KR101385855B1 - 카뎁신 검출용 다이아로마틱 아미노산 기질 - Google Patents

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이동익
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Abstract

본 발명은 카뎁신 검출용 다이아로마틱아미노산 기질에 관한 것으로, 다이아로마틱 아미노산에 프로테아제 선호 아미노산과 소광제를 결합시킨 고분자를 카뎁신 검출을 위한 기질로 사용할 경우 카뎁신에 의해 다이아로마틱 아미노산으로부터 프로테아제 선호 아미노산과 소광제가 분해되면서 형광이 회복되어 카뎁신을 민감하고 정확하게 형광 검출할 수 있다.

Description

카뎁신 검출용 다이아로마틱 아미노산 기질{Diaromatic amino acid-based substrate for detecting cathepsins}
본 발명은 다이아로마틱 아미노산을 기반으로 한 기질을 이용하여 민감하고 정확하게 시스테인 프로테아제인 카뎁신을 형광 검출하는 것에 관한 것이다.
프로테아제는 단백질 및 폴리펩타이드의 펩타이드 결합을 선택적으로 절단하는 효소이다. 그들의 작용 메카니즘을 기초로 하여 세린 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 아스파틱 프로테아제 및 메탈로프로테아제로 분류한다. 프로테아제는 여러 종류의 질환, 예를 들어, HIV 같은 바이러스 감염, 심혈관 질환, 암, 알츠하이머 질환 및 염증성 질환과 연관이 있다는 보고들이 증가하면서, 과거 수십 년 동안 프로테아제 활성의 빠르고, 민감하며 특이적인 평가를 할 수 있는 물질에 대한 요구가 크게 증가하였다. 예컨대, 시스테인 프로테아제는 세포외 기질 전환, 항원 제시, 및 프로세싱 이벤트에 특히 기능을 수행하고 있어, 골다공증, 관절염, 면역 반응 관련 질환, 아테로마성 동맥경화증, 암, 및 다수의 기생충 감염 등의 주요 질환에 대한 다양한 약물 타겟을 대표할 수 있다.
시스테인 프로테아제 중 카뎁신 B, L 및 S는 종양의 형성, 성장 및 침습에 관여하고, 다양한 암종, 예를 들어, 카뎁신 B는 신경교종 및 흑색종뿐만 아니라 유방암, 결장암, 식도암, 위암, 폐암, 난소암 및 갑상선암에서, 카뎁신 L은 신장 및 고환 종양, 비소세포폐암 및 유방암, 난소암, 결장암, 신장암, 방광암, 전립선암 및 갑상선암에서, 카뎁신 S는 고등급 전립샘의 상피내신생물 및 종양 관련 대식세포에서, 높은 수준으로 발견되는 것이 알려져 있어 많은 흥미를 끌고 있다. 피부의 편평세포암종의 경우, 각질세포에서 카뎁신 L의 발현은 신생물 진행으로부터 세포를 보호하는 것으로 밝혀졌다. 카뎁신 L의 이러한 보호 역할은 악성 진행에서 각각의 시스테인 카뎁신의 역할을 완전히 정의하고, 치료적 측면에서 표적화하기 전에 시스테인 카뎁신들을 구별할 수 있는 기질 또는 억제제를 개발할 필요가 있음을 시사하는 것이다. 소수의 기질 및 억제제 만이 특이 시스테인 카뎁신을 위해 개발되어 있다. 즉, 카뎁신 B의 선택적 분석을 위한 Abz-Gly-Ile-Val-Arg-Ala-Lys(Dnp)-OH, 카뎁신 S의 선택적 분석을 위한 Abz-Leu-Glu-Gln-EDDnp, 및 카뎁신 K의 선택적 억제제인 AceHis-Gly-Pro-Arg-ACC. Abz, Dnp, EDDnp, 및 ACC 각각 o-aminobenzoyl, 2,4-dinitrophenyl, ethylene diamine 2,4-dinitrophenyl, 및 7-amino-4-carbamoylmethylcourmarin를 의미한다.
그러나, 이러한 펩타이드 기반 기질은 펩타이드 합성을 위한 비용이 비싸고, 장비가 복잡하여 생산단가가 높은 단점이 있다.
1. 미국 특허 제7169574호, 2007.01.30 2. 대한민국 공개특허 제2000-0026009호, 2000.05.06
1. Anal Chim Acta, vol.723, pp.101-7, 2012.02.27
본 발명의 목적은 카뎁신을 민감하고, 선택적으로 분석할 수 있는 다이아로마틱 아미노산 기반 기질, 이의 제조방법 및 이의 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure 112012083874579-pat00001

상기 식에서,
X1은 글리신, 라이신, 아르기닌 또는 루신을 나타내고,
X2는
Figure 112012083874579-pat00002
또는
Figure 112012083874579-pat00003
를 나타내고,
R1은 아민 보호기를 나타낸다.
본 발명은 또한 하기 화학식 2로 표시되는 화합물과 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물을 반응시켜 하기 화학식 4로 표시되는 화합물을 제조하는 단계; 하기 화학식 4의 화합물에서 아민 보호기(R1)를 제거하는 단계; 및 아민 보호기(R1)가 제거된 화학식 4의 화합물과 하기 화학식 5로 표시되는 화합물을 반응시켜 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하는 단계를 포함하는 화학식 1의 화합물의 제조방법을 제공한다:
[화학식 2]
Figure 112012083874579-pat00004

[화학식 3]
Figure 112012083874579-pat00005

[화학식 4]
Figure 112012083874579-pat00006

[화학식 5]
Figure 112012083874579-pat00007

[화학식 1]
Figure 112012083874579-pat00008

상기 식에서,
X1은 글리신, 라이신, 아르기닌 또는 루신을 나타내고,
X2는
Figure 112012083874579-pat00009
또는
Figure 112012083874579-pat00010
를 나타내고,
R1은 아민 보호기를 나타낸다.
본 발명은 또한 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 카뎁신 검출용 센서를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 카뎁신 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 카뎁신 고 발현 질환 진단 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 카뎁신 억제물질의 스크리닝용 조성물을 제공한다.
본 발명은 다이아로마틱 아미노산에 카뎁신 선호 아미노산과 소광제인 이소니아지드를 연결하여 카뎁신 분석을 위한 기질로 사용함으로써 카뎁신을 선택적으로 민감하게 형광 검출할 수 있으며, 상기 기질은 구조가 간단하고 생산단가가 저렴한 효과가 있다.
또한, 상기 형광 기질은 카뎁신을 고 발현하는 각종 암종을 진단하거나, 카뎁신 억제물질을 스크리닝할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 DBDY-(아미노산-INH)2의 합성과정을 도시한 것이다.
도 2는 분리 정제된 DBDY-(Gly-INH)2의 특성 규명 결과로, (A)는 화학적 구조, (B)는 HPLC 크로마토그램, (C)는 d6-DMSO에서 1H NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 3 내지 10은 분리 정제된 DBDY-(아미노산-INH)2의 화학적 구조 및 d6-DMSO에서 1H NMR 스펙트럼을 나타낸 것으로, 도 3은 DBDY-(Lys-INH)2, 도 4는 DBDY-(Ile-INH)2, 도 5는 DBDY-(Leu-INH)2, 도 6은 DBDY-(Met-INH)2, 도 7은 DBDY-(Phe-INH)2, 도 8은 DBDY-(Val-INH)2, 도 9는 DBDY-(Trp-INH)2, 도 10은 DBDY-(Tyr-INH)2이다.
도 11 내지 19는 9종의 DBDY-(아미노산-INH)2의 프로테아제에 의해 촉매된 가수분해 결과를 나타낸 것으로, 도 11은 DBDY-(Gly-INH)2, 도 12는 DBDY-(Lys-INH)2, 도 13은 DBDY-(Ile-INH)2, 도 14는 DBDY-(Leu-INH)2, 도 15는 DBDY-(Met-INH)2, 도 16은 DBDY-(Phe-INH)2, 도 17은 DBDY-(Val-INH)2, 도 18은 DBDY-(Trp-INH)2 및 도 19는 DBDY-(Tyr-INH)2를 나타낸다.
도 20은 카뎁신 B, L 및 S를 포함한 시스테인 프로테아제에 의한 DBDY-(Gly-INH)2 (A) 및 DBDY-(Lys-INH)2 (B) 의 가수분해 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 DBDY-(Gly-INH)2 (A) 및 DBDY-(Lys-INH)2 (B)의 카뎁신 B에 의해 촉매된 가수분해 산물의 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명자들은 선행 연구에서 N, N'-diBoc-다이타이로신(DBDY)과 이소니아지드 2분자의 결합을 통해 DBDY-(INH)2를 합성하고, 이를 파페인 및 키모파페인의 선택적이고 민감한 분석에 사용할 수 있음을 밝혔다. DBDY-(이소니아지드)2에서, 형광 염료 및 형광 소거제로서 뿐만 아니라 파페인 및 키모파페인에 대한 특이성을 주는 펩타이드 성분(DBDY=P1 위치 아미노산, INH=P2 위치 아미노산)으로서 DBDY 및 이소니아지드를 사용하였다. 그러나, DBDY-(INH)2 는 카뎁신 B 및 L에 의해 가수분해 되지 않았다. 또한, 카뎁신 B 및 L을 포함하는 대부분의 파페인 유사 시스테인 프로테아제들이 P1 위치에 아르기닌, 라이신, 루신, 및 글리신을 선호함이 보고되어 있어 이를 기반으로 하여, 본 발명자들은 P1 위치에서 글리신, 라이신 등을 포함하여 프로테아제가 인식하는 아미노산이 고정된 다양한 종류의 DBDY-(아미노산-INH)2를 합성함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물에 관한 것이다:
[화학식 1]
Figure 112012083874579-pat00011

