carbocyclic ring, e.g. coumaran, bufuralol, befunolol, clobenfurol, amiodarone
-
- E—FIXED CONSTRUCTIONS
- E06—DOORS, WINDOWS, SHUTTERS, OR ROLLER BLINDS IN GENERAL; LADDERS
- E06B—FIXED OR MOVABLE CLOSURES FOR OPENINGS IN BUILDINGS, VEHICLES, FENCES OR LIKE ENCLOSURES IN GENERAL, e.g. DOORS, WINDOWS, BLINDS, GATES
- E06B3/00—Window sashes, door leaves, or like elements for closing wall or like openings; Layout of fixed or moving closures, e.g. windows in wall or like openings; Features of rigidly-mounted outer frames relating to the mounting of wing frames
- E06B3/04—Wing frames not characterised by the manner of movement
- E06B3/06—Single frames
- E06B3/08—Constructions depending on the use of specified materials
- E06B3/12—Constructions depending on the use of specified materials of metal
-
- E—FIXED CONSTRUCTIONS
- E06—DOORS, WINDOWS, SHUTTERS, OR ROLLER BLINDS IN GENERAL; LADDERS
- E06B—FIXED OR MOVABLE CLOSURES FOR OPENINGS IN BUILDINGS, VEHICLES, FENCES OR LIKE ENCLOSURES IN GENERAL, e.g. DOORS, WINDOWS, BLINDS, GATES
- E06B3/00—Window sashes, door leaves, or like elements for closing wall or like openings; Layout of fixed or moving closures, e.g. windows in wall or like openings; Features of rigidly-mounted outer frames relating to the mounting of wing frames
- E06B3/54—Fixing of glass panes or like plates
- E06B3/58—Fixing of glass panes or like plates by means of borders, cleats, or the like
- E06B3/5807—Fixing of glass panes or like plates by means of borders, cleats, or the like not adjustable
- E06B3/5842—Fixing of glass panes or like plates by means of borders, cleats, or the like not adjustable fixed by a tongue-and-groove or mortise-and-tenon connection substantially parallel to the pane
Abstract
본 발명은 탄시논(tanshinone)을 유효성분으로 함유하는 자연살해세포(natural killer cell, NK 세포) 분화 또는 활성 증진용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 크립토탄시논(cryptotanshinone) 또는 탄시논 ⅡA(tanshinone ⅡA)가 조혈줄기세포에서 NK 세포의 분화를 유도 및 촉진시키며 NK 세포 분화와 관련된 유전자인 ID2의 발현을 증가시키고, 암세포인 YAC-1에 대하여 세포독성을 지니며 IFN-γ의 생성 또한 증가시켜 NK 세포의 활성을 증진시키므로, NK 세포 분화 또는 활성 증진용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.The present invention relates to a composition for the differentiation or activity enhancement of a natural killer cell (NK cell) containing tanshinone as an active ingredient, and more particularly to a composition for cryptotanshinone or tanshinone IIA tanshinone ⅡA) induces and promotes the differentiation of NK cells in hematopoietic stem cells, increases the expression of ID2, a gene related to NK cell differentiation, cytotoxic to cancer cell YAC-1, and increases the production of IFN-γ Thereby enhancing the activity of NK cells. Therefore, it can be effectively used as an active ingredient of a composition for NK cell differentiation or activity enhancement.
Description
본 발명은 탄시논(tanshinone)을 유효성분으로 함유하는 자연살해세포 분화 또는 활성 증진용 조성물, 및 조혈줄기세포로부터 자연살해세포로의 분화를 유도하는 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a composition for promoting differentiation or activity of natural killer cells containing tanshinone as an active ingredient, and a method for inducing differentiation from hematopoietic stem cells into natural killer cells.
NK 세포(natural killer cell, 이하 NK 세포라 약칭함)는 암이나 바이러스 감염이 된 세포를 파괴함으로서 선천성 면역반응에서 중요한 역할을 수행하는 면역세포이다(J. Immunol., 136: 3910-3915, 1986; Melanoma Res., 13: 349-356, 2003; Lung Cancer, 35: 23-28, 2002). 또한, 자극(stimulation)을 통해 사이토카인(cytokine)을 분비하여 다른 면역 체계(immune system)를 동원(recruiting)함으로서 간접적인 면역반응을 수행하기도 한다. 이러한 NK 세포의 파괴능은 림포카인 활성세포(lymphokine activated killer cell, LAK) 및 종양침윤림프구(tumor infiltration lymphocytes, TIL)를 이용하여 고형암(solid tumor) 치료에 이용하거나, 공여자 임파구 주입(donor lymphocyte infusion)을 통한 면역치료법(Tilden. A. B. et al., J. Immunol., 136: 3910-3915, 1986; Bordignon C, et al., Hematologia 84: 1110-1149, 1999)을 수행함으로써, 골수이식이나 장기 이식시 발생하는 거부반응을 방지하기 위한 새로운 세포치료 요법으로 응용이 시도되고 있다. 또한, NK 세포의 분화와 활성의 결함은 유방암(Konjevic G, et al., Breast Cancer Res. Treat., 66: 255-263, 2001), 흑색종암(Ryuke Y, et al., Melanoma Res., 13: 349-356, 2003), 폐암(Villegas FR, et al., Lung Cancer, 35: 23-28, 2002) 등 다양한 암 질환과 관련되어 있음이 보고되어 상기와 같은 질환들을 치료하기 위해 NK 세포 치료법이 대두되고 있다. NK cells (hereinafter abbreviated as NK cells) are immune cells that play an important role in the innate immune response by destroying cancer or virus infected cells (J. Immunol., 136: 3910-3915, 1986; Melanoma Res., 13: 349-356, 2003; Lung Cancer, 35: 23-28, 2002). In addition, the immune system secretes cytokines through stimulation and recruits the immune system to perform an indirect immune response. These NK cell-destructive functions can be used to treat solid tumors using lymphocine activated killer cells (LAK) and tumor infiltration lymphocytes (TIL), or to treat donor lymphocytes Bordignon C, et al., Hematologia 84: 1110-1149, 1999) by performing an immunotherapy with an immunosuppressive agent (Tilden, AB et al., J. Immunol., 136: 3910-3915, 1986; New cell therapies have been attempted to prevent rejection of organ transplants. In addition, defects in the differentiation and activity of NK cells have been reported in breast cancer (Konjevic G, et al., Breast Cancer Res. Treat., 66: 255-263, 2001) Melanoma Res., 13: 349-356, 2003), lung cancer (Villegas FR, et al. Lung Cancer, 35: 23-28, 2002). Thus, NK cell therapy has been developed to treat the above-mentioned diseases.
또한, NK 세포는 골수(bone marrow)의 조혈줄기세포 (hematopoietic stem cell, HSC)로부터 유래된다고 알려져 있다. 생체 외(In vitro) 배양의 방법으로는 조혈줄기세포를 분리하여 사이토카인을 처리하여 배양함으로서 NK 세포로 분화시키는 방법들이 보고되었다(Immunity 3: 459-473, 1995; Blood 87:2632-2640, 1996; Eur J Immunol. 33:3439-3447, 2003; Blood 108: 3824-3833, 2006). 즉, 조혈줄기세포에 Flt-3L, IL-7, SCF 및 IL-15 등을 첨가하여 일정기간을 배양함으로서 일반적인 NK 세포로 분화시킬 수 있다. 생체 내(In vivo) NK 세포는 골수에서 분화 과정을 거치며 골수의 미세 환경은 NK 세포의 분화에 필수적이다. NK 세포는 분화 과정을 거침에 따라 다양한 표면 분자들을 순차적으로 발현하는 것을 특징으로 한다. 마우스 모델(model)에서 NK 세포는 분화 과정 중에 CD122, NK1.1, NKG2 패밀리(family), Ly49 패밀리, DX5(CD49b) 및 CD43을 순차적으로 발현한다(Nat Immunol, 3: 523-528, 2008). It is also known that NK cells are derived from hematopoietic stem cells (HSCs) in bone marrow. Vitro (In vitro) by the method of culture has been reported that a method of differentiating into NK cells by incubation with cytokines and the treatment to remove the hematopoietic stem cells (Immunity 3: 459-473, 1995; Blood 87: 2632-2640, 1996; Eur J Immunol 33: 3439-3447, 2003, Blood 108: 3824-3833, 2006). That is, the hematopoietic stem cells can be differentiated into normal NK cells by adding Flt-3L, IL-7, SCF, IL-15, etc. for a certain period of time. In vivo (In vivo NK cells undergo differentiation in the bone marrow and the microenvironment of bone marrow is essential for the differentiation of NK cells. NK cells are characterized by the sequential expression of various surface molecules as they undergo differentiation processes. In the mouse model, NK cells sequentially express the CD122, NK1.1, NKG2 family, Ly49 family, DX5 (CD49b) and CD43 during differentiation (Nat Immunol, 3: 523-528, 2008) .
