KR101396244B1 - Trichoderm koningii rsc1 producing cellulase and use thereof - Google Patents

Abstract

본 발명은 셀룰라아제(cellulase)와 자일라나아제(xylanase) 생산능이 있는 트리코데르마 코닌지(Trichoderm koningii) RSC1 균주 및 이 균주를 이용하여 셀룰라아제를 생산하는 방법과 개선된 사료를 제조하는 방법을 제공한다.The present invention relates to a cellulase and xylanase-producing Trichoderma ( Trichoderma) koningii ) RSC1 strain, and a method for producing a cellulase using the strain and a method for producing an improved feed.

Description

셀룰라아제를 생산하는 트리코데르마 코닌지 ＲＳＣ１및 이의 용도{TRICHODERM KONINGII RSC1 PRODUCING CELLULASE AND USE THEREOF}TRICODERMAKONINI RSC1 producing cellulase and its use {TRICHODERM KONING II RSC1 PRODUCING CELLULASE AND USE THEREOF}

본 발명은 셀룰라아제를 생산하는 신규한 트리코데르마 속 미생물(Trichoderm koningii RSC1) 및 이를 이용하여 개선된 사료를 제조하는 방법에 대한 것이다.
The present invention relates to a novel Trichoderma sp. Microorganism ( Trichoderm koningii RSC1) producing a cellulase and a method for producing an improved feed using the same.

현재 우리나라 양축 농가들이 급여하는 사료 중 조사료의 급여 비율은 40% 이하로서, 농후 사료를 과다 급여하고 있다. 또한 조사료의 대부분을 볏짚 등 저급 조사료로 급여함으로써 축우 사육의 경쟁력 확보에 가장 큰 걸림돌이 되고 있다. At present, the feed rate of the forage among the feeds of the farmers in Korea is less than 40%, and they are overfeeding the concentrated feeds. In addition, most of the forage is supplied as low-grade forage such as rice straw, which is the biggest obstacle to securing competitiveness of breeding cattle.

특히 젖소의 경제수명이 낙농 선진국의 절반에도 미치지 못하며 공판장에서 도축되는 소의 65%가 제1위 부전각화증에 걸려 있고 45%가 간농양에 걸려 있다는 사실은 조사료 급여 부족을 말해주는 것으로서, 농후사료 위주의 사료 급여에 의한 피해를 단적으로 보여주는 것이.In particular, the economic life of dairy cattle is less than half that of the developed countries, and the fact that 65% of cattle slaughtered in the tanks are caught in the first-stage keratosis and 45% in the liver abscess is the result of the lack of survey fees. It is to show the damage caused by the feeding of feed.

이러한 당면하고 있는 조사료 부족 문제를 해소하지 않고서는 축우산업의 경제성과 경쟁력 확보는 불가능하다. 최근 FTA 개방 대책으로 한우 육질의 차별화를 통한 고급육 생산이 대안으로 대두되고 있으나, 생후부터 14개월까지의 육성기에 조사료 위주의 사양을 통해 반추위와 골격을 형성하지 않는 한 후기 비육이 어렵다. 젖소의 경우에도 1일 10,000㎏ 이상의 고능력 육우 사육이 경쟁력 확보의 지상과제가 되고 있으나, 이 또한 양질조사료의 충분한 급여 없이는 이룰 수 없는 과제인 것이다. It is impossible to secure economic efficiency and competitiveness of the poultry industry without solving the problem of insufficient investigation fee. Recently, production of high quality meat by differentiating the quality of Korean beef has been emerging as an alternative to open FTA, but it is difficult to raise the latter half of breeding season until the 14th month of breeding period, unless rumen and skeleton are formed. Even in the case of dairy cows, breeding of high-quality beef cattle 10,000 kg or more per day is a challenge for securing competitiveness, but this is also an issue that can not be achieved without sufficient supply of quality forage.

연간 12백만톤, 2조원의 사료 곡물을 수입하는 국내 현실에서, 사료 자급율 향상은 축산업에서 지상 최대의 과제가 되어야 하며 초지 사료 작물 재배를 통한 자급조사료 생산은 가장 바람직한 자급사료 축산, 자주축산의 형태가 될 것이다. In Korea, which imports 12 million tons and 2 trillion won of feed grains annually, the improvement of the feed self-sufficiency rate should be the biggest challenge in the livestock industry, and the production of self-supporting forage by cultivating grassland crops is the most desirable type of feed, .

난소화성 탄수화물은 영양적 가치가 떨어지며 반추동물에서도 사료로서의 효율성이 떨어지며 물리적으로도 이물감을 준다. 따라서 이러한 농축부산물에 존재하는 난소화성 탄수화물의 분해는 사료로서의 가치를 매우 높일 수 있다. Indigestible carbohydrates have lower nutritional value and are less effective as feed for ruminants and physically impaired. Therefore, the degradation of ovarian carbohydrates present in these concentrated by-products can greatly enhance the value as a feed.

이중 볏짚은 주로 반추동물의 사료로 사용되고 있다. 그러나 매년 약 600만 톤 정도 생산되는 볏짚 중 40% 내외가 조사료로 사용되고 나머지는 조사료로서의 사용가치를 상실한 채로 버려지므로 사료로서의 가치가 높지 않다. 최근 곡물 가격 급등으로 인한 배합사료 비용 상승은 축산농가의 생산성 저하로 연결되 있다(2006년에 비해 2008년에 약 1.5배 상승). Double rice straw is mainly used as feed for ruminants. However, about 40% of the rice straw, which is produced about 6 million tons per year, is used as the forage and the rest is discarded as the use value as the forage is lost. The recent increase in grain prices has led to a decrease in productivity of livestock farmers (about 1.5 times in 2008 compared to 2006).

배합사료 비용 상승과 볏짚 생산량의 감소 문제를 동시에 해결할 수 있는 방안 중 하나는, 볏짚의 사료가치를 높이는 일이다. 특히 소의 경우 볏짚을 직접 소화하는 것이 아니고 위에 존재하는 미생물의 도움으로 소화를 하는데, 이와 같은 작용을 볏짚에 적용하여 미생물로 볏짚에 함유된 셀룰로오스를 당화시킴으로써 사료 가치를 높일 필요가 있다. One of the ways to overcome the problems of increased feed costs and reduced rice straw production is to increase the feed value of rice straw. In particular, in case of cattle, digestion is carried out with the aid of microorganisms present, rather than digesting rice straw directly. It is necessary to increase the feed value by saccharifying cellulose contained in rice straw as a microorganism by applying such action to rice straw.

이에 본 발명자들은 볏짚 등의 조사료에 함유된 셀룰로오스를 당화시키는 미생물에 대해 연구를 거듭한 끝에 본 발명에 이르렀다.
Accordingly, the present inventors have made intensive studies on microorganisms which saccharify cellulose contained in the forage such as rice straw, and have reached the present invention.

대한민국 등록특허공보 제10-0614412호Korean Patent Publication No. 10-0614412

Thygesen A, Oddershede J, Lilholt H, Thomsen BA, and Stahl K, Cellulose., 12, 563-576 (2005). Thygesen A, Oddershede J, Lilholt H, Thomsen BA, and Stahl K, Cellulose 12, 563-576 (2005). Ko JK, Bak JS, Jung MW, Lee HJ, Choi IG, Kimb TH, and Kim KH, Bioresour Technol., 100, 4374-4380 (2009).Ko JK, Bak JS, Jung MW, Lee HJ, Choi IG, Kim BTH, and Kim KH, Bioresour Technol., 100, 4374-4380 (2009).

본 발명의 목적은 셀룰라아제(cellulase)와 자일라나아제(xylanase) 생산능이 있는 신규 균주를 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide novel strains capable of producing cellulase and xylanase.

본 발명의 다른 목적은 상기 균주를 이용하여 셀룰라아제를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for producing a cellulase using the strain.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주를 이용하여 사료를 개선하는 방법을 제공하는 것이다.It is still another object of the present invention to provide a method for improving feed using the strain.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주를 이용하여 사료를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.It is still another object of the present invention to provide a method for producing a feed using the strain.

본 발명은 수탁번호 KACC93150P로 기탁된, 셀룰라아제(cellulase)와 자일란아제(xylanase) 생산능이 있는 트리코데르마 코닌지(Trichoderm koningii) RSC1 균주를 제공한다.The present invention provides a Trichoderma koningii RSC1 strain having the ability to produce cellulase and xylanase deposited under Accession No. KACC93150P.

또한 본 발명은 상기 균주를 배양하고; 그리고The present invention also relates to a method for culturing said strain; And

상기 균주를 배양한 배양액으로부터 셀룰라아제를 회수하는;Recovering the cellulase from the culture medium in which the strain has been cultured;

단계를 포함하는 셀룰라아제의 생산 방법을 제공한다.A method of producing a cellulase comprising the steps of:

상기 배양은 35-45℃ 및 pH 6-8에서 수행될 수 있다.The incubation can be carried out at 35-45 [deg.] C and pH 6-8.

상기 균주를 배양하는 단계에서 펩톤(peptone), 요소(urea), 카제인 가수분해물(casein hydrolysate), 콩(soybean meal), 질산나트륨(sodium nitrate) 또는 옥수수 침지물(corn steep solid)을 첨가할 수 있다.Peptone, urea, casein hydrolyzate, soybean meal, sodium nitrate or corn steep solids may be added in the step of culturing the strain. have.