상기 식에서,
X1은 글리신, 라이신, 아르기닌 또는 루신을 나타내고,
X2는
Figure 112012083874579-pat00012
또는
Figure 112012083874579-pat00013
를 나타내고,
R1은 아민 보호기를 나타낸다.
본 발명의 화합물의 치환체 정의에 사용된 용어는 하기와 같다.
"아민 보호기"는, 통상의 유기합성 시 아민기에 결합하여 특정 기능기의 화학적 선택성을 제공할 수 있는 보호기의 일종을 의미한다. 상기 아민 보호기는 공지의 아민 보호기, 예를 들어, 카보벤질록시기, p-메톡시벤질 카보닐기, 터트-부틸록시카보닐기, 9-플루오레닐메틸록시카보닐기, 아세틸기, 벤질기, 카바메이트기 등을 가리킨다. 또한, 상기 아민 보호기는 카르복실기로 개질된 친수성 또는 소수성 화합물, 또는 아미노산이 아민기와 결합하여 보호기 역할을 수행할 수도 있다. 상기 친수성 또는 소수성 화합물로, 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 폴리스티렌, 폴리아이소피렌, 폴리메틸메타크릴레이트, 이들의 유도체, 또는 이들의 공중합체 등일 수 있다.
"아미노산 모이어티"는 아미노산의 탄소에 결합되어 있는 사이드 체인을 의미하는 것으로, 공지의 아미노산 종류, 예를 들어, 알라닌, 시스테인, 아스파르트산 등의 아미노기와 카르복실기를 제외한 사이드 체인 부분을 포함할 수 있다.
또한, 본 명세서에서 용어 "프로테아제 선호 아미노산"이란 Schechter와 Berger의 명명법에 따르면 기질의 N 말단 사이드(terminal side)인 부분을 P1, P2,...Pn으로 C 말단 사이드 부분을 P1', P2',...P'n으로 명명하는데, 대부분의 파페인 유사 시스테인 프로테아제들은 P2 위치에는 Phe, Tyr 등의 소수성(hydrophobic)의 아미노산을 P1 위치에는 Arg, Lys, Gly, Leu 등의 아미노산을 선호한다. 따라서 본 발명의 경우, P2 위치에는 소수성 성질을 유지하는 다이아로마틱 아미노산을 P1 위치에는 Gly, Lys 등의 아미노산을 위치시켜 파페인 유사 시스테인 프로테아제에 의한 선택적인 분해를 유도할 수 있다. 한편 소광제의 경우에는 P1' 위치에 결합시킬 수 있다. 따라서, 프로테아제 선호 아미노산은 상술한 바와 같이, 기질의 P1, P2 등의 위치에 존재하는 아미노산을 의미한다.
상기 화학식 1의 화합물은 구체적으로는,
X1은 글리신 또는 라이신을 나타내고,
X2는
Figure 112012083874579-pat00014
를 나타내며,
R1은 터트-부틸록시카보닐기, 9-플루오레닐메틸록시카보닐기, 벤질록시카보닐기, 폴리에틸렌글리콜, 또는 NH2CHR'n이고, 여기서, R'는 아미노산 모이어티이고, n은 1 내지 20을 나타내는 화합물일 수 있다.
본 발명의 화학식 1의 화합물은 형광성을 갖는 다이아로마틱 아미노산의 말단 작용기인 카르복실기와 직접 또는 가교성 결합을 통해 프로테아제가 선호하는 아미노산과 다이아로마틱 아미노산의 형광을 소거하는 소광제 화합물이 양 말단에 결합되어 프로테아제, 특히 카뎁신을 특이적으로 검출할 수 있는 기질로 사용할 수 있는 복합형 고분자인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 화합물에 있어서, 상기 다이아로마틱 아미노산은 말단의 카르복실기의 화학적 선택성을 위해 말단 아민기에 아민 보호기가 결합된 형태이거나, 상기 아민기와 아마이드 결합을 통해 친수성 또는 소수성 화합물, 또는 아미노산 등이 결합되어 아민기가 블라킹되어 있는 구조를 가지는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 화합물은 화학식 1의 소광제 화합물 말단의 아민기와 프로테아제 선호 아미노산의 카르복실기가 반응하여 결합하고, 상기 프로테아제 선호 아미노산의 아민기는 다이아로마틱 아미노산의 카르복실기와 반응하여 펩타이드 결합을 형성함으로써 다이아로마틱 아미노산의 양 말단에 프로테아제 선호 아미노산과 소광제 화합물이 결합되어 제조될 수 있다.
상기 다이아로마틱 아미노산과 프로테아제 선호 아미노산-소광제 화합물의 펩타이드 결합을 통해 다이아로마틱 아미노산의 형광성이 사라진다. 상기 프로테아제 선호 아미노산과 소광제 화합물의 펩타이드 결합 부위는 프로테아제, 특히 카뎁신이 분해할 수 있는 인식 부위로서, 카뎁신에 의한 분해를 통해 다이아로마틱 아미노산 기반 기질로부터 소광제 화합물이 제거되어 다이아로마틱 아미노산의 형광성이 회복된다. 따라서, 본 발명의 화합물은 카뎁신 존재 여부에 따라 분해에 의한 형광 강도의 증가를 나타내므로 카뎁신을 형광 검출할 수 있어 본 발명의 화합물은 카뎁신 검출을 위한 형광 센서로 사용할 수 있는 것이다.
본 발명은 또한 하기 화학식 2로 표시되는 화합물과 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물을 반응시켜 하기 화학식 4로 표시되는 화합물을 제조하는 단계; 하기 화학식 4의 화합물에서 아민 보호기(R1)를 제거하는 단계; 및 아민 보호기(R1)가 제거된 화학식 4의 화합물과 하기 화학식 5로 표시되는 화합물을 반응시켜 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하는 단계를 포함하는 화학식 1의 화합물의 제조방법에 관한 것이다:
[화학식 2]
Figure 112012083874579-pat00015

