KR101383527B1

KR101383527B1 - Cryogel scaffold comprising synthetic polymer, polysaccharide and protein, and tissue regeneration method using the same

Info

Publication number: KR101383527B1
Application number: KR1020120048208A
Authority: KR
Inventors: 한성수; 딥티싱
Original assignee: 영남대학교 산학협력단
Priority date: 2012-05-07
Filing date: 2012-05-07
Publication date: 2014-04-08
Also published as: KR20130124798A

Abstract

본 발명은 합성 고분자, 폴리사카라이드 및 단백질을 포함하는 크라이오젤 스캐폴드 및 상기 스캐폴드를 이용한 조직 재생방법에 관한 것으로, 특히 2-하이드록시에틸메타크릴레이트(HEMA), 알지네이트 및 젤라틴의 고분자를 혼합하여 크라이오젤법을 통해 얻어진 크라이오젤로서, 기계적 강도, 강성 및 탄성 등이 우수할 뿐 아니라, 세포 부착 및 증식과 생체적합성이 우수하여 조직 공학용 스캐폴드로서 사용할 수 있다.
또한, 상기 크라이오젤 스캐폴드를 폐세포를 이식한 폐 패치로서 이용하여 폐기종을 치료할 수 있고, 심근경색이나 퇴행성 디스크 질환의 경우에도 심장세포를 이식한 심장 패치 또는 중간엽 줄기세포를 이식한 재생 패치로서 본 발명의 크라이오젤 스캐폴드를 사용할 수 있다.The present invention relates to cryogel scaffolds comprising synthetic polymers, polysaccharides and proteins, and to tissue regeneration methods using the scaffolds, and in particular to polymers of 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA), alginate and gelatin. As a cryogel obtained by mixing the cryogel method, it is not only excellent in mechanical strength, rigidity and elasticity, but also excellent in cell adhesion, proliferation and biocompatibility, and thus can be used as a scaffold for tissue engineering.
In addition, the cryogel scaffold can be used as a pulmonary patch transplanted with lung cells to treat emphysema, and in the case of myocardial infarction or degenerative disc disease, a heart patch transplanted with a heart cell or a regenerative patch transplanted with a mesenchymal stem cell is used. As the cryogel scaffold of the present invention can be used.

Description

합성 고분자, 폴리사카라이드 및 단백질을 포함하는 크라이오젤 스캐폴드 및 상기 스캐폴드를 이용한 조직 재생방법{Cryogel scaffold comprising synthetic polymer, polysaccharide and protein, and tissue regeneration method using the same}Cryogel scaffold comprising synthetic polymer, polysaccharide and protein, and tissue regeneration method using the same}

본 발명은 합성 고분자, 폴리사카라이드 및 단백질을 포함하는 크라이오젤 스캐폴드 및 상기 스캐폴드를 이용한 조직 재생방법에 관한 것이다.The present invention relates to cryogel scaffolds comprising synthetic polymers, polysaccharides and proteins, and to tissue regeneration methods using the scaffolds.

스캐폴드(Scaffold)는 조직 세포의 체외 배양과 체내 이식이 가능하도록 만들어진 물리적 지지체 및 점착 기질을 칭하는 것으로, 이러한 스캐폴드는 인체조직 재생을 위한 세포 이식에 사용되고 있으며, 또한 세포의 대량배양 및 증식에 있어서 그 중요성은 매우 높다. 왜냐하면 세포와 기질 간의 접촉부분에서 세포의 점착 및 이에 수반되는 상피세포의 이동과 증식에 기인하기 때문이다. Scaffolds refer to physical scaffolds and adhesive substrates made for in vitro culture and transplantation of tissue cells. These scaffolds are used for cell transplantation for human tissue regeneration, and also for mass culture and proliferation of cells. The importance is very high. This is due to the adhesion of the cells at the contact area between the cells and the substrate and the subsequent migration and proliferation of epithelial cells.

즉, 생물학적으로 활성을 지니고 있는 대부분의 세포는 체내 또는 체외의 물질과 접촉 시 생존하기 위하여 반드시 거쳐야 되는 기본 단계가 있으며, 그 첫 단계는 세포의 점착이다. 특히, 섬유아세포 및 조직세포의 생존단계를 살펴보면, 세포는 우선적으로 기질에 점착을 하며 점착 후 세포질에서의 세포기관(organelle)의 대사가 활발해지고, 증식 및 양분의 공급을 원활히 하기 위하여 새로운 부위로 이동하게 된다. In other words, most biologically active cells have a basic step that must be passed in order to survive in contact with substances in or outside the body. The first step is cell adhesion. In particular, when looking at the survival stage of fibroblasts and tissue cells, the cells preferentially adhere to the substrate, and after adhesion, the metabolism of organelles in the cytoplasm becomes active, and a new site is used to facilitate the proliferation and supply of nutrients. Will move.

따라서, 세포의 증착을 활성화시키는 표면은 세포의 증식을 배가하는데 가장 기본이 되는 수단이다. 이러한 세포의 기질에 대한 점착 능은 기질의 성분에 의하여 인위적으로 조절될 수 있다. 스캐폴드는 세포의 재생과 이들이 성장할 때 지지체가 되어주는 담체, 즉 인공기질의 근간이 되는 물질로서, 최근 세포의 대량배양 및 증식용기 또는 플라스크에 코팅되어 사용된다.Thus, the surface that activates the deposition of cells is the most basic means of doubling cell proliferation. The adhesion of these cells to the substrate can be artificially controlled by the components of the substrate. Scaffolds are carriers that support scaffolds as they regenerate and grow, that is, the basis of artificial substrates. Recently, scaffolds have been used in mass culture and growth vessels or flasks of cells.