또한 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 난소화성 탄수화물을 분해하는 미생물을 이용한 사료 개선제를 제공한다.The present invention also provides a feed improving agent using a microorganism capable of degrading an ovarianizable carbohydrate containing the strain or a culture thereof as an active ingredient.

또한 본 발명은 난소화성 탄수화물을 함유하는 조사료(roughage)에 제 1항의 균주 또는 이의 배양액을 처리하고; 그리고The present invention also relates to a method of treating a strain of the present invention, or a culture thereof, to a roughage containing an indigestible carbohydrate; And

상기 균주 또는 이의 배양액이 처리된 조사료를 발효시켜서 조사료를 개선시키는;Fermenting the strain or the culture medium treated with the strain to improve the roughage;

단계를 포함하는 사료 제조 방법을 제공한다.The method comprising the steps of:

상기 배양액에 펩톤(peptone), 요소(urea), 카제인 가수분해물(casein hydrolysate), 콩(soybean meal), 질산나트륨(sodium nitrate) 또는 옥수수 침지물(corn steep solid)을 첨가하여 셀룰레아제 생산능을 높일 수 있다.To the culture solution, peptone, urea, casein hydrolyzate, soybean meal, sodium nitrate or corn steep solids were added to the cellulase production ability .

상기 발효는 25-30℃, pH 5에서 수행될 수 있다.The fermentation may be carried out at 25-30 ° C, pH 5.

상기 조사료는 알파 셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로스, 볏짚, 쌀겨, 낙엽, 밀기울 및 이들의 혼합물로 구성된 난소화성 탄수화물 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.The forage may be any one selected from the group of indigestible carbohydrates consisting of alpha-cellulose, carboxymethyl cellulose, rice straw, rice bran, leaves, bran, and mixtures thereof.

상기 조사료를 개선시키는 단계는 상기 조사료의 셀룰로오스를 당화시키는 단계일 수 있다.
The step of improving the forage can be a step of saccharifying the cellulose of the forage.

본 발명은 셀룰로오스와 자일로오스를 동시에 분해하는 능력이 우수한 신규 균주 트리코데르마 속 미생물(Trichoderm koningii)을 이용하여 조사료를 제조할 수 있다. 난소화성 탄수화물인 셀룰로오스를 당화시켜서 볏짚의 사료 가치를 높이고, 볏짚으로 사료를 대체함으로써 생산성 상승에 기여하고, 그리고 볏짚의 조사료로서의 사용률을 증가시킬 수 있다. 아울러 거대 분자의 분해로 물성이 개선되어 사료의 가공이 용이해지고, 사료 물성의 개선으로 가축의 사료 섭취를 돕고, 미생물의 발효 과정을 통해 다양한 영양 성분이 미생물로부터 합성됨으로써 기능성 물질이 사료에 첨가되는 결과를 가져오고, 그리고 선별된 미생물이 사료에서 생균제로서의 기능도 수행하는 효과가 있다.The present invention can produce a forage using a new strain of Trichoderma koningii which is capable of simultaneously decomposing cellulose and xylose. It is possible to increase the productivity value of rice straw by increasing the feed value of rice straw by saccharifying the cellulose which is an indigestible carbohydrate and replacing the feed with rice straw. In addition, the degradation of macromolecules improves physical properties, facilitating the processing of feeds, improving the feed properties, assisting in the feeding of livestock feed, and allowing various nutrients to be synthesized from the microorganisms through the microbial fermentation process, Results are obtained, and the selected microorganisms also function as probiotics in the feed.

아울러 본 발명은 소화성 탄수화물(볏짚, 밀집 등)의 사료 가치를 상승시킴으로써 배합사료 비용 상승과 볏짚 생산량의 감소 문제를 동시에 해결할 수 있는 효과를 제공한다.In addition, the present invention provides an effect of simultaneously increasing the feed cost of digestible carbohydrates (rice straw, dense rice, etc.) and reducing the production of rice straw.

도 1은 UV조사 및 계대배양을 통해 선발된 개량 균주의 제1 결과를 나타낸 사진이다.
도 2는 타 균주와 트리코데르마 코닌지(Trichoderm koningii) 균주와의 유사성 및 상동성을 비교한 제2 결과를 나타낸 사진이다.
도 3은 트리코데르마 코닌지 RSC1으로부터 정제된 셀룰라아제의 활성 제3 결과를 나타낸 사진이다(a는 대조구(무처리), b는 대조구(효소 무처리) 그리고 c는 처리구(효소 처리)임).
도 4는 상기 정제된 셀룰라아제의 역가 측정, 활성범위(pH, 온도, 염) 측정 결과를 나타낸 사진이다.
도 5는 상기 정제된 효소의 β-glucosidase 활성 결과를 나타낸 사진이다.
도 6은 T. koningii RSC1 균주와 함께 다양한 질소원 처리후 분해 활성을 측정결과를 나타낸 것이다.
도 7은 볏짚 부산물에 T. koningii RSC1 처리 후 셀룰로오스의 분해효과 측정 결과를 나타낸 사진이다(Non-inoculated는 기본배지를 의미하고, No Nitrogen은 기본배지에서 질소원을 뺀 것을 의미함).
도 8은 난소화성 탄수화물을 분해하는 T. koningii RSC1의 적용 및 최적화 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 T. koningii RSC1를 이용한 자일라나아제 생산 최적화 결과를 나타낸 것이다(왼쪽 세개의 붉은 막대는 펩톤, 그 다음 세개의 붉은 막대는 요소, 그리고 파란 막대는 카제인임).
도 10은 T. koningii RSC1를 이용한 셀룰라아제 최적 활성을 나타낸 것이다.
도 11은 T. koningii RSC1에 의한 글루코오스 및 셀룰라아제의 최적 활성 제15 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 T. koningii RSC1 처리에 의한 볏짚의 물성 변화를 주사전자현미경(SEM)으로 확인한 것이다.
도 13은 T. koningii RSC1 처리에 의한 볏짚의 물성 변화를 X선 회절 정도로 확인한 것이다.Figure 1 is a photograph showing the first result of an improved strain selected through UV irradiation and subculture.
Fig. 2 is a photograph showing the second result of comparing the homology and homology of the strain to the strain of Trichoderma koningii .
Fig. 3 is a photograph showing the activity third result of purified cellulase from Trichoderma makinigan RSC1 (a is a control (no treatment), b is a control (no enzyme treatment) and c is a treatment (enzyme treatment).
FIG. 4 is a photograph showing the activity measurement (pH, temperature, salt) measurement of the activity of the purified cellulase.
5 is a photograph showing the results of β-glucosidase activity of the purified enzyme.
Figure 6 shows the results of measuring the degradation activity after various nitrogen sources treatment with the T. koningii RSC1 strain.
FIG. 7 is a photograph showing the result of measurement of degradation effect of cellulose after T. koningii RSC1 treatment on rice straw byproducts. (Non-inoculated means basal medium, and No Nitrogen means subtracting nitrogen source from the basic medium).
Figure 8 shows the application and optimization results of T. koningii RSC1 degrading the indigestible carbohydrate.
Figure 9 shows the results of optimization of xylenase production using T. koningii RSC1 (the three red bars on the left are peptone, the next three red bars are element, and the blue bar is casein).
Figure 10 shows the optimal activity of cellulase using T. koningii RSC1.
Figure 11 shows the results of Optimal Activity 15 of glucose and cellulase by T. koningii RSC1.
12 is a scanning electron microscope (SEM) image showing changes in the physical properties of rice straw by T. koningii RSC1 treatment.
13 shows the change in the physical properties of rice straw by T. koningii RSC1 treatment in terms of X-ray diffraction.

이하 본 발명의 이해를 돕기 위해 바람직한 실시예를 통하여 좀 더 구체적으로 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings. However, the following examples are illustrative of the present invention and are not intended to limit the scope of the present invention.

실시예 1: 셀룰라아제를 생산하는 신규 미생물의 분리 및 동정Example 1 Isolation and Identification of New Microorganisms Producing Cellulase

1-1: 신규한 균주 분리를 위한 배양액의 종류, 배양 조건 및 균주 선별1-1: Kinds of Culture Medium, Culture Conditions and Strain Selection for New Strain Isolation

난소화성 탄수화물 분해 효소인 셀룰라아제를 고효율로 생산하는 균주를 분리하기 위해, 경기도 용인 함박산에서 곰팡이 병이 발병하는 시기인 6 - 8월에 걸쳐 ??은 나무로부터 시료를 채취하였다. 그 분리 방법은 다음과 같다.In order to isolate strains producing highly efficient cellulase, which is an indigestible carbohydrate degrading enzyme, samples were collected from June to August, when the fungal disease occurred at Mt. The separation method is as follows.

다양한 곰팡이 균에 의해 분해된 나무로부터 접종침을 사용하여 0.05% 트리톤 X-100이 첨가된 멸균수에 포자를 현탁하여 감자 녹말 2 g/L, 덱스트로스 10 g/L, 아가 2.5 g/L, 최종 pH 5.1의 1/2 감자한천배지(PDA, Potato dextrose agar)상에서 평판희석법으로 단일 포자를 분리하여 사용하였다. The spores were suspended in sterilized water to which 0.05% Triton X-100 had been added using inoculation from various fungi-degraded trees, and 2 g / L of potato starch, 10 g / L of dextrose, 2.5 g / Single spores were used by plate dilution on a final pH 5.1 1/2 potato dextrose agar (PDA).