[화학식 3]
Figure 112012083874579-pat00016

[화학식 4]
Figure 112012083874579-pat00017

[화학식 5]
Figure 112012083874579-pat00018

[화학식 1]
Figure 112012083874579-pat00019

상기 식에서,
X1은 글리신, 라이신, 아르기닌 또는 루신을 나타내고,
X2는
Figure 112012083874579-pat00020
또는
Figure 112012083874579-pat00021
를 나타내고,
R1은 아민 보호기를 나타낸다.
본 발명의 화학식 1의 화합물의 제조방법을 도면 1을 참조하여 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
제1단계는 촉매 및 가교제 하에서 일 말단에 아민 보호기가 결합된 화학식 2의 아미노산의 카르복실기와 화학식 3의 소광제의 아민기를 반응시켜 화학식 4의 화합물을 제조하는 단계이다.
상기 아민 보호기는 공지의 아민 보호기를 사용할 수 있어 특별히 제한하지 않으며, 도입 방법 역시 공지의 방법을 수행할 수 있다. 예컨대, 터트-부틸록시카보닐기, 9-플루오레닐메틸록시카보닐기, 벤질록시카보닐기, 폴리에틸렌글리콜, 또는 NH2CHR'n-이고, 여기서, R'는 아미노산 모이어티이고, n은 1 내지 20을 나타내는 것을 사용할 수 있다.
상기 화학식 2의 아미노산은 프로테아제가 선호하는 아미노산의 종류를 사용할 수 있고, 예컨대, 글리신, 라이신, 아르기닌 또는 루신일 수 있다. 상기 라이신의 경우, 사이드 체인(-(CH2)3CH2NH2)을 가지고 있어 후술하는 다이아로마틱 아미노산과 결합 시 상기 사이드 체인이 결합하는 것을 억제하기 위해 FMOC가 추가로 결합된 형태로 사용할 수 있다. 상기 FMOC는 화학식 1의 화합물이 합성된 후 20% 피페리딘을 함유하는 DMF 용액에 용해시켜 제거할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
상기 화학식 3의 소광제 화합물은 화학식 2의 아미노산과 결합할 수 있는 작용기를 포함하거나, 상기 작용기를 포함하도록 말단이 개질 및 활성화될 수 있는 소광제 화합물이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 이소니아지드(isoniazid, INH)일 수 있다.
상기 화학식 2의 아미노산과 소광제 화합물의 결합 반응은 촉매 및 가교제 하에서 실시할 수 있다.
상기 촉매 및 가교제는 화학식 2의 아미노산 또는 화학식 3의 소광제 화합물의 말단 작용기를 아실 할라이드(Cl, F), 아실아지드, 활성화된 에스테르, 아실아이소우레아(카르보다이이미드) 언하이드라이드, 아실록시포스포리움 양이온, 아실우론니움 양이온의 형태로 활성화시키기 위해 사용할 수 있다.
상기 촉매로 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride, CMC(1-cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)carbodiimide), DCC(N,N'-dicyclohexyl carbodiimide), 또는 DIC(diisopropyl carbodiimide)) 등의 카르보다이이미드계 화합물 및 NHS 또는 sulfo-NHS, 카르보다이이미다졸(N,N'-carbonyldiimidazole), 또는 우드워드 리에이젼트 K(woodward's reagent K) 등을 사용할 수 있다.
상기 가교제로 DSP(Dithiobis(succinimidylpropionate)), DTSSP(3,3'-Dithiobis(sulfosuccinimidylpropionate)), DSS(Disuccinimidyl suberate), BS3(Bis(sulfosuccinimidyl)suberate), EGS(Ethylene glycolbis(succinimidylsuccinate)), DSC(N,N'-Disuccinimidyl carbonate) 등의 Homobifunctional 가교제, 또는, SPDP(N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate), SMPT(Succinimidyloxycarbonyl-α-(2-pyridyldithio)toluene), SMCC(Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexane-1-carboxylate) 등의 heterobifunctional 가교제를 사용할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 화학식 3의 화합물의 아민기를 카보디이미드계 화합물과 NHS를 이용하여 활성화된 에스테르 형태로 만들고 이를 화학식 2의 카르복실기와 반응시킴으로써 아마이드 결합을 형성할 수 있다.
또한, 상기 반응은 디클로로메탄(dichloromethane), 디메틸포름아마이드(dimethylformamide), 다이옥산(1,4-dioxane), 또는 메틸렌 클로라이드(methylene chloride) 등의 용매에서 상온에서 교반하면서 실시할 수 있다. 보다 구체적으로, 디메틸포름아마이드를 사용할 수 있는데, NHS로 활성화된 카르복실기는 디메틸포름아마이드에서 아민기와의 반응성이 매우 강하기 때문이다.
상기 화학식 3의 화합물은 화학식 2의 화합물 1 몰당 1 내지 3몰의 몰 비로 사용하여 프로테아제가 선호하는 아미노산과 소광제 화합물이 결합된 화학식 3의 화합물을 제조할 수 있다.
상기 화학식 4의 화합물은 예컨대, 일 말단에 보호기가 결합된, 글리신-INH, 라이신-INH, 아르기닌-INH 또는 루신-INH 일 수 있다.
본 발명의 화학식 1의 화합물의 제조방법에 있어서, 제2단계는 화학식 4의 화합물에서 아민 보호기를 제거하여 화학식 5의 다이아로마틱 아미노산과 반응할 수 있는 작용기를 확보하는 단계이다.
상기 아민 보호기는 화학식 4의 화합물을 TFA(trifluoroacetic acid) 및 CH2Cl2(methylene chloride)를 동량 혼합한 혼합 용매에 부가하여 교반을 통해 제거할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
본 발명의 화학식 1의 화합물의 제조방법에 있어서, 제3단계는 상기 단계에서 아민 보호기가 제거되어 일 말단에 작용기 특히, 아민기를 갖는 화학식 4의 화합물과 화학식 5의 다이아로마틱 아미노산의 카르복실기를 반응시켜 화학식 1의 화합물을 제조하는 단계이다.
상기 화학식 1의 화합물은 양 말단의 아민기가 블라킹되어 있는 화학식 5의 다이아로마틱 아미노산의 카르복실기와 화학식 4의 아미노산-이소니아지드의 아민기의 반응을 통해 제조할 수 있다.
상기 화학식 5의 다이아로마틱 아미노산은 다이타이로신 또는 다이트립토판일 수 있다.
상기 화학식 5의 다이아로마틱 아미노산은 말단 카르복실기의 최적 반응을 위해 양 말단의 아민기가 보호기로 보호되어 있거나, 블라킹되어 있는 다이아로마틱 아미노산을 사용하는 것이 좋다.
상기 다이아로마틱 아미노산의 블라킹은 아민 보호기를 도입하거나, 다이아로마틱 아미노산의 아민기와 아마이드 결합을 형성할 수 있는 화합물을 처리하여 수행할 수 있다.
상기 보호기의 종류는 공지의 아민 보호기를 사용할 수 있어 특별히 제한하지 않으며, 도입 방법 역시 공지의 방법을 수행할 수 있다.
상기 다이아로마틱 아미노산의 아민기와 아마이드 결합을 형성할 수 있는 화합물은 카르복실기로 개질된 친수성 또는 소수성 화합물, 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜 등을 사용하거나, 아미노산 등을 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
상기 다이아로마틱 아미노산과 프로테아제 선호 아미노산-소광제 화합물의 결합 반응은 촉매 및 가교제 하에서 실시할 수 있다.
상기 촉매 및 가교제는 다이아로마틱 아미노산 또는 화학식 4의 아미노산-소광제 화합물의 말단 작용기를 아실 할라이드(Cl, F), 아실아지드, 활성화된 에스테르, 아실아이소우레아(카르보다이이미드) 언하이드라이드, 아실록시포스포리움 양이온, 아실우론니움 양이온의 형태로 활성화시키기 위해 사용할 수 있다.
상기 촉매 및 가교제의 종류는 전술한 바와 같다.
일 구체예에 따르면, 화학식 4의 화합물의 아민기를 카보디이미드계 화합물과 NHS를 이용하여 활성화된 에스테르 형태로 만들고 이를 다이아로마틱 아미노산의 카르복실기와 반응시킴으로써 아마이드 결합을 형성할 수 있다.
다른 구체예에 따르면, homofunctional 가교제 중 하나인 DSC를 이용하여 화학식 4의 아민기를 활성화된 에스테르 형태로 만든 후 다이아로마틱 아미노산의 아민기와 반응시켜 우레아 결합을 시킬 수 있다.
또한, 상기 반응은 디클로로메탄(dichloromethane), 디메틸포름아마이드(dimethylformamide), 다이옥산(1,4-dioxane), 또는 메틸렌 클로라이드(methylene chloride) 등의 단독 또는 2종 이상의 혼합 용매에서 상온에서 교반하면서 실시할 수 있다. 보다 구체적으로, 메틸렌 클로라이드 및 디메틸포름아마이드를 8:2의 부피비로 혼합하여 사용할 수 있는데, NHS로 활성화된 카르복실기는 디메틸포름아마이드에서 아민기와의 반응성이 매우 강하기 때문이다.
상기 반응 결과, 24시간 내에 높은 수율로 다이아로마틱 아미노산의 양 말단에 프로테아제 선호 아미노산-소광제 화합물이 결합된 고분자를 얻을 수 있다.
상기 화학식 4의 화합물은 화학식 5의 다이아로마틱 아미노산의 1 몰당 2 내지 5몰의 몰 비로 사용할 수 있다. 보다 구체적으로, 약 3몰의 몰 비로 사용할 수 있다. 상기 범위 내로 사용할 경우, 다이아로마틱 아미노산의 양 말단에 프로테아제 선호 아미노산-소광제가 결합할 수 있다.
또한, 본 발명의 화합물의 제조방법은 반응 후 제조된 화합물에 대해 용매를 이용한 침전법과 투석(dialysis), 실리카 컬럼(silica column), GPC(gel permeate chromatography), GFC(gel filtration chromatography), 또는 IEC(ion exchange chromatography)를 이용한 분리정제 단계를 추가로 실시할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 카뎁신 검출용 센서에 관한 것이다.