한편, 대한민국 공개특허 제2004-0016984호에는 세포 및 조직 배양용 담체 및 배양방법에 관한 것으로서, 섬유아세포의 과잉증식을 억제하면서 목적으로 하는 조직이나 장기를 효과적으로 재생할 수 있는 세포 및 조직배양용 담체, 및 세포 및 조직배양 방법을 개시한다. 그러나, 상기 특허에 공지된 스캐폴드는 세포의 대량배양에 적합할 만큼 기질에 대한 점착 능과 물리적 특성이 우수하지 않을 뿐 아니라, 제조공정 또한 간단하지 않고 바람직하지 않은 점이 많은 문제가 있다.On the other hand, Korean Patent Laid-Open No. 2004-0016984 relates to a carrier for culturing cells and tissues and a method for culturing, wherein the carrier for culturing cells and tissues that can effectively regenerate a target tissue or organ while suppressing overproliferation of fibroblasts, And cell and tissue culture methods. However, the scaffolds known in the patent are not only excellent in adhesion and physical properties to the substrate to be suitable for mass culture of the cells, but also have many problems in that the manufacturing process is not simple and undesirable.

따라서, 본 발명자들은 특정한 고분자 혼합물을 이용하여 크라이오젤법을 통해 얻어진 크라이오젤을 기계적 강도, 강성 및 탄성 등이 우수할 뿐 아니라, 세포 부착 및 증식과 생체적합성이 우수하여 조직 공학용 스캐폴드로서 사용할 수 있다는 점을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.Therefore, the present inventors can use the cryogel obtained by the cryogel method using a specific polymer mixture not only with excellent mechanical strength, rigidity and elasticity, but also with excellent cell adhesion, proliferation and biocompatibility, and thus can be used as a scaffold for tissue engineering. The present invention has been completed by confirming that there is.

이에, 본 발명의 목적은 조직 공학용 스캐폴드로서 유용하게 사용할 수 있는 새로운 고분자 혼합물 크라이오젤 및 이의 제조방법을 제공하는 데에 있다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a novel polymer mixture cryogel and its preparation method which can be usefully used as a scaffold for tissue engineering.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 크라이오젤 스캐폴드를 이용한 조직 재생방법을 제공하는 데에 있다.In addition, another object of the present invention to provide a tissue regeneration method using the cryogel scaffold.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 합성 고분자, 폴리사카라이드 및 단백질로 이루어진 고분자 혼합물을 포함하는 크라이오젤 스캐폴드를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a cryogel scaffold comprising a polymer mixture consisting of synthetic polymers, polysaccharides and proteins.

상기 합성 고분자는 2-하이드록시에틸메타크릴레이트(HEMA)일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.The synthetic polymer may be 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA), but is not limited thereto.

상기 폴리사카라이드는 알지네이트, 키토산 및 아가로오스로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.The polysaccharide may be any one selected from the group consisting of alginate, chitosan and agarose, but is not limited thereto.

상기 단백질은 젤라틴, 콜라겐, 엘라스틴, 라미닌 및 케라틴으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.The protein may be any one selected from the group consisting of gelatin, collagen, elastin, laminin, and keratin, but is not limited thereto.

보다 상세하게는, 본 발명은 2-하이드록시에틸메타크릴레이트(HEMA), 알지네이트 및 젤라틴으로 이루어진 고분자 혼합물(HAG)을 포함하는 크라이오젤 스캐폴드를 제공한다.More specifically, the present invention provides a cryogel scaffold comprising a polymer mixture (HAG) consisting of 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA), alginate and gelatin.

상기 고분자 혼합물 총 100 중량부에 대하여, 2-하이드록시에틸메타크릴레이트(HEMA) 5 내지 7 중량부, 알지네이트 1 내지 5 중량부 및 젤라틴 1 내지 5 중량부를 포함할 수 있다.Based on 100 parts by weight of the polymer mixture, 5 to 7 parts by weight of 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA), 1 to 5 parts by weight of alginate and 1 to 5 parts by weight of gelatin may be included.

또한, 본 발명은 물에 알지네이트 및 젤라틴을 첨가하여 용해시키는 단계; 상기 용해된 고분자 용액에 2-하이드록시에틸메타크릴레이트(HEMA)를 첨가하고 냉각하는 단계; 상기 냉각된 고분자 혼합물을 액체 크라이오스탯 내에서 중합시키는 단계; 및 상기 중합된 젤을 세정하여 미중합 단량체를 제거하는 단계를 포함하는 크라이오젤 스캐폴드의 제조방법을 제공한다.In addition, the present invention comprises the steps of dissolving by adding alginate and gelatin to water; Adding and cooling 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA) to the dissolved polymer solution; Polymerizing the cooled polymer mixture in a liquid cryostat; And it provides a method for producing a cryogel scaffold comprising the step of washing the polymerized gel to remove the unpolymerized monomer.

상기 물 100 중량%에 알지네이트 및 젤라틴을 각각 1 내지 5 중량%가 되도록 첨가할 수 있으며, 상기 알지네이트 및 제라틴을 포함한 고분자 용액 100 중량%에 2-하이드록시에틸메타크릴레이트(HEMA)를 5 내지 10 중량%가 되도록 첨가할 수 있다.Alginate and gelatin may be added in an amount of 1 to 5% by weight to 100% by weight of water, and 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA) may be added in 100% by weight of a polymer solution including alginate and gelatin. It may be added to 10% by weight.

또한, 본 발명은 상기 크라이오젤 스캐폴드에 세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 조직 재생방법을 제공한다.The present invention also provides a tissue regeneration method comprising culturing cells in the cryogel scaffold.

상기 세포는 폐세포, 심장세포, 신경세포, 줄기세포, 뼈세포 및 연골세포로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상일 수 있다.The cells may be any one or two or more selected from the group consisting of lung cells, heart cells, neurons, stem cells, bone cells and chondrocytes.

