KR101382217B1 - The biomarker for diagnosis of intrahepatic cholestasis and the method of diagnosis for intrahepatic cholestasis thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 간내 담즙 정체 진단용 바이오마커 및 이를 이용한 간내 담즙 정체 진단 방법에 관한 것으로, 팔로이딘이 투여되어 간내 담즙 정체가 유도된 동물 모델에서 마이크로어레이 칩을 이용하여 유전자 발현 변화를 측정하여 특정 유전자의 발현이 변화됨을 확인하므로써 변화된 유전자들을 간내 담즙 정체 진단용 바이오마커로 이용될 수 있으며, 또한 상기 바이오마커를 이용하여 간내 담즙 정체의 진단에 유용하게 이용될 수 있다.The present invention relates to a biomarker for diagnosing intrahepatic bile stagnation and a method for diagnosing intrahepatic bile stagnation using the same, by measuring a gene expression change using a microarray chip in an animal model in which paloidine is administered and intrahepatic bile stagnation is induced, By confirming that the expression is changed, the changed genes can be used as a biomarker for diagnosing intrahepatic bile stagnation, and can also be usefully used for diagnosing intrahepatic bile stagnation using the biomarker.
간내 담즙 정체(intrahepatic cholestasis), 팔로이딘, 바이오마커, 마이크로어레이 칩 Intrahepatic Cholestasis, Paloidine, Biomarkers, Microarray Chips
Description
본 발명은 간내 담즙 정체(intrahepatic cholestasis) 진단용 바이오마커 및 이를 이용한 간내 담즙 정체 진단 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a biomarker for diagnosing intrahepatic cholestasis and a method for diagnosing intrahepatic bile stasis using the same.
담즙은 간세포에 의해 생성되어 담관으로 배출되며, 다양하고 복잡한 성분들을 함유하는 콜로이드성 용액이다. 담즙의 생성은 다양한 간 기능 중 가장 중요한 기능 중 하나이다. 간으로부터 분비되는 담즙은 97% 의 물, 및 담즙염, 담즙 색소, 포스파티딜콜린, 콜레스테롤, 미량 알부민, 전해질 등을 포함하는 기타 성분으로 구성된다. 담즙의 주요 기능은 담즙산에 의한 지방산 소화 및 흡수의 촉진이다. 담즙산은 담즙산 의존적인 담즙 분비를 유도하는 담관성(cholagogic property)을 갖는다. 담즙은 또한 담즙산과 부관하게 분비될 수 있으며, 상기 분비는 담즙산 비의존적 담즙 분비로 불린다. 담낭관의 차단, 담낭 수축 부전, 간세 포 의존적 황달 등에 의해 일어날 수 있는 담즙 분비의 감소는 지방산 흡수불량과 같은 다양한 부전 및 질환을 일으킬 수 있음이 공지되어 있다.Bile is produced by hepatocytes and excreted into the bile ducts and is a colloidal solution containing various complex components. The production of bile is one of the most important functions of various liver functions. Bile secreted from the liver consists of 97% water and other components including bile salts, bile pigments, phosphatidylcholine, cholesterol, trace albumin, electrolytes and the like. The main function of bile is the promotion of fatty acid digestion and absorption by bile acids. Bile acids have cholagogic properties that induce bile acid dependent bile secretion. Bile can also be secreted unrelated to bile acids, which are called bile acid independent bile secretion. It is known that the reduction of bile secretion, which may occur due to blockage of the gallbladder, gall bladder contraction failure, hepatic cell-dependent jaundice, and the like, can lead to various failures and diseases such as fatty acid uptake.
담즙 정체제는 미세섬유(microfilamnet) 합성을 증가시키는 것으로 알려졌다(Elias, E., Z. et al., 1980. Proc . Natl . Acad . Sci . USA. 77:2229-2233.; Vonk, R. et al., 1982. Liver 2:133-140.; Watanabe, N., et al., 1991. J. CellBiol. 113:1069-1180.; Dubin, M., et al., 1980. Gastroenterology 79:646-654.; Dancker, P., et al., 1975, Biochim . Biophys . Acta. 400:407-414.). 또한 세포질의 액틴 필라멘트의 중합 반응을 촉진시켜 소담관(bile canaliculi)을 닫히게 한다(Dancker, P., et al., 1975, Biochim . Biophys . Acta. 400:407-414.; French, S. W. and P.L. Davies. 1975. Gastroenterology 68:765-774; Elias, E., Z. et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA. 77:2229-2233.; Vonk, R. et al., 1982. Liver 2:133-140.; Collucio, L. M. and L.G. Tilney. 1984. J.CellBiol. 99:529-535.). 간세포 미세섬유는 크게 액틴에 포함된다. 이들은 세포 형태 및 세포막의 신축성을 유지하는데 중요하게 작용하므로 담즙 성분은 근육 구축 및 소담관의 근육 수축 및 소담관의 느슨함의 반복으로 인해 배출된다(Watanabe, N., et al., J. CellBiol .113:1069-1180.; Thibault, N., et al., Toxicology 73:269-279.; Yamamoto, K., et al., ActaMed . Okayama. 42:207-213.).Bile retention agents are known to increase microfilamnet synthesis (Elias, E., Z. et al., 1980. Proc . Natl . Acad . Sci . USA . 77: 2229-2233 .; Vonk, R. et al., 1982. Liver 2: 133-140 .; Watanabe, N., et al., 1991. J. Cell Biol . 113: 1069-1180 .; Dubin, M., et al., 1980. Gastroenterology 79: 646-654 .; Dancker, P., et al., 1975, Biochim . Biophys . Acta . 400: 407-414. It also promotes the polymerization of cytoplasmic actin filaments to close the bile canaliculi (Dancker, P., et al., 1975, Biochim . Biophys . Acta . 400: 407-414 .; French, SW and PL Davies. 1975. Gastroenterology 68: 765-774; Elias, E., Z. et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA . 77: 2229-2233 .; Vonk, R. et al., 1982. Liver 2: 133-140 .; Collucio, LM and LG Tilney. 1984. J. Cell Biol . 99: 529-535.). Hepatocyte microfibers are largely included in actin. They play an important role in maintaining cell morphology and elasticity of cell membranes, so bile components are excreted due to the repetition of muscle contraction and muscle contraction of the small bile ducts and loosening of the small bile ducts (Watanabe, N., et al., J. Cell Biol 113: 1069-1180; Thibault, N., et al., Toxicology 73: 269-279 .; Yamamoto, K., et al., Acta Med . Okayama . 42: 207-213.