본 발명의 화학식 1의 화합물은 카뎁신에 의해 펩타이드 결합이 분해되면서 다이아로마틱 아미노산의 형광성이 회복되어 형광 세기가 증가하므로 카뎁신을 선택적으로 검출하기 위한 형광센서로 사용할 수 있다.
도면 1에서와 같이, 형광 신호화는 다이아로마틱 아미노산 기반 기질에서 프로테아제 선호 아미노산과 소광제 화합물의 펩타이드 결합을 분해하면서 화학식 1의 화합물로부터 소광제 화합물이 분리되고 다이아로마틱 아미노산의 형광성이 회복되어 강한 형광성을 나타내는 턴-온 타입의 형광 신호화 특성을 나타낸다.
본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 수용액에서 카뎁신을 첨가함에 따라 농도의존적으로 284 nm(여기 파장) 및 410 nm(방출 파장)에서 선택적인 형광 증가를 나타내므로 상기 화학식 1의 화합물을 "턴-온(turn-on)" 타입의 형광 프로브(probe)로 사용하여 카뎁신을 검출할 수 있다.
본 발명의 카뎁신 검출용 센서는 카뎁신을 검출하고자 하는 시료용액과 혼합하여 카뎁신의 유무 및 농도를 확인할 수 있는 통상의 키트로 제공될 수 있다.
상기 카뎁신은 카뎁신 B 또는 L 일 수 있다.
본 발명은 또한 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 카뎁신 검출용 조성물에 관한 것이다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 또한 상기 화학식 1로 표시되는 화합물과 카뎁신을 검출하고자 하는 시료를 반응시키는 단계; 및 상기 시료에서 발생되는 형광 강도를 측정하는 단계를 포함하는 카뎁신의 검출방법에 관한 것이다.
본 발명의 화학식 1의 화합물은 카뎁신을 수용액 상태에서 검출할 수 있는 "턴-온(turn-on)" 타입의 센서로서 형광을 나타내지 않는 상태에서 카뎁신을 감지하면 형광의 세기가 증폭되는 사실을 센서화시킨 타입이다.
본 발명의 카뎁신 검출용 조성물은 화학식 1로 표시되는 화합물 외에 완충용액을 포함할 수 있다. 완충용액의 종류 및 농도는 특별히 제한되지 아니하나, 상기 카뎁신 검출용 조성물의 적용 용도에 따라 적절히 변경할 수 있을 것이다. 보다 구체적으로는, pH 3 내지 10의 완충용액일 수 있다. 가장 구체적으로는, NaCl 및 EDTA가 포함된 pH 3 내지 10의 인산염 완충용액을 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
또한, 상기 화학식 1의 화합물에 의한 카뎁신의 검출은 형광 강도의 변화를 측정하는 것으로, 카뎁신의 농도 의존적으로 410 nm에서 큰 폭으로 증가된 형광 강도를 나타내므로 이를 측정할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 카뎁신 고 발현 질환 진단 키트에 관한 것이다.
카뎁신의 경우, 카뎁신 B는 신경교종 및 흑색종뿐만 아니라 유방암, 결장암, 식도암, 위암, 폐암, 난소암 및 갑상선암에서, 카뎁신 L은 신장 및 고환 종양, 비소세포폐암 및 유방암, 난소암, 결장암, 신장암, 방광암, 전립선암 및 갑상선암에서 고 발현되므로 상기 화학식 1의 화합물은 카뎁신의 형광 검출을 통해 상기 효소를 고 발현하는 질환을 진단할 수 있다.
상기 카뎁신 고 발현 질환 진단은 정상세포의 카뎁신의 형광 강도 대비 질환세포의 카뎁신의 형광 강도를 비교함으로써 실시할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 카뎁신 억제물질의 스크리닝용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 스크리닝 조성물은 상기 화학식 1의 화합물을 이용하여 카뎁신 및 카뎁신 억제 후보물질이 포함된 시료와 반응시켜 카뎁신 억제물질이 상기 효소의 활성을 억제하고, 상기 화학식 1의 화합물의 펩타이드 결합의 분해가 억제되므로, 형광 강도의 감소를 측정할 수 있어 이를 통해 카뎁신 억제 후보물질을 스크리닝할 수 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 조성물은 대조군 시약(양성 및/또는 음성)과 함께 상기 화학식 1의 화합물을 투여 형태로 제형화한 것을 포함할 수 있다. 예를 들면, 필요에 따라, 당-코팅된 정제, 캡슐제, 엘릭서제 및 마이크로캡슐제로서 경구투여될 수 있으며, 또는 물 또는 다른 약학적으로 허용 가능한 액체를 가지는 멸균 용액 또는 현탁제의 주사제 형태로 비경구 투여될 수 있다.
또한, 상기 화학식 1의 화합물은 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 매질(media), 구체적으로는 멸균수, 생리 식염수, 식물성 오일, 유화제, 현탁제, 계면 활성제, 안정제, 향신제, 부형제, 비히클(vehicle), 보존제, 결합제등과 혼합될 수 있다. 상기 제제화에서 활성 성분의 양은 바람직한 범위 내에서 적절한 투여량으로 한다.
정제 및 캡슐제에 혼합될 수 있는 첨가제의 예는 젤라틴, 옥수수 녹말, 트라거캔스 고무 및 아라빅 고무와 같은 결합제; 크리스탈 셀룰로스와 같은 부형제; 옥수수 녹말, 젤라틴, 알긴산(alginic acid)과 같은 팽윤제; 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제; 설탕, 락토스 또는 사카린과 같은 감미제; 및 페퍼민트, 가울테리아 아데노쓰릭스(Gaultheria adenothrix) 오일 및 체리와 같은 향신제이다.
단위-투여 형태가 캡슐일 경우, 오일과 같은 액상 담체가 또한 추가로 상기의 성분에 포함될 수 있다. 주사제용 멸균 합성물들은 주사제에 사용된 멸균수와 같은 비히클을 사용하는 정상 약물 제조법에 따라 제형화될 수 있다. 생리 식염수, 글루코스, 및 D-솔비톨, D-만니톨, D-만노스, 및 염화 나트륨과 같은 보조제를 포함하는 다른 등장액이 주사제의 수용액으로 사용될 수 있다. 이는 알코올, 구체적으로는 에탄올, 프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리알코올, 폴리솔베이트 80(TM) 및 HCO-50과 같은 비-이온성 계면 활성제와 같은 적합한 용해제와 함께 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 키트 형태로 제조될 수 있어 분석을 수행하기 위한 사용설명서(예, 서면, 테이프, VCR, CD-ROM 등)가 포함될 수 있다. 상기 조성물의 분석 포맷은 당해 기술분야에 알려진 형광분석장치, 예를 들어, Perkin-Elmer LS55 luminescence spectrometer를 이용한 상대형광값이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예> 카뎁신 검출용 다이타이로신 기반 기질의 합성
Boc-타이로신-OH (Boc-Tyr) (98%), Boc-페닐알라닌-OH (Boc-Phe) (≥99%), Boc-트립토판-OH (Boc-Trp) (≥99%), BOC-글리신-OH (BOC-Gly) (≥99%), BOC-발린-OH (BOC-Val) (≥99%), BOC-루신-OH (BOC-Leu) (≥99%), BOC-타이로신-Osu (BOC-Tyr-Osu) (≥99%), BOC-페닐알라닌-Osu (BOC-Phe-Osu) (≥98%), BOC-트립토판-Osu (BOC-Trp-Osu), INH, N,N-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) (99%), N,N′-diisopropylcarbodiimide (DIC) (99%), N-hydroxysuccinimide (NHS), L-시스테인, 에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA), Tris-HCl, sodium phosphate monobasic, sodium phosphate dibasic, 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA) (99%), N, N' -디메틸 포름아마이드(DMF) (99.8%), deuterium oxide (D2O), 디메틸 설폭사이드-D6 ([D6]-DMSO) (99.9%), 및 디메틸 설폭사이드는 모두 Sigma-Aldrich Chemical Co. (St Louis, MO, USA)에서 구입하였다. BOC-라이신(FMOC)-OH (BOC-Lys(FMOC)) (≥98%), BOC-이소루신-OH·0.5H2O (BOC-Ile·0.5H2O) (≥98%), 및 BOC-메티오닌-OH (BOC-Met) (≥98%)는 Novabiochem (Darmstadt, Germany)에서 구입하였다. 아세토니트릴 및 물 (HPLC grade)는 Baker Chemical Co. (Phillipsburg, NJ, USA)에서 구입하였다. Silica 60 알루미늄 시트는 Merck Co. (Darmstadt, Germany)에서 구입하였다. MgSO4는 Showa Chemical Industry Co. (Meguro-ku, Tokyo, Japan)에서 구입하였다. PBS 완충용액은 Hyclone Laboratoreis, Inc. (South Logan, Utah, USA)에서 구입하였다. 소듐 클로라이드(Sodium chloride), 칼슘 클로라이드(calcium chloride), 및 메틸렌 클로라이드(methylene chloride, 99%)는 Duksan Pure Chemical Co. (Ansan, GyonggiDo, Korea)에서 구입하였다. 여과를 위해 기공 크기가 0.2 ㎛인 Advantec PTFE filter membrane (Advantec, Japan)를 사용하였다. 본 발명에 사용된 모든 프로테아제는 Sigma?ldrich에서 구입하였다: 우태아 췌장 유래의 키모트립신 및 트립신, Bacillus licheniformis 유래의 서브틸리신, Tritirachium album 유래의 프로티나아제 K, Bacillus thermoproteolyticus rokko 유래의 써모라이신, 우태아 췌장 유래의 카르복시펩티다아제 A, Bacillus polymyxa 유래의 디스파아제, Clostridium histolyticum 유래의 콜라게나아제, 돼지 위점막 유래의 펩신, Aspergillus saitoi 유래의 아스퍼질로펩신, 파파야 유액 유래의 파페인 및 키모파페인, 파인애플 줄기 유래의 브로멜라인, 사람의 간 유래의 카뎁신 B 및 L, 사람의 비장 유래의 카뎁신 S.