본 발명의 크라이오젤 스캐폴드는 2-하이드록시에틸메타크릴레이트(HEMA), 알지네이트 및 젤라틴의 고분자를 혼합하여 크라이오젤법을 통해 얻어진 크라이오젤로서, 기계적 강도, 강성 및 탄성 등이 우수할 뿐 아니라, 세포 부착 및 증식과 생체적합성이 우수하여 조직 공학용 스캐폴드로서 사용할 수 있다. 특히 폐세포를 이식한 폐 패치로서 이용하여 폐기종을 치료할 수 있고, 심근경색이나 퇴행성 디스크 질환의 경우에도 심장세포를 이식한 심장 패치 또는 중간엽 줄기세포를 이식한 재생 패치로서 본 발명의 크라이오젤 스캐폴드를 사용할 수 있다.The cryogel scaffold of the present invention is a cryogel obtained through the cryogel method by mixing a polymer of 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA), alginate and gelatin, and has excellent mechanical strength, rigidity and elasticity, It is excellent in cell adhesion, proliferation and biocompatibility, and can be used as a scaffold for tissue engineering. In particular, the emphysema can be treated by using a lung patch transplanted with lung cells, and in the case of myocardial infarction or degenerative disc disease, the heart patch transplanted with cardiac cells or a regenerative patch transplanted with mesenchymal stem cells according to the present invention is used as a cryo patch. Folds can be used.

도 1은 HAG 스캐폴드의 SEM 이미지를 나타낸 것이고,
도 2는 마이크로 CT 이미지 분석 결과를 나타낸 것이고,
도 3은 폐세포를 HAG 스캐폴드에 분주하여 배양한 SEM 이미지를 나타낸 것이고,
도 4는 HAG 스캐폴드 내로 세포 투과를 확인한 공초점 현미경 이미지를 나타낸 것이고,
도 5는 HAG 스캐폴드의 생체적합성을 확인한 면역-조직학적 이미지를 나타낸 것이다.1 shows an SEM image of a HAG scaffold,
2 shows the results of micro CT image analysis,
Figure 3 shows the SEM image of cultured by dispensing lung cells in HAG scaffold,
4 shows confocal microscopy images confirming cell penetration into the HAG scaffold,
5 shows immunohistochemical images confirming biocompatibility of HAG scaffolds.

이하, 상기 합성 고분자로 2-하이드록시에틸메타크릴레이트(HEMA)를, 상기 폴리사카라이드로 알지네이트를, 그리고 상기 단백질로 젤라틴을 사용한 크라이오젤 스캐폴드를 본 발명의 일실시예로 하여 상세하게 설명한다.Hereinafter, a cryogel scaffold using 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA) as the synthetic polymer, alginate as the polysaccharide, and gelatin as the protein will be described in detail as an embodiment of the present invention. do.

상기 고분자 혼합물 총 100 중량부에 대하여, 2-하이드록시에틸메타크릴레이트(HEMA) 5 내지 7 중량부, 알지네이트 1 내지 5 중량부 및 젤라틴 1 내지 5 중량부를 포함할 수 있다. Based on 100 parts by weight of the polymer mixture, 5 to 7 parts by weight of 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA), 1 to 5 parts by weight of alginate and 1 to 5 parts by weight of gelatin may be included.

이때, 상기 2-하이드록시에틸메타크릴레이트는 스캐폴더의 생체적합성 성질을 띄게 하고, 상기 함량 범위를 벗어나면 가교가 일어나지 않아 스캐폴더의 물성이 약해지는 문제가 야기될 수 있다. 상기 알지네이트는 음이온 고분자로서 스캐폴더를 견고하게 만드는 역할을 수행하며, 상기 함량 범위를 벗어나면 가교가 일어나지 않아 스캐폴더의 물성이 약해지는 문제가 야기될 수 있다. 그리고 상기 젤라틴은 스캐폴더에 세포가 쉽게 부착 할 수 있도록 도와주는 역할을 수행하며, 상기 함량 범위를 벗어나면 가교가 일어나지 않아 스캐폴더의 물성이 약해지는 문제가 야기될 수 있다.At this time, the 2-hydroxyethyl methacrylate makes the biocompatible properties of the scaffold, and if outside the content range does not cause crosslinking may cause a problem that the physical properties of the scaffold become weak. The alginate serves to harden the scaffold as an anionic polymer, and if the alginate is out of the content range, crosslinking does not occur, which may cause a problem that the physical properties of the scaffold become weak. In addition, the gelatin serves to help cells easily attach to the scaffold, and when the content is out of the content range, crosslinking does not occur, which may cause a problem of weakening the physical properties of the scaffold.

또한, 본 발명은 물에 알지네이트 및 젤라틴을 첨가하여 용해시키는 단계; 상기 용해된 고분자 용액에 2-하이드록시에틸메타크릴레이트(HEMA)를 첨가하고 냉각하는 단계; 상기 냉각된 고분자 혼합물을 액체 크라이오 상태 내에서 중합시키는 단계; 및 상기 중합된 젤을 세정하여 미중합 단량체를 제거하는 단계를 포함하는 크라이오젤 스캐폴드의 제조방법을 제공한다.In addition, the present invention comprises the steps of dissolving by adding alginate and gelatin to water; Adding and cooling 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA) to the dissolved polymer solution; Polymerizing the cooled polymer mixture in a liquid cryo state; And it provides a method for producing a cryogel scaffold comprising the step of washing the polymerized gel to remove the unpolymerized monomer.