분리된 균주들은 아래 [표 1]에 나타낸 영양배지에 접종하여 증폭시킨 후 4℃ 또는 -20℃에 보관하였다. 상기 배지를 사용하여 28℃에서 균주를 배양하였고, 시간 경과에 따른 균주 성장 형태를 관찰하면서 계대배양을 통해 균주의 활성을 유지하였고 순수 분리를 수행하였다. The isolated strains were inoculated on the nutrient medium shown in [Table 1] and stored at 4 ° C or -20 ° C. The strain was cultured at 28 ° C using the above medium, and strain activity was maintained through subculture while observing the growth pattern of the strain over time, and pure separation was performed.

난소화성 탄수화물을 분해하는 미생물 분리용 배지 조성Composition of microorganism-separating medium for decomposing indigestible carbohydrates 배지 성분Medium component 함량(g)Content (g) KH₂PO₄ KH ₂ PO ₄ 22 CaCl₂·2H₂OCaCl ₂ .2H ₂ O 0.30.3 MgSO₄·7H₂OMgSO ₄ .7H ₂ O 0.30.3 FeSO₄·7H₂OFeSO ₄ .7H ₂ O 0.0050.005 CoCl₂·6H₂OCoCl ₂ .6H ₂ O 0.020.02 MnSO₄·7H₂OMnSO ₄ .7H ₂ O 0.00160.0016 ZnSO₄·7H₂OZnSO ₄ .7H ₂ O 0.00140.0014

이 때 기존에 알려진 셀룰레아제를 생산하는 Penicillium camemberti (Jun CW, Min MZ, Sel KM., Folia Microbiol (Praha). 1992;37(3):199-204.)대조구와 사면배지에 5일간 자란 균주를 상기 표 1의 배지성분을 함유한 액체배양액에 접종 후 28℃에서 7일간 진탕배양 후 난소화성 탄수화물의 분해능이 가장 우수한 미생물을 분리하였다. At this time, Penicillium, which produces a known cellulase, camemberti A strain grown for 5 days in a control and slope medium was inoculated into a liquid culture medium containing the medium components of Table 1 above (see, for example, . After incubation at 28 ° C for 7 days with shaking, microorganisms having the best ability to hydrolyze indigestible carbohydrates were isolated.

1-2: 자외선(UV) 조사로 트리코데르마 코닌지 T.C.2의 돌연변이 유발을 통한 균주 개량1-2: Improvement of strain through mutation induction of T.C.2 by ultraviolet (UV) irradiation

UV 조사 및 계대배양을 통한 개량 균주 선발을 위해, 야생형 T. koningii T.C.2 균주를 사면배지에 접종한 후 28℃에서 7일간 배양하여 포자를 형성시켰다. 0.2% 트윈 80(20 mL) 용액을 사면배지에 주입하여 포자를 회수한 후, 멸균된 페트리 디쉬에 담아 UV광을 조사하였다. UV광 조사가 완료된 후 포자를 멸균된 증류수로 희석하여, 0.01% 트리톤 X-100이 첨가된 상기 표 1의 생산배지에 도말하였다. 5~7일 후 콜로니가 나타나는 균주를 선별하였다. 이때 포자 농도를 1 x 10⁵ conidia/ml 로 조정하고 30분 동안 UV광을 조사하였을 때 7.5%가 생존하였으며, 60분 동안 조사할 때는 2.3%의 생존하였다. 이 중 가장 많이 생존한 균주를 선별하였다(도 1). In order to select an improved strain by UV irradiation and subculture, a wild type T. koningii TC2 strain was inoculated on a slope medium and cultured at 28 ° C for 7 days to form spores. 0.2% Tween 80 (20 mL) was injected into the slant medium to collect the spores and then irradiated with UV light in a sterile petri dish. After the UV light irradiation was completed, the spores were diluted with sterilized distilled water and plated on the production medium of Table 1 to which 0.01% Triton X-100 had been added. After 5 to 7 days, strains showing colonies were selected. At this time, when the spore concentration was adjusted to 1 × 10 ⁵ conidia / ml and UV light was irradiated for 30 minutes, 7.5% survived, and when irradiated for 60 minutes, 2.3% survived. The most abundant strains were selected (Fig. 1).

1-3: 18S rRNA 염기서열 분석을 통한 신규 균주의 동정1-3: Identification of new strains by 18S rRNA sequencing

선별된 균주로부터 18S rRNA 염기서열(서열번호 1) 특이적인 포워드 프라이머(tccgtaggtgaaccttgcgg)와 리버스 프라이머(tcctccgcttattgatatgc)로 PCR반응을 수행한 후 얻어진 산물의 염기서열을 분석한 후 타 균주와 트리코데르마 코닌지(Trichoderm koningii) 균주와의 유사성 및 상동성을 비교하여 계통도(phylogenetic tree)를 작성하여 도 2에 나타내었다. 또한 UV 광 조사를 통해 얻어진 돌연변이균주를 "트리코데르마 코닌지(Trichoderm koningii) RSC1"로 명명하여 2012년 3월 15일자에 국립농업과학원 농업유전자원센터에 기탁하였다(기탁번호: KACC93150P).
PCR was carried out with the forward primer (tccgtaggtgaaccttgcgg) and the reverse primer (tcctccgcttattgatatgc) specific for 18S rRNA nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1) from the selected strains and the nucleotide sequence of the obtained product was analyzed. The phylogenetic tree was prepared by comparing the similarity and homology with the Trichoderma koningii strain and is shown in Fig. The mutant strain obtained through UV light irradiation was named " Trichoderm koningii RSC1" and deposited on March 15, 2012 with the National Institute of Agricultural Science and Technology (National Institute of Agricultural Science and Technology, Korea) (Accession No .: KACC93150P).

실시예 2: 셀룰라아제의 정제 및 특성 규명Example 2: Purification and Characterization of Cellulase

2-1: [실시예 1]의 트리코데르마 코닌지 RSC1으로부터 셀룰라아제 정제2-1: Purification of cellulase from RSC1 of Trichoderma makinigi of [Example 1]

1L 삼각플라스크에 100 ㎖의 트리코데르마 코닌지 RSC1을 접종한 후, 30℃에서 5일간 진탕배양(150 rpm)하는 방법으로 전배양을 실시하고, 이들을 본 배양에 이용하였다. 본 배양에는 펩톤 0.8% (w/v), 효모 추출물 0.2% (w/v), 글루코오스 0.5% (w/v), KH₂PO₄ 0.5% (w/v), K₂HPO₄ 0.5% (w/v), MgSO₄ㆍ7H₂O 0.3% (w/v), 티아민 HCl 5 ppm을 포함한 액체배지(pH 5.1)를 사용하였다. 조제된 액체배지에 다시 전배양액 5 ㎖를 첨가하고, 볏짚을 혼입율 5% (w/v)가 되도록 조정하여 다시 3주간 본 배양을 실시하였다. 이 배양이 완료된 후 배양액을 필터 페이퍼 (Adventec No.2)로 여과한 후, Amicon 멤브레인 농축기를 사용하여 탈염, 농축하여 최종 조효소(셀룰라아제) 농축액을 얻었다. 그 다음 이 농축액을 필터 페이퍼에 처리하여 무처리구와 비교한 결과 뛰어나 효소 활성을 보이는 것을 확인하였다(도 3).
A 1 L Erlenmeyer flask was inoculated with 100 ml of Trichoderma makinigine RSC1 and then subjected to shake culture (150 rpm) at 30 캜 for 5 days, followed by pre-culture, and these were used for the main culture. This culture has peptone 0.8% (w / v), 0.2% yeast extract (w / v), glucose 0.5% (w / v), KH 2 PO 4 0.5% (w / v), K 2 HPO 4 0.5% ( (pH 5.1) containing 0.3% (w / v) of MgSO ₄揃 7H ₂ O and 5 ppm of thiamine HCl. 5 ml of the preculture solution was added to the prepared liquid medium, and the rice straw was adjusted to have a mixing ratio of 5% (w / v), followed by further culturing for 3 weeks. After completion of the cultivation, the culture was filtered with a filter paper (Adventec No. 2), desalted and concentrated using an Amicon membrane concentrator to obtain a final coenzyme (cellulase) concentrate. The concentrate was then treated on a filter paper and compared with the untreated sample, indicating that the enzyme activity was excellent (FIG. 3).

2-2: 정제된 셀룰라아제의 역가, 활성 범위 측정 및 안정성 실험2-2: Measurement of potency, activity range and stability of purified cellulase

셀룰라아제 생산중의 pH 및 온도가 미치는 효과는 각각 다른 pH(4, 5, 6, 7 및 8)로 조정된 배지에 탄소원으로서 와트만 여과지를 사용하였고, 각각 다른 온도(25, 30, 35, 40 및 45℃)에서 배양하여 최적의 pH와 온도를 결정하였다. 도 4에 나타난 것과 같이, 최적 온도는 35-45℃이고 최적 pH는 6-8임을 알 수 있다.The effect of pH and temperature on cellulase production was determined by using Wattmann filter paper as a carbon source on media adjusted to different pHs (4, 5, 6, 7 and 8) And 45 ° C) to determine the optimum pH and temperature. As shown in Fig. 4, it can be seen that the optimum temperature is 35-45 DEG C and the optimum pH is 6-8.