간 내의 폐색으로 인한 간내 담즙정체는 현재 bromosulphalein clearance 또는 serum bilirubin level과 같은 독소 테스트를 이용하여 진단되고 있다. 최근 독성 유전학의 발전은 다른 약물 또는 화합물에 대한 분자 마커를 개발하는데 도움 이 되었다. 그러나 아무도 담즙 정체의 분자 마커를 개발하고자 하는 시도는 없었다. 팔로이딘은 간내 담즙 정체를 통한 독성을 증가시키므로(Ishizaki, K., et al., 1997, Toxicol . Lett. 90:29-34.; Ishizaki, K., et al., 2001. Eur .J. Pharmacol. 421:55-60.) 유전자 발현 연구를 위한 간 독성에 이용할 가치가 있다. 마이크로어레이-기초 독성학 프로필은 간 및 혈액 생물학에서 조직병리학적 관찰을 뒷받침해주도록 개발되었다. Hepatic cholestasis due to hepatic obstruction is currently diagnosed using toxin tests such as bromosulphalein clearance or serum bilirubin levels. Recent advances in toxicology have helped develop molecular markers for other drugs or compounds. However, no attempt has been made to develop molecular markers of bile stagnation. Palroyi Dean increases the toxicity through the intrahepatic cholestasis (Ishizaki, K., et al, 1997, Toxicol Lett 90:.... 29-34 .; Ishizaki, K., et al, 2001. Eur .J. Pharmacol 421: 55-60.) It is valuable for liver toxicity for gene expression studies. Microarray-based toxicology profiles have been developed to support histopathological observations in liver and blood biology.
이에 본 발명자들은 간내 담즙 정체의 새로운 분자 마커를 개발하고자 팔로이딘을 투여한 동물 모델인 마우스의 간을 이용하여 마이크로어레이 칩을 이용하여 유전자 발현의 변이를 관찰하여 본 발명을 완성하였다. In order to develop a new molecular marker of intrahepatic bile stagnation, the present inventors completed the present invention by observing variation of gene expression using a microarray chip using the liver of a mouse, an animal model to which paloidine was administered.
본 발명의 목적은 간내 담즙 정체 진단용 마커 및 이를 이용한 간내 담즙 정체 진단 방법을 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide a marker for diagnosing intrahepatic bile stagnation and a method for diagnosing intrahepatic bile stagnation using the same.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 간내 담즙 정체 진단용 바이오마커를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a biomarker for diagnosing intrahepatic bile stagnation.
또한 본 발명은 상기 바이오마커 유전자 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보가닥 분자가 집적됩 간내 담즙 정체 진단용 DNA 마이크로어레이 칩을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a DNA microarray chip for diagnosing intrahepatic bile stasis in which oligonucleotides or their complementary strand molecules containing all or part of the biomarker gene sequence are integrated.
또한 본 발명은 간내 담즙 정체 진단용 키트를 제공한다.The present invention also provides a kit for diagnosing intrahepatic bile stagnation.
또한 본 발명은 간내 담즙 정체 진단 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for diagnosing intrahepatic bile stagnation.
또한 본 발명은 팔로이딘 노출 여부 판정 방법을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a method for determining whether or not paleoid exposure.
아울러 본 발명은 팔로이딘 노출 여부 판정용 키트를 제공한다.In addition, the present invention provides a kit for determining whether or not paloydine exposure.
본 발명의 간내 담즙 정체 진단용 바이오마커 및 이를 이용한 진단 방법은 정확하고 빠른 시간 내에 간단한 방법을 이용하여 특이적으로 대상이 간내 담즙 정체 여부를 판정하는데 유용하다.The biomarker for diagnosing hepatic bile stagnation of the present invention and a diagnostic method using the same are useful for determining whether the subject has hepatic bile stagnation specifically using a simple method in an accurate and fast time.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 간내 담즙 정체 진단용 바이오마커를 제공한다.The present invention provides a biomarker for diagnosing intrahepatic bile stagnation.
본 발명자들은 간내 담즙 정체를 유도하는 것으로 알려진 화합물인 팔로이딘을 여러 농도 및 시간대별로 동물 모델인 마우스에 적용하여 간내 담즙 정체를 일으키는 적합한 농도 및 시간대를 정하였다(도 1 내지 3 참조). 정해진 팔로이딘의 농도 및 시간대는 1 mg/kg 이며, 시간대는 1, 3 및 7일이다. 상기 농도로 팔로이딘을 동물 모델인 마우스에 적용한 후, 시간대마다 마우스를 희생하여 간을 수득하였다. 수득된 간에서 전체 RNA를 추출하여, cDNA를 제작한 후 마우스 올리고 칩과 혼성화하고 데이터를 분석하였다. 그 결과 165개의 유의적인 유전자의 발현이 2배 이상 증가 또는 0.5배 감소됨을 확인하였다. The present inventors applied paloidine, a compound known to induce hepatic bile stagnation, to mice of animal models at various concentrations and time periods to determine a suitable concentration and time zone for causing intrahepatic bile stagnation (see FIGS. 1 to 3). The defined paloidine concentration and time zone is 1 mg / kg and time zones are 1, 3 and 7 days. After applying paloidine to the animal model mouse at the above concentration, the liver was obtained at the time of sacrifice by the mouse. Total RNA was extracted from the obtained liver, cDNA was prepared, hybridized with mouse oligo chip, and the data analyzed. As a result, the expression of 165 significant genes was confirmed to be increased more than 2 times or decreased 0.5 times.