(DBDY-(아미노산-INH)2의 합성)
도 1은 DBDY-(아미노산-INH)2의 합성을 도식적으로 나타내는 것으로, BOC-아미노산과 INK의 결합, BOC의 제거, 및 DBDY의 결합으로 구성된다. 본 발명에서, 9종류의 DBDY-(아미노산-INH)2 를 합성하였다: DBDY-(Tyr-INH)2; DBDY-(Phe-INH)2; DBDY-(Trp-INH)2; DBDY-(Val-INH)2; DBDY-(Gly-INH)2; DBDY-(Ile-INH)2; DBDY-(Leu-INH)2; DBDY-(Met-INH)2; 및 DBDY-(Lys-INH)2.
BOC-Tyr-INH, BOC-Phe-INH, BOC-Trp-INH, 및 BOC-Val-INH는 DMF에 BOC-아미노산(즉, BOC-Tyr, BOC-Phe, BOC-Trp, 및 BOC-Val), INH, 및 DIC를 2:1:2의 몰 비로 혼합하여 합성하였다. 실온에서 오버나이트 동안 반응시킨 후, 동결 건조하여 DMF를 제거하였다. 남아있는 반응물은 메틸렌 클로라이드(CH2Cl2)로 세척하여 제거하였다. BOC-Gly-INH, BOC-Ile-INH, BOC-Leu-INH, BOC-Met-INH, 및 BOC-Lys(FMOC)-INH는 DMF에 BOC-아미노산, INH, NHS, 및 DCC를 1:2:1:1의 몰 비로 혼합하여 합성하였다. 실온에서 오버나이트 동안 반응시킨 후, 침전물인 N, N' -디클로로헥실우레아(N, N' -dicyclohexylurea)는 여과하여 제거하고, 여과물은 동결 건조하였다. 남아있는 잔여물은 CH2Cl2에 녹이고, 물로 3회 세척하고, 무수 MgSO4로 건조한 후 진공 증발시켰다. 산물은 UV 흡광 검출기(Waters 486 Tunable Absorbance Detector, Meadows Instrumentation Inc., USA)가 장착된 preparative HPLC 시스템에서 분리 정제하였다. 분리 과정은 용출액으로 0.1% TFA를 포함한 물 및 아세토니트릴 혼합물을 사용하여 C-18 컬럼(5 ㎛ 입자 크기, 250 mm×4.6 mm, 80 Å 기공 크기, Phenomenex, USA)에서 수행하였다. 용출은 30분 동안 0%에서 40%까지 아세토니트릴의 직선 구배를 증가하면서 수행하였다. 용출액의 유속 및 분리 온도는 1 mL min-1 및 35℃ 로 유지하였다. 합성된 BOC-아미노산-INH는 TFA/CH2Cl2 (1:1)에 녹이고, 실온에서 30분 동안 교반하여 BOC 기를 제거하였다. 용매 증발 후, 산물은 C-18 컬럼(10 ㎛ 의 입자 크기, 100 mm×21.2 mm, 110 Å 기공 크기, Phenomenex)을 이용하여 preparative HPLC 시스템에서 0.1% TFA를 포함하는 물과 아세토니트릴 혼합물을 용출액으로 사용하여 분리정제 하였다. 용출은 15분 동안 0%에서 40%까지 아세토니트릴의 직선 구배를 증가시키면서 수행하였다. 용출액의 유속 및 분리 온도는 5 mL min-1 및 35℃ 로 유지하였다. 산물은 210nm 및 280nm의 파장에서 검출하였다. 순수 아미노산-INH를 함유하는 분획을 붓고 동결 건조하였다.
DBDY의 합성 방법은 D.I. Lee 등, "Large-scale production of N,N-diBoc-dityrosine and dityrosine by HRP-catalyzed N-Boc-L-tyrosine oxidation and one-step chromatographic purification", Process Biochem. 46 (2011) 142-147에 구체적으로 개시되어 있다.
DBDY 및 아미노산-INH의 결합을 위해, CH2Cl2/DMF(8:2)에서 DBDY, 아미노산-INH, NHS, 및 DCC를 1:3:2.1:2.1의 몰 비로 혼합하였다. TEA를 아미노산-INH과 같은 몰로 상기 용액 내에 미리 부가하여 두었다. 실온에서 오버나이트 동안 반응시킨 후, 침전물, N, N' -디클로로헥실우레아는 여과하여 제거하고, 여과물은 동결 건조하였다. 남아있는 반응물은 물로 세척하여 제거하였다. 물에 녹지 않는 침전물은 preparative HPLC 시스템을 이용하여 분리정제하였다.
사이드 체인(-(CH2)3CH2NH2)을 갖는 라이신의 경우, DBDY에 사이드 체인이 결합하는 것을 억제하기 위해 BOC-Lys(FMOC)-OH를 사용하였다. DBDY-(Lys(FMOC)-INH)2의 분리정제 후, 20% 피페리딘을 함유하는 DMF 용액에 용해시켜 FMOC를 제거하였다. 혼합물은 실온에서 30분 동안 교반하고, 동결 건조하였다. DMF-에틸 에테르에서 재결정 후, 침전물은 여과하여 회수하고, preparative HPLC 시스템을 이용하여 분리정제 하였다.
DBDY-(아미노산-INH)2 의 구조 동정은 Bruker Advance 500-MHz nuclear magnetic resonance spectrometer(Bruker BioSpin Corp., Germany)에서 기록된 1H-NMR 스펙트럼을 기반으로 하여 수행하였다.
(BOC-아로마틱 아미노산-Gly-INH 및 BOC-아로마틱 아미노산-Lys-INH의 합성)
시스테인 프로테아제의 선택적 분석을 위한 DBDY의 효과를 평가하기 위해, DBDY 없는 기질(즉, BOC-아미노산-INH) 및 P2 위치에 아로마틱 아미노산이 있는 기질(즉, BOC-아로마틱 아미노산-아미노산-INH)를 합성하고, DBDY-(아미노산-INH)2과 비교하였다.
예를 들어, BOC-아로마틱 아미노산과 Gly-INH 및 Lys(FMOC)-INH를 결합하여 BOC-아로마틱 아미노산-Gly-INH 및 BOC-아로마틱 아미노산-Lys-INH를 제조하였다. DMF에 포함된 BOC-아로마틱 아미노산-Osu 용액과 DMF에 포함된 Gly-INH 또는 Lys(FMOC)-INH 용액을 1:1의 몰비로 혼합하였다. TEA는 Gly-INH 및 Lys(FMOC)-INH 용액과 같은 몰로 미리 첨가해 두었다. 실온에서 오버나이트 동안 반응 시킨 후, 잔여물을 동결 건조하였다. 남아있는 반응물은 물과 CH2Cl2로 세척하여 제거하였다. BOC-아로마틱 아미노산-Lys(FMOC)-INH의 경우, FMOC 기를 제거하였다. 산물(즉, BOC-아로마틱 아미노산-Gly-INH 및 BOC-아로마틱 아미노산-Lys-INH)는 preparative HPLC 시스템을 이용하여 분리 정제하고, 그들의 구조는 그들의 1H-NMR 스펙트럼을 이용하여 동정하였다.
(이소니아지드 및 아미노산의 소거 효율)
DBDY-(아미노산-INH)2에서 INH 및 아미노산의 소거 효율을 비교하기 위해, INH 및 아미노산의 여부에 따라 DBDY의 형광을 측정하였다. 재흡수 및 재방출 효과를 제거하기 위해, PBS 완충용액(pH 7.4, 25℃) 에서 DBDY의 농도를 0.25 μM로 조정하는 반면, 타이로신을 제외하고, INH 및 아미노산의 농도는 10mM로 하였다. pH7.4 PBS 완충용액에서의 낮은 용해성으로 인해 타이로신은 5mM로 부가하였다. 형광 강도는 PerkinElmer LS 55 luminescence spectrometer를 이용하여 측정하였다. 여기 파장(λex) 및 방출 파장(λem)은 각각 320 nm 및 410 nm로 하였다.
(프로테아제에 의해 촉매된 가수분해)
프로테아제들의 의미 있는 비교를 위해, 다른 문헌(키모트립신, 서브틸리신, 써모라이신 및 펩신에 대해서는 R. Beynon, J.S. Bond, Proteolytic Enzymes (Second Edition), Oxford University Press, 2001, pp. 295-316를 참조; 트립신, 프로티나아제 K, 카복시펩티다아제 A, 콜라게나아제, 디스파아제, 아스퍼질로펩신, 파페인, 키모파페인, 브로메라인, 카뎁신 B, 카뎁신 L, 및 카뎁신 S에 대해서는 시그마-알드리치 사의 카달로그를 참조함)에서 보고된 최적 조건에서 가수분해 반응을 수행하였다.
표 1은 이들 16종의 프로테아제들에 대한 반응 조건을 요약한 것이다.
Figure 112012083874579-pat00022
반응 전에, 반응 완충용액과 프로테아제의 혼합물을 분석 온도로 온도를 조정한 수조에서 30분 동안 미리 인큐베이션 하였다. 가수분해 반응은 DMSO에서 녹인 기질을 부가하여 개시하였다. 부가된 기질 용액의 부피는 DMSO의 최종 농도가 1.5%(v/v) 보다 낮도록 제어하였다.
DBDY-(아미노산-INH)2의 가수분해 시, PerkinElmer LS 55 luminescence spectrometer를 사용하여 DBDY의 회복된 형광을 측정하였다. 파페인, 키모파페인, 브로멜라인, 카뎁신류, 아스퍼질로펩신 및 펩신에 대해서는 λex 및 λem는 284 nm 및 410 nm로 하는 한편, 키모트립신, 트립신, 서브틸리신, 프로티아나제 K, 써모라이신, 카복시펩티다아제 A, 콜라게나아제 및 디스파아제에 대해서는 λex=320 nm 및 λemm=410 nm로 하며, 반응은 알칼리 조건에서 수행하였다.
DBDY-(아미노산-INH)2를 부가하자 마자, 형광을 측정하고, 초기 형광으로 표시하였다. 반응 말기에 측정된 형광은 최종 형광으로 표시하였다. 증가된 형광을 그들의 차이로 정의하였고, 이는 생성된 DBDY (또는 DBDY-(아미노산)2) 및 반응된 DBDY-(아미노산-INH)2간의 형광에서의 차이와 동일하다.
가수분해 산물은 HPLC 시스템을 사용하여 분석하였다. 샘플을 제조하기 위해, 가수분해 반응은 세린, 시스테인 및 메탈로프로테아제에 대해서는 2% (v/v) 1M HCl를, 아스파틱 프로테아제에 대해서는 1M NaOH를 부가하여 종결시켰다. 분리는 용출액으로 10 mM 암모늄 바이카보네이트(ammonium bicarbonate) 및 아세토니트릴(acetonitrile)의 혼합물을 사용하여 C-18 컬럼 (5 ㎛ 입자 크기, 250 mm×4.6 mm, 80 Å 기공 크기, Phenomenex, USA)에서 수행하였다. 용출은 15분 동안 0%에서 60%까지의 아세토니트릴의 직선 구배를 높이면서 수행하였다. 용출액의 유속 및 분리 온도는 1 mL min-1 및 35℃로 유지하였다. 산물은 254nm 파장에서 검출하였다.
