KR101379318B1 - 미더덕 유래 항균 펩타이드의 신규한 유사체 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항균 활성을 가지는 항균 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 기존에 알려진 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 9번 및 12번째 아미노산에 위치한 이소루신(Isoleucine, I)을 라이신(Lysine, K)으로 치환된 항균 펩타이드 및 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 항균 펩타이드는 이를 유효성분으로 함유하는 항균 또는 방부용 조성물, 항생용 약학적 조성물, 병원성 세균감염의 예방 및 치료용 약학적 조성물, 항생용 식품첨가제로 제공될 수 있다.

Description

미더덕 유래 항균 펩타이드의 신규한 유사체 및 이의 용도{Novel analogues of antibacterial peptide derived from Styela clava and the use thereof}

본 발명은 항균 펩타이드 및 그의 용도에 관한 것으로, 상세하게는 기존에 알려진 서열번호 1로 기재되는 미더덕에서 유래한 항균 활성을 갖는 항균 펩타이드의 9번째 및 12번째 아미노산에 위치한 이소루신(Isoleucine, I)을 라이신(Lysine, K)으로 치환하여 합성된 신규한 항균 펩타이드 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

항생제는 살아있는 유기물에서 추출한 것으로 다른 미생물의 생장을 억제하거나 죽이는 물질을 말한다. 1928년 플레밍(A. Fleming)이 페니실린을 처음 발견하고, 1943년 스트렙토마이신이 발견된 후 약 5천여 종 이상의 항생물질이 발견됐고, 50여 종의 항생제가 400여 종의 제제로 개발되어 임상에서 사용되고 있다. 기존 항생제는 주로 다음과 같은 기작으로 미생물의 생장을 억제하거나 사멸시킨다. 1) 세포벽의 합성을 차단(Cycloserine, Vancomycin, Bacitracin, Penicillin, Cephalos포린(porin), Monobactam, Carbapenem , Ampicillin), 2) 세포막 구조를 파괴(Polymyxin), 3) 대사작용 억제(Trimethroprim, Sulfonamide), 4) DNA 또는 RNA 합성 억제(Actinomycin, Nalidixic acid, Ciprofloxacin, Novobiocin, Rifampin, Streptovaricin), 5) 단백질 합성 억제(Erythromycin, Chloramphenicol, Clindamycin, Lincomycin, Tetracycline, Streptinomycin, Streptomycin,Gentamicin, Kanamycin, Amikacin, Nitrofuran, Mupirocin, Puromycin).

경제성장에 의한 신체활동의 감소는 면역력의 저하를 초래해 박테리아, 곰팜이, 기생충 등과 같은 미생물 감염으로부터 각종 질병의 위험에 노출되어 있으며(Clark GC et al. journal of medical microbiology, 58, 977, 2009), 현재 전 세계적으로 질병 예방과 치료를 위해 다양한 약물을 사용하고 있지만 약물의 오남용은 병원균의 저항성을 증가시켰다. 특히 superbugs로 불리우는 VRE (vancomysin resistant enterococci), MRSA (methicillin resistant Staphylococcus aureus)와 MDRP (multidrug-resistant pathogens)의 증가는 현재 전 세계적인 관심의 대상이다(Jabra-Rizk. et al M. A, PloS pathog, 6 2010, Woo. J. et al J. Food Prot., 73, 2285, 2010).

이러한 항생제의 저항성(resistance)의 증가는 최초 1970년대에 뉴모코커스(Pneumococcus sp.)에서 발견이 되었으며 페니실린의 작용 기작에 대한 중요한 단서를 제공하였다(Tomasz et al., Nature, 227, 138-140, 1970). 내성을 보이는 종은 통상적인 농도의 항생제 존재하에서는 성장을 멈추지만 결과적으로 죽지는 않는다. 내성은 항생제가 세포벽 합성 효소를 저해할 때 오토라이신(autolysin)과 같은 세균의 자가분해(autolytic) 효소의 활성이 일어나지 않기 때문에 생기는데, 페니실린의 경우에 있어서 내인성 가수분해 효소(endogenous hydrolytic enzymes)를 활성화함으로써 세균을 죽이지만, 효소의 활성을 억제하여 항생제 치료 시에도 생존하는 결과를 나타내게 된다.