본 발명의 바이오마커는 하기의 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다: The biomarker of the present invention is preferably selected from the group consisting of the following genes:
유전자 등록번호(GeneBank Accession no.) NW_008830[ATP-binding cassette, subfamily B(MDR/TAP), member 4], 유전자 등록번호 NM_009290(Wingless-related MMTV integration site 8A), 유전자 등록번호 X06453(Prolyl-4-hydroxylase, beta polypeptide), 유전자 등록번호 X61453(H19), 유전자 등록번호 NM_010232(Flavin-containing monooxygenase 5), 유전자 등록번호 NM_008302(Heat shock protein 1, beta), 유전자 등록번호 AF237627(Smooth muscle leiomodin), 유전자 등록번호 NM_012032(Tumor differentially expressed protein 1), 유전자 등록번호 AK002626(Longevity assurance homolog 2), 유전자 등록번호 NM_033562(Carcinoma related gene), 유전자 등록번호 AK020229(AMSH family protein), 유전자 등록번호 NM_021319(Peptidoglycan recognition protein 2), 유전자 등록번호 NM_013709(SH3 domain YSC-like 1), 유전자 등록번호 NM_011018(Sequestosome 1), 유전자 등록번호 NM_010358(Glutathione S-transferase, mu 1), 유전자 등록번호 NM_009005(RAB7, member RAS oncogene family), 유전자 등록번호 NM_009101(Harvey rat sarcoma oncogene, subgroup R), 유전자 등록번호 NM_007393(Action, beta, cytoplasmic), 유전자 등록번호 NM_008156(Glycosylphosphatidylinositolspecific phospholipase D1), 유전자 등록번호 NM_009795(Caplain, small subunit 1), 유전자 등록번호 NM_021456(Carboxylesterase 1), 유전자 등록번호 NM_019771(Destrin), 유전자 등록번호 AK005069(Hypothetical protein), 유전자 등록번호 AK020471(Cofilin 1, nonmuscle), 유전자 등록번호 NM_133655(CD 81 antigen), 유전자 등록번호 AK011290(Homolog to phosphoribosypyrophosphate synthetase-associated rptoein 39), 유전자 등록번호 NM_026183(Hypothetical protein LOC67473), 유전자 등록번호 NM_009479(Uroporphyrinogen Ⅲ synthase), 유전자 등록번호 BC002094(cAMP responsive element binding protein 3), 유전자 등록번호 NM_009187(Cytochrome c oxidase subunit Ⅶa polypeptide-2 like ), 유전자 등록번호 AK004887(Ganglioside-induced differentiation-associated-protein 2), 유전자 등록번호 NM_015751(ATP-binding cassette, subfamily E, membet 1), 유전자 등록번호 NM_009679(Adaptor protien complex AP-2, mu1), 유전자 등록번호 AK002441(DNA segment, Chr 14, ERATO Doi 449, expressed), 유전자 등록번호 BC005752(cDNA sequence BC005752), 유전자 등록번호 NM_017374(Protien phosphatase 2a, catalytic subunit, beta isoform), 유전자 등록번호 NM_008622(Mpv17 transgene, kidney disease mutant), 유전자 등록번호 AK011566(Homolog to alpha-fodrin), 유전자 등록번호 BC025555(Hypothetical protein LOC74467), 유전자 등록번호 NM_008676(Neighbor of Brcal gene 1), 유전자 등록번호 AK016715(RIKEN cDNA 2510006D16), 유전자 등록번호 NM_013679(Seminal vesicle secretion 6), 유전자 등록번호 NM_011200(Protein tyrosine phosphatase-4a1), 유전자 등록번호 NM_026417(Yip1 domain family, member 4) 및 유전자 등록번호 AK003820(Homolog to potential phospholipid-transporting ATPase).GeneBank Accession no. NW_008830 [ATP-binding cassette, subfamily B (MDR / TAP), member 4], gene registration number NM_009290 (Wingless-related MMTV integration site 8A), gene registration number X06453 (Prolyl-4 -hydroxylase, beta polypeptide), gene registration number X61453 (H19), gene registration number NM_010232 (Flavin-containing monooxygenase 5), gene registration number NM_008302 (
상기 바이오마커는 담즙 정체시 발현이 증가하는 유전자이다. The biomarker is a gene that increases expression during bile stagnation.
또한 본 발명은 상기 바이오마커 유전자 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보가닥 분자가 집적됩 간내 담즙 정체 진단용 DNA 마이크로어레이 칩을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a DNA microarray chip for diagnosing intrahepatic bile stasis in which oligonucleotides or their complementary strand molecules containing all or part of the biomarker gene sequence are integrated.
상기 올리고 뉴클레오티드 또는 이의 상보가닥 분자는 상기 바이오마커 유전자의 18 내지 100개의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것이 바람직하고, 바람직하게 는 20 내지 25개의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것이 더욱 바람직하다. The oligonucleotide or its complementary strand molecule preferably comprises 18 to 100 polynucleotides of the biomarker gene, and more preferably 20 to 25 polynucleotides.