본 발명에 따른 크라이오젤 스캐폴드는 도 5에 도시된 바와 같이 생체 적합성이 우수한 것으로 확인되어 이상적인 고분자 스캐폴드로서 사용이 가능하다. 예를들어, 조직 손실이 높은 치사율을 야기하는 폐기종 환자의 경우 폐세포를 이식한 본 발명의 크라이오젤 스캐폴드를 폐 패치로서 사용하여 폐기종을 치료할 수 있고, 심근경색이나 퇴행성 디스크 질환의 경우에도 심장세포를 이식한 심장 패치 또는 중간엽 줄기세포를 이식한 재생 패치로서 본 발명의 크라이오젤 스캐폴드를 사용할 수 있다.The cryogel scaffold according to the present invention has been found to have excellent biocompatibility as shown in FIG. 5 and thus can be used as an ideal polymer scaffold. For example, in patients with emphysema whose tissue loss causes high mortality, the cryogel scaffold of the present invention with transplanted lung cells can be used as a pulmonary patch to treat emphysema, and in the case of myocardial infarction or degenerative disc disease, The cryogel scaffold of the present invention can be used as a heart patch transplanted with cells or a regenerative patch transplanted with mesenchymal stem cells.

따라서, 본 발명에 따른 크라이오젤 스캐폴드는 조직공학, 의학, 약학 및 재료과학 분야에서 약물, 세포, 단백질 및 성장인자 전달용 재료 또는 인공피부 등으로 폭넓게 사용할 수 있다.
Therefore, the cryogel scaffold according to the present invention can be widely used as a material for the delivery of drugs, cells, proteins and growth factors or artificial skin in the fields of tissue engineering, medicine, pharmacy and materials science.

이하, 하기 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the present invention is not limited by these examples.

<실시예 1> 헤마-알지네이트-젤라틴(HAG) 크라이오젤 스캐폴드의 제조Example 1 Preparation of Hema-Alginate-Gelatin (HAG) Cryogel Scaffold

젤라틴과 알지네이트의 최종 농도가 각각 3 중량%가 되도록 물에 젤라틴과 알지네이트를 용해시켜 준비하였다. 상기 고분자 용액에 0.7 ml의 2-하이드록시에틸메타크릴레이트(HEMA)(최종농도: 7 중량%)를 첨가하였으며, 단시간 동안 냉각시켰다. 상기 고분자의 중합반응을 위한 개시제로서 암모늄 퍼설페이트(APS)(10 중량%) 및 TEMED(N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine)(0.01 ml)를, 가교제로서 폴리(에틸렌글리콜)디아크릴레이트(PEGDA)(1:2의 비율) 및 글루타르알데히드(25 부피%)(1:20의 비율)를 각각 사용하였다. 이러한 중합반응은 액체 크라이오스탯 내에서 -12℃에서 밤새도록 수행되었다. 이렇게 얻어진 중합된 HAG 젤을 실온에서 탈이온수로 세정하여 미중합 단량체를 제거하였으며, 완전한 해동 후 동결건조기를 이용하여 진공 건조하였다. 이렇게 진공건조된 크라이오젤은 사용 전까지 실온에서 보관하였다.It was prepared by dissolving gelatin and alginate in water so that the final concentration of gelatin and alginate was 3% by weight, respectively. 0.7 ml of 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA) (final concentration: 7 wt%) was added to the polymer solution and cooled for a short time. Ammonium persulfate (APS) (10% by weight) and TEMED ( N , N , N ' , N'- Tetramethylethylenediamine) (0.01 ml) as an initiator for the polymerization of the polymer, poly (ethylene glycol) diacryl as a crosslinking agent The rate (PEGDA) (ratio of 1: 2) and glutaraldehyde (25 vol%) (ratio of 1:20) were used, respectively. This polymerization was carried out overnight at −12 ° C. in a liquid cryostat. The polymerized HAG gel thus obtained was washed with deionized water at room temperature to remove unpolymerized monomer, and after complete thawing, vacuum drying was performed using a lyophilizer. This vacuum dried cryogel was stored at room temperature until use.

<실시예 2> HAG 크라이오젤 스캐폴드의 특성 분석Example 2 Characterization of HAG Cryogel Scaffolds

1. SEM을 이용한 미세구조 분석1. Microstructure Analysis Using SEM

SEM(FET Quanta 200)을 사용하여 HAG 크라이오젤의 형상을 분석하였다. 스캐폴드를 밤새 건조시켜 습기를 제거한 후 SEM 분석을 수행하였다. SEM은 4.5 mm의 시료 크기를 이용하여 15 kV에서 높은 진공 하에서 조작하여 시료를 촬영하였다. 기공 범위, 분포, 기공 직경 및 크라이오젤의 상호연결관계를 SEM 관련 이미지 분석 소프트웨어를 이용하여 결정하였다.The shape of the HAG cryogel was analyzed using SEM (FET Quanta 200). The scaffolds were dried overnight to remove moisture and then subjected to SEM analysis. The SEM was photographed by operating under high vacuum at 15 kV using a sample size of 4.5 mm. Pore range, distribution, pore diameter, and cryogel interconnections were determined using SEM-related image analysis software.

그 결과, 도 1과 같이 HAG 크라이오젤의 평균 기공 크기는 약 66 ㎛인 것으로 확인되었다.
As a result, as shown in FIG. 1, the average pore size of the HAG cryogel was found to be about 66 μm.

2. 마이크로컴퓨터 단층촬영을 이용한 3차원 평가2. Three-Dimensional Evaluation Using Microcomputer Tomography

앞서 제조된 HAG 크라이오젤을 절단하여 약 2 mm 크기의 단편을 얻고, X-선관 전류 173 mA로 30kV 상 8.27 mm 복셀 해상도(50배)에서 X-선 CT스캐너를 이용하여 상기 단편을 분석하였다. 스캐폴드를 시료 홀더 상에 놓고, 스캐닝 이미지는 시료 회전 매 0.3도마다 기록하였다. 내부기공 형상의 3차 구조 재현은 축 이미지를 이용하여 수행하였으며 제조자에 의해 제공된 CT Vol 및 CTan 소프트웨어에 의해 분석하였다.The previously prepared HAG cryogel was cut to obtain a fragment of about 2 mm in size, and the fragment was analyzed using an X-ray CT scanner at 8.27 mm voxel resolution (50 times) at 30 kV with an X-ray tube current of 173 mA. The scaffold was placed on the sample holder and the scanning image was recorded every 0.3 degrees of sample rotation. Tertiary structure reproduction of the internal pore shape was performed using axial images and analyzed by CT Vol and CTan software provided by the manufacturer.