항생제에 대한 내성(tolerance)은 항생제에 대한 저항성(resistance)과는 구별되는 현상인데, 1970년대에 뉴모코커스(Pneumococcus sp.)에서 최초로 발견이 되었으며 페니실린의 작용 기작에 대한 중요한 단서를 제공하였다(Tomasz et al.,Nature, 227, 138-140, 1970). 내성을 보이는 종은 통상적인 농도의 항생제 존재하에서는 성장을 멈추지만 결과적으로 죽지는 않는다.

세균이 항생제에 대한 내성을 가지는 것은 임상적으로 대단히 중요한데, 이는 내성 세균을 박멸하는 것이 불가능하게 되면 임상적인 감염에서 항생제 치료의 효용이 떨어지기 때문이다(Handwerger and Tomasz, Rev. Infec . Dis., 7, 368-386, 1985). 아울러, 내성은 항생제에 대한 세균의 저항성이 발생할 선행조건이라고 간주하는데, 이것은 항생제 치료에도 살아남는 균주가 생기기 때문이다. 이러한 균주는 항생제에 저항성을 가지는 새로운 유전 요소를 획득해서 항생제의 존재하에서도 계속 성장하게 된다. 실제로 항생제에 대한 저항성을 보이는 모든 세균들은 그 항생제에 대한 내성도 있는 것으로 알려져 있으므로(Liu and Tomasz, J. Infect . Dis., 152, 365-372, 1985), 항생제 저항성을 가지는 세균을 죽일 수 있는 신규한 항생제의 개발이 필요하다.

작용 기작의 측면에서 내성은 크게 두 가지로 구분되는데, 첫 번째는 모든 세균에 있어서 성장 속도가 감소할 때 일어나는 외형적(phenotypic) 내성이며(Tuomanen E., Revs . Infect . Dis., 3, S279-S291, 1986), 두 번째는 특정 세균에서 일어나는 돌연변이에 의한 유전적인 내성이다. 두 가지 경우 모두에 있어서 기본적인 현상은, 오토라이신 효소의 활성을 감소시키는 조절(down regulation)이 일어나는 것인데, 이러한 조절은 외부자극에 대한 외형적인 내성일 경우에는 일시적이지만, 세포 용혈을 조절하는 경로의 변화를 야기하는 돌연변이가 일어난 유전적인 내성의 경우에는 영구적이다. 명백하게, 가장 간단한 유전적인 내성의 경우는 오토라이신 효소의 결손으로 생긴 경우인데, 확실하지 않은 여러 가지 이유로, 이러한 자가분해 효소의 결손에 의해 내성을 가지는 균주가 임상적으로 발견된 적은 없으며, 오히려 임상에서 발견되는 내성은 오토라이신 효소의 활성을 외형적으로 조절하는 과정으로 이루어진다(Tuomanen et al., J. infect. Dis., 158, 36-43, 1988).

세균이 항생제에 내성을 가지게 되는 이유는 a)효소에 의한 항생제의 활성화(inactivation), b)표적 물질(target site) 의 변화, c)세포막의 항생제 투과성 변화(permeability), d)세포 외로의 항생제 유출(efflux) 등 다양한 기전이 있다. 세균은 이들 중 한 가지 또는 여러 가지 복합적으로 작용하여 항생제에 내성을 가지게 된다. 효소에 의한 항생제의 불활성화는 beta-lactamase가 그 대표적인 예이다. beta-lactamase는 beta-lactam환을 가수분해하여 이 구조에 의하여 항균력을 발휘하는 약제를 불활성화한다. 그러나 세균이 beta-lactamse를 생성한다 하여 모든 beta-lactam 항생제에 내성이 되는 것은 아니다. 그 예로 beta-lactamase를 생성하는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus )는 이 효소가 분해하는 페니실린, 암피실린, 피페라실린 등에는 내성이 있지만, 이 효소에 안정한 메티실린, 옥사실린, 나프실린 등에는 감수성이 있다. 이는 beta-lactamase의 종류에 따라서 가수분해 할 수 있는 기질(항생제)의 범위가 다르기 때문이다. 아미노글리코사이드(Aminoglycoside)를 불활성화 하는 효소에는 aminoglycoside acetyltransferase, aminoglycoside phosphotransferase, aminoglycoside adenyltransferase들이 있다.