안전성 실험을 위해 β-glucosidase 활성을 조사하였다. β-glucosidase 활성을 조사하기 위하여, 에스큘린(aesculin) 고체배지(Czapek solut ion A 50ml, Czapek solut ion C 50ml, Zinc solution 1ml, Copper solution 1ml, Sucros e 5g, Aesculin 3g, Ferric citrate 0.2g, Agar 12g, Distilled water 900ml)배지를 이용하였고, 활성 측정을 위해 트리코데르마 코닌지 RSC1 종균을 접종하였다. 트리코데르마 코닌지 RSC1은 수크로오스를 처음으로 이용하고 그 다음에 에스큘린을 분해하여 글루코오스와 에스큘레틴(6,7-디하이드록시쿠마린(aesculetin(6,7-dihydroxycoumarin))을 생성하는데, 이 때 에스큘린은 아이언 시트레이트(iron citrate)와 반응하여 배지를 검게 만든다. 이러한 블랙 복합체(black complex)의 정도를 조사하여 효소 활성을 측정하였다. 도 5를 통해, 6-9일에서 β-glucosidase 활성이 높다는 것을 알 수 있다. 이미 알려진 셀룰라아제 생산 균주가 β-glucosidase를 활성화하기 위해서는 최소 14일의 기간이 소요되었으나 본 발명에 따른 균주를 이용하면 6-9일 내에 최대 활성을 얻을 수 있음을 알 수 있다. 따라서 본 발명의 균주인 트리코데르마 코닌지 RSC1를 이용하면 셀룰라아제 생산을 위한 반응 시간을 단축시킬 수 있다.
Β-glucosidase activity was investigated for safety experiments. To investigate β-glucosidase activity, 50 μl of aesculin solid medium (50 ml of Czapek solution A, 50 ml of Czapek solution C, 1 ml of Zinc solution, 1 ml of Copper solution, 5 g of Sucros e, 3 g of Aesculin, 0.2 g of Ferric citrate, 12g, Distilled water 900ml) medium was used, and the activity of tricoderemaconin RSC1 strain was inoculated. Tricode dermaconing RSC1 uses sucrose for the first time and then degrades escululin to produce glucose and esculetin (aesculetin (6,7-dihydroxycoumarin)), The escululin reacts with iron citrate to make the medium black. The enzyme activity was measured by examining the degree of the black complex. Through Figure 5, β-glucosidase It was found that the activity was at least 14 days in order to activate β-glucosidase. However, when the strain according to the present invention was used, the maximum activity could be obtained within 6-9 days Therefore, the reaction time for producing the cellulase can be shortened by using the strain TRCODERMAKONINI RSC1 of the present invention.

실시예 3: 셀룰로오스 분해 활성 측정Example 3: Measurement of cellulolytic activity

T. koningii RSC1 균주와 함께 질소원으로 펩톤(peptone), 요소(urea), 카제인 가수분해물(casein hydrolysate), 콩(soybean meal), 질산나트륨(sodium nitrate) 또는 옥수수 침지물(corn steep solid)을 첨가했을 때 균주로부터 생산되는 셀룰라아제의 활성이 배양 6일째, 무처리구에 비해 10~12배 증가하는 것을 확인하였다(도 6). 이때 사용한 배지의 조성은 아래 [표 2]와 같다.
Peptone, urea, casein hydrolyzate, soybean meal, sodium nitrate or corn steep solids are added to the nitrogen source together with the T. koningii strain RSC1. , It was confirmed that the activity of the cellulase produced from the strain was increased 10 to 12 times as compared to the untreated group on the 6th day of culture (Fig. 6). The composition of the medium used here is shown in Table 2 below.

T. koningii RSC1균주의 셀룰라아제 활성 증가를 위한 배지 조성 T. koningii Medium composition for increasing cellulase activity of strain RSC1 배지 성분Medium component 함량content 볏짚 파우더 Rice straw powder 15 g15 g 밀기울bran 1 g1 g 질소원
(펩톤, 요소, 카제인 가수분해물, 콩, 질산나트륨 또는 옥수수 침지물)Nitrogen source
(Peptone, urea, casein hydrolyzate, soy, sodium nitrate or corn steep liquor) 1 g1 g 증류수 Distilled water 70 ml70 ml [표 1]의 영양배지 용액The nutrient medium solution of [Table 1] 2 ml2 ml

3-1: 볏짚과 밀짚 부산물에 3-1: In rice straw and straw byproducts T. koningii T. koningii RSC1 처리 후 셀룰로오스의 분해 활성 측정 Measurement of degradation activity of cellulose after RSC1 treatment

T. koningii RSC1 균주 처리에 의해 볏짚과 밀짚의 셀룰로오스가 분해되는지 알아보기 위해, 당으로 환원되는 활성도를 측정할 때 탄소원으로서 2% 알파-셀룰로오스와 1% 쌀겨 + 1% 밀겨를 사용하여 글루코오스의 증가를 비교하였다. 이때 T. koningii RSC1 균주를 10⁸ x CFU 의 농도로 1kg의 볏짚(쌀겨) 및 밀짚(밀겨)에 각각 처리한 후 당화되는 활성도를 비교하고 분석하여 그 결과를 아래 표 3에 나타내었다. 활성 측정은 공지된 방법에 따라 수행하였다(Ghose, T.K., 1987. Measurement of cellulase activities. Pure Appl. Chem., 59,257­268). In order to investigate the decomposition of cellulose in rice straw and straw by T. koningii RSC1 strain treatment, the activity of reduced sugar was measured using 2% alpha-cellulose and 1% rice bran + 1% Were compared. At this time, T. koningii The RSC1 strain was treated with 1 kg of rice straw (rice bran) and straw (pressed) at a concentration of 10 ⁸ x CFU, and the activities of saccharification were compared and analyzed. The results are shown in Table 3 below. Activity measurements were performed according to known methods (Ghose, TK, 1987. Measurement of cellulase activities. Pure Appl. Chem., 59 , 257268).

상기 [표 2]에 제시한 배지조성으로 셀룰라아제 활성을 측정하였다. 측정 방법으로, 염료 승화 방식(dye diffusion methods)을 이용하였는데, 셀룰로오스 아쥬어(cellulose azure)와 같은 염색약이 결합된 셀룰로오스를 이용하여 실험에 이용하였다. 그 기본 방법은 다음과 같다. 1g의 볏짚에, 40 ml의 멸균수를 넣고 최대속으로 교반한 후 그 현탁액을 30분간 4℃에서 3000 rpm으로 원심분리하였다. 이후 상등액을 여과지에 넣어 CMCase(carboxymethylcellulase), β-글루코시다아제 및 자일라나아제의 활성도를 측정하였다. Cellulase activity was measured by the medium composition shown in Table 2 above. As a measurement method, dye diffusion methods were used. Cellulose coupled with a dye such as cellulose azure was used for the experiment. The basic method is as follows. To 1 g of rice straw, 40 ml of sterilized water was added, and the suspension was stirred at a maximum speed. The suspension was centrifuged at 3000 rpm at 4 캜 for 30 minutes. The supernatant was then added to the filter paper to measure the activity of CMCase (carboxymethylcellulose), β-glucosidase and xylanase.

주요 난소화성 탄수화물인 셀룰로오스를 당화시키기 위해서는 셀룰라아제와 자일라나아제와 같은 효소가 필요하기 때문에, T. koningii RSC1을 볏짚에 처리한 후 CMC(Carboxymethyl cellulase) 효소 활성(endoglucanase)을 검증하였다. 그 결과, T. koningii RSC1 균주 배양액에 각종 효소 활성 촉매제(질소원)를 동시에 첨가하여 CMC(Carboxymethyl cellulase) 효소 활성을 측정한 결과, 도 7에 나타난 것과 같이, 펩톤(peptone), 요소(urea), 카제인 가수분해물(casein hydrolysate) 등이 배양 9일째, 무처리구에 비해 15~20배 높은 활성을 보였다. 도 7을 보면 배양 9일 이후에는 효소 활성이 활발히 일어나 미이 분해할 대상이 없어져서 대조구보다 질소원의 실험구가 활성이 낮게 나타나기도 함을 알 수 있다.
Since enzymes such as cellulase and xylenase are required to glycosylate the main indigestible carbohydrate, T. koningii RSC1 was treated with rice straw and carboxymethyl cellulase (CMC) enzyme activity (endoglucanase) was verified. As a result, carboxymethyl cellulase (CMC) enzyme activities were measured by simultaneously adding various enzymatic activity catalysts (nitrogen source) to the culture medium of T. koningii RSC1. As a result, peptone, urea, Casein hydrolysate, etc., showed 15 ~ 20 times higher activity than the untreated group on the 9th day of culture. As shown in FIG. 7, after 9 days of incubation, the enzyme activity was actively activated, and there was no myiolytic substance, so that the activity of the nitrogen source was lower than that of the control.