<실험예 1> DBDY-(아미노산-INH)2의 합성 및 특성 규명
합성된 DBDY-(아미노산-INH)2의 순도 및 화학 구조는 HPLC 크로마토그램 및 1H NMR 스펙트럼(Bruker Advance 500-MHz nuclear magnetic resonance spectrometer (Bruker BioSpin Corp., Germany))으로부터 측정하였다. 도 2는 DBDY-(Gly-INH)2에 대한 결과를 나타낸 것으로, HPLC 크로마토그램은 DBDY-(Gly-INH)2 (RT=20.1 min)의 존재를 나타내고, DBDY (RT=28.0 min) 및 Gly-INH (RT=2.9 min)를 부재를 나타내며, RT는 체류시간을 의미한다. 종류 별 DBDY-(아미노산-INH)2의 화학식 구조 및 d6-DMSO에서 1H NMR 스펙트럼 결과는 도 2 내지 10에 나타내었다.
DBDY-(아미노산-INH)2 에 있는 INH 또는 아미노산의 존재에서 DBDY의 형광 강도를 측정하였고, DBDY 자체의 형광 강도에 대한 그것의 비율을 상대 형광 양자 수득률(relative fluorescence quantum yield)로 정의하였다(표 2 참조).
Figure 112012083874579-pat00023
INH 만이 타이로신 및 트립토판의 존재 하에서(즉, φf, rel(DBDY,Tyr) 및 φf,rel(DBDY, Trp)) DBDY의 의미 있는 형광 소거, φf, rel를 나타냈고, 1.0 보다 더 높았다. 이는 5 mM 타이로신 및 10 mM 트립토판의 형광 강도가 0.25 μM DBDY의 것에 부가되었기 때문이다. 같은 농도에서 측정할 때(λex=320 nm 및 λem=410 nm), DBDY의 형광 강도는 타이로신 및 트립토판에 비해 각각 약 11,000 및 4,300배 더 높았다. 그러므로, INH는 DBDY-(아미노산-INH)2에서 형광 소거에 주도적으로 영향을 미치며, DBDY의 형광은 가수분해 산물이 DBDY-(아미노산)2일 때만 나타났다.
<실험예 2> 프로테아제 분석을 위한 DBDY-(아미노산-INH)2 의 선택성 평가
카뎁신을 제외하고 13종의 프로테아제의 선택적 분석을 위해 9종류의 DBDY-(아미노산-INH)2 를 시험하였고, 실험 결과는 도 11 내지 19에 도시하였다. 각 기질 및 프로테아제의 초기 농도는 각각 2.5 μM 및 0.1 μM로 하였다. 가수분해 반응은 2시간 수행하였다. X-축에 있는 첨자, C1=papain; C2=chymopapain; C3=bromelain; S1=chymotrypsin; S2=trypsin; S3=subtilisin; S4=proteinase K; M1=thermolysin; M2=carboxypeptidase A; M3=dispase; M4=collagenase; A1=pepsin; 및 A2=aspergillopepsin를 뜻한다. 각 실험은 최소 3회 반복하였다.
시험된 기질 중 어느 것도 아스파틱 프로테아제(즉, 펩신 및 아스퍼질로펩신) 및 카르복시펩티다아제 A에 의해 가수분해되는 것은 없었다. 도 11에 나타난 바와 같이, DBDY-(Gly-INH)2 는 시스테인 프로테아제에 대해 민감도와 선택도를 나타냈고(즉, 다른 프로테아제에 의해서는 가수분해가 일어나지 않음), 이는 DBDY(P2 위치) 및 Gly(P1 위치)의 쌍방향 효과에서 기인한 것으로 보인다.
거의 모든 파페인 유사 시스테인 프로테아제들과 트립신은 P1 위치에서 라이신을 선호한다는 보고와 일치하게도, DBDY-(Lys-INH)2 는 시스테인 프로테아제뿐만 아니라 트립신에 의해서도 가수분해 되었다(도 12 참조). 써모라이신 및 디스파아제는 P1' 위치에서 Phe, Ile, Leu, Met, 및 Val를 갖는 펩타이드를 선호한다는 보고가 있다. 이 보고와도 일치하게, DBDY-(Phe-INH)2, DBDY-(Ile-INH)2, DBDY-(Leu-INH)2, DBDY-(Met-INH)2, 및 DBDY-(Val-INH)2 는 써모라이신 및 디스파아제에 매우 민감함을 나타냈고(도 12 내지 17), 가수분해 산물은 Phe-INH, Ile-INH, Leu-INH, Met-INH, 및 Val-INH 이었다(미도시됨).
시스테인 프로테아제에 대한 선택도는 비록 후자가 트립신에 의해 약간의 가수분해를 나타내긴 하였으나, DBDY-(Gly-INH)2 및 DBDY-(Lys-INH)2에서 자명하였다.
<실험예 3> 시스테인 프로테아제에 의한 DBDY-(Gly-INH)2 및 DBDY-(Lys-INH)2 의 선택적 가수분해에 대한 다이타이로신의 효과
시스테인 프로테아제에 의한 선택적 가수분해 시 다이타이로신의 영향을 조사하기 위해, DBDY-(Gly-INH)2 및 DBDY-(Lys-INH)2에서 DBDY 대신 BOC-아미노산으로 치환하였다. 거의 모든 파페인 유사 시스테인 프로테아제는 P2 위치에 페닐알라닌 같은 소수성 아미노산을 선호한다는 보고를 기반으로, BOC-아로마틱 아미노산-Gly-INH 및 BOC-아로마틱 아미노산-Lys-INH를 특별히 제조하고 키모트립신, 트립신, 파페인, 펩신 및 써모라이신에 대한 기질로서 시험하였다. 실험 결과는 표 3에 요약하였다.
Figure 112012083874579-pat00024
P1 위치에서 아로마틱 아미노산과 같은 소수성 아미노산에 대해 특이성을 갖는 것으로 알려진 키모트립신과의 반응에서만 DY의 영향이 뚜렷했다. 시험된 BOC-아로마틱 아미노산-Gly-INH 및 BOC-아로마틱 아미노산-Lys-INH 모두 키모트립신에 의해 가수분해 되었고(표 3 참조), 반응 산물은 Gly-INH 및 Lys-INH였다(미도시됨). 그러나, DBDY-(Gly-INH)2 및 DBDY-(Lys-INH)2 는 키모트립신에 의해 거의 가수분해되지 않았다. 비록 다이타이로신이 소수성이기는 하지만, 키모트립신의 활성 부위에 꼭 맞을 만큼 벌키하지는 않는 것으로 생각된다.
<실험예 4> 카뎁신 B, L 및 S에 대한 DBDY-(Gly-INH)2 및 DBDY-(Lys-INH)2 의 선택도
카뎁신 B, L 및 S는 시스테인 프로테아제로 분류되므로, 이들 카뎁신에 의한 선택적 가수분해를 위해 DBDY-(Gly-INH)2 및 DBDY-(Lys-INH)2 를 시험하였다. 실험 결과는 도 20에 도시하였다. 카뎁신 B에 의한 가수분해는 파페인 및 키모파페인에 의한 것 보다 훨씬 빨랐기 때문에, 도 20에서 반응은 실험예 2(기질(2.5 μM) 및 프로테아제(0.1 μM)의 농도에서 2시간 동안 반응시킴)에 비해 기질(1.0 μM) 및 프로테아제(10 nM)의 농도를 더 낮게 하여 30분 동안 실시하였다. X-축에 표시된 C1, C2, CB, CL, 및 CS는 각각 파페인, 키모파페인, 카뎁신 B, 카뎁신 L, 및 카뎁신 S를 나타낸다. 각 실험은 최소 3회 반복하였다.
예상대로, DBDY-(Lys-INH)2 는 카뎁신 B 및 L에 의해 가수분해되었다. 그러나, 흥미롭게도, DBDY-(Gly-INH)2 는 카뎁신 B에 의해서만 가수분해되었다. 카뎁신 S는 P2 위치에서 아로마틱 아미노산이 아닌 지방족 아미노산을 선호하는 것으로 알려져 있다. 이러한 이유로 DBDY-(Lys-INH)2 및 DBDY-(Gly-INH)2는 카뎁신 S에 의해 가수분해되지 않았다.
가수분해 산물을 동정하기 위해 HPLC 분석을 하고, 카뎁신 B와의 반응 결과를 도 21에 도시하였다. 각 기질 및 카뎁신 B의 초기 농도는 각각 0.1 mM 및 0.1 μM이다. 반응은 5시간 수행하였다.
HPLC 크로마토그램 둘 다에서, 체류시간(retention time, RT) 8분에서 INH에 대한 피크가 발견되는 반면, Gly-INH (RT=4.9 min) 및 Lys-INH (RT=7.1 min)에 대한 피크는 나타나지 않았다. 카뎁신 B는 DBDY-(Gly-INH)2 및 DBDY-(Lys-INH)2의 가수분해 시 P1 위치 아미노산으로서 글리신과 라이신을 인식하였다. 카뎁신 L은 또한 DBDY-(Lys-INH)2의 가수분해 시 P1 위치 아미노산으로 라이신을 인식하였다(카뎁신 L에 대한 HPLC 크로마토그램은 도시되지 않음).
시스테인 프로테아제에 의한 DBDY-(Gly-INH)2 및 DBDY-(Lys-INH)2 의 가수분해는 Michaelis-Menten kinetics를 따르는 것으로 확인되었다. 표 4는 카이네틱스 파라미터를 요약한 것이다.
Figure 112012083874579-pat00025
KM 값은 1.17 μM 내지 12.9 μM의 범위를 나타냈고, 다른 프로테아제 분석 물질에 대해 보고된 것에 비해 꽤 낮았다(4.6-404 μM). 특히, DBDY-(Gly-INH)2 에 대한 카뎁신 B의 KM 값은 2.88 μM이었고, 다른 물질에 대한 카뎁신 B에 필적할만하였다. 즉, Abz-Phe-Phe-Dap(Dnp)-Trp-OH 에 대해서는 2.1 μM, Abz-Phe-Arg-Dap(Dnp)-Trp-OH 에 대해서는 3.0 μM, Abz-Gly-Ile-Val-Arg-Ala-Lys(Dnp)-OH에 대해서는 5.9 μM임. Abz 및 Dap(Dnp)는 각각 o-aminobenzoyl 및 3-(2,4-dinitrophenyl)-2,3-diaminopropionic acid를 뜻한다.
자동 펩타이드 합성을 위한 비싸고 복잡한 장비를 이용할 필요가 없다는 점에서, DBDY-(Gly-INH)2는 카뎁신 B의 선택적이고 민감한 분석에 유용하다.
결론적으로, 다이아로마틱 아미노산을 프로테아제 선호 아미노산 및 이소니아지드의 2 분자와 결합시켜 프로테아제 분석을 위한 기질로 사용가능한지 시험한 결과, DBDY-(아미노산-INH)2에서 DBDY (λex=284~320 nm; λem=400~420 nm)의 형광은 INH의 소거 효과로 인해 사라졌으나, 아미노산-INH 또는 INH의 방출을 유도하는 프로테아제에 의해 촉매된 가수분해 시 형광은 회복되었다. 특히 카뎁신 B 및 L은 DBDY-(Lys-INH)2 및 DBDY-(Gly-INH)2에 의해 민감하고 선택적으로 분석되었다.