IL-15는 NK 세포 분화에 관여하고, 이것은 IL-15 생성에 요구되는 전사인자 인터페론(transcription factor interferon, IFN)-조절 인자 1이 결핍된 쥐에서는 NK 세포가 결핍되며(Kouetsu et al., Nature 391, 700-703, 1998), IL-15 또는 IL-15Ra가 결핍된 쥐에서는 NK 세포가 발견되지 않는다는 것에 의해 알게 되었다. 이로써 IL-15는 NK 세포에서 발현되는 IL-15 수용체를 통해서 NK 세포의 성장과 분화를 직접적으로 증진시킨다는 것이 보고되었다(MrozekE et al., Blood 87, 2632-2640,1Ⅱ996).IL-15 is involved in NK cell differentiation, which is deficient in NK cells in mice lacking the transcription factor interferon (IFN) -
그 동안의 연구들에 의하면 탄시논(Tanshinone) 계열의 화합물들은 급성 전골수성 백혈병(acute promyelocytic leukemia, APL) 세포의 분화에 영향을 준다는 것이 밝혀졌다(Zhonghua Xueyexue Zazhi 2000,21:23-26). 또한, 암(cancer)의 증식을 억제하며 세포자멸사(apoptosis)를 유도한다는 것이 알려져 있다(Chin J Cancer 2003,22:1363-1366; Int J Mol Med 2010 Sep, 26(3):379-85). 그러나 아직까지 이러한 탄시논 계열의 화합물들이 NK 세포를 비롯한 림프구(lymphocyte)의 분화 및 면역반응을 유도하는 역할을 수행할지에 대해서는 보고가 되지 않았다. 따라서 특정 세포의 분화를 유도하는 탄시논 계열 화합물의 작용이 NK 세포에도 적용이 된다면 기존의 NK 세포를 분화시키는 방법보다 효율적으로 NK 세포를 획득함으로써 염증, 감염, 암 등의 질환 치료에 적극적으로 응용이 가능하다.
Studies have shown that compounds of the Tanshinone family influence the differentiation of acute promyelocytic leukemia (APL) cells (Zhonghua Xueyexue Zazhi 2000, 21: 23-26). In addition, it is known that it inhibits the proliferation of cancer and induces apoptosis (Chin J Cancer 2003, 22: 1363-1366; Int J Mol Med 2010 Sep, 26 (3): 379-85) . However, it has not yet been reported whether these tanshinone compounds will play a role in inducing the differentiation and immune responses of lymphocytes including NK cells. Therefore, if the action of the tanshinone compound inducing the differentiation of a specific cell is applied to the NK cell, the NK cell can be acquired more efficiently than the method of differentiating the existing NK cell, thereby being positively applied to the treatment of diseases such as inflammation, This is possible.
이에 본 발명자들은 탄시논이 NK 세포의 분화 및 면역반응에 미치는 영향을 알아보기 위하여 연구한 결과, 크립토탄시논(cryptotanshinone) 또는 탄시논 ⅡA(tanshinone ⅡA)가 조혈줄기세포에서 NK 세포의 분화를 유도 및 촉진시키며 NK 세포 분화와 관련된 유전자인 ID2의 발현을 증가시키고, 암세포인 YAC-1에 대하여 세포독성을 지니며 IFN-γ의 생성 또한 증가시켜 NK 세포의 활성을 증진시키는 것을 확인함으로써, 탄시논을 NK 세포 분화 또는 활성 증진용 조성물의 유효성분으로 사용할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
Thus, the inventors of the present invention found that cryptotanshinone or tanshinone ⅡA inhibited the differentiation of NK cells in hematopoietic stem cells by studying the effects of tanshinone on the differentiation and immune response of NK cells Inducing and promoting NK cell differentiation, increasing the expression of ID2, a gene related to NK cell differentiation, having cytotoxicity against YAC-1, which is a cancer cell, and increasing the production of IFN-y to enhance the activity of NK cells, The present invention has been accomplished on the basis of the fact that the rice paddy can be used as an active ingredient of a composition for NK cell differentiation or activity enhancement.
본 발명의 목적은 탄시논(tanshinone)을 유효성분으로 함유하는 자연살해세포(natural killer cell, NK 세포) 분화 또는 활성 증진용 조성물을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a composition for differentiation or activity enhancement of natural killer cells (NK cells) containing tanshinone as an active ingredient.
본 발명의 다른 목적은 자연살해세포 전구체 세포에 탄시논을 투여하는 단계를 포함하는 조혈줄기세포로부터 자연살해세포로의 분화 유도 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for inducing differentiation of hematopoietic stem cells into natural killer cells, comprising the step of administering tanshinone to natural killer cell precursor cells.
본 발명의 다른 목적은 조혈줄기세포에서 분화된 자연살해세포 전구체 세포에 탄시논을 처리하는 단계를 포함하는 자연살해세포의 활성 증진 방법을 제공하는 것이다.
It is another object of the present invention to provide a method for promoting the activity of natural killer cells, comprising the step of treating tanshinone with natural killer cell precursor cells differentiated from hematopoietic stem cells.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 탄시논(tanshinone)을 유효성분으로 함유하는 자연살해세포(natural killer cell, NK 세포) 분화 또는 활성 증진용 조성물을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a composition for the differentiation or activity enhancement of natural killer cells (NK cells) containing tanshinone as an active ingredient.
또한, 본 발명은 탄시논 및 IL-15(interleukin-15)를 유효성분으로 함유하는 자연살해세포 분화 또는 활성 증진용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a composition for the differentiation or activity enhancement of natural killer cells containing tanshinone and IL-15 (interleukin-15) as an active ingredient.
또한, 본 발명은 In addition,
1) 조혈줄기세포에서 자연살해세포 전구체 유도제를 첨가하여 자연살해세포 전구체 세포로의 증식을 유도하는 단계; 및1) inducing proliferation of natural killer cell precursor cells by adding natural killer cell precursor inducer in hematopoietic stem cells; And
2) 단계 1)의 자연살해세포 전구체 세포에 탄시논을 투여하는 단계를 포함하는 조혈줄기세포로부터 자연살해세포로의 분화 유도 방법을 제공한다.2) a step of administering tanshinone to the natural killer cell precursor cells of step 1) to induce differentiation from hematopoietic stem cells into natural killer cells.
또한, 본 발명은 조혈줄기세포에서 분화된 자연살해세포 전구체 세포에 탄시논을 처리하는 단계를 포함하는 자연살해세포의 활성 증진 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for promoting the activity of natural killer cells, which comprises treating natural killer cell precursor cells differentiated from hematopoietic stem cells with tanshinone.
아울러, 본 발명은 본 발명의 자연살해세포 분화 또는 활성 증진용 조성물을 유효성분으로 함유하는 항암 세포 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
In addition, the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of cancer cells containing the composition for nail killer cell differentiation or activity enhancement of the present invention as an active ingredient.
본 발명은 크립토탄시논(cryptotanshinone) 또는 탄시논 ⅡA(tanshinone ⅡA)가 조혈줄기세포에서 NK 세포의 분화를 유도 및 촉진시키며 NK 세포 분화와 관련된 유전자인 ID2의 발현을 증가시키고, 암세포인 YAC-1에 대하여 세포독성을 지니며 IFN-γ의 생성 또한 증가시켜 NK 세포의 활성을 증진시키므로, NK 세포 분화 또는 활성 증진용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
The present invention is based on the finding that cryptotanshinone or tanshinone IIA induces and promotes the differentiation of NK cells in hematopoietic stem cells, increases the expression of ID2, a gene related to NK cell differentiation, 1 and increases the production of IFN-y to enhance the activity of NK cells. Therefore, it can be usefully used as an active ingredient of a composition for NK cell differentiation or activity enhancement.
도 1은 생쥐의 조혈줄기세포로부터 NK 세포로 분화한 결과를 나타낸 도이다.
A: IL-15(25ng/㎖), 크립토탄시논(cryptotanshinone, CRY)(5uM) 및 탄시논 ⅡA(tanshinone ⅡA, TA)(10uM)로 분화시킨 NK 세포를 유동세포분석법(Flow cytometry)으로 분석한 결과; 및
B: 크립토탄시논 또는 탄시논 ⅡA의 각 농도별로 처리하여 분화시킨 NK 세포(CD3-NK1.1+)를 유동세포분석법으로 분석한 결과.