도 2(A)는 스캔 후 MIP(maximum intensity projection)를, 도 2(B)는 스캐폴드의 기공과 비기공 영역을 나타낸 바이너라이즈된 이미지이고, 도 2(C)는 스캐폴드의 3-D 재구성을 나타낸 것이다.
FIG. 2 (A) shows a maximum intensity projection (MIP) after scanning, FIG. 2 (B) shows a binarized image showing the pore and non-pore areas of the scaffold, and FIG. D reconstruction is shown.

3. 유동학에 따른 스캐폴드의 점탄성 거동 평가3. Evaluation of Viscoelastic Behavior of Scaffolds According to Rheology

유동학은 특정 조건 하에서 고분자의 변형 및 흐름에 대한 연구를 위한 이상적인 툴이다. HAG 크라이오젤의 9 mm 두께 단편을 자르고 150㎛ 갭 너비 및 4도의 각도에서 40 mm의 콘 직경을 갖는 점도측정기(cone and plate geometry)로 고정된 시료 홀더에 위치시키고, 15분 동안 초당 1N의 힘을 적용하였다. 스캐폴드의 저장 탄성율(G')과 손실 탄성율(G'')은 1Hz의 주파수에서 진동 대수 스윕(oscillatory logarithmic sweep)을 이용하여 산출하였다. 기질 측정 포인트는 1000으로, 데이터 포인트는 60으로 고정하였고 모든 조건은 분석을 위해 항상성을 유지하였다. 스캐폴드의 점탄성 특성은 골격 및 폐 조직 공학에서 특히 중요한 역할을 수행한다. HAG 크라이오젤을 25℃ 및 37℃와 같이 2회 다른 온도에서 분석하였다.Rheology is an ideal tool for studying the deformation and flow of polymers under certain conditions. Cut a 9 mm thick piece of HAG cryogel and place it in a fixed sample holder with cone and plate geometry with a cone diameter of 40 mm at 150 μm gap width and 4 degrees and a force of 1 N per second for 15 minutes. Was applied. The storage modulus (G ') and loss modulus (G' ') of the scaffold were calculated using an oscillatory logarithmic sweep at a frequency of 1 Hz. The substrate measurement point was fixed at 1000 and the data point at 60 and all conditions maintained homeostasis for analysis. The viscoelastic properties of scaffolds play a particularly important role in skeletal and lung tissue engineering. HAG cryogels were analyzed at two different temperatures, such as 25 ° C and 37 ° C.

그 결과는 하기 표 1과 같다.
The results are shown in Table 1 below.

4. HAG 크라이오젤의 흐름 및 물 투과 특성4. Flow and Water Permeation Characteristics of HAG Cryogel

흐름 측정은 스캐폴드의 상호결합력을 분석하는 데에 중요하다. HAG 크라이오젤에서의 유속을 종래 알려진 방법(Adrados et al.)에 따라 페리스탈릭 펌프를 이용하여 측정하였다. 펌프의 컨프롤 유속을 0.625psi로 고정하고, HAG 크라이오젤(50 mm 높이, 10 mm 직경)을 플라스틱 시린지 몰드의 동일 크기 내에 위치시켰다. 시린지의 입구 및 출구를 고정 전 펌르에 연결시키고 크라이오젤 시료의 최대 물 흐름 한계(ml/min)를 기록하였다. 다공성 고분자 모노리스의 물 투과는 Darcy 법칙을 이용하여 산출하였다. HAG 크라이오젤 시료(13 직경, 5 mm 두께)를 준비한 후, 종래 알려진 방법에 따라 투과성 측정 세팅기에 위치시켰다. 물을 모으기 위하여 1분 동안 실험 세팅기에 상수 물 압력 헤드(constant water pressure head)를 유지하였으며, 대조군 또는 테스트 세팅기로부터 온 출구에서 물을 모았다. 흘러나온 물을 칭량하고 얻어진 값을 다음 식을 이용하여 투과도를 산출하였다.Flow measurements are important for analyzing the scaffold's mutual binding force. The flow rate in the HAG cryosel was measured using a peristaltic pump according to a known method (Adrados et al.). The control flow rate of the pump was fixed at 0.625 psi and the HAG cryogel (50 mm high, 10 mm diameter) was placed within the same size of the plastic syringe mold. The inlet and outlet of the syringe were connected to the pump prior to fixation and the maximum water flow limit (ml / min) of the cryogel sample was recorded. Water permeation of the porous polymeric monolith was calculated using Darcy's law. HAG cryogel samples (13 diameter, 5 mm thick) were prepared and placed in a permeation measurement setter according to a known method. A constant water pressure head was maintained in the experimental setter for 1 minute to collect water, and water was collected at the outlet from the control or test setter. Permeability was computed using the following formula by weighing out the water which flowed out.

[수학식 1][Equation 1]

이때, k는 상기 다공성 재료의 물 투과도를, ΔX는 스캐폴드의 두께를, A는 크라이오젤의 flushing 영역을, M_B1은 세팅기의 출구로부터 온 물의 질량 유속을 의미한다.Where k is the water permeability of the porous material, ΔX is the thickness of the scaffold, A is the flushing area of the cryogel, and M _B1 is the mass flow rate of water from the outlet of the setter.