본 발명의 간내 담즙 정체 진단용 DNA 마이크로어레이 칩은 당업자에게 알려진 방법으로 제작할 수 있다. 상기 마이크로어레이 칩을 제작하는 방법은 하기와 같다. 상기 탐색된 바이오마커를 탐침 DNA 분자로 이용하여 DNA 칩의 기판 상에 고정화시키기 위해 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting)법 또는 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 핀 형태의 스폿터인 마이크로어레이를 이용하였다. 상기 DNA 마이크로어레이 칩의 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 활성기가 코팅된 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막, 및 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 아미노-실란이 코팅된 슬라이드 글래스를 이용하였다.The DNA microarray chip for diagnosing intrahepatic bile stasis of the present invention can be produced by a method known to those skilled in the art. A method of fabricating the microarray chip is as follows. In order to immobilize the searched biomarker as a probe DNA molecule on a substrate of a DNA chip, a micropipetting method or a pin-shaped spotter using a piezoelectric method is used. It is preferable to use the method, but the present invention is not limited thereto. In a preferred embodiment of the present invention, a microarray, which is a pin-shaped spotter, is used. The substrate of the DNA microarray chip is preferably coated with one activator selected from the group consisting of amino-silane, poly-L-lysine, and aldehyde, But is not limited thereto. The substrate may be selected from the group consisting of a slide glass, a plastic, a metal, a silicon, a nylon film, and a nitrocellulose membrane, but the present invention is not limited thereto. In a preferred embodiment of the present invention, Coated slide glass was used.
또한 본 발명은 간내 담즙 정체 진단용 키트를 제공한다.The present invention also provides a kit for diagnosing intrahepatic bile stagnation.
본 발명의 간내 담즙 정체 진단용 키트는 간세포 및 본 발명의 간내 담즙 정체 진단용 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 것이 바람직하다.The hepatic bile stagnation diagnostic kit of the present invention preferably comprises a hepatocyte and a DNA microarray chip for diagnosing the hepatic bile stasis of the present invention.
또한 본 발명의 간내 담즙 정체 진단용 키트는 간세포 및 본 발명의 바이오마커 유전자 서열에 상보적으로 결합하는 프라이머 쌍을 포함하는 것 바람직하다. In addition, the kit for diagnosing intrahepatic bile stasis of the present invention preferably comprises a pair of primers that complementarily bind to the hepatocytes and the biomarker gene sequence of the present invention.
상기 키트에 추가적으로 형광물질을 포함할 수 있으며, 상기 형광물질은 스트렙아비딘-알칼리 탈인화효소 접합물질(strepavidin-like phosphatease conjugate), 화학형광물질(chemiflurorensce) 및 화학발광물질(chemiluminescent)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시 예에서는 Cy3와 Cy5를 사용하였다. The kit may further comprise a fluorescent material, wherein the fluorescent material is selected from the group consisting of a strepavidin-like phosphatease conjugate, a chemiluminescent substance, and a chemiluminescent substance But it is not limited thereto. In a preferred embodiment of the present invention, Cy3 and Cy5 are used.
상기 키트에 추가적으로 반응 시약을 포함시킬 수 있으며, 상기 반응 시약은 혼성화에 사용되는 완충용액, RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, cNTPs 및 rNTP(사전 혼합형 또는 분리 공급형), 형광 염색제의 화학적 유도제와 같은 표식시약, 세척 완충용액 등으로 구성될 수 있으나 이에 한정된 것은 아니며, 당업자에게 알려진 DNA 마이크로어레이 칩의 혼성화 반응에 필요한 반응 시약은 모두 포함시킬 수 있다.The reaction reagent may further include a buffer solution used for hybridization, a reverse transcriptase for synthesizing cDNA from RNA, cNTPs and rNTP (pre-mixed or separate feed type), a chemical inducer for fluorescent dye And a washing buffer solution. However, the present invention is not limited thereto. Any reaction reagent necessary for hybridization reaction of a DNA microarray chip known to a person skilled in the art can be included.
상기 본 발명의 키트의 프라이머는 당업자에게 알려진 공지의 방법으로 제작하는 것이 바람직하다.The primer of the kit of the present invention is preferably produced by a known method known to those skilled in the art.
또한 본 발명은 간내 담즙 정체 진단 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for diagnosing intrahepatic bile stagnation.
상기 간내 담즙 정체 진단 방법은 하기와 같다: 1) 대상에서 간세포를 수득하는 단계; 2) 단계 1)에서 수득된 간세포 및 대조군 간세포의 전체 RNA를 분리하는 단계; 3) 단계 2)의 수득된 간세포 및 대조군 간세포의 전체 RNA로 cDNA를 합성하는 단계; 4) 단계 3)의 수득된 간세포 및 대조군 간세포의 cDNA를 본 발명의 간내 담즙 정체 진단용 DNA 마이크로어레이 칩에 혼성화하는 단계; 5) 단계 4)의 혼 성화된 DNA 마이크로어레이 칩의 데이터를 분석하는 단계; 및 6) 단계 5)의 분석된 데이터를 본 발명의 바이오마커와 비교하여 담즙 정체를 판정하는 단계.The method for diagnosing intrahepatic bile stasis is as follows: 1) obtaining hepatocytes in a subject; 2) separating the total RNA of the hepatocytes and control hepatocytes obtained in step 1); 3) synthesizing cDNA with total RNA of the obtained hepatocytes and control hepatocytes of step 2); 4) hybridizing the cDNAs of the obtained hepatocytes and the control hepatocytes of step 3) to the hepatic bile stasis diagnostic DNA microarray chip of the present invention; 5) analyzing the data of the hybridized DNA microarray chip of step 4); And 6) comparing the analyzed data of step 5) with the biomarkers of the present invention to determine bile stagnation.