항생제가 결합하는 표적 단백질의 변화시키거나, 표적 단백질을 과량 생성하여 내성을 획득하는 세균도 있다. 스타필로코커스 아우레우스, 스트렙토코커스 뉴모니아등 그람양성 세균 중에는 이 기전에 의해서 beta-lactam 항생제에 대한 내성을 획득하는 경우가 많다. beta-lactam 계열 항생제의 표적은 penicillin-binding protein(PBP)이다. 황색포도상구균은 beta-lactam 항생제와의 친화도가 낮은 새로운 PBP(PBP2)를 생성해서 메티실린에 내성을 가지게 되며 이 유전자를 mec이라고 한다. 스트렙토코커스 뉴모니아(S. pneumoniae)는 기존의 PBP 변성에 의해서 beta-lactam 항생제에 대한 내성을 획득한다. 슈도모나스 아에로지노사(Pseudomonas aeruginosa), 엔테로박테라아속(Enterobacteriaceae)등 그람음성 세균 중에도 이러한 기전에 의해서 beta-lactam 항생제에 대한 내성을 획득한 세균이 있다. 반코마이신(Vancomycin)-내성 엔테로코커스(Enterococcus)(VRE) 또한 표적 물질의 변성에 의하여 vancomycin에 대한 내성을 획득하는 예이다. 반코마이신은 펩티도글리칸(peptidoglycan) 전구체의 N-terminal D-Ala-D-Ala와 결합하여서 PBP가 이 부위에 결합하지 못하게 한다. 이 결과 세균은 펩티도글리칸 중합에 의한 세포벽 합성을 하지 못하게 된다. 그러나 VRE의 N-terminal은 D-Ala-D-Lac 등으로 변화되어서 반코마이신과의 친화도가 1/1,000 이하로 감소되며, 이로 인해 반코마이신에 대한 내성을 획득하는 것으로 알려져 있다. 퀴놀론의 표적부위인 DNA gyrase와 topoisomerase IV의 돌연변이로 퀴놀론 결합이 이루어지지 못해 내성이 발생하게 된다.

포린(porin)은 세포 외막에 존재하는 단백질로 그람 음성세균에만 존재한다. 포린(porin)은 영양물질을 받아들이고, 대사산물을 내 보내는 통로로 대부분의 항생제는 이 구조를 통해서 세포 내로 들어간다. 대장균(E. coli)의 외막에는 여러 종류의 포린(porin)이 있지만, 항생제는 주로 OmpF와 OmpC를 투과한다. 항생제의 포린(porin) 투과도는 항생제 분자의 전하(charge), 소수성(hydrophobicity) 및 분자량에 따라 결정된다. 음성 전하의 분자는 양성 혹은 양성 전하의 분자에 비하여 포린(porin)을 통과하는 속도가 느리다. 또한 소수성 분자는 친수성(hydrophilic) 분자에 비해서, 분자량이 큰 항생제는 분자량이 작은 항생제에 비해서 popin을 잘 투과하지 못한다. 메티실린은 소수성이기 때문에 포린(porin)을 잘 투과하지 못하며, 따라서 그람음성 세균에 대한 항균력이 없다. 이와 같이 그람 음성 간균에서는 포린(porin)이 항생제 감수성에 많은 영향을 미치며, 포린(porin)이 소실 혹은 변화되면 항생제에 대한 내성 정도가 높아지게 된다.

세포 내로 유입된 항생제를 능동적으로 세포 외로 유출하는 세균도 있다. 이 내성 기전은 리보좀의 단백질 생성을 저해하는 테트라사이클린이나 마코라이드에 내성인 세균과 DNA gyrase의 활성을 억제하는 퀴놀론에 내성인 세균에서 볼 수 있다. 녹농균(P. aeruginosa) 세포 외막의 OprK 단백질은 세포 내의 독성 성분을 세포 외로 유출하는 기능을 가지고 있으며, 이 단백질을 다량 발현하는 변이주는 유출에 의해서 시플로사신(ciprofloxacin), 날리딕스산(nalidixic acid), 테트라사이클린(tetracycline), 클로람페니콜(chloramphenicol) 등 여러 항생제에 내성을 가지게 된다. 이와 같이 능동적인 유출에 의해서 여러 가지 항생제에 대한 내성을 획득하는 기전은 다제내성 펌프(multidrug resistance pump, MDR)라 불린다. MDR 펌프는 S. aureus 등의 그람양성 세균, E. coli , P. aeruginosa 등 그람음성 세균뿐 아니라, 진균인 Candida albicans, 원충인 Plasmodium falciparum 등도 가지고 있다. S. aureus의 MDR 펌프로는 NorA, QacA, QacB 등이 알려져 있다. QacA 단백을 다량 발현하는 균주는 클로로헥시딘(chlorhexidine)에, NorA를 다량 발현하는 균주는 퀴놀론(quinolone)에 내성이다. E. coli의 MDR 펌프로는 EmrAB 등이 알려졌는데, 이 단백질을 다량 발현하는 균주는 날리딕스산(nalidixic acid)과 티오락토마이신(thiolactomycin)에 내성이다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 항생제에 대한 저항성을 나타내는 세균을 제거하기 위하여 새로운 항생제의 개발이 필요하며, 오토라이신 효소의 활성과는 독립적으로 작용하는 새로운 항생제의 개발이 필요하다