도 2는 생쥐의 조혈줄기세포로부터 화합물을 처리하여 분화한 NK 세포를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
A: 대조군(control), IL-15, 크립토탄시논(cryptotanshinone, CRY) 및 IL-15과 함께 크립토탄시논으로 분화시킨 NK 세포(CD3-NK1.1+)의 전체 세포 수의 변화를 분석한 결과; 및
B: 대조군(control), IL-15, 탄시논 ⅡA(tanshinone ⅡA, TA) 및 IL-15과 함께 탄시논 ⅡA로 분화시킨 NK 세포(CD3-NK1.1+)의 세포 수의 변화를 분석한 결과.
도 3은 조혈줄기세포로부터 화합물을 처리하여 분화시킨 NK 세포에서 성숙(maturation)과 관련된 유전자 발현(gene expression)을 실시간 PCR(real-time PCR)로 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 생쥐의 조혈줄기세포로부터 다양한 조건으로 배양시킨 NK 세포의 세포독성(cytotoxicity) 및 IFN-γ 생성능을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
A: 줄기세포로부터 각 각 대조군(control), IL-15(25ng), 크립토탄시논(cryptotanshinone, CRY)(5uM) 및 IL-15(25ng)과 함께 크립토탄시논(5uM)을 처리하여 분화시킨 성숙한 NK(mature NK, mNK) 세포를 가지고 YAC-1에 대한 세포독성을 측정한 결과; 및
B: 조혈줄기세포로부터 각 각 대조군(control), IL-15(25ng), 크립토탄시논(5uM), 탄시논 ⅡA(10uM), IL-15(25ng)과 함께 크립토탄시논(5uM) 및 IL-15(25ng)과 함께 탄시논 ⅡA(10uM)을 처리하여 분화시킨 성숙한 NK 세포를 가지고 IL-12(20ng)로 활성화시킨 후 IFN-γ 생성량을 ELISA로 측정한 결과.Fig. 1 shows the results of differentiation of hematopoietic stem cells into NK cells in mice.
A: NK cells differentiated with IL-15 (25 ng / ml), cryptotanshinone (CRY) (5 uM) and tanshinone IIA (TA) (10 uM) were subjected to flow cytometry Results; And
B: Analysis of NK cells (CD3 - NK1.1 + ) treated with different concentrations of cryptoxanthin or tanshinone ⅡA by flow cytometry.
2 is a graph showing the results of analysis of NK cells differentiated by treating a compound from hematopoietic stem cells of a mouse.
A: Changes in the total cell number of NK cells (CD3 - NK1.1 + ) differentiated with cryptotansinone with control (IL-15), cryptotanshinone (CRY) Results; And
B: Changes in the number of cells of NK cells (CD3 - NK1.1 + ) differentiated with Tanshinone IIA together with control (IL-15), tanshinone IIA (TA) result.
FIG. 3 is a graph showing the results of real-time PCR measurement of gene expression associated with maturation in NK cells obtained by treating a compound from hematopoietic stem cells.
FIG. 4 is a graph showing the results of analysis of cytotoxicity and IFN-γ production of NK cells cultured from hematopoietic stem cells of mice under various conditions.
A: Cryptotansinone (5 uM) was treated with stem cells from each control, IL-15 (25 ng), cryptotanshinone (CRY) (5 uM) and IL- The cytotoxicity of YAC-1 was measured with differentiated mature NK (mature NK, mNK) cells; And
B: Cryptotansinone (5uM) was added from hematopoietic stem cells to each control (control), IL-15 (25ng), cryptotansinone (5uM), tanshinone ⅡA (10uM) And IL-12 (20 ng) with mature NK cells treated with Tanshinone Ⅱ A (10 uM) with IL-15 (25 ng) and then measuring the amount of IFN-γ produced by ELISA.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 탄시논(tanshinone)을 유효성분으로 함유하는 자연살해세포(natural killer cell, NK 세포) 분화 또는 활성 증진용 조성물을 제공한다.The present invention provides a composition for the differentiation or activity enhancement of natural killer cells (NK cells) containing tanshinone as an active ingredient.
또한, 본 발명은 탄시논 및 IL-15(interleukin-15)를 유효성분으로 함유하는 자연살해세포 분화 또는 활성 증진용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a composition for the differentiation or activity enhancement of natural killer cells containing tanshinone and IL-15 (interleukin-15) as an active ingredient.
상기 탄시논은 구체적으로 단삼(Salvia miotiorrhiza bunge)이라고 불리는 중국 약초(Chinese medicinal plant)의 뿌리로부터 추출한 화학물질(chemical)이고 크립토탄시논(cryptotanshinone) 또는 탄시논 ⅡA이며, 보다 구체적으로 크립토탄시논(cryptotanshinone)의 구조식은 C19H20O3이고 화학식은 
또한, 상기 탄시논은 조혈줄기세포에서 NK 세포로의 분화를 유도하거나 촉진시키고, NK 세포 분화와 관련된 유전자인 ID2의 발현을 증가시키며 암 세포인 YAC-1 세포에 대하여 세포독성을 가질 뿐만 아니라 IFN-γ의 생성을 증가시키는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.In addition, the Tanshinone induces or promotes differentiation from hematopoietic stem cells into NK cells, increases the expression of ID2, which is a gene related to NK cell differentiation, not only has cytotoxicity against YAC-1 cells that are cancer cells, -γ, but not limited thereto.
또한, 구체적으로 상기 탄시논을 IL-15(interleukin-15)과 함께 조혈줄기세포에 처리하는 것이고, 보다 구체적으로 상기 크립토탄시논 또는 탄시논 ⅡA는 2uM 내지 10uM의 농도로, 상기 IL-15는 10 내지 50ng/㎖으로 처리하는 것이며, 가장 구체적으로 상기 크립토탄시논은 5uM의 농도로, 상기 탄시논 ⅡA는 10uM의 농도로, 상기 IL-15는 25ng/㎖의 농도로 처리하는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
Specifically, the above-mentioned tanshinone is treated with hematopoietic stem cells together with IL-15 (interleukin-15). More specifically, the cryptotansinone or tanshinone IIA is treated with IL-15 Is treated with 10 to 50 ng / ml, most specifically, the cryptoxanthin is treated at a concentration of 5 uM, the Tanshinone IIA at a concentration of 10 uM, and the IL-15 at a concentration of 25 ng / But is not limited thereto.
본 발명자들은 조혈줄기세포로부터 NK 세포를 분화시키기 위하여 마우스 골수로부터 조혈줄기세포를 분리하여 NK 세포로의 분화를 위해 7일간 배양한 중간단계의 전구체 세포들을 회수하여 다양한 농도의 쥐의 IL-15과 크립토탄시논(crptotanshinone) 또는 탄시논 ⅡA(tanshinone ⅡA)를 포함하는 배지에서 배양한 후 2일, 4일 및 6일 별로 항(anti)-NK1.1(PE) 및 항(anti)-CD3(FITC) 항체를 이용하여 NK1.1+CD3-인 NK 세포의 순도를 분석하고, 다양한 NK 세포 표면 분자에 대한 항체를 이용하여 NK 세포의 분화 정도를 유동세포분석법(flow cytometry)으로 분석한 결과, 조혈줄기세포로부터 NK 세포로 분화시켰을 때 IL-15(25ng/㎖)만을 첨가한 경우 약 30%가 CD3-NK+세포로 분화된 반면, 크립토탄시논(5uM) 또는 탄시논 ⅡA(crptotanshinone/tanshinone ⅡA)(10uM)를 함께 첨가한 경우 약 65%, 62%가 NK 세포로 분화되었다는 것을 확인하였다(도 1의 A 참조). The present inventors isolated hematopoietic stem cells from mouse bone marrow to differentiate NK cells from hematopoietic stem cells, and recovered intermediate-stage precursor cells cultured for 7 days to differentiate into NK cells, (PE) and anti-CD3 (CDK) at 2 days, 4 days and 6 days after culturing in a medium containing cryptotanshinone or tanshinone IIA (FITC) using the antibody NK1.1 + CD3 - the result of analyzing the purity of NK cells, and using the antibodies to a variety of NK cell surface molecules analyze the differentiation of NK cells by flow cytometry (flow cytometry) , 30% of the cells were differentiated into CD3 - NK + cells when IL-15 (25 ng / ml) alone was added to the NK cells from the hematopoietic stem cells, whereas cryptotansinone (5 uM) or crptotanshinone / tanshinone ⅡA) (10uM) were added together, about 65% and 62% of NK cells (Fig. 1, A).