또한 상기 간내 담즙 정체 진단 방법은 하기와 같다: 1) 대상에서 간세포를 수득하는 단계; 2) 단계 1)에서 수득된 간세포 및 대조군 간세포의 전체 RNA를 분리하는 단계; 3) 단계 2)의 수득된 간세포 및 대조군 간세포의 전체 RNA를 대상으로 제 1항의 바이오마커 유전자 서열과 상보적인 프라이머쌍을 이용하여 RT-PCT을 수행하는 단계; 및 4) 단계 3)의 RT-PCT 결과를 분석하여 본 발명의 바이오마커와 비교하여 담즙 정체를 판정하는 단계.In addition, the method for diagnosing hepatic bile stagnation is as follows: 1) obtaining hepatocytes in a subject; 2) separating the total RNA of the hepatocytes and control hepatocytes obtained in step 1); 3) performing RT-PCT on the total RNA of the obtained hepatocytes and control hepatocytes of step 2) using primer pairs complementary to the biomarker gene sequence of
또한 본 발명은 팔로이딘 노출 여부 판정 방법을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a method for determining whether or not paleoid exposure.
상기 팔로이딘 노출 여부 판정 방법은 하기와 같다: 1) 대상에서 간세포를 수득하는 단계; 2) 단계 1)에서 수득된 간세포 및 대조군 간세포의 전체 RNA를 분리하는 단계; 3) 단계 2)의 수득된 간세포 및 대조군 간세포의 전체 RNA로 cDNA를 합성하는 단계; 4) 단계 3)의 수득된 간세포 및 대조군 간세포의 cDNA를 본 발명의 간내 담즙 정체 진단용 DNA 마이크로어레이 칩에 혼성화하는 단계; 5) 단계 4)의 혼성화된 DNA 마이크로어레이 칩의 데이터를 분석하는 단계; 및 6) 단계 5)의 분석된 데이터를 본 발명의 바이오마커와 비교하여 팔로이딘에 노출 여부를 판정하는 단계.The method for determining whether palodine is exposed is as follows: 1) obtaining hepatocytes in a subject; 2) separating the total RNA of the hepatocytes and control hepatocytes obtained in step 1); 3) synthesizing cDNA with total RNA of the obtained hepatocytes and control hepatocytes of step 2); 4) hybridizing the cDNAs of the obtained hepatocytes and the control hepatocytes of step 3) to the hepatic bile stasis diagnostic DNA microarray chip of the present invention; 5) analyzing the data of the hybridized DNA microarray chip of step 4); And 6) comparing the analyzed data of step 5) with the biomarkers of the invention to determine whether it is exposed to paloidine.
아울러 본 발명은 팔로이딘 노출 여부 판정용 키트를 제공한다.In addition, the present invention provides a kit for determining whether or not paloydine exposure.
상기 팔로이든 노출 여부 판정용 키트는 간세포 및 본 발명의 간내 담즙 정체 진단용 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 것이 바람직하다.Preferably, the kit for exposing the palaudon exposure comprises hepatocytes and a DNA microarray chip for diagnosing intrahepatic bile stasis of the present invention.
또한 상기 팔로이든 노출 여부 판정용 키트는 간세포 및 본 발명의 바이오마커 유전자 서열에 상보적으로 결합하는 프라이머 쌍을 포함하는 것 바람직하다. In addition, the kit for determining whether the paloden exposure is preferably comprises a pair of primers complementary to the hepatocytes and the biomarker gene sequence of the present invention.
상기 키트에 추가적으로 형광물질을 포함할 수 있으며, 상기 형광물질은 스트렙아비딘-알칼리 탈인화효소 접합물질(strepavidin-like phosphatease conjugate), 화학형광물질(chemiflurorensce) 및 화학발광물질(chemiluminescent)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시 예에서는 Cy3와 Cy5를 사용하였다. The kit may further comprise a fluorescent material, wherein the fluorescent material is selected from the group consisting of a strepavidin-like phosphatease conjugate, a chemiluminescent substance, and a chemiluminescent substance But it is not limited thereto. In a preferred embodiment of the present invention, Cy3 and Cy5 are used.
상기 키트에 추가적으로 반응 시약을 포함시킬 수 있으며, 상기 반응 시약은 혼성화에 사용되는 완충용액, RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, cNTPs 및 rNTP(사전 혼합형 또는 분리 공급형), 형광 염색제의 화학적 유도제와 같은 표식시약, 세척 완충용액 등으로 구성될 수 있으나 이에 한정된 것은 아니며, 당업자에게 알려진 DNA 마이크로어레이 칩의 혼성화 반응에 필요한 반응 시약은 모두 포함시킬 수 있다.The reaction reagent may further include a buffer solution used for hybridization, a reverse transcriptase for synthesizing cDNA from RNA, cNTPs and rNTP (pre-mixed or separate feed type), a chemical inducer for fluorescent dye And a washing buffer solution. However, the present invention is not limited thereto. Any reaction reagent necessary for hybridization reaction of a DNA microarray chip known to a person skilled in the art can be included.
상기 본 발명의 키트의 프라이머는 당업자에게 알려진 공지의 방법으로 제작하는 것이 바람직하다.The primer of the kit of the present invention is preferably produced by a known method known to those skilled in the art.