항균 펩타이드가 병원균에 작용하는 기작은 기존 항생제들의 작용기전과 매우 다르다. 이들은 주로 미생물의 세포표면에 결합한 후, 세포막에 pore를 형성함으로써 세포막의 정상적 투과특성을 교란하여 병원체를 빠른 속도로 죽게 한다(Pharmacol. Rev. 55: 27-55, 2003). 또한 이들은 병원체의 내독성 인자로 인해 초래되는 패혈증을 방지할 수 있다고 알려져 있으며(Biochim. Biophys. Acta. 1562: 32-36, 2002), 고등동물체내에서 후천성면역반응을 매개하는 신호분자로서도 작용한다고 보고되었다(J. Leukoc. Biol. 60: 415-422, 1996). 이러한 특성으로 인해 항균 펩타이드는 항생제 내성균을 제어할 수 있는 신규 항생제나 새로운 생체면역활성인자로 이용할 수 있을 것으로 주목받고 있다. 이에 그 동안 기존 항생제를 대체할 수 있는 항생물질을 찾기 위해 다양한 생물체에서 펩타이드성 항생물질이 분리되어 시험 되었다. 그러나 실제 제품화되어 사용되고 있는 사례는 극히 드문데, 이는 펩타이드 항생제가 생체내에 주입되었을 때의 안정성이나 인체에 대한 안전성의 문제가 제기되었기 때문이다. 이러한 난점을 해결하기 위해서는 항균 또는 항진균 활성을 갖는 펩타이드들의 아미노산 서열과 구조를 비교 분석하여 인체에는 위해를 가하지 않으면서 효율적으로 미생물을 사멸시킬 수 있는 구조를 알아내야 한다. 이를 위해서는 지금까지 보고된 것 이상의 다양한 항생제 활성 펩타이드의 아미노산 서열과 구조에 대한 정보가 필요한 실정이다.

한편, 곤충, 동물 그리고 해양생물 등은 항균 펩타이드를 자체적으로 생산할 수 있는데(Bevins et al., Ann. Rev. Biochem., 59, 395-414, 1990), 구조에 따라 세 개의 그룹으로 나눌 수 있다. 첫 번째는 시스테인이 풍부한 (cysteine-rich) -병풍(sheet)구조 펩타이드이고, 두 번째는 -나선형(helical)구조의 양친화성 펩타이드 분자이며, 세 번째는 프롤린이 풍부한(proline-rich) 펩타이드이다(Mayasaki et al., Int. J. Antimicrob. Agents, 9, 269-280, 1998). 이들 항균 펩타이드들은 숙주 방어 및 선천적 면역계에 있어서 중요한 역할을 담당한다고 알려져 있다(Boman, H. G., Cell, 65:205, 1991; Boman, H. G., Annu. Rev. Microbiol., 13:61, 1995). 또한, 상기 항균 펩타이드들은 아미노산 서열에 따라 다양한 구조를 갖는다.

미더덕(Styela clava)은 척색동물문 미색동물아문에 속하는 해양생물로서, 1980년대 중반부터 본격적인 양식이 시작되면서 어민의 소득 증대에 기여하고 있다(농림부 통계 연보, p.291. 1993). 그리고, 미더덕은 우리나라 전역에서 발견되는 해양생물로서, 특히 경상남도 마산시에서 우리나라 소비량의 80%정도를 생산하고 있다. 독특한 맛과 향긋한 향 때문에 연중 이용되고 있으며, 4월부터 7월 사이가 생산량이 가장 많은 시기이다. 미더덕의 소비 형태는 주로 찜이나 된장찌개 등의 재료로 식품에 널리 이용되고 있으며, 그 밖에 횟감용으로는 4 ~5월경에 채취된 것이 이용되고 있다. 미더덕에 대한 연구는 스테롤함량(Jo YG. 1978. The sterol composition of Styela clava. Kor Fish Soc 11: 97-101), 계절에 따른 영양성분 조성의 변화(Lee KH, Park CS, Hong BI, Jung BC, Cho HS, Jea YG. 1995. Seasonal variations of nutrients in warty sea squirt (Styela clava). J Korean Soc. Food Nutr 24: 268-273; Ahn SH. 2003. Extraction of glycosaminoglycans from Styela clava tunic. Biotechnol Bioproc Eng 18: 180-185) 등 주로 성분에 대한 연구가 대부분이었으며, 기능성 성분으로 껍질로부터 글루코사미노글리칸(glycosaminoglycan)을 추출한 예(Lehrer RI. 2001. Clavanins and styelins, alpha-helical antimicrobial peptides from the hemocytes of Styela clava. Adv Exp Med Biol 484: 71-76)가 있었다.