Claims (21)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물:
    [화학식 1]
    Figure 112012083874579-pat00026


    상기 식에서,
    X1은 글리신, 라이신, 아르기닌 또는 루신을 나타내고,
    X2는
    Figure 112012083874579-pat00027
    또는
    Figure 112012083874579-pat00028
    를 나타내고,
    R1은 아민 보호기를 나타낸다.
  2. 제1항에 있어서,
    X1은 글리신 또는 라이신을 나타내고,
    X2는
    Figure 112012083874579-pat00029
    를 나타내며,
    R1은 터트-부틸록시카보닐기, 9-플루오레닐메틸록시카보닐기, 벤질록시카보닐기, 폴리에틸렌글리콜, 또는 NH2CHR'n-이고, 여기서, R'는 아미노산 모이어티이고, n은 1 내지 20을 나타내는 화합물.
  3. 하기 화학식 2로 표시되는 화합물과 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물을 반응시켜 하기 화학식 4로 표시되는 화합물을 제조하는 단계;
    하기 화학식 4의 화합물에서 아민 보호기(R1)를 제거하는 단계; 및
    아민 보호기(R1)가 제거된 화학식 4의 화합물과 하기 화학식 5로 표시되는 화합물을 반응시켜 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하는 단계를 포함하는 화학식 1의 화합물의 제조방법:
    [화학식 2]
    Figure 112012083874579-pat00030