그 결과는 하기 표 1과 같다.
The results are shown in Table 1 below.

5. 팽창 속도론 및 팽창비5. Expansion kinetics and expansion ratio

크라이오젤의 팽창 속도를 종래 알려진 중량분석 방법에 따라 측정하였다. 즉, 다공성 크라이오젤 재료의 물 업데이크 능력 및 평형상태를 ~25℃에서 시간에 따라 결정하였다. HAG 크라이오젤 단편(13 mm 직경, 5 mm 높이)을 준비하고 최초 건조 질량을 측정하였다. 그후, 시료를 정해진 시간동안 탈이온수에 두었다. 이러한 크라이오젤 시료를 물로부터 제거하여 일정한 시간 간격으로 칭량하였다. 이때, 동일 높이와 직경의 4개 시료를 이용하였다. 얻어진 값을 이용하여 다음 식에 의해 % 물 업데이크 능력을 산출하였다.The rate of expansion of the cryogel was measured according to the known gravimetric method. That is, the water update ability and equilibrium of the porous cryogel material were determined over time at ˜25 ° C. HAG cryogel pieces (13 mm diameter, 5 mm height) were prepared and the initial dry mass was measured. Thereafter, the sample was placed in deionized water for a predetermined time. These cryogel samples were removed from the water and weighed at regular time intervals. At this time, four samples of the same height and diameter were used. Using the obtained value,% water update ability was computed by following Formula.

[수학식 2]&Quot; (2) "

이때, M_u는 물 질량의 업데이크 능력, M_RT는 정해진 시간 간격에서의 질량, M_D는 건조 크라이오젤의 질량, MSE는 ~25℃에서의 팽창 평형에서 팽창된 겔의 물 질량을 의미한다. Where M _u is the update capacity of the mass of water, M _RT is the mass at a defined time interval, M _D is the mass of dry cryogel, and MSE is the mass of water of the expanded gel at expansion equilibrium at ~ 25 ° C. .

그러나, 크라이오젤의 용매 흡수 능력은 다음 식에 의해 산출한 팽창비로서 정의하였다.However, the solvent absorption capacity of cryogel was defined as the expansion ratio calculated by the following equation.

[수학식 3]&Quot; (3) "

이때, S.R은 팽창비, M_s는 팽창된 겔의 질량, M_d는 건조 겔의 질량을 의미한다.In this case, SR means expansion ratio, M _s is the mass of the expanded gel, M _d means the mass of the dry gel.

그 결과는 하기 표 1과 같다.
The results are shown in Table 1 below.

6. 폐세포-세포 기질 간의 상호작용에 대한 3-DHAG 크라이오젤 매트릭스6. 3-DHAG Cryogel Matrix for Interaction Between Pulmonary Cells and Cell Substrates

합성된 HAG 크라이오젤이 조직 재생을 위한 패치로서 사용될 수 있는지를 검토하기 위하여, 상기 HAG 크라이오젤에 인간 폐 상피세포(한국세포주은행으로부터 구매)를 분주하였다. 즉, HAG 크라이오젤을 1ml DMEM 배지를 함유한 24웰 플레이트 상에 첨가하고 1X10⁴ 세포/웰의 세포 분주 밀도로 폐세포를 분주하였다. 정해진 시간 간격에서 MTT 분석을 통해 대사활성을 측정하였다. 크라이오젤로부터 배지를 제거하고 PBS(0.1M)로 세정한 후 티아졸릴 블루를 함유한 MTT 용액(0.5%)을 첨가하여 37℃에서 4시간 동안 반응시켰다. 각 웰로부터 MTT 용액을 제거한 후 침전에 DMSO를 가하고, DMSO로 용해된 포마잔 결정 용액을 490 nm에서 분광분석기를 통해 관찰하였다. 또한, SEM 분석을 위해 3시간 동안 글루타르알데히드로 고정하고 건조시켰다. 또한, MTT 분석과 동시에 세포핵 염색 즉 DAPI 염색을 수행하고 공초점 현미경을 통해 스캐폴드 내로 세포의 투과를 관찰하였다. In order to examine whether the synthesized HAG cryogel can be used as a patch for tissue regeneration, human lung epithelial cells (purchased from Korea Cell Line Bank) were dispensed on the HAG cryogel. That is, HAG cryogel was added onto a 24-well plate containing 1 ml DMEM medium and the lung cells were dispensed at a cell division density of 1 × 10 ⁴ cells / well. Metabolic activity was measured by MTT assay at defined time intervals. The medium was removed from the cryogel, washed with PBS (0.1 M), and then reacted at 37 ° C. for 4 hours by adding MTT solution (0.5%) containing thiazolyl blue. After removal of the MTT solution from each well, DMSO was added to the precipitate, and the formazan crystal solution dissolved in DMSO was observed through a spectrometer at 490 nm. In addition, glutaraldehyde was fixed and dried for 3 hours for SEM analysis. In addition, nuclear staining or DAPI staining was performed simultaneously with MTT analysis, and the penetration of cells into the scaffold was observed through confocal microscopy.

그 결과, MTT 분석을 통해 폐세포가 HAG 크라이오젤 상에서 70% 향상된 대사활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.As a result, the MTT analysis showed that the lung cells showed a 70% enhanced metabolic activity on the HAG cryogel.

또한, 도 3과 같이 HAG 크라이오젤에 분주된 폐세포는 24 시간 이내에 균일하게 크라이오젤에 부착되었으며, 실험 5일, 10일 및 15일째에서 보이는 바와 같이 세포는 계속적으로 증식하여 세포외기질(extracellular matrix; ECM)을 증착시킴을 알 수 있다.In addition, as shown in FIG. 3, the lung cells dispensed with HAG cryogels were uniformly attached to the cryogels within 24 hours, and as shown on the 5th, 10th, and 15th day of the experiment, the cells continued to proliferate to form extracellular matrix (extracellular). matrix; ECM).