또한, 본 발명자들은 조혈줄기세포로부터 NK 세포 분화를 유도하는 크립토탄시논/탄시논 ⅡA의 적정 처리 농도를 알기 위하여 각 2, 5 및 10uM의 농도별로 처리한 결과, 크립토탄시논(cryptotanshinone)의 경우, NK 세포로의 분화율이 5uM을 처리하였을 때 약 56%로 가장 높았고 탄시논 ⅡA(tanshinone ⅡA)의 경우에는 10uM을 처리하였을 때 약 62%로 가장 높게 나왔다는 것을 확인하였다(도 1의 B 참조). 따라서, 적정 농도의 크립토탄시논 또는 탄시논 ⅡA를 IL-15과 함께 처리를 했을 경우, NK 세포의 분화 유도 및 증식이 증가됨을 알 수 있었다.The present inventors also studied cryptotanshinone / tanshinone ⅡA, which induces differentiation of NK cells from hematopoietic stem cells, at various concentrations of 2, 5 and 10 uM, , It was found that the differentiation rate to NK cells was the highest at about 56% when 5 uM was treated and about 62% at 10 uM treatment of tanshinone IIA (Fig. 1 See B). Therefore, when cryptoxanthinone or tanshinone ⅡA at an appropriate concentration was treated with IL-15, induction of differentiation and proliferation of NK cells were increased.
또한, 본 발명자들은 NK 세포의 분화율 증가가 실제로 NK 집단(population) 변화와 연관성이 있는지를 알기 위하여 분화 중간단계인 전구체에 IL-15을 처리한 시점부터 날짜별로 수거한 세포의 수를 세고, 전체 세포 수로부터 NK 세포 분화도(%)를 이용하여 NK 세포 수를 계산한 결과, IL-15를 처리하지 않은 대조군, IL-15 단독 처리군, 크립토탄시논 단독 처리군, 및 IL-15 및 크립토탄시논을 함께 처리한 군에서 시간이 경과함에 따라 전체 세포 수는 전반적으로 큰 차이 없이 감소하는 양상을 보였지만 NK 세포 수를 비교한 결과 IL-15 및 크립토탄시논을 함께 처리한 군에서 IL-15만을 처리한 경우보다 NK 세포 수가 크게 증가한 것을 확인할 수 있었고, IL-15 및 탄시논 ⅡA를 처리한 군에서도 상기와 유사한 양상을 보였다는 것을 확인하였다(도 2의 A 및 도 2의 B 참조).The present inventors also counted the number of cells collected by date from the time of treatment with IL-15 to the precursor, which is an intermediate stage of differentiation, to see whether the increase in the differentiation rate of NK cells is actually related to the change in the NK population, The number of NK cells was calculated from the total number of cells using NK cell differentiation ratio (%). As a result, the number of NK cells was counted as a control group without IL-15, IL-15 alone group, In the group treated with cryptoxanthinone, the total number of cells decreased with time, but the number of NK cells was compared with that of the group treated with IL-15 and cryptoxanone It was confirmed that the number of NK cells was significantly increased compared with the case of treatment with IL-15 alone, and it was confirmed that IL-15 and tanshinone Ⅱ A treatment also showed similar pattern to the above case (FIG. 2A and FIG. 2B Reference).
또한, 본 발명자들은 NK 세포로 분화되는 과정에서 발현되는 표적 유전자(target gene)를 알아내기 위하여 기존의 NK 세포 분화와 관련된 유전자들의 발현을 날짜별로 실시간 PCR(real-time PCR)로 측정한 결과, TRAF, IRF2 및 PU.1은 각 각의 처리조건에서 유전자 발현량이 크게 차이를 보이지 않았지만, ID2의 경우 크립토탄시논 단독 처리군, IL-15 및 크립토탄시논을 함께 처리한 군에서만 발현량이 높게 유지되고 있다는 것을 확인하였다(도 3 참조). 따라서, 크립토탄시논 또는 탄시논 ⅡA(cryptotanshinone/tanshinone ⅡA)를 첨가한 경우 ID2의 발현양이 증가함으로서 NK 세포분화에 영향을 미칠 것으로 생각된다.In addition, the present inventors measured the expression of genes related to the differentiation of NK cells by real-time PCR by date in order to find a target gene expressed in the process of differentiating into NK cells. As a result, TRAF, IRF2, and PU.1 showed no significant difference in gene expression in each treatment condition. However, in the case of ID2, only the treated group treated with cryptoxanthinone alone, the group treated with IL-15 and cryptoxanone showed the expression level (See Fig. 3). Therefore, the addition of cryptotanshinone or tanshinone IIA would increase the expression of ID2, which may affect NK cell differentiation.
아울러, 본 발명자들은 분화 중간단계의 전구체에 IL-15과 크립토탄시논 또는 탄시논 ⅡA를 함께 처리하였을 때 NK 세포로의 분화율이 증가됨을 확인하였고, 상기와 같은 과정으로 분화된 NK 세포가 제대로된 면역 반응을 수행하는지 확인하기 위하여 암세포인 YAC-1 세포에 대한 세포독성을 알아보고, NK 세포의 활성을 확인할 수 있는 주요한 특성인 IFN-γ의 생성을 측정하였다. 그 결과, IL-15(25ng/㎖) 및 크립토탄시논(cryptotanshinone)(5uM)을 함께 처리한 조건에서 세포독성이 가장 높게 나왔고(도 4의 A 참조), 세포독성과 마찬가지로 IL-15(25ng/㎖)과 크립토탄시논(5uM) 또는 IL-15(25ng/㎖)과 탄시논 ⅡA(10uM)를 함께 처리한 조건에서 IFN-γ의 분비량이 가장 높게 나왔다는 것을 확인하였다(도 4의 B 참조).In addition, the present inventors confirmed that when the IL-15 and cryptoxanthin or tanshinone IIA were treated together with the precursor at the intermediate stage of differentiation, the differentiation rate into NK cells was increased, and the NK cells differentiated with the above- In order to confirm whether the immune response is properly performed, the cytotoxicity of YAC-1 cells, which are cancer cells, was examined and the production of IFN-γ, which is a main characteristic for confirming the activity of NK cells, was measured. As a result, cytotoxicity was highest in the case of treatment with IL-15 (25 ng / ml) and cryptotanshinone (5 uM) (see A in FIG. 4) 25 ng / ml), cryptosanicin (5 uM), IL-15 (25 ng / ml) and tanshinone Ⅱ A (10 uM) See B).
그러므로, 본 발명의 크립토탄시논 및 탄시논 ⅡA는 IL-15와 함께 처리하여 조혈줄기세포에서 NK 세포의 분화를 유도 및 촉진시키며 NK 세포 분화와 관련된 유전자인 ID2의 발현을 증가시키고 IFN-γ의 생성량을 증가시켜 NK 세포의 활성을 증진시키므로 NK 세포의 분화 또는 활성 증진용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
Therefore, the cryptoxanthin and tanshinone IIA of the present invention are treated together with IL-15 to induce and promote the differentiation of NK cells in hematopoietic stem cells, to increase the expression of ID2, a gene related to NK cell differentiation, To increase the activity of NK cells. Therefore, the present invention can be effectively used as a composition for promoting the differentiation or activity of NK cells.
또한, 본 발명은In addition,
1) 조혈줄기세포에서 자연살해세포 전구체 유도제를 첨가하여 자연살해세포 전구체 세포로의 증식을 유도하는 단계; 및1) inducing proliferation of natural killer cell precursor cells by adding natural killer cell precursor inducer in hematopoietic stem cells; And
2) 단계 1)의 자연살해세포 전구체 세포에 탄시논을 투여하는 단계를 포함하는 조혈줄기세포로부터 자연살해세포로의 분화 유도 방법을 제공한다.2) a step of administering tanshinone to the natural killer cell precursor cells of step 1) to induce differentiation from hematopoietic stem cells into natural killer cells.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 자연살해세포 전구체 유도제는 구체적으로 SCF(stem cell factor), Flt3L(Fms-like tyrosine kinase3 ligand) 및 IL-7(interleukin-7)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나이나, 이에 한정되는 것은 아니다.In this method, the natural killer cell precursor directing agent of step 1) is specifically selected from the group consisting of SCF (stem cell factor), Flt3L (Fms-
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 탄시논은 구체적으로 크립토탄시논(cryptotanshinone) 또는 탄시논 ⅡA이나, 이에 한정되는 것은 아니다.In this method, the tanshinone of step 2) is specifically cryptotanshinone or tanshinone IIA, but is not limited thereto.
상기 방법에 있어서, 구체적으로 단계 2)의 자연살해세포 전구체 세포에 IL-15를 함께 투여하는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.In this method, specifically, the natural killer cell precursor cells of step 2) are administered together with IL-15, but the present invention is not limited thereto.
상기 방법에 있어서, 구체적으로 상기 크립토탄시논 또는 탄시논 ⅡA는 2uM 내지 10uM의 농도로, 상기 IL-15는 10 내지 50ng/㎖으로 처리하는 것이며, 보다 구체적으로 상기 크립토탄시논은 5uM의 농도로, 상기 탄시논 ⅡA는 10uM의 농도로, 상기 IL-15는 25ng/㎖의 농도로 처리하는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.In this method, specifically, the cryptotansinone or tanshinone IIA is treated at a concentration of 2 uM to 10 uM and the IL-15 is treated at 10 to 50 ng / ml. More specifically, the cryptoxanthone or tanshinone IIA is treated at a concentration of 2 uM to 10 uM, , The Tanshinone IIA is treated at a concentration of 10 uM, and the IL-15 is treated at a concentration of 25 ng / ml, but the present invention is not limited thereto.