    [화학식 3]
    Figure 112012083874579-pat00031


    [화학식 4]
    Figure 112012083874579-pat00032


    [화학식 5]
    Figure 112012083874579-pat00033


    [화학식 1]
    Figure 112012083874579-pat00034


    상기 식에서,
    X1은 글리신, 라이신, 아르기닌 또는 루신을 나타내고,
    X2는
    Figure 112012083874579-pat00035
    또는
    Figure 112012083874579-pat00036
    를 나타내고,
    R1은 아민 보호기를 나타낸다.
  4. 제3항에 있어서,
    화학식 4의 화합물 또는 화학식 1의 화합물을 제조하는 반응은 촉매 및 가교제 하에서 실시하는 화학식 1의 화합물의 제조방법.
  5. 제4항에 있어서,
    촉매는 카르보다이이미드계 화합물(carbodiimide) 및 NHS 또는 sulfo-NHS, 카르보다이이미다졸(carbodiimidazole), 또는 우드워드 리에이젼트 K(woodward's reagent K) 중 적어도 하나인 화학식 1의 화합물의 제조방법.
  6. 제4항에 있어서,
    가교제는 DSP(Dithiobis(succinimidylpropionate)), DTSSP(3,3'-Dithiobis(sulfosuccinimidylpropionate)), DSS(Disuccinimidyl suberate), BS3(Bis(sulfosuccinimidyl)suberate), EGS(Ethylene glycolbis(succinimidylsuccinate)), DSC(N,N'-Disuccinimidyl carbonate), SPDP(N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate), SMPT(Succinimidyloxycarbonyl-α-(2-pyridyldithio)toluene) 및 SMCC(Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexane-1-carboxylate)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 화학식 1의 화합물의 제조방법.
  7. 제3항에 있어서,
    화학식 3의 화합물은 화학식 2의 화합물 1 몰 당 1 내지 3 몰의 몰 비로 첨가하는 화학식 1의 화합물의 제조방법.
  8. 제3항에 있어서,
    화학식 4의 화합물 또는 화학식 1의 화합물을 제조하는 반응은 디클로로메탄(dichloromethane), 디메틸포름아마이드(dimethylformamide), 다이옥산(1,4-dioxane) 및 메틸렌 클로라이드(methylene chloride)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 유기용매 하에서 실시하는 화학식 1의 화합물의 제조방법.
  9. 제3항에 있어서,
    화학식 4의 화합물은 화학식 5의 화합물 1 몰 당 2 내지 5 몰의 몰 비로 첨가하는 화학식 1의 화합물의 제조방법.
  10. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 카뎁신 검출용 센서:
    [화학식 1]
    Figure 112012083874579-pat00037


    상기 식에서,
    X1은 글리신, 라이신, 아르기닌 또는 루신을 나타내고,
    X2는
    Figure 112012083874579-pat00038
    또는
    Figure 112012083874579-pat00039
    를 나타내고,
    R1은 아민 보호기를 나타낸다.
  11. 제10항에 있어서,
    X1은 글리신 또는 라이신을 나타내고,
    X2는
    Figure 112012083874579-pat00040
    를 나타내며,
    R1은 터트-부틸록시카보닐기, 9-플루오레닐메틸록시카보닐기, 벤질록시카보닐기, 폴리에틸렌글리콜, 또는 NH2CHR'n-이고, 여기서, R'는 아미노산 모이어티이고, n은 1 내지 20을 나타내는 카뎁신 검출용 센서.
  12. 제10항에 있어서,
    카뎁신은 카뎁신 B 또는 L인 카뎁신 검출용 센서.
  13. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 카뎁신 검출용 조성물:
    [화학식 1]
    Figure 112012083874579-pat00041


    상기 식에서,
    X1은 글리신, 라이신, 아르기닌 또는 루신을 나타내고,
    X2는
    Figure 112012083874579-pat00042
    또는
    Figure 112012083874579-pat00043
    를 나타내고,
    R1은 아민 보호기를 나타낸다.
  14. 제13항에 있어서,
    X1은 글리신 또는 라이신을 나타내고,
    X2는
    Figure 112012083874579-pat00044
    를 나타내며,
    R1은 터트-부틸록시카보닐기, 9-플루오레닐메틸록시카보닐기, 벤질록시카보닐기, 폴리에틸렌글리콜, 또는 NH2CHR'n-이고, 여기서, R'는 아미노산 모이어티이고, n은 1 내지 20을 나타내는 카뎁신 검출용 조성물.
  15. 제13항에 있어서,
    pH 3 내지 10의 수용액을 더 포함하는 카뎁신 검출용 조성물.
  16. 제15항에 있어서,
    수용액은 NaCl 및 EDTA가 포함된 인산염 완충용액인 카뎁신 검출용 조성물.
  17. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 카뎁신 고 발현 질환 진단 키트:
    [화학식 1]
    Figure 112012083874579-pat00045


    상기 식에서,
    X1은 글리신, 라이신, 아르기닌 또는 루신을 나타내고,
    X2는
    Figure 112012083874579-pat00046
    또는
    Figure 112012083874579-pat00047
    를 나타내며,
    R1은 아민 보호기를 나타낸다.
  18. 제17항에 있어서,
    X1은 글리신 또는 라이신을 나타내고,
    X2는
    Figure 112012083874579-pat00048
    를 나타내며,
    R1은 터트-부틸록시카보닐기, 9-플루오레닐메틸록시카보닐기, 벤질록시카보닐기, 폴리에틸렌글리콜, 또는 NH2CHR'n-이고, 여기서, R'는 아미노산 모이어티이고, n은 1 내지 20을 나타내는 카뎁신 고 발현 질환 진단 키트.
  19. 제17항에 있어서,
    질환은 암인 키트.
  20. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 카뎁신 억제물질의 스크리닝용 조성물:
    [화학식 1]
    Figure 112012083874579-pat00049


    상기 식에서,
    X1은 글리신, 라이신, 아르기닌 또는 루신을 나타내고,
    X2는
    Figure 112012083874579-pat00050
    또는
    Figure 112012083874579-pat00051
    를 나타내고,
    R1은 아민 보호기를 나타낸다.
  21. 제20항에 있어서,
    X1은 글리신 또는 라이신을 나타내고,
    X2는
    Figure 112012083874579-pat00052
    를 나타내며,
    R1은 터트-부틸록시카보닐기, 9-플루오레닐메틸록시카보닐기, 벤질록시카보닐기, 폴리에틸렌글리콜, 또는 NH2CHR'n-이고, 여기서, R'는 아미노산 모이어티이고, n은 1 내지 20을 나타내는 카뎁신 억제물질의 스크리닝용 조성물.

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KR19980703261A (ko) * 1995-03-24 1998-10-15 다니엘 이이치. 페트리 가역성 프로테아제 억제제
KR20020058076A (ko) * 1999-12-03 2002-07-12 개리 이. 프라이드만 피코르나바이러스 억제 화합물 및 조성물, 이들의 약학적용도, 및 이들의 합성을 위한 물질

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