실시예 4: 셀룰라아제 분해 Example 4: Cellulase degradation T. koningii T. koningii RSC1의 적용 및 최적화Application and optimization of RSC1

셀룰라아제 활성도는 전자 수용체의 흡광도 감소로 분석하였다. 100 μL 2,6-디클로로페놀-인도페놀(2,6-dichlorophenol-indophenol)[DCIP, 3 mM in water containing 10% (v/v) ethanol], 100 μL 락토오스(300 mM), 100 μL 소듐 아세테이트 버퍼 (100 mM, pH 4.0), 그리고 700 μL 배양 상등액(표 2의 배양액을 이용)이 포함된 총 1.0 mL 의 효소 반응액을 55℃에서 5분간 반응시킨 후 520 nm에서 흡광도 감소를 측정하였다. 1 유니트의 효소 활성도는 분당 1 μmol의 DCIP가 환원된 양(FPU/ml)으로 규정하였다.Cellulase activity was analyzed by decreasing the absorbance of the electron acceptor. 100 μL of 2,6-dichlorophenol-indophenol [DCIP, 3 mM in water containing 10% (v / v) ethanol], 100 μL of lactose (300 mM), 100 μL of sodium acetate A total of 1.0 mL of the enzyme reaction solution containing buffer (100 mM, pH 4.0) and 700 μL culture supernatant (using the culture medium of Table 2) was reacted at 55 ° C for 5 minutes and absorbance reduction was measured at 520 nm. The enzyme activity of 1 unit was defined as the amount of 1 μmol of DCIP reduced per minute (FPU / ml).

FPase 활성도는, 왓트만 No. 1 여과지와 0.1M 소듐 아세테이트 완충액(pH 5.0) 2 mL에 상기 배양 상등액으로부터 분리된 조효소액 0.2 mL를 첨가하여 교반한 다음 50℃ 항온조에서 1 시간 반응시킨 후 반응액 1 mL를 취하여 환원당 정량법에 의해 측정하였다. 이때 표준반응조건에서 단위분당 1μmol의 글루코오스에 상응하는 환원당을 생성하는데 필요한 효소량을 1 유니트로 정의하였다.The activity of FPase was determined by the method of Wattsman No. 1. 1 filter paper and 0.2 mL of crude enzyme solution isolated from the culture supernatant was added to 2 mL of 0.1 M sodium acetate buffer (pH 5.0), and the mixture was reacted for 1 hour in a 50 ° C thermostat. Then, 1 mL of the reaction solution was taken and analyzed by reducing sugar determination Respectively. The amount of enzyme required to produce reducing sugar corresponding to 1 μmol of glucose per minute under standard reaction conditions was defined as 1 unit.

CMCase 활성도는, 기질로 볏짚 2%, 요소 0.5%를 증류수에 넣어 121℃ 1.5기압에서 30분간 멸균하여 브로쓰로 사용하였다. 250 ml 삼각플라스크에서 총 36시간 배양 동안 0, 6, 12, 24, 36 시간에 효소의 활성을 측정하였다.CMCase activity was determined by adding 2% rice straw and 0.5% urea to distilled water, and sterilized at 121 ° C and 1.5 atm for 30 minutes. Enzyme activity was measured at 0, 6, 12, 24, and 36 hours in a 250 ml Erlenmeyer flask for a total of 36 hours of culture.

β-글루코시다아제 활성도 측정을 위해, 0.05 M 시트레이트 버퍼(pH 4.8)에 1 mM PNPG(p-nitrophenyl-β-D-glucoside)를 용해시킨 후 기질 용액 0.9 mL와 0.1 mL 배양 상등액을 섞은 후 50℃ 항온조에서 150 rpm으로 20 분간 반응시켰다. 반응 후 1 M Na₂CO₃ 용액 1.0 mL를 반응액에 첨가하여 반응을 종결시킨 후 400 nm에서 흡광도를 측정하였다. 1 유니트의 효소 활성도는 분당 1 μmol의 p-니트로페놀(p-nitrophenol)이 생산된 양으로 규정하였다.For measurement of β-glucosidase activity, 1 mM PNPG (p-nitrophenyl-β-D-glucoside) was dissolved in 0.05 M citrate buffer (pH 4.8) and 0.9 mL of substrate solution and 0.1 mL culture supernatant were mixed The reaction was carried out at 50 rpm in a thermostatic chamber at 150 rpm for 20 minutes. After the reaction, 1.0 mL of 1 M Na ₂ CO ₃ solution was added to the reaction solution to terminate the reaction, and the absorbance at 400 nm was measured. One unit of enzyme activity was defined as the amount of 1 μmol p-nitrophenol produced per minute.

자일라나아제의 활성도는 DNS(3,5-dinitrosalicylic acid) 방법을 사용하여 자일란(xylan)으로부터 유리된 자일로오스(xylose) 함량을 측정하여 분석하였다. 증류수에 녹인 1.0%(w/v) 자일란 500 μl, PBS(pH 7.0) 250 μl와 효소 용액 250 μl을 넣고 50℃에서 15분 동안 반응시킨 후, DNS 시약 3 ml을 첨가하여 반응을 정지시키고 5분 동안 끓인 다음, 찬물에서 냉각 후 575 nm에서 흡광도를 측정하였고, D-자일로오스를 표준시료로 사용하여 동일 조건하에서 발색시켜 조사한 흡광도와 비교함으로써 유리된 환원당의 양을 결정하였다. 효소의 활성도 1.0 유니트는 위의 조건하에서 1분 동안 자일란으로부터 1 μmol의 자일로오스에 상응하는 환원당을 생성하는 효소의 양으로 정의 하였다. The activity of xylanase was analyzed by measuring the amount of xylose liberated from xylan using the DNS (3,5-dinitrosalicylic acid) method. 500 μl of 1.0% (w / v) xylan dissolved in distilled water, 250 μl of PBS (pH 7.0) and 250 μl of the enzyme solution were added and reacted at 50 ° C. for 15 minutes. Then, 3 ml of the DNS reagent was added to stop the reaction, Min, and then the absorbance was measured at 575 nm after cooling in cold water. The amount of reducing sugars liberated was determined by comparing the absorbance with the absorbance obtained by color development under the same conditions using D-xylose as a standard sample. Activity of the enzyme 1.0 unit was defined as the amount of enzyme producing reducing sugars corresponding to 1 μmol of xylose from xylan for 1 minute under the above conditions.

단백질 정량은 배양액을 아미콘 멤브레인(Amicon membrane) 농축기를 사용하여 농축하고 얻어진 농축액을 분석용 추출물로 사용하였다. 단백질 정량은 브래드포드 방법(Bradford, 1967)에 따라 정량하였고 다음 식에 의거하여 단백질 농도를 구하여 각각의 활성도 측정 결과에 반영하였다.For protein determination, the culture was concentrated using an Amicon membrane concentrator, and the obtained concentrate was used as an analytical extract. Protein quantification was quantitated according to the Bradford method (Bradford, 1967), and the protein concentration was determined according to the following equation and reflected in the results of each activity measurement.

단백질 농도 (mg/㎖)= A595 × 0.811 + 0.009Protein concentration (mg / ml) = A595 x 0.811 + 0.009

T. koningii RSC1 10⁸ x CFU 농도로 1kg의 볏짚에 처리한 후 FPase, CMCase 및 β-글로코시다아제 생산중의 pH 및 온도의 최적화는, 각각 다른 pH(4, 5, 6, 7 및 8)로 조정된 배지에 질소원으로서 카제인이 함유된 고체배지(표 2 배지구성과 동일)를 사용하였고, 각각 다른 온도(25, 30, 35 및 40℃)에서 배양하여 최적의 pH와 온도를 결정하였다. 이때 반응 최적온도는 25~30℃의 범위에서 높은 셀룰라아제 활성을 보였다. pH 영향에서는 다양한 완충용액을 이용하여 pH를 4~8까지 변화시켜 효소 활성을 측정하였다. pH 3~4는 소듐 아세테이트 버퍼를 이용하였으며 pH 5~8는 포스페이트 버퍼를 이용하였다. 반응온도의 변화에 따라 효소활성이 급격하게 변화하는 것과는 다르게 조사된 pH의 범위에서는 효소 활성이 약 80% 이상 유지되었다. 그 중에서도 pH 5(도 5를 통해 선택된 pH)에서 셀룰레아제 활성이 최적치를 나타났다(도 8). Optimization of pH and temperature during production of FPase, CMCase and β-glucocodidase after 1 kg of rice straw treated with T. koningii RSC1 10 ⁸ × CFU resulted in different pH (4, 5, 6, 7 and 8 ) Was used as the culture medium, and the optimal pH and temperature were determined by culturing at different temperatures (25, 30, 35 and 40 ° C), respectively, using a solid medium containing casein as a nitrogen source . At this time, the optimum temperature for the reaction was high in the range of 25 to 30 ° C. For the effect of pH, enzyme activity was measured by varying the pH from 4 to 8 using various buffer solutions. Sodium acetate buffer was used for pH 3 ~ 4 and phosphate buffer was used for pH 5 ~ 8. Unlike the rapid change of enzyme activity according to the change of reaction temperature, enzyme activity was maintained over 80% in the range of irradiated pH. Among them, the cellulase activity was optimal at pH 5 (pH selected in FIG. 5) (FIG. 8).