<< 실시예Example 1> 1> 팔로이딘에Paloydin 의한 by 간내Liver 담즙 정체 정도 측정 Measuring bile stagnation
<1-1> 팔로이딘을 마우스에 적용<1-1> Paloidine Applied to Mice
대략 9주령의 BALB/c 수컷 마우스(SLC, 일본)는 실험하기 2주 전부터 12시간 명/암 주기로, 온도 및 습도 조절 하에 사육실에서 사육하였다. 마우스는 표준 식품 사료를 섭취시켰다. 이들 마우스의 체중은 24 ~ 27 g(mean ± SD, 25.75 ± 0.97), DMSO에 용해시킨 팔로이딘은 미리 정해둔 치사량에 가까운 3개의 농도(0.25, 0.5 및 1 mg/kg 몸무게)로 5마리에 각각 투여하였다. 팔로이딘 및 DMSO는 Sigma-Aldrich(USA)에서 구배하였다. 팔로이딘은 2% DMSO-saline 용액에 용해시켰다. 대조군 마우스는 동일한 양의 식염수를 처리하였다. 마우스는 처리 후 24시간, 3일 또는 7일 후에 마취하여 희생하였다. 각각 마우스의 처음 또는 마지막 몸무게를 기록하였다. 마우스는 주의깊게 혈액 및 간 시료를 수득하였다. 간/신체 무게 비 또한 계산되었다.Approximately 9 weeks old BALB / c male mice (SLC, Japan) were bred in a breeding room under temperature and humidity control at a 12 hour light / dark cycle from 2 weeks before the experiment. Mice received a standard food diet. These mice weighed between 24 and 27 g (mean ± SD, 25.75 ± 0.97), and Paloidine dissolved in DMSO was found in five rats at three concentrations (0.25, 0.5 and 1 mg / kg body weight) close to a predetermined lethal dose. Each was administered. Paloidine and DMSO were gradients from Sigma-Aldrich (USA). Paloidine was dissolved in 2% DMSO-saline solution. Control mice were treated with the same amount of saline. Mice were sacrificed by anesthesia 24 hours, 3 days or 7 days after treatment. The first or last weight of each mouse was recorded. Mice carefully obtained blood and liver samples. Liver / body weight ratios were also calculated.
그 결과, 대조군과 팔로이딘 처리(250, 500 ㎍/㎎/1일)한 군 사이의 간 무게에는 유의적인 변화가 없었다. 1 mg/kg/1일 팔로이딘을 7일간 처리했을 때 마우스는 시간대별로 식염수를 처리한 대조군 마우스에 비하여 유의적으로 간 무게가 높음이 관찰되었다. 간 무게 퍼센트는 팔로이딘 처리군은 6.59% ± 0.28%이고, 대조군은 5.44% ± 0.22%이고, 통계학적 차이는 대조군 p < 0.01으로 관찰되었다(도 1).As a result, there was no significant change in liver weight between the control group and the paloidine treated group (250, 500 μg / mg / 1 day). When treated with 1 mg / kg / day paloidine for 7 days, mice were significantly higher in liver weight than the control mice treated with saline at each time period. The liver weight percentage was 6.59% ± 0.28% in the paloidine treated group, 5.44% ± 0.22% in the control group, and statistical differences were observed in the control group p <0.01 (FIG. 1).
<1-2> 조직병리학적 관찰<1-2> Histopathological Observation
상기 실시예 1-1에서 수득된 시험군 또는 대조군 마우스의 간 시료는 10% neutral-buffered formalin으로 고정되었고, paraffin으로 앰배드하였다. 섹션(4 ㎛ 두께)은 RM2165 마이크로톰(Lerica, Germany)를 이용하여 수행되었으며, hematoxylin 및 eosin(H&E)으로 염색하였고, 광학 현미경(Nikon E400, Japan)으로 관찰하였다. 이때 소엽(lobule)의 중심소엽성 영역(centrilobular region) 근처의 간세포가 비교되었다. Liver samples of the test or control mice obtained in Example 1-1 were fixed with 10% neutral-buffered formalin and were amplified with paraffin. Sections (4 μm thick) were performed using RM2165 microtomes (Lerica, Germany), stained with hematoxylin and eosin (H & E) and observed with an optical microscope (Nikon E400, Japan). At this time, hepatocytes near the centrilobular region of the lobules were compared.
그 결과, 250 및 500 ㎍/㎎ 농도에서 1 및 3일 처리한 팔로이딘을 처리한 마우스의 간에서는 유의적인 조직병리학적 변화는 관찰되지 않았다(도 2B 및 C). 그러나 1 mg/kg/1일 농도로 팔로이딘을 처리한 실험군 마우스에서 7일간 처리했을 때 적은 중심소엽성 비대가 관찰되었다. 또한, 대조군 마우스의 중심소엽성 지역과 비교했을 때 간세포의 수가 줄어들고, 중심소엽성 지역의 세포 크기가 증가함을 관찰하였다. 관찰 결과는 최소(minimal: +) 또는 가벼움(mild: ++)로 표현되었다(표 1 및 도 2D).As a result, no significant histopathological changes were observed in the livers of mice treated with paloidine treated at 1 and 3 days at 250 and 500 μg / mg concentrations (FIGS. 2B and C). However, small central lobular hypertrophy was observed after 7 days of treatment in mice treated with paloidine at a concentration of 1 mg / kg / day. In addition, it was observed that the number of hepatocytes decreased and the cell size of the central lobules increased compared with the central lobules of the control mice. Observations were expressed in minimal (+) or light (mild: ++) (Table 1 and FIG. 2D).