본 발명의 크립토탄시논 및 탄시논 ⅡA는 IL-15와 함께 처리하여 조혈줄기세포에서 NK 세포의 분화를 유도 및 촉진시키고 NK 세포의 수를 증가시키며 NK 세포 분화와 관련된 중요한 유전자인 ID2의 발현을 증가시키므로 조혈줄기세포로부터 자연살해세로의 분화 유도 방법에 유용하게 사용될 수 있다.
The cryptoxanthin and tanshinone ⅡA of the present invention were treated with IL-15 to induce and promote the differentiation of NK cells in hematopoietic stem cells, to increase the number of NK cells, and to express the important gene related to NK cell differentiation, And thus can be usefully used as a method of inducing differentiation of hematopoietic stem cells into natural killer cells.
또한, 본 발명은 조혈줄기세포에서 분화된 자연살해세포 전구체 세포에 탄시논을 처리하는 단계를 포함하는 자연살해세포의 활성 증진 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for promoting the activity of natural killer cells, which comprises treating natural killer cell precursor cells differentiated from hematopoietic stem cells with tanshinone.
상기 탄시논은 구체적으로 크립토탄시논 또는 탄시논 ⅡA이고 2uM 내지 10uM의 농도로 처리하는 것이고, 보다 구체적으로 상기 크립토탄시논은 5uM의 농도로, 상기 탄시논 ⅡA는 10uM의 농도로 처리하는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.The above-mentioned tanshinone is specifically cryptotansinone or tanshinone IIA and is treated at a concentration of 2 uM to 10 uM. More specifically, the cryptoxanthone is treated at a concentration of 5 uM and the tanshinone IIA is treated at a concentration of 10 uM But is not limited thereto.
또한, 구체적으로 상기 탄시논을 IL-15(interleukin-15)와 함께 조혈줄기세포에 처리하는 것이고, 보다 구체적으로 상기 IL-15는 10 내지 50ng/㎖으로 처리하는 것이고, 가장 구체적으로 25ng/㎖의 농도로 처리하는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.Specifically, the tanshinone is treated with hematopoietic stem cells together with IL-15 (interleukin-15). More specifically, the IL-15 is treated at 10 to 50 ng / ml, , But the present invention is not limited thereto.
본 발명의 크립토탄시논 또는 탄시논 ⅡA는 IL-15와 함께 처리하여 조혈줄기세포에서 NK 세포의 분화를 유도 및 촉진시키며 NK 세포 분화와 관련된 유전자인 ID2의 발현을 증가시키고 IFN-γ의 생성량을 증가시켜 NK 세포의 활성을 증진시키므로 NK 세포의 활성 증진 방법으로 유용하게 사용될 수 있다.
The cryptoxanthin or tanshinone IIA of the present invention is treated together with IL-15 to induce and promote the differentiation of NK cells in hematopoietic stem cells, to increase the expression of ID2, a gene related to NK cell differentiation, To increase the activity of NK cells, and thus can be usefully used as a method for promoting the activity of NK cells.
아울러, 본 발명은 본 발명의 자연살해세포 분화 또는 활성 증진용 조성물을 유효성분으로 함유하는 항암 세포 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of cancer cells containing the composition for nail killer cell differentiation or activity enhancement of the present invention as an active ingredient.
상기 암은 구체적으로 유방암, 흑색종암, 위암, 간암 및 폐암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.The cancer is specifically selected from the group consisting of breast cancer, melanoma, stomach cancer, liver cancer and lung cancer, but is not limited thereto.
본 발명의 크립토탄시논 및 탄시논 ⅡA는 조혈줄기세포에서 NK 세포의 분화를 유도 및 촉진시키고 암세포인 YAC-1에 대하여 세포독성을 지니며 IFN-γ의 생성량을 증가시켜 NK 세포의 활성을 증진시키므로 항암 세포 예방 및 치료용 약학적 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.
The cryptoxanthin and tanshinone IIA of the present invention induce and promote the differentiation of NK cells in hematopoietic stem cells and have cytotoxicity against YAC-1, which is a cancer cell, and increase the production of IFN-y to increase the activity of NK cells And thus can be usefully used as a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of cancer cells.
본 발명의 조성물은 상기 NK 세포에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 투여를 위해서는 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 산제, 정제, 캡슐제, 환, 과립 또는 주사액제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 구체적으로 제제화할 수 있다.The composition of the present invention may further contain at least one active ingredient which exhibits the same or similar function to the NK cell. For administration, one or more additional pharmaceutically acceptable carriers may be prepared. The pharmaceutically acceptable carrier may be a mixture of saline, sterilized water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, and one or more of these components. If necessary, an antioxidant, Other conventional additives such as a bacteriostatic agent may be added. In addition, diluents, dispersants, surfactants, binders, and lubricants may be additionally added to formulate into main dosage forms such as aqueous solutions, suspensions, emulsions, powders, tablets, capsules, rings, granules or injection solutions. Further, it can be formulated according to each disease or ingredient according to a suitable method in the art or using the method disclosed in Remington's Pharmaceutical Science (Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990).
본 발명의 조성물은 구체적으로 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명에 따른 조성물의 일일 투여량은 구체적으로 0.01 내지 5000 ㎎/㎏이며, 보다 구체적으로 0.01 내지 10 ㎎/㎏ 이며, 가장 구체적으로 하루 일 회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이나 이에 한정되는 것은 아니다.
The composition of the present invention may specifically be administered parenterally (for example, intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or topically), and the dose may be appropriately determined depending on the body weight, age, sex, health condition, diet, The range varies depending on the method, excretion rate and severity of the disease. The daily dose of the composition according to the present invention is specifically from 0.01 to 5000 mg / kg, more specifically from 0.01 to 10 mg / kg, and most specifically from one day to several times a day.
이하, 본 발명을 실시예 및 제조예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Examples and Production Examples.
단, 하기 실시예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 제조예에 한정되는 것은 아니다.
However, the following examples and preparative examples are merely illustrative of the present invention, and the present invention is not limited to the following examples and preparative examples.
<< 실시예Example 1> 마우스 골수로부터 1> from mouse bone marrow 조혈줄기세포의Of hematopoietic stem cells 분리 detach
실험용 마우스(중앙실험동물(주), 한국)의 종아리뼈, 넓적다리뼈, 골반뼈를 분리하고 이로부터 당 업계에 알려진 방법에 의해 총 골수 세포를 추출하였다. 골수에서 추출한 세포에 ACK 용액을 처리하여 적혈구를 제거한 후, B220, CD2, NK1.1, CD11b, Gr-1, 및 TER-119 항체를 처리하여 각각에 해당하는 B 세포, T 세포, NK/NKT 세포, 단핵구, 과립구 및 적혈구에 붙이고, 이를 MACS(magnetic-activated cell sorting) 세포 분리 키트(Cell Separation Kit)(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)를 이용하여 음성 선택(negative selection)으로 제거하였다. 이와 같이 분화된 면역세포들을 제거한 후, 조혈줄기세포의 특이 표면 분자인 CD117(c-kit)에 대한 마이크로-비드(micro-bead) 및 MACS를 이용하여 양성 선택(positive selection)으로 조혈줄기세포를 분리하였다.The calf bone, thigh bone, and pelvic bone of experimental mice (Central Experimental Animals Co., Korea) were separated and total bone marrow cells were extracted therefrom by methods known in the art. B cells, T cells, NK / NKTs, and BK cells treated with B220, CD2, NK1.1, CD11b, Gr-1 and TER-119 antibodies were treated with ACK solution to remove the red blood cells. Cells, mononuclear cells, granulocytes and red blood cells, and they were removed by negative selection using a magnetic separation cell sorting kit (MACS) cell sorting kit (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany). After removal of these differentiated immune cells, hematopoietic stem cells were obtained by positive selection using micro-beads and MACS for CD117 (c-kit), a specific surface molecule of hematopoietic stem cells Respectively.