또한 T. koningii RSC1 균주의 각종 FPase, CMCase 및 β-글루코시다아제 효소 활성을 촉매하기 위하여, 볏짚과 함께 각종 질소원인 펩톤, 요소, 카제인 가수분해물, 옥수수 침지물, 콩 또는 질산나트륨 1 Kg을 10⁸ x CFU 농도의 균주 배양액에 첨가하여 각각의 효소 활성도를 측정하였고, 신규한 배지를 고안하는 데 활용하였다. 아래 표 4에 나타난 것과 같이, 상기 질소원을 첨가하면 효소 활성이 무처리구보다 증가하였다. 특히 카제인과 균주를 함께 처리한 후 생산되는 효소의 활성이 배양 6일째에 무처리구에 비해 약 2.5배 이상 증가하는 것을 확인하였다.In order to catalyze various FPase, CMCase and β-glucosidase enzyme activities of T. koningii RSC1 strain, 1 Kg of various nitrogen-causing peptone, urea, casein hydrolyzate, corn steep liquor, soybean or sodium nitrate together with 10 ⁸ x CFU, and the enzyme activity was measured and used to design a new medium. As shown in Table 4 below, when the nitrogen source was added, the enzyme activity was increased compared to the control. In particular, it was confirmed that the activity of the enzyme produced after treatment with casein and the strain was increased about 2.5 times as compared with that of untreated on the 6th day of culture.

볏짚을 탄소원으로 이용하여 생산한 자일라나아제의 최적 활성에 가장 적합한 촉매제를 선별하기 위해 배양액에 각종 당화 촉매원(질소원)을 첨가하여 활성을 분석하였다. 그 결과, 도 9에 나타난 것과 같이, 펩톤, 요소, 카제인 무수물 등이 배양 9일째, 무처리구에 비해 30~44배 높은 활성을 보였다.
In order to select the most suitable catalyst for the optimum activity of xylanase produced by using rice straw as a carbon source, various saccharification catalyst sources (nitrogen source) were added to the culture solution to analyze the activity. As a result, as shown in Fig. 9, peptone, urea, casein anhydride and the like showed 30- to 44-fold higher activity than the untreated group on the 9th day of culture.

실시예 5: 조사료 개선 효과Example 5: Improvement of roughage rate

본 실시예에서 사용된 배지의 종류 및 사용량, 균주의 처리량, 볏짚의 사용량, 각종 효소 촉매제의 사용량, 발효 조건 및 방법은 실시예 3과 동일하게 수행하였다.The type and amount of the medium used, the throughput of the strain, the amount of rice straw used, the amount of the enzyme catalyst used, the fermentation conditions and the method used in this example were performed in the same manner as in Example 3.

글루코오스 및 셀룰로오스에 대한 최적 활성은 실시예 3에 기재된 방법을 통해 측정하였으며, 이를 통해 조사료(볏짚)의 사료화 개선 효과를 확인하였다. T. koningii RSC1 균주를 볏짚에 처리한 후(처리량은 실시예 3과 같음), 글루코오스 및 셀룰라아제 생산 효율을 36~136 시간 동안 측정한 결과, 도 10과 같이, 생산 효율이 증대되는 것을 확인하였다. The optimum activity for glucose and cellulose was measured by the method described in Example 3, and the effect of improving the feed conversion of the forage (rice straw) was confirmed. T. koningii RSC1 strain was treated with rice straw (the throughput was the same as in Example 3), and the production efficiency of glucose and cellulase production was measured for 36 to 136 hours. As a result, it was confirmed that the production efficiency was increased as shown in FIG.

볏짚을 탄소원으로 이용하여 생산한 글루코오스 및 셀룰라아제의 최적 활성을 상기 실시예 3과 동일한 방법을 사용하여 측정하였다. 그 결과, 도 11에 나탄 것과 같이, 생산 효율을 6 ~ 34시간 동안 측정한 결과, 생산효율이 증대되는 것을 확인하였다. The optimum activity of glucose and cellulase produced using rice straw as a carbon source was measured using the same method as in Example 3 above. As a result, as shown in Fig. 11, the production efficiency was measured for 6 to 34 hours, and it was confirmed that the production efficiency was increased.

각종 효소 활성(FPase, CMCase, B-glucosidase) 측정을 통한 본 발명 균주의 활성을 타 그룹에서 분리한 균주와 비교 분석하여 하기 [표 5]에 나타내었다.The activity of the strain of the present invention through various enzyme activities (FPase, CMCase, B-glucosidase) was compared with strains isolated from other groups, and the results are shown in Table 5 below.

따라서 본 발명의 균주를 이용하면 조사료 개선 효과가 탁월함을 알 수 있다.Therefore, it can be seen that the use of the strain of the present invention excellently improves the forage quality.

실시예 6: 조사료의 물성 변화 분석Example 6: Analysis of physical properties of forage

볏짚 기질 표면에 강산(1% H₂SO₄), 알카리(2.5% NaOH) 및 T. koningii RSC1 균주를 10⁸ x CFU 농도로 처리한 후 볏짚 표면의 효소 당화성의 당화율을 평가하였다. Strong acid (1% H ₂ SO ₄ ), alkali (2.5% NaOH) and T. koningii After the RSC1 strain was treated with 10 ⁸ x CFU, the glycation of the enzyme saccharide on the rice straw surface was evaluated.

난소화성 탄수화물인 셀룰로오스의 미세 표면구조가 당화성에 미치는 영향을 구명하기 위하여 주사형전자현미경(SEM)으로 관찰하는 방법은 다음과 같다. 시료를 이온 증착기(Cressington, Sputter Coater 108)를 이용하여 100 Å의 두께로 Au 증착 후 주사전자현미경(SEM, JEOL, JSM-5510)으로 20 kV 가속 전압 하에서 관찰하였다. 도 12에 나타난 것과 같이, 본 발명의 균주을 처리하면 기존의 산성 또는 알카리성 처리법에 비해 보다 효율적으로 셀룰로오스가 분해됨을 알 수 있다.In order to investigate the effect of the fine surface structure of the cellulosic substance, which is an indigestible carbohydrate, on the glycation property, a method of observation with a scanning electron microscope (SEM) is as follows. The samples were deposited by Au deposition with a thickness of 100 Å using Cressington (Sputter Coater 108) and observed with a scanning electron microscope (SEM, JEOL, JSM-5510) under an accelerating voltage of 20 kV. As shown in FIG. 12, when the strain of the present invention is treated, cellulose is decomposed more efficiently than conventional acidic or alkaline treatment methods.

난소화성 탄수화물의 종류에 따라 다른 당화에 대한 셀룰로오스 결정성의 영향을 알아 보기 위하여 볏짚을 대상으로 상대 결정화도를 Segal법(Segal et al., 1959)에 의해 측정하였다. 시료는 두께 약 1 mm, 폭10 mm의 시편을 제작하여 Power X-ray Diffractometry (XRD, RIGAKU, DMAX 2100V)를 이용하여 측정하였고 40 kV, 40 mA 조건하에서 Ni filter로 단색화한 Cu Kα선을 사용하여 실시하여 그 결과를 도 13에 나타내었다. 본 발명 균주 처리 후 볏짚의 셀룰로오스 분해 정도를 보다 정밀하게 관찰하기 위해 FTIR분석을 통해 대조구와 처리구 각각의 셀룰로오스에 생기게 한 관능 변화를 정량적으로 측정하였다. 그 결과 X선 회절 정도는 T. koningii T.C.2를 처리한 볏짚의 결정도가 대조구에 비해 상당히 축소되는 것을 확인하였다(도 14).
Relative crystallinity was measured by Segal method (Segal et al., 1959) in rice straw to investigate the effect of cellulose crystallinity on other saccharides depending on the type of indigestible carbohydrate. Specimens with thickness of about 1 mm and width of 10 mm were measured using Power X-ray diffractometry (XRD, RIGAKU, DMAX 2100V) and Cu Kα line monochromated with Ni filter under 40 kV, 40 mA The results are shown in Fig. In order to more precisely observe the degradation degree of cellulose in the rice straw after the treatment of the strain of the present invention, the sensory change caused by the cellulose in the control and the treatment was quantitatively measured by FTIR analysis. As a result, it was confirmed that the crystallinity of the rice straw treated with T. koningii TC2 was significantly reduced as compared with that of the control (Fig. 14).

실시예 7: 볏짚에 Example 7: T. koningii T. koningii RSC1 균주 처리 후 생산물 세포독성 시험 Product cytotoxicity test after RSC1 strain treatment

최종적으로 T. koningii RSC1 균주의 동물 사료 첨가제로서의 적합성을 판독하기 위해, 경기바이오센터 천연물신약연구소에 독성 평가를 의뢰하여 독성 유무 평가하였다. 스프래그 다우리 흰쥐(Sprague-Dawley Rat)를 온도 23ㅁ 3℃, 상대습도 55ㅁ 15%, 조명 12시간 및 조도 150-300 Lux로 유지되는 환경에서 1주일간 순화시킨 후 500, 1000, 2000 mg/kg의 용량으로 T. koningii RSC1 균주 배양액을 각 군당 5마리씩 1회 경구투여 한 후 세포독성을 확인하였다. 사료와 물은 자율급이 하였으며 투여 후 3일 동안 동물의 일반 행동과 체중을 관찰 한 후 동물을 희생하였다. 혈액을 채취하여 혈구와 생화학 검사를 실시하여 몸무게, 치사율, 혈구분석 및 혈액 생화학 분석 등을 통해 독성 관련 변화를 측정하였다. T. koningii RSC1 균주와 볏짚을 발효하여 얻어진 생성물이 동물 사료 첨가제로서의 적합성을 판독하기 위해, 세포독성을 평가를 수행하였다. 그 결과를 표 6, 7 및 8에 나타내었다.Finally, to evaluate the suitability of T. koningii strain RSC1 as an animal feed additive, toxicity evaluation was carried out to evaluate the toxicity of the strain. The Sprague-Dawley rats were maintained for 1 week at a temperature of 23 ° C and 3 ° C, 55 ° C and 15% relative humidity, 12 hours of illumination and 150-300 Lux of illumination. / kg of T. koningii RSC1 culture medium was orally administered once per 5 mice per group and cytotoxicity was confirmed. The animals were sacrificed after observing general behavior and body weight of animals for 3 days after administration. Blood samples were taken and blood cell and biochemical tests were carried out, and the toxicity related changes were measured by body weight, mortality, hematology analysis, and blood biochemical analysis. To evaluate the suitability of the product obtained by fermentation of T. koningii strain RSC1 and rice straw as an animal feed additive, cytotoxicity was evaluated. The results are shown in Tables 6, 7 and 8.