(Centrilobular hypertrophy)Central lobular hypertrophy
(Centrilobular hypertrophy)
<1-3> 생화학적 분석<1-3> biochemical analysis
혈액은 하대정맥(inferior vena cava)에서 수득하였다. 세럼은 원심분리로 분리되었다. ALT(Alanine aminotransferase), AST(aspartate aminotransferase), ALP(alkaline phosphatease) 활성 및 DBIL(direct bilirubin)을 자동 임상 화학 분석기(Fuji Dri-Chem 3500s; Fujifilm, Japan)를 이용하여 각 시간대에서 검출하였다. 데이터는 5개 시료의 mean±SD로 표현하였다. 다양한 실험군간의 통계적 유의성 은 Dunnett 시험에 의한 one-way ANOVA(analysis of variance)값으로 유의성은 p값이 0.05 이하이다.Blood was obtained from the inferior vena cava. The serum was separated by centrifugation. Alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), alkaline phosphatease (ALP) activity, and direct bilirubin (DBIL) were detected at each time point using an automated clinical chemistry analyzer (Fuji Dri-Chem 3500s; Fujifilm, Japan). Data is expressed as mean ± SD of five samples. The statistical significance between various experimental groups is the one-way ANOVA (Analysis of Variance) value by Dunnett test.
그 결과, AST의 유의적인 변화를 관찰할 수 없었으나(도 3A), 1 mg/kg/1일 처리군에서 각 시간대마다 ALT 레벨이 상승됨이 관찰되었다(도 3B). ALP 레벨은 모든 농도의 처리군에서 현저하게 시간 의존적으로 증가됨이 관찰되었고(도 3C). DBIL의 세럼 레벨 증가는 1 mg/kg 팔로이딘 처리 마우스에서 발견되었다(도 3D). 가장 높은 값은 1 mg/kg 팔로이딘을 7일간 처리한 마우스에서만 관찰되었다.As a result, a significant change in AST could not be observed (FIG. 3A), but in the 1 mg / kg / day treatment group, the ALT level was increased at each time point (FIG. 3B). ALP levels were observed to be markedly time dependently increased in all concentration groups (FIG. 3C). An increase in serum level of DBIL was found in 1 mg / kg paloidine treated mice (FIG. 3D). The highest value was observed only in mice treated with 1 mg / kg paloidine for 7 days.
상기 결과를 토대로 본 발명자들은 팔로이딘 처리 농도를 1 mg/kg으로 정하고 1, 3 및 7일간 투여한 마우스에서 간을 수득한 후 마이크로어레이 칩 분석을 수행하였다.Based on the above results, the present inventors performed a microarray chip analysis after obtaining liver from mice administered with 1, 3 and 7 days of palosidin treatment concentration of 1 mg / kg.
<실시예 2> 마이크로어레이 칩 분석Example 2 Microarray Chip Analysis
<2-1> 전체 RNA 분리<2-1> Total RNA Isolation
마우스의 간의 좌외엽(left lateral lobe)을 제거하고 RNA 추출을 수행하였다. cDNA 마이크로어레이 분석을 위하여 전체 RNA는 Trizol 시약(Invitrogen, USA)을 이용하여 추출하였고, RNeasy total RNA isolation kit(Qiagen, Germany)를 이용하여 제조사의 방법대로 수행하였다. 전체 RNA는 NanoDrop ND-1000(NanoDrop, USA)으로 정량되었고, 순도는 2100 Bioanalyzer(Agilent, Germany)를 이용하여 평가되었다.The left lateral lobe of the liver of the mouse was removed and RNA extraction was performed. For cDNA microarray analysis, total RNA was extracted using Trizol reagent (Invitrogen, USA), and performed according to the manufacturer's method using RNeasy total RNA isolation kit (Qiagen, Germany). Total RNA was quantified with NanoDrop ND-1000 (NanoDrop, USA) and purity was assessed using 2100 Bioanalyzer (Agilent, Germany).
<2-2> cDNA 마이크로어레이 혼성화 <2-2> cDNA Microarray Hybridization
마이크로어레이 분석을 위하여 형광-표지된 cDNA는 Superscript Ⅱ(Invitrogen, USA)를 이용하여 Cy3-dUTP 또는 Cy5-dUTP(NEN)이 존재하에 전체 RNA의 역전사를 수행하여 제작하였다. 단일가닥 cDNA 프루브는 PCR purification kit(Qiagen, Germany)을 이용하여 정제하였다. 프루브는 혼성화 용액[50% formamide, 5X saline-sodium citrate buffer(SSC), 0.1% sodium dodecyl sulfate(SDS)]에 용해하였다. 마우스 올리고 칩 10K(GenomicTree, Korea)를 형광-표지된 cDNA와 42℃, 16시간 동안 습윤 챔버에서 혼성화시켰다.Fluorescently-labeled cDNA for microarray analysis was prepared by performing reverse transcription of total RNA in the presence of Cy3-dUTP or Cy5-dUTP (NEN) using Superscript II (Invitrogen, USA). Single-stranded cDNA probes were purified using a PCR purification kit (Qiagen, Germany). Probes were dissolved in hybridization solution [50% formamide, 5X saline-sodium citrate buffer (SSC), 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS)]. Mouse oligo chip 10K (GenomicTree, Korea) was hybridized with fluorescently-labeled cDNA in a humid chamber at 42 ° C. for 16 hours.