<< 실시예Example 2> 골수로부터 분리된 2> separated from the bone marrow 조혈줄기세포로부터From hematopoietic stem cells NKNK 세포로의 분화 유도Induction of cell differentiation
골수에서 분리한 조혈줄기세포를 24-웰(well) 플레이트(plate)(Becton and Dickinson Bioscience, San Diego, CA)에 1.0 × 106세포/웰(cells/well)의 농도로 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS), 2 ㎍/㎖ 인도메타신(indometacin)(Sigma-Aldrich, St. Louis), 2 ㎍/㎖ 젠타마이신(gentamicin)(Sigma-Aldrich), 30 ng/㎖ 쥐의(murine) SCF(PeproTech, Rocky Hill, NJ), 50 ng/㎖ 쥐의 Flt3L(PeproTech), 0.5 ng/㎖ 쥐의 IL-7(PeproTech)을 포함하는 RPMI 1640 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2에서 7일간 배양하였다. 최초 배양 3일 후 절반의 배양 상층액을 같은 조성의 사이토카인(cytokine)이 함유된 새로운 배지로 교체하였다. NK 세포로의 분화를 위해 7일간 배양한 중간단계의 전구체 세포들을 회수하여 다양한 농도의 쥐의 IL-15 및 크립토탄시논/탄시논 ⅡA(crptotanshinone/tanshinone ⅡA)를 포함하는 배지에서 7일간 추가 배양하였다. 3일 후 절반의 배지를 같은 조성의 사이토카인이 함유된 새로운 배지로 교체하였다. 2일, 4일 및 6일 별로 항(anti)-NK1.1(PE) 및 항(anti)-CD3(FITC) 항체를 이용하여 NK1.1+CD3-인 NK 세포의 순도를 분석하고, 다양한 NK 세포 표면 분자에 대한 항체를 이용하여 NK 세포의 분화 정도를 유동세포분석법(flow cytometry)으로 분석하였다.10% of the hematopoietic stem cells isolated from bone marrow in a concentration of 24-well (well) plates (plate) (Becton and Dickinson Bioscience , San Diego, CA) 1.0 × 10 6 cells / well (cells / well) in fetal bovine serum (Sigma-Aldrich, St. Louis), 2 ug / ml gentamicin (Sigma-Aldrich), 30 ng / ㎖ of fetal bovine serum (FBS), 2 ug /
그 결과, 도 1의 A에서 보는 바와 같이 조혈줄기세포로부터 NK 세포로 분화시켰을 때 IL-15(25ng/㎖)만을 첨가한 경우 약 30%가 CD3-NK+세포로 분화되었지만, 크립토탄시논(5uM)/탄시논 ⅡA(crptotanshinone/tanshinone ⅡA)(10uM)를 함께 첨가한 경우 약 65%, 62%가 NK 세포로 분화되었다는 것을 확인하였다(도 1의 A).As a result, as shown in FIG. 1 A, about 30% of the cells were differentiated into CD3 - NK + cells when IL-15 (25 ng / ml) was added only when the cells were differentiated from hematopoietic stem cells into NK cells, (5 μM) / crptotanshinone / tanshinone IIA (10 μM) were added together, it was confirmed that about 65% and 62% of the cells were differentiated into NK cells (FIG.
또한, 조혈줄기세포로부터 NK 세포 분화를 유도하는 크립토탄시논/탄시논 ⅡA의 적정 처리 농도를 알기 위해 각 2, 5 및 10uM의 농도별로 처리하였다.In order to determine the optimum treatment concentration of cryptoxanthin / tanshinone ⅡA inducing NK cell differentiation from hematopoietic stem cells, the cells were treated at a concentration of 2, 5 and 10 uM, respectively.
그 결과, 도 1의 B에서 보는 바와 같이 크립토탄시논(cryptotanshinone)의 경우, NK 세포로의 분화율이 5uM을 처리하였을 때 약 56%로 가장 높았고 탄시논 ⅡA(tanshinone ⅡA)의 경우에는 10uM을 처리하였을 때 약 62%로 가장 높게 나왔으므로 적정 농도의 크립토탄시논/탄시논 ⅡA를 IL-15과 함께 처리를 했을 경우, NK 세포의 분화 유도 및 증식이 증가됨을 확인하였다(도 1의 B).
As a result, as shown in FIG. 1B, in the case of cryptotanshinone, the differentiation rate to NK cells was highest at about 56% when 5 uM was treated and 10 μM for tanshinone IIA , It was confirmed that the treatment with IL-15 resulted in an increase in differentiation induction and proliferation of NK cells (see FIG. 1 B).
<< 실시예Example 3> 3> NKNK 세포의 분화도 확인 Identification of cell differentiation
상기 <실시예 2>에서 분석한 NK 세포의 분화율 증가가 실제로 NK 집단(population) 변화와 연관성이 있는지를 알기 위하여 분화 중간단계인 전구체에 IL-15(25 ng)을 처리한 시점부터 날짜별로 수거한 세포의 수를 세었다. 전체 세포 수로부터 NK 세포 분화도(%)를 이용하여 NK 세포 수를 계산하였다.In order to determine whether the increase in the differentiation rate of NK cells in the above Example 2 is actually related to the population change of the NK group, the precursor of the differentiation intermediate stage was treated with IL-15 (25 ng) The number of collected cells was counted. The number of NK cells was calculated from the total number of cells using NK cell differentiation (%).
그 결과, 도 2의 A 및 도 2의 B에서 보는 바와 같이 IL-15를 처리하지 않은 대조군, IL-15 단독 처리군(25 ng), 크립토탄시논(5uM) 단독 처리군, 및 IL-15(25 ng) 및 크립토탄시논(5uM)을 함께 처리한 군에서 시간이 경과함에 따라 전체 세포 수는 전반적으로 큰 차이 없이 감소하는 양상을 보였지만 NK 세포 수를 비교한 결과 IL-15 및 크립토탄시논을 함께 처리한 군에서 IL-15만을 처리한 경우보다 세포 수가 크게 증가한 것을 확인할 수 있었고, IL-15(25 ng) 및 탄시논 ⅡA(10uM)를 함께 처리한 군에도 상기와 유사한 양상을 보였다는 것을 확인하였다(도 2의 A 및 도 2의 B).As a result, as shown in FIG. 2A and FIG. 2B, the control group without IL-15, the group treated with IL-15 alone (25 ng), the group treated with cryptotansinone (5 uM) alone, 15, 25 ng) and cryptoxanthin (5 uM), the total number of cells decreased with time, but the number of NK cells was lower than that of IL-15 and crypts (25 ng) and Tanshinon Ⅱ A (10 μM) were treated with IL-15 and IL-15, respectively, in the group treated with tanshinone. (FIG. 2A and FIG. 2B).
또한, NK 세포로 분화되는 과정에서 발현되는 표적 유전자(target gene)를 알아내기 위해 기존의 NK 세포 분화와 관련된 유전자들의 발현을 날짜별로 실시간 PCR(real-time PCR)로 측정하였다.Also, in order to identify a target gene expressed in the process of differentiating into NK cells, the expression of genes related to the NK cell differentiation was measured by real-time PCR on a date basis.
구체적으로, 분화 과정 중의 NK 세포를 회수하고 트리졸 시약(Trizol Reagent)(Invitrogen, Carlsbad, CA)/클로로포름(chloroform)/이소프로필 알코올(isopropyl alcohol)을 이용하여 총 RNA를 분리하였다. 1 내지 3 ㎍의 RNA를 2.5 U의 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(Moloney murine leukemia virus, M-MLV) 역전사 효소(reverse transcriptase)(Roche Diagnostics, Basel, Switzerland)와 함께 37℃에서 1시간 동안 반응시켜 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA의 전사체는 SYBR Premix Ex Taq(Takara Bio, Tokyo, Japan) 및 Real-time system TP 800(Takara Bio)을 이용하여 정량하였으며, 시료의 표준화를 위하여 GAPDH를 사용하였다. 각각의 프라이머(primer)는 Primer3 소프트웨어(software)를 사용하여 제작하였다. 사용된 프라이머는 하기와 같다:Specifically, NK cells in the differentiation process were recovered and total RNA was isolated using Trizol Reagent (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) / Chloroform / isopropyl alcohol. 1 to 3 μg of RNA was reacted with 2.5 U of Moloney murine leukemia virus (M-MLV) reverse transcriptase (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland) at 37 ° C. for 1 hour to obtain cDNA Were synthesized. Transcripts of the synthesized cDNA were quantitated using SYBR Premix Ex Taq (Takara Bio, Tokyo, Japan) and Real-time system TP 800 (Takara Bio) and GAPDH was used for standardization of the samples. Each primer was generated using Primer3 software. The primers used were:
ID2 정방향 프라이머 5'-GCAAAAGAAAGAGAAAGTAAGA-3'(서열번호 1) 및 ID2 역방향 프라이머 5'-GAACACGGACATCAGCATC-3'(서열번호 2);ID2 forward primer 5'-GCAAAAGAAAGAGAAAGTAAGA-3 '(SEQ ID NO: 1) and ID2 reverse primer 5'-GAACACGGACATCAGCATC-3' (SEQ ID NO: 2);
TRAF 정방향 프라이머 5'-CAGACAGAGGAGACAGCAGGA-3'(서열번호 3) 및 TRAF 역방향 프라이머 5'-CACACAGAAGAGGAACTA-3'(서열번호 4);TRAF forward primer 5'-CAGACAGAGGAGACAGCAGGA-3 '(SEQ ID NO: 3) and TRAF reverse primer 5'-CACACAGAAGAGGAACTA-3' (SEQ ID NO: 4);
IRF2 정방향 프라이머 5'-GCTTCCTCTTGGTTTTGCTC-3'(서열번호 5) 및 IRF2 역방향 프라이머 5'-CTCTGCTGTGCGGGTGTA-3'(서열번호 6); 및IRF2 forward primer 5'-GCTTCCTCTTGGTTTTGCTC-3 '(SEQ ID NO: 5) and IRF2 reverse primer 5'-CTCTGCTGTGCGGGTGTA-3' (SEQ ID NO: 6); And
PU.1 정방향 프라이머 5'-GGTCATCTTCTTGCGGTTCT-3'(서열번호 7) 및 PU.1 역방향 프라이머 5'-CCTTCCAGTTCTCGTCCA-3'(서열번호 8).PU.1 forward primer 5'-GGTCATCTTCTTGCGGTTCT-3 '(SEQ ID NO: 7) and PU.1 reverse primer 5'-CCTTCCAGTTCTCGTCCA-3' (SEQ ID NO: 8).