몸무게 및 치사율Weight and mortality rate 투여량Dose 체중(g)
(1일째)Weight (g)
(Day 1) 체중(g)
(3일째)Weight (g)
(Third day) 체중 변화 (g)Weight change (g) 치사율(%)Lethality (%) 담체(Vehicle)Vehicle 188.48±5.10188.48 ± 5.10 214.80±8.00214.80 + - 8.00 + 26.32+ 26.32 00 500 mg/kg500 mg / kg 190.00±2.66190.00 ± 2.66 211.65±3.15211.65 + - 3.15 + 21.65+ 21.65 00 1000 mg/kg1000 mg / kg 190.28±4.59190.28 ± 4.59 210.48±10.29210.48 ± 10.29 + 20.20+20.20 00 2000 mg/kg2000 mg / kg 190.18±3.25190.18 ± 3.25 210.02±6.94210.02 + - 6.94 + 19.84+ 19.84 00

혈구 분석 결과Blood cell analysis result 투여량Dose WBC
(10³/ul)WBC
(10 ³ / ul) RBC
(10⁶/ul)RBC
(10 ⁶ / ul) 헤모글로빈
(g/dl)hemoglobin
(g / dl) 적혈구 용적율
(%)Hematocrit
(%) 담체carrier 8.7±1.58.7 ± 1.5 6.1±0.36.1 ± 0.3 13.8±0.413.8 ± 0.4 40.1±0.740.1 ± 0.7 500 mg/kg500 mg / kg 7.7±1.57.7 ± 1.5 6.2±0.36.2 ± 0.3 13.6±0.413.6 ± 0.4 39.5±1.539.5 ± 1.5 1000 mg/kg1000 mg / kg 7.1±1.17.1 ± 1.1 6.3±0.36.3 ± 0.3 13.8±0.813.8 ± 0.8 40.2±2.240.2 ± 2.2 2000 mg/kg2000 mg / kg 7.5±1.47.5 ± 1.4 6.2±0.36.2 ± 0.3 13.7±0.713.7 ± 0.7 39.2±3.239.2 ± 3.2 투여량Dose MCH
(pg)MCH
(pg) 혈소판
(10³/ul)Platelet
(10 ³ / ul) 림프구
(%)Lymphocyte
(%) 림프구
(10³/ul)Lymphocyte
(10 ³ / ul) 담체carrier 22.8±0.822.8 ± 0.8 953.4±66.0953.4 + - 66.0 93.2±1.193.2 ± 1.1 8.1±1.48.1 ± 1.4 500 mg/kg500 mg / kg 22.0±0.722.0 ± 0.7 1020.3±128.11020.3 + - 128.1 93.8±0.893.8 ± 0.8 7.2±1.47.2 ± 1.4 1000 mg/kg1000 mg / kg 21.9±0.521.9 ± 0.5 989.8±56.1989.8 ± 56.1 90.4±6.790.4 ± 6.7 6.4±1.26.4 ± 1.2 2000 mg/kg2000 mg / kg 22.1±0.422.1 ± 0.4 999.3±46.6999.3 + - 46.6 92.4±1.392.4 ± 1.3 6.7±2.36.7 ± 2.3 투여량Dose 단핵구
(%)Monocyte
(%) 단핵구
(10³/ul)Monocyte
(10 ³ / ul) 과립구
(%)Granulocyte
(%) 과립구
(10³/ul)Granulocyte
(10 ³ / ul) 담체carrier 4.0±0.74.0 ± 0.7 0.4±0.10.4 ± 0.1 2.8±0.62.8 ± 0.6 0.2±0.00.2 ± 0.0 500 mg/kg500 mg / kg 4.9±0.54.9 ± 0.5 0.3±0.10.3 ± 0.1 2.3±0.72.3 ± 0.7 0.2±0.00.2 ± 0.0 1000 mg/kg1000 mg / kg 4.8±2.14.8 ± 2.1 0.3±0.20.3 ± 0.2 2.7±0.12.7 ± 0.1 0.2±0.00.2 ± 0.0 2000 mg/kg2000 mg / kg 4.9±0.14.9 ± 0.1 0.3±0.10.3 ± 0.1 2.5±0.12.5 ± 0.1 0.2±0.00.2 ± 0.0

혈액 생화학 분석 결과Blood biochemical analysis results 투여량Dose 총 단백질
(g/dl)Total protein
(g / dl) 알부민
(g/dl)albumin
(g / dl) GOT
(U/L)GOT
(U / L) GTP
(U/L)GTP
(U / L) 담체carrier 5.47±0.205.47 ± 0.20 2.34±0.062.34 ± 0.06 70.95±2.4670.95 + - 2.46 48.28±4.2748.28 + - 4.27 500 mg/kg500 mg / kg 5.32±0.055.32 ± 0.05 2.25±0.032.25 + 0.03 80.35±12.0180.35 + 12.01 47.36±10.8347.36 ± 10.83 1000 mg/kg1000 mg / kg 5.59±0.315.59 ± 0.31 2.29±0.082.29 ± 0.08 65.59±3.4765.59 + - 3.47 46.34±6.1746.34 ± 6.17 2000 mg/kg2000 mg / kg 5.49±0.225.49 ± 0.22 2.33±0.052.33 ± 0.05 62.51±4.4862.51 + - 4.48 43.33±5.1443.33 + - 5.14 투여량Dose BUN
(mg/dl)BUN
(mg / dl) 크레아티닌
(mg/dl)Creatinine
(mg / dl) LDH
(U/L)LDH
(U / L) 콜레스테롤
(mg/dl)cholesterol
(mg / dl) 담체carrier 16.34±2.1216.34 ± 2.12 0.44±0.050.44 ± 0.05 180.70±17.27180.70 ± 17.27 100.32±6.37100.32 + - 6.37 500 mg/kg500 mg / kg 14.68±2.3914.68 ± 2.39 0.48±0.050.48 ± 0.05 321.73±115.60321.73 + - 115.60 95.40±8.0995.40 + - 8.09 1000 mg/kg1000 mg / kg 13.26±1.6613.26 ± 1.66 0.46±0.050.46 ± 0.05 170.17±14.42170.17 + - 14.42 95.14±10.4995.14 + - 10.49 2000 mg/kg2000 mg / kg 13.11±1.2313.11 + - 1.23 0.47±0.050.47 ± 0.05 165.73±14.24165.73 + - 14.24 92.43±9.4992.43 + - 9.49 투여량Dose 글루코오스
(mg/dl)Glucose
(mg / dl) 트리글리세라이드
(mg/dl)Triglyceride
(mg / dl) HDL
(mg/dl)HDL
(mg / dl) LDL
(mg/dl) LDL
(mg / dl) 담체carrier 202.27±18.41202.27 ± 18.41 153.13±57.82153.13 + - 57.82 38.03±1.6438.03 + - 1.64 16.94±2.3116.94 + - 2.31 500 mg/kg500 mg / kg 210.95±23.16210.95 ± 23.16 122.47±61.88122.47 + - 61.88 35.48±1.8935.48 ± 1.89 15.99±2.4615.99 ± 2.46 1000 mg/kg1000 mg / kg 179.67±20.09179.67 ± 20.09 108.30±50.48108.30 ± 50.48 36.34±3.7936.34 ± 3.79 17.41±6.0017.41 + - 6.00 2000 mg/kg2000 mg / kg 169.26±10.33169.26 + - 10.33 101.11±20.84101.11 ± 20.84 35.34±6.7935.34 ± 6.79 17.77±8.0917.77 8.09

세포독성 임상 시험 종합결과, 임상 증상으로는 500mg/kg, 1000mg/kg 군 모두 생존율에 영향을 미치지 않았으며, 몸무게는 정상군에 비해 500mg/kg, 1000mg/kg 및 2000mg/kg에서 체중증가 억제 현상이 경미하게 관찰되었다(표 6). Cytotoxicity The overall result of the clinical study showed that the survival rate did not affect the survival rate in both 500 mg / kg and 1000 mg / kg groups, and the body weight gain was inhibited at 500 mg / kg, 1000 mg / kg and 2000 mg / (Table 6).