<2-3> 형광 스팟 분석<2-3> fluorescence spot analysis
실시예 2-2에서 혼성화된 마우스 올리고 칩 10K의 세척을 수행한 후 올리고 칩은 Axon GenPix 4000B(Axon Instrument, USA)를 이용하여 스캔하였다. 스캔한 이미지는 GenePix 3.0 softwear(Axon Instrument)로 계산되었고, GeneSpring Softwear version 7.0(Slilcon Genetics, USA)로 분석되었다. 유전자 발현비는 LOWEES regression에 의해 평균화되었다(Yang, Y. H., et al., 2001.NucleicAcidsRes. 30(4):e15). 본 발명자들은 분석 중 팔로이딘 처리 후 대조군과 비교했을 때 발현이 2배 유도 또는 2배 억제된 유전자만이 통계적 유의성이 있다고 판단되었다. 대조군과 처리군 사이의 통계적 차이는 Student's test를 이용하여 결정하였다. 통계적 유의성은 p값이 <0.05이다. After performing the washing of the hybridized mouse oligo chip 10K in Example 2-2, the oligo chip was scanned using Axon GenPix 4000B (Axon Instrument, USA). Scanned images were calculated with GenePix 3.0 softwear (Axon Instrument) and analyzed with GeneSpring Softwear version 7.0 (Slilcon Genetics, USA). Gene expression ratios were averaged by LOWEES regression (Yang, YH, et al., 2001. Nucleic Acids Res . 30 (4): e15). We determined that only genes with 2-fold induction or 2-fold inhibition of expression were statistically significant as compared to the control group after paloidine treatment in the analysis. Statistical differences between the control and treatment groups were determined using the Student's test. Statistical significance was p-value <0.05.
<2-4> 클러스터 분석 및 데이터 주석<2-4> Cluster Analysis and Data Annotation
유의적으로 다르게 조절되는 유전자는 GeneSpring software를 이용하여 분석하였다. 계층적 클러스터링으로 유전자 발현 패턴을 작성하였다. 정보는 다른 데이터 베이스(NCBI의 Unigene 또는 NetAffx analysis Center)에서 수득하였다.Significantly differently regulated genes were analyzed using GeneSpring software. Gene expression patterns were created by hierarchical clustering. Information was obtained from another database (NCBI's Unigene or NetAffx analysis Center).
그 결과, 10,000개의 프루브 중 전체 3791 유전자가 검출되었다. 308개 유전자가 Student's t test(p 값은 0에서 0.05)에서 분류되었으며, 165개 유전자가 최종적으로 선택되었다(표 2). 대조군과 실험군 마우스의 비교한 DEG(differentially expressed gene)에서 유전자 발현의 유의적 변화는 표현형 변화가 시간 요인보다 더 유의적임을 증명하였다(도 4).As a result, a total of 3791 genes were detected among 10,000 probes. 308 genes were classified in the Student's t test (p values ranged from 0 to 0.05) and 165 genes were finally selected (Table 2). Significant changes in gene expression in differentially expressed genes (DEGs) compared to control and experimental mice demonstrated that phenotypic changes were more significant than time factors (FIG. 4).
마이크로어레이 데이터를 좀 더 분리하기 위하여, 본 발명자들은 QT (quality threshold>0.95) clustering을 수행하였다. QT는 높은 수준의 클러스터를 통해 유전자를 그룹핑하는 방법이다. In order to further separate the microarray data, the inventors performed QT (quality threshold> 0.95) clustering. QT is a way of grouping genes through high-level clusters.
그 결과, 45개의 유전자가 비슷한 유전자 프로필을 보여주었다(표 3 및 도 5). 이를 통해 상기 유전자가 시간 의존적으로 유전자 발현이 증가함을 알 수 있다. 표 3의 유전자emfd,s 대조군과 비교했을 때 1 mg/kg의 팔로이딘을 적용한 후 마우스 간에서 유의적(P < 0.05)으로 변화한 유전자에 대한 것이다. 흥미롭게도 많은 액틴-결합 단백질 및 액틴 중합화에 연관된 다른 요소(regulator, actin-depolymerizingfactor)가 팔로이딘 처리하에 유도됨을 알 수 있다. As a result, 45 genes showed similar gene profiles (Table 3 and FIG. 5). It can be seen that the gene is time-dependently increased gene expression. The genes of Table 3 are for the genes changed significantly (P <0.05) in mouse liver after applying 1 mg / kg of paloidine compared to the emfd, s control. Interestingly, it can be seen that many actin-binding proteins and other regulators (actin-depolymerizingfactors) involved in actin polymerization are induced under paloidine treatment.
또한 본 발명자들은 t-test 및 배(fold) 차이 필터링된 165 유전자가3종류의 시간대에서 다르게 조절되며, 유전자 대부분이 3개의 주요 대사경로 즉 액신 세포골격, 타이트 정션 및 국소 유착의 조절로 분류됨을 확인하였다(도 5). The inventors also found that the t-test and fold differential filtered 165 genes are regulated differently in three types of time zones, and that most of the genes are classified into three major metabolic pathways, namely axon cytoskeleton, tight junctions and local adhesion control. It was confirmed (FIG. 5).
도 1은 실험군 마우스 및 대조군 마우스의 간 무게 변화를 표시한 그래프이다.1 is a graph showing the change in liver weight of experimental mice and control mice.
도 2는 실험군 마우스와 대조군 마우스의 조직병리학적 관찰 결과이다:2 shows histopathological observations of experimental and control mice:
A : 대조군;A: control group;
B : 1 mg/kg 1일 팔로이딘 투여;B: 1 mg / kg daily paloidine administration;
C : 1 mg/kg 3일 팔로이딘 투여;C: 1 mg /
D : 1 mg/kg 7일 팔로이딘 투여; 및D: 1 mg /
CV : 중심정맥.CV: central vein.
도 3은 실험군 마우스 세럼 상의 AST, ALT, ALP 및 DBIL의 농도를 측정한 그래프이다.Figure 3 is a graph measuring the concentration of AST, ALT, ALP and DBIL on experimental mouse serum.
도 4는 발현 변화가 있는 유전자들을 표현형 및 시간대 기준으로 정열한 결과를 나타낸 다이아그램이다.Figure 4 is a diagram showing the results of sorting genes with expression changes on the basis of phenotype and time zone.
도 5은 발현 변화가 있는 유전자들의 데이터를 분석하여 클러스터링한 결과이다.5 is a result of clustering by analyzing data of genes with expression changes.
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