또한, 도 4와 같은 공초점 이미지로부터 세포의 표면 부착과 함께 HAG 크라이오젤이 세포 내로 관통하는 것을 관찰할 수 있었다.
In addition, it was observed from the confocal image as shown in FIG. 4 that the HAG cryogel penetrated into the cell together with the surface adhesion of the cell.

7. 크라이오젤의 in vivo 생체적합성 평가7. In vivo Biocompatibility Evaluation of Cryogel

ISO 10993 규칙에 따라 in vivo 평가는 8마리 마우스를 대상으로 수행하였다. 마우스는 각각 4군(n=4)으로 나누어 관찰하였다. 모든 마우스는 사료 및 물에 접근이 자유롭고 비슷한 생장 조건에서 모두 유지되었다. 이하 실험은 영남대학 인권위원회로부터 승인받아 수행하였다. HAG 크라이오젤을 멸균 환경 하에서 이식하였다. HAG 스캐폴드를 농도별 에탄올(20, 40, 60, 80, 100 %)에서 멸균시켜 이식 시 완전히 멸균되도록 하였다. 마우스를 퍼퓨란과 공기 50:50% 혼합물로 마취시켰다. 이식 부위는 털을 깎고 수술 전에 70% 알코올로 세정하였다. 스캐폴드는 횡절개를 통해 마우스의 등 부분에 경피적으로 이식하였다. 절개 길이는 대략 5-10 mm이었다. HAG 스캐폴드 이식 후, 절개를 재흡수성 봉합선을 이용하여 봉합하였다. 이식 후, 봉합선을 제거하지 않고 이식 몇주 후에 용해된 것을 관찰하였다. 이식 부위에서 어떠한 염증도 관찰되지 않았다. In vivo evaluation was performed on 8 mice according to the ISO 10993 rule. Mice were divided into 4 groups (n = 4) and observed. All mice had free access to feed and water and were maintained under similar growth conditions. The following experiment was performed with approval from Yeungnam University Human Rights Commission. HAG cryogels were implanted under sterile environment. HAG scaffolds were sterilized in concentration-specific ethanol (20, 40, 60, 80, 100%) to ensure complete sterilization upon transplantation. Mice were anesthetized with a 50: 50% mixture of perfuran and air. The implant site was shaved and washed with 70% alcohol before surgery. The scaffold was implanted percutaneously into the dorsal part of the mouse via a transsection. The incision length was approximately 5-10 mm. After HAG scaffold implantation, the incision was closed using resorbable sutures. After transplantation, dissolution was observed several weeks after transplantation without removing sutures. No inflammation was observed at the transplant site.

크라이오젤 이식 마우스를 1주, 2주 및 5주 후 각각 희생시켜 이식 부위 또는 그 주위의 피부 조직을 모았다. 절개된 조직을 포름알데히드 용액에 고정시켜 보관하였다. 조직을 에탄올 용액의 농도별 구배를 이용하여 탈수한 후 파라핀에 놓아두었다. 마이크로톰(HM 360)을 이용하여 조직에서 5개의 마이크로미터 두께의 단편을 잘랐다. 헤마톡실린 및 에오신(H&E), 사프라닌(safranin) O 및 마손 트리크롬(Masson trichrome) 염색을 수행하여 전 조직 형상 및 이식 재료에 대한 반응성 조직의 변화를 관찰하였다. 사프라닌 O 염색은 이식 부위에서 비만세포의 침윤을 확인하기 위하여 절개된 조직 단편에서 수행되었다. 사프라닌 O 염색을 위해 단편을 먼저 100% 알콜에서 탈수시킨 후 95% 알콜에서 3분 동안 탈수시켰다. 탈수 공정 후, 단편을 Mayer HTX 용액에서 10분 동안 반응시킨 후 흐르는 수돗물 하에서 15분 동안 단편을 세정하였다. 세정 후, 단편을 5분 동안 0.1% fast green 용액에서 염색하였다. pH를 낮추기 위하여, 단편을 1% 빙초산에 담군 후 0.1% 사프라닌으로 반응시켰다. 마지막으로, 단편을 95% 알콜 및 100% 알콜로 2분 동안 건조시키고 Masson trichrome으로 각각 염색하였다.Cryogel transplanted mice were sacrificed after 1, 2 and 5 weeks, respectively, to collect skin tissue at or around the implant site. The incised tissue was stored fixed in formaldehyde solution. The tissue was dehydrated using a concentration gradient of ethanol solution and then placed in paraffin. A microtome (HM 360) was used to cut five micrometer thick fragments in the tissue. Hematoxylin and eosin (H & E), safranin O, and Masson trichrome staining were performed to observe changes in reactive tissue for whole tissue shape and graft material. Safranin O staining was performed on dissected tissue fragments to confirm infiltration of mast cells at the site of transplantation. For safranin O staining the fragments were first dehydrated in 100% alcohol and then dehydrated in 95% alcohol for 3 minutes. After the dehydration process, the fragments were reacted in Mayer HTX solution for 10 minutes and then the fragments were washed for 15 minutes under running tap water. After washing, the fragments were stained in 0.1% fast green solution for 5 minutes. To lower the pH, the fragments were immersed in 1% glacial acetic acid and then reacted with 0.1% safranin. Finally, the fragments were dried for 2 minutes with 95% alcohol and 100% alcohol and stained with Masson trichrome respectively.