또한, 부검 시 모든 군에서 특이증상은 발견되지 않았으며, 빈혈, 염증과 관련된 혈액학적 검사(표 7)에서도 세 군 모두에서 유의성 있는 변화는 관찰되지 않았고, 혈액생화학 분석결과 500mg/kg군에서 LDH의 값이 증가하는 것으로 나타났으나 이는 정상 임상 범위 안에 포함이 되는 값으로 독성은 아니라고 판단되었다. 이외에 간독성을 나타내는 GOT, GPT 및 신장 염증 관련 지표인 BUN, creatinine 역시 독성관련 변화는 보이지 않았다(표 8).In addition, no specific symptoms were found in all groups at the time of autopsy, and no significant change was observed in all the hematological tests (Table 7) related to anemia and inflammation. As a result of blood biochemical analysis, LDH , But it was considered to be toxic because it was included in the normal clinical range. In addition, toxicity-related changes were not observed for GOT, GPT, and BN, creatinine, which are hepatotoxicity-related indicators (Table 8).

세포독성 임상시험 종합결과, 임상 증상으로는 500 mg/kg 및 1000 mg/kg 및 2000mg/kg 투여군 모두 생존율에 영향을 미치지 않았으며, 몸무게는 정상군에 비해 500 mg/kg, 1000 mg/kg 및 2000mg/kg 투여군에서 체중 증가 억제 현상이 경미하게 나타났다(표 6).Cytotoxicology The results of the cytotoxicity study did not affect the survival rate in all of the 500 mg / kg and 1000 mg / kg and 2000 mg / kg groups as clinical symptoms. The body weights were 500 mg / kg, 1000 mg / kg, The inhibition of weight gain was slightly observed in the 2000 mg / kg group (Table 6).

또한, 부검 시 모든 군에서 특이 증상은 발견되지 않았으며, 빈혈, 염증과 관련된 혈액학적 검사에서도 세 군 모두에서 유의성 있는 변화는 관찰되지 않았다(표 7). In addition, no specific symptoms were found in all groups at the time of autopsy, and there was no significant change in the hematological test for anemia and inflammation in all three groups (Table 7).

아울러, 혈액 생화학 분석 결과, 500 mg/kg 투여군에서 LDH의 값이 증가하는 것으로 나타났으나 이는 정상 임상 범위 안에 포함이 되는 값으로 독성은 아니라고 판단되었으며, 이외에 간독성을 나타내는 GOT, GPT 및 신장 염증 관련 지표인 BUN, 크레아티닌(creatinine) 역시 독성 관련 변화는 나타나지 않았다(표 8).In addition, the blood biochemical analysis showed that the LDH value increased in the 500 mg / kg group, but it was considered to be within the normal clinical range and was not considered to be toxic. In addition, GOT, GPT and kidney inflammation BUN and creatinine, the indicators, also did not show any toxic-related changes (Table 8).

농업생명공학연구원Agricultural Biotechnology Research Institute KACC93150PKACC93150P 2012031520120315

<110> MYONGJI UNIVERSITY INDUSTRY AND ACADEMIA COOPERATION <120> TRICHODERM KONINGII RSC1 PRODUCING CELLULASE AND USE THEREOF <130> P12-0025 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 540 <212> DNA <213> Trichoderma koningii <400> 1 ttccgtaygg gtaacctgcg gagggatcat taccgagttt acaactccca aaccccaatg 60 tgaacgttac caatctgttg cctcggcggg attctcttgc cccgggcgcg tcgcagcccc 120 ggatcccatg gcgcccgccg gaggaccaac tccaaactct tttttctctc cgtcgcggct 180 cccgtcgcgg ctctgtttta tttttgctct gagcctttct cggcgaccct agcgggcgtc 240 tcgaaaatga atcaaaactt tcaacaacgg atctcttggt tctggcatcg atgaagaacg 300 cagcgaaatg cgataagtaa tgtgaattgc agaattcagt gaatcatcga atctttgaac 360 gcacattgcg cccgccagta ttctggcggg catgcctgtc cgagcgtcat ttcaaccctc 420 gaacccctcc ggggggtcgg cgttggggat cggcccctca ccgggccgcc cccgaaatac 480 agtggcggtc tcgccgcagc ctctcctgcg cagtagtttg cacactcgca ccgggagcgc 540 540 <110> MYONGJI UNIVERSITY INDUSTRY AND ACADEMIA COOPERATION <120> TRICHODERM KONINGII RSC1 PRODUCING CELLULASE AND USE THEREOF <130> P12-0025 <160> 1 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 540 <212> DNA <213> Trichoderma koningii <400> 1 ttccgtaygg gtaacctgcg gagggatcat taccgagttt acaactccca aaccccaatg 60 tgaacgttac caatctgttg cctcggcggg attctcttgc cccgggcgcg tcgcagcccc 120 ggatcccatg gcgcccgccg gaggaccaac tccaaactct tttttctctc cgtcgcggct 180 cccgtcgcgg ctctgtttta tttttgctct gagcctttct cggcgaccct agcgggcgtc 240 tcgaaaatga atcaaaactt tcaacaacgg atctcttggt tctggcatcg atgaagaacg 300 cagcgaaatg cgataagtaa tgtgaattgc agaattcagt gaatcatcga atctttgaac 360 gcacattgcg cccgccagta ttctggcggg catgcctgtc cgagcgtcat ttcaaccctc 420 gaacccctcc ggggggtcgg cgttggggat cggcccctca ccgggccgcc cccgaaatac 480 agtggcggtc tcgccgcagc ctctcctgcg cagtagtttg cacactcgca ccgggagcgc 540                                                                          540

Claims (10)

수탁번호 KACC93150P로 기탁된, 셀룰라아제(cellulase)와 자일라나아제(xylanase) 생산능이 있는 트리코데르마 코닌지(Trichoderm koningii) RSC1 균주.
A cellulase and xylanase-producing trichoderma ( Trichoderma ) complex deposited with accession number KACC93150P koningii ) RSC1 strain.
제 1항의 균주를 배양하고; 그리고
상기 균주를 배양한 배양액으로부터 셀룰라아제를 회수하는;
단계를 포함하는 셀룰라아제의 생산 방법.
Culturing the strain of claim 1; And
Recovering the cellulase from the culture medium in which the strain has been cultured;
RTI ID = 0.0 &gt; 1, &lt; / RTI &gt;
제 2항에 있어서, 상기 배양은 35-45℃ 및 pH 6-8에서 수행되는 것을 특징으로 하는 셀룰라아제의 생산 방법.
3. The method according to claim 2, wherein said culturing is performed at 35-45 DEG C and pH 6-8.
제 2항에 있어서, 상기 균주를 배양하는 단계에서 펩톤(peptone), 요소(urea), 카제인 가수분해물(casein hydrolysate), 콩(soybean meal), 질산나트륨(sodium nitrate) 또는 옥수수 침지물(corn steep solid)을 첨가하는 것을 특징으로 하는 셀룰라아제의 생산 방법.
3. The method according to claim 2, wherein in the step of culturing the strain, the peptone, the urea, the casein hydrolyzate, the soybean meal, the sodium nitrate or the corn steep solid. &lt; / RTI &gt;
난소화성 탄수화물을 분해하는 미생물을 이용한 사료 첨가제로서,
제 1항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 사료 첨가제.
As a feed additive using a microorganism that degrades indigestible carbohydrates,
A feed additive comprising the strain of claim 1 or a culture thereof as an active ingredient.
난소화성 탄수화물을 함유하는 조사료(roughage)에 제 1항의 균주 또는 이의 배양액을 처리하고; 그리고
상기 균주 또는 이의 배양액이 처리된 조사료를 발효시켜서 조사료를 개선시키는;
단계를 포함하는 사료 제조 방법.
Treating the strain of claim 1 or a culture thereof with a roughage containing an indigestible carbohydrate; And
Fermenting the strain or the culture medium treated with the strain to improve the roughage;
&Lt; / RTI &gt;
제 6항에 있어서, 상기 배양액에 펩톤(peptone), 요소(urea), 카제인 가수분해물(casein hydrolysate), 콩(soybean meal), 질산나트륨(sodium nitrate) 또는 옥수수 침지물(corn steep solid)을 첨가하여 셀룰레아제 생산능을 높이는 것을 특징으로 하는 사료 제조 방법.
7. The method according to claim 6, wherein peptone, urea, casein hydrolyzate, soybean meal, sodium nitrate or corn steep solids are added to the culture solution Thereby increasing the ability to produce cellulase.
제 6항에 있어서, 상기 발효는 25-30℃, pH 5에서 수행되는 것을 특징으로 하는 사료 제조 방법.
The method according to claim 6, wherein the fermentation is carried out at 25-30 ° C, pH 5.
제 6항에 있어서, 상기 조사료는 알파 셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로스, 볏짚, 쌀겨, 낙엽, 밀기울 및 이들의 혼합물로 구성된 난소화성 탄수화물 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 사료 제조 방법.
[7] The method according to claim 6, wherein the forage is any one selected from the group of indigestible carbohydrates consisting of alpha-cellulose, carboxymethyl cellulose, rice straw, rice bran, leaves, bran and mixtures thereof.
제 6항에 있어서, 상기 조사료를 개선시키는 단계는 상기 조사료의 셀룰로오스를 당화시키는 것을 특징으로 하는 사료 제조 방법.
[7] The method according to claim 6, wherein the step of improving the forage is to saccharify the cellulose of the forage.

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