그 결과, 도 3에서 보는 바와 같이 TRAF, IRF2 및 PU.1은 각 각의 처리조건에서 유전자 발현량이 크게 차이를 보이지 않았지만, ID2의 경우 크립토탄시논(5uM) 단독 처리군, IL-15(25ng) 및 크립토탄시논(5uM)을 함께 처리한 군에서만 발현량이 높게 유지되고 있다는 것을 확인하였다(도 3).
As shown in FIG. 3, TRAF, IRF2, and PU.1 showed no significant difference in gene expression in each treatment condition. In ID2, cryptanthinone (5uM) alone treatment, IL-15 25 ng) and cryptoxanthin (5 uM) were treated together (FIG. 3).
<< 실시예Example 4> 전구체로부터 분화한 4 > differentiated from the precursor NKNK 세포의 기능 확인 Identification of cell function
표적 세포(target cell)인 YAC-1에 대한 NK 세포의 세포독성(cytotoxicity)을 측정하기 위하여 4-h 51Cr-방출 분석(51Cr-release assay) 방법을 이용하였다. 51Cr이 라벨된 표적(51Cr-labeled target) YAC-1 세포(5 × 103세포/웰)에 대하여 각 각 50:1, 25:1 및 5:1로 희석하여 상기 <실시예 2>의 방법으로 분화된 NK 세포를 처리함으로서 실시하였고, 상층액에 분비된 51Cr을 γ-카운터(γ-counter)를 사용하여 측정하였다.A 4-h 51 Cr- release assay (51 Cr-release assay) method was used to measure the target cell cytotoxicity (cytotoxicity) of NK cells YAC-1 for the (target cell). Diluted with one of the foregoing <Example 2>: 1, 25: 1 and 5 51 Cr for each angle of 50 with respect to label the target (51 Cr-labeled target) YAC -1 cells (5 × 10 3 cells / well) , And the amount of 51 Cr secreted in the supernatant was measured using a? -Counter (? -Counter).
그 결과, 도 4의 A에서 보는 바와 같이 IL-15(25ng/㎖) 및 크립토탄시논(5uM)을 함께 처리한 조건에서 세포독성이 가장 높게 나왔다는 것을 확인하였다(도 4의 A). As a result, it was confirmed that the cytotoxicity was the highest in the condition that IL-15 (25 ng / ml) and cryptoxanthin (5 uM) were treated together as shown in FIG. 4A (FIG.
또한, NK 세포의 기능을 알아보는 또 다른 방법인 IFN-γ의 분비량을 측정하기 위하여 상기 <실시예 2>의 방법으로 분화시킨 NK 세포(2 × 105세포/웰)를 mIL-12(20ng/㎖) 및 mIL-15(25ng/㎖)로 16시간 동안 자극 시킨 후에 상층액을 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 키트(kit)(R&D systems, CA)로 측정하였다.In order to measure the secretion amount of IFN-y, another method of examining the function of NK cells, NK cells (2 x 10 5 cells / well) differentiated by the method of Example 2 were transfected with mIL-12 / Ml) and mIL-15 (25 ng / ml) for 16 hours, and then the supernatant was measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit (R & D systems, CA).
그 결과, 도 4의 B에서 보는 바와 같이 세포독성과 마찬가지로 IL-15(25ng/㎖)과 크립토탄시논(5uM), 또는 IL-15(25ng/㎖)과 탄시논 ⅡA(10uM)를 함께 처리한 조건에서 IFN-γ의 분비량이 가장 높게 나왔다는 것을 확인하였다(도 4의 B).
As a result, as shown in FIG. 4B, IL-15 (25 ng / ml) and cryptoxanthin (5 uM) or IL-15 (25 ng / ml) and tanshinone IIA It was confirmed that the secretion amount of IFN-y was the highest in the treated condition (Fig. 4B).
하기에 본 발명의 조성물을 위한 제조예를 예시한다.
The preparation examples for the composition of the present invention are illustrated below.
<< 제조예Manufacturing example 1> 약학적 제제의 제조 1> Preparation of pharmaceutical preparations
<1-1> <1-1> 산제의Sanje 제조 Produce
탄시논 또는 크립토탄시논 25 ㎎25 mg of tanshinone or cryptoxanthinone
IL-15 25 ㎎IL-15 25 mg
유당 50 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
After mixing the above components, the mixture was packed in an airtight container to prepare a powder.
<1-2> 정제의 제조<1-2> Preparation of tablets
탄시논 또는 크립토탄시논 25 ㎎25 mg of tanshinone or cryptoxanthinone
IL-15 25 ㎎IL-15 25 mg
유 당 50 ㎎50 mg of milk
스테아린산 마그네슘 2 ㎎2 mg of magnesium stearate
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
After mixing the above components, tablets were prepared by tableting according to a conventional method for producing tablets.
<1-3> 캡슐제의 제조 ≪ 1-3 > Preparation of capsules
탄시논 또는 크립토탄시논 25 ㎎25 mg of tanshinone or cryptoxanthinone
IL-15 25 ㎎IL-15 25 mg
유 당 50 ㎎50 mg of milk
스테아린산 마그네슘 2 ㎎2 mg of magnesium stearate
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
After mixing the above components, the capsules were filled in gelatin capsules according to the conventional preparation method of capsules.
<1-4> 환의 제조≪ 1-4 >
탄시논 또는 크립토탄시논 25 ㎎25 mg of tanshinone or cryptoxanthinone
IL-15 25 ㎎IL-15 25 mg
유 당 50 ㎎50 mg of milk
글리세린 100 ㎎100 mg of glycerin
자일리톨 100 ㎎100 mg of xylitol
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1 환 당 300 ㎎이 되도록 제조하였다.
After mixing the above components, they were prepared to be 300 mg per one ring according to a conventional method.
<1-5> 과립의 제조<1-5> Preparation of granules
탄시논 또는 크립토탄시논 25 ㎎25 mg of tanshinone or cryptoxanthinone
IL-15 25 ㎎IL-15 25 mg
대두추출물 50 ㎎Soybean extract 50 mg
포도당 100 ㎎Glucose 100 mg
전분 100 ㎎100 mg of starch
상기의 성분을 혼합한 후, 30% 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 섭씨 60℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.
After mixing the above components, 100 mg of 30% ethanol was added and the mixture was dried at 60 캜 to form granules, which were then filled in a capsule.
<1-6> 주사액제의 제조<1-6> Preparation of Injection Solution
탄시논 또는 크립토탄시논 25 ㎎25 mg of tanshinone or cryptoxanthinone
IL-15 50 ㎍/㎖IL-15 50 [mu] g / ml
묽은 염산 BP pH 7.6로 될 때까지Diluted hydrochloric acid BP until pH 7.6
주이용 염화나트륨 BP 최대 1 ㎖Sodium chloride up to 1 ml for injection
적당한 용적의 주이용 염화나트륨 BP 중에 탄시논/크립토탄시논 및 IL-15을 용해시키고, 생성된 용액의 pH를 묽은 염산 BP를 이용하여 pH 7.6로 조절하고, 주이용 염화나트륨 BP를 이용하여 용적을 조절하고 충분히 혼합하였다. 용액을 투명 유리로 된 5 ㎖ 타입 I 앰플 중에 충전시키고, 유리를 용해시킴으로써 공기의 상부 격자하에 봉입시키고, 120℃에서 15분 이상 오토클래이브시켜 살균하여 주사액제를 제조하였다.The pH of the resulting solution was adjusted to pH 7.6 with diluted hydrochloric acid BP, and the volume was adjusted to pH 7.6 using sodium chloride burette Lt; / RTI > The solution was filled in a 5 ml type I ampoule made of transparent glass, sealed in an upper lattice of air by dissolving the glass, sterilized by autoclaving at 120 DEG C for 15 minutes or longer, and an injection solution was prepared.