그 결과, 도 5와 같이 이식된 스캐폴드 주위에 초기 혈관신생이 관찰되었으며, 이식물은 잘 수용되었으며 별다른 문제는 관찰되지 않았다. 특히, 이식 후 5주 후에도 졸음이나 식이 습성에서 어떠한 변화도 관찰되지 않았다. 또한, 헤마톡신 및 에오신 염색을 통해 이식 부위에서 세포 침윤을 관찰할 수 있었으며, 많은 세포들이 이식 3주 및 5주째에 이식 부위에서 발견되어 이식물 주위로 세포를 유인함을 알 수 있었다. 또한, 사프라닌 염색을 통해 비만세포의 존재를 확인한 결과, 5주째에서도 이식 부위에서 비만 세포가 관찰되지 않아 상기 재료가 숙주 및 이식 거부를 야기하는 어떠한 면역반응을 유발하지 않음을 알 수 있었다. 따라서, 이식된 크라이오젤 스캐폴드는 이식 부위에서 완화된 염증을 보이며 대식세포, 수지세포의 침윤과 많은 상피세포의 증식을 특징으로 하였다. HAG 크라이오젤에서 조직 반응은 3주 및 5주 이식보다 1주 이식에서 보다 의미있게 증가되었으나, 어떠한 비만 세포는 관찰되지 않았다. HAG 크라이오젤에서 결합 조직은 1주 후 이식물 근처에서 관찰되었다. 이식물은 이식 3주 후 숙주조직에 완전히 편입되었으며, 그후 분해되었다. As a result, initial angiogenesis was observed around the implanted scaffold as shown in FIG. 5, the implant was well received and no problems were observed. In particular, no changes in drowsiness or dietary habits were observed 5 weeks after transplantation. In addition, hematoxylin and eosin staining showed cell infiltration at the site of transplantation, and many cells were found at the site of transplantation at 3 and 5 weeks of transplantation to attract cells around the implant. In addition, as a result of confirming the presence of mast cells through safranin staining, it was found that even at 5 weeks, no mast cells were observed at the transplantation site, and thus the material did not cause any immune response causing host and transplant rejection. Thus, the implanted cryogel scaffolds showed moderate inflammation at the site of transplantation and were characterized by infiltration of macrophages, dendritic cells and proliferation of many epithelial cells. Tissue response in HAG cryogel was more significantly increased at 1 week transplantation than at 3 and 5 week transplants, but no mast cells were observed. Connective tissue in HAG cryogel was observed near the implant after 1 week. The implant was fully incorporated into host tissue three weeks after transplantation and then degraded.

8. 수지상 세포에 대한 면역조직적 분석8. Immunohistochemical Analysis of Dendritic Cells

절개된 조직을 포름알데히드 용액에 고정시켜 준비하였다. 조직을 파라핀에 담지하기 전에 농도별 에탄올 용액을 이용하여 탈수하였다. 마이크로톰(HM 360)을 이용하여 조직으로부터 5개의 마이크로미터 두께 단편을 잘랐다. 제1염색 TAU를 PBS(0.1% PBS)로 1:100 희석하여 단편에 넣었고, 밤새도록 반응시켰다. 이러한 단편을 철저히 세정한 후, 제2 항체를 1:200 희석하여 넣었고, 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 상기 단편을 세정하고 형광현미경으로 관찰하였다.The dissected tissue was prepared by immobilization in formaldehyde solution. The tissues were dehydrated using ethanol solutions by concentration before loading on paraffin. Five micrometer thick fragments were cut from the tissue using a microtome (HM 360). First-stained TAU was diluted 1: 100 with PBS (0.1% PBS) into fragments and allowed to react overnight. After washing these fragments thoroughly, the second antibody was diluted 1: 200 and reacted for 1 hour at room temperature. The fragments were washed and observed by fluorescence microscopy.

이상과 같이, 본 발명은 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 본 발명은 이것에 의해 한정되지 않으며 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술 사상과 아래에 기재될 청구범위의 균등 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능함은 물론이다. While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the invention is not limited to the disclosed exemplary embodiments. It is to be understood that various modifications and changes may be made without departing from the scope of the appended claims.

Claims

크라이오젤 스캐폴드에 폐세포를 이식한 것으로서,
상기 크라이오젤 스캐폴드는 2-하이드록시에틸메타크릴레이트(HEMA), 알지네이트 및 젤라틴으로 이루어진 고분자 혼합물을 포함하며, 상기 고분자 혼합물 총 100 중량부에 대하여, 2-하이드록시에틸메타크릴레이트(HEMA) 5 내지 7 중량부, 알지네이트 1 내지 5 중량부 및 젤라틴 1 내지 5 중량부로 이루어지는 것을 특징으로 하는 폐 패치.Transplanted lung cells into the cryogel scaffold,
The cryogel scaffold comprises a polymer mixture consisting of 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA), alginate and gelatin, and based on 100 parts by weight of the polymer mixture, 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA) A lung patch comprising 5 to 7 parts by weight, 1 to 5 parts by weight of alginate and 1 to 5 parts by weight of gelatin.

청구항 1에 있어서, 상기 폐 패치는 폐기종 치료용 패치인 것을 특징으로 하는 폐 패치.The lung patch of claim 1, wherein the lung patch is a patch for treating emphysema.

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청구항 1에 있어서, 상기 크라이오젤 스캐폴드는,
물에 알지네이트 및 젤라틴을 첨가하여 용해시키는 단계;
상기 용해된 고분자 용액에 2-하이드록시에틸메타크릴레이트(HEMA)를 첨가하고 냉각하는 단계;
상기 냉각된 고분자 혼합물을 액체 크라이오스탯 내에서 중합시키는 단계; 및
상기 중합된 젤을 세정하여 미중합 단량체를 제거하는 단계;
를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 하는 폐 패치.The method according to claim 1, wherein the cryogel scaffold,
Dissolving by adding alginate and gelatin to water;
Adding and cooling 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA) to the dissolved polymer solution;
Polymerizing the cooled polymer mixture in a liquid cryostat; And
Washing the polymerized gel to remove unpolymerized monomers;
Lung patch, characterized in that it is prepared.

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