서열목록 전자파일 첨부Attach an electronic file to a sequence list
Claims (13)
[화학식 1]
[화학식 2]
A composition for differentiation or activity enhancement of a natural killer cell (NK cell) comprising cryptotanshinone represented by the following formula (1) or tanshinone IIA represented by the following formula (2) as an active ingredient:
[Chemical Formula 1]
(2)
The composition according to claim 1, wherein the cryptoxanthin or tanshinone IIA induces or promotes differentiation from hematopoietic stem cells into natural killer cells.
The composition according to claim 1, wherein the cryptoxanthin or tanshinone IIA increases the expression of ID2.
The composition according to claim 1, wherein the cryptoxanthin or tanshinone IIA is cytotoxic to YAC-1 cells and increases the production of IFN-y.
A composition for promoting the differentiation or activity of a natural killer cell comprising cryptoxanthinone or tanshinone IIA, and IL-15 (interleukin-15) as an active ingredient.
2) 단계 1)의 자연살해세포 전구체 세포에 크립토탄시논 또는 탄시논 ⅡA를 투여하는 단계를 포함하는 조혈줄기세포로부터 자연살해세포로의 분화 유도 방법.
1) inducing proliferation of natural killer cell precursor cells by adding natural killer cell precursor inducer in hematopoietic stem cells; And
2) A method for inducing differentiation of hematopoietic stem cells into natural killer cells, comprising the step of administering cryptoxanthin or tanshinone ⅡA to the natural killer cell precursor cells of step 1).
The method according to claim 7, wherein IL-15 is administered to the natural killer cell precursor cells of step 2), thereby inducing differentiation from hematopoietic stem cells into natural killer cells.
A method for promoting the activity of natural killer cells, comprising the step of treating cryptotansinone or tanshinone Ⅱ A with natural killer cell precursor cells differentiated from hematopoietic stem cells.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020120007819A KR101400900B1 (en) | 2012-01-26 | 2012-01-26 | A composition for differentiating natural killer cell or enhancing natural killer cell activation containing tanshinone as active ingredient |
| PCT/KR2013/000556 WO2013111969A1 (en) | 2012-01-26 | 2013-01-24 | Composition containing tanshinone as active ingredient, for increasing differentiation or activity of natural killer cells |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020120007819A KR101400900B1 (en) | 2012-01-26 | 2012-01-26 | A composition for differentiating natural killer cell or enhancing natural killer cell activation containing tanshinone as active ingredient |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20130086820A KR20130086820A (en) | 2013-08-05 |
| KR101400900B1 true KR101400900B1 (en) | 2014-05-29 |
Family
ID=48873653
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020120007819A KR101400900B1 (en) | 2012-01-26 | 2012-01-26 | A composition for differentiating natural killer cell or enhancing natural killer cell activation containing tanshinone as active ingredient |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101400900B1 (en) |
| WO (1) | WO2013111969A1 (en) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104341450B (en) * | 2013-08-09 | 2018-03-27 | 北京健峤医药科技有限公司 | A kind of synthesis of phosphocreatine derivative and pharmaceutical applications |
| KR20190093500A (en) | 2018-02-01 | 2019-08-09 | 주식회사 엔케이맥스 | Composition for Anti-cancer Comprising CD56+ Natural Killer Cells |
| KR20190093499A (en) | 2018-02-01 | 2019-08-09 | 주식회사 엔케이맥스 | Manufacturing Method for Natural Killer Cells |
| CN110433290A (en) * | 2019-03-15 | 2019-11-12 | 中山大学 | Cryptotanshinone and the combination of TKI inhibitor are preparing the application in Ph+ acute lymphoblastic leukemia chemotherapeutics |
| KR20210067776A (en) | 2019-11-29 | 2021-06-08 | 주식회사 엔케이맥스 | Mass Manufacturing Method for Natural Killer Cells comprising Freezing and Thawing Process |
| US20210393585A1 (en) * | 2020-06-19 | 2021-12-23 | Tzu Chi University | Method for preventing and/or treating a stress-induced disease |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1304723A (en) * | 2001-01-16 | 2001-07-25 | 中山大学 | Tanshinone compounds containing dihydrofuran ring structure used for medicine to treat hepatic encephalopathy |
| EP1706108A4 (en) * | 2003-12-30 | 2009-08-12 | Md Bioalpha Co Ltd | Obesity and metabolic syndrome treatment with tanshinone derivatives which increase metabolic activity |
| CA2636909A1 (en) * | 2006-01-13 | 2007-07-26 | The Feinstein Institute For Medical Research | Inhibition of inflammatory cytokine production with tanshinones |
| KR101182199B1 (en) * | 2010-05-27 | 2012-09-12 | 동국대학교 경주캠퍼스 산학협력단 | Composition containing Salvia miltiorrhiza extract or Cryptotanshinone for prevention or treatment of stroke |
-
2012
- 2012-01-26 KR KR1020120007819A patent/KR101400900B1/en active IP Right Grant
-
2013
- 2013-01-24 WO PCT/KR2013/000556 patent/WO2013111969A1/en active Application Filing
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| X. WANG et al, Potential anticancer activity of tanshinone ⅡA against human breast cancer, Int. J. Cancer, 2005, Vol. 116, pp. 799-807 * |
| X. WANG et al, Potential anticancer activity of tanshinone ⅡA against human breast cancer, Int. J. Cancer, 2005, Vol. 116, pp. 799-807* |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2013111969A1 (en) | 2013-08-01 |
| KR20130086820A (en) | 2013-08-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101400900B1 (en) | A composition for differentiating natural killer cell or enhancing natural killer cell activation containing tanshinone as active ingredient | |
| JP6869994B2 (en) | Medium addition kit for NK cell culture, and NK cell culture method using the kit | |
| US20120121544A1 (en) | Method for Efficiently Proliferating and Differentiating Natural Killer Cells from Umbilical Cord Blood | |
| JP7339309B2 (en) | Methods of producing natural killer cells and compositions for cancer therapy | |
| CN108025026A (en) | The purposes of anti-third party's central type memory T cell | |
| JPWO2013118899A1 (en) | Monocyte proliferating agent, monocyte growth medium, monocyte production method, dendritic cell production method, and dendritic cell vaccine production method | |
| KR20140091674A (en) | Use of foti to enhance stem cell mobilization and proliferation | |
| KR102236011B1 (en) | Mass proliferation culture method of NK cell | |
| KR101968184B1 (en) | Method of expansion of immune cell under hypoxic culture condition | |
| KR101447546B1 (en) | A method for differentiation and expansion of NK cell from CD14 positive monocytes | |
| KR101145391B1 (en) | A method for expansion of NK cells from Peripheral Blood | |
| CN108853129B (en) | Application of cimicin in preparation of myelogenous cytostatic drug | |
| KR20190060412A (en) | Composition for culturing NK cell and method for culturing NK cell using the same | |
| KR101143369B1 (en) | A COMPOSITION CONTAINING TUMOR NECROSIS FACTOR-alpha; FOR DIFFERENTIATING NATURAL KILLER CELL AS AN ACTIVE INGREDIENT AND A METHOD OF DIFFERENTIATION USING THE SAME | |
| KR102032384B1 (en) | Method for generation of natural killer cell from cord blood mononuclear cells | |
| KR20120095320A (en) | Cell protecting composition for toxicity suppression of natural killer cell comprising retinal or retinoic acid as an effective component | |
| KR100797050B1 (en) | Cd8 t cells having therapeutic effects on atopic dermatitis | |
| KR101273747B1 (en) | Composition for preventing and treating cancer or autoimmune diseases comprising STA-21 | |
| CN105861484B (en) | Cell culture medium composition containing resveratrol and silk sericin | |
| KR102566680B1 (en) | Effective novel dual-culture methods for the proliferation of immune cell as well as natural killer cell and use thereof | |
| KR102502770B1 (en) | Composition for preventing or treating cancer containing NK cells cultured with alloferon | |
| KR101535172B1 (en) | A method of differentiating stem cells into IL-22-producing natural killer cells | |
| KR102504039B1 (en) | Effective novel culture methods for the proliferation of natural killer cell and use thereof | |
| KR101932840B1 (en) | Myeloid derived suppressor cells treated with soluble PD-L1 having immuno-modulating activity and use thereof | |
| KR20130131268A (en) | Composition for preventing or treating th17-mediated diseases comprising poly-gamma-glutamic acid |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20170517 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20180412 Year of fee payment: 5 |