그러나 아직까지 본 발명에서와 같이 미더덕 조직에서 유래한 항균 펩타이드의 아미노산 서열 9번과 12번에 위치한 이소루신을 라이신으로 치환함으로써 제조된 서열번호 2(CSP-4)로 기재되는 신규 펩타이드에 대한 발명은 없었다.

이에, 본 발명자들은 기존에 알려진 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 항균 펩타이드로부터 9번과 12번에 위치한 이소루이신(Isoleucine, I)을 라이신(Lysine, K)으로 치환함으로써 제조된 서열번호 2(CSP-4)로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 신규 펩타이드를 제조하였다. 본 발명의 항균 펩타이드는 서열번호 1(Clavaspirin)로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드보다 pH 7.4에서 뭉침 현상이 현저히 줄어들며, 낮은 세포독성을 갖으며, 항균 활성은 pH에 제한을 받지 않는 효과를 가진다. 또한 서열번호 2를 가지는 항균 펩타이드(CSP-4)는 pH 7.4에서 박테리아 막 작용 활성이 pH 5.5와 비교 결과 빠른 작용을 보이는 것으로 기존에 알려진 서열번호 1로 기재되는 항균 펩타이드(clavaspirin)에 히스티딘(Histidine) 잔기가 많이 함유되어 있어 pH 6.04보다 낮을시 양이온 전극(cation charge)의 증가로 세포막에 강한 정전기적 상호작용 (electrostatic interaction)을 보이지만 pH 7.4에서는 히스티딘(Histidine)의 영향을 받지 않으므로 pH 7.4에서 서열번호 2로 기재되는 본 발명의 항균 펩타이드가 더 빠른 세포막 작용을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 9번 및 12번째 아미노산에 위치한 이소루신(Isoleucine, I)을 라이신(Lysine, K)으로 치환된 항균 펩타이드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균 또는 방부용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항생용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 병원성 세균 감염의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항생용 식품첨가제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 9번 및 12번째 아미노산에 위치한 이소루신(Isoleucine, I)이 라이신(Lysine, K)으로 치환된 항균 펩타이드를 제조하여, 낮은 세포독성 및 pH에 제한을 받지 않는 항균 활성을 가지는 신규한 항균 펩타이드를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균 또는 방부용 조성물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항생용 약학적 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 병원성 세균 감염의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항생용 식품첨가제를 제공한다.

본 발명에 따른 기존에 알려진 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 9번 및 12번째 아미노산에 위치한 이소루신(Isoleucine, I)을 라이신(Lysine, K)으로 치환된 항균 펩타이드는 서열번호 1(Clavaspirin)로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드보다 pH 7.4에서 뭉침 현상이 현저히 줄어들었고, 낮은 세포독성을 갖으며, 항균 활성은 pH에 제한을 받지 않고, pH 7.4에서 박테리아 막 분해 활성이 pH 5.5와 비교 결과 빠른 활성을 보이는 것으로 Clavaspirin 펩타이드에 히스티딘(Histidine) 잔기가 많이 함유되어 있어 pH 6.04보다 낮을시 양이온 전극(cation charge)의 증가로 세포막에 강한 정전기적 상호작용(electrostatic interaction)을 보이지만 pH 7.4에서는 히스티딘(Histidine)의 영향을 받지 않으므로 pH 7.4에서 더 빠른 세포막 분해 활성을 가진다.

도 1은 모체 항균 펩타이드(Clavaspirin)와 본 발명에서 제조한 항균 펩타이드(CSP-4)를 pH 5.5와 pH 7.4에서 뭉침 현상을 통한 빛의 산란의 정도를 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명에서 제조한 항균 펩타이드(CSP-4)와 모체 항균 펩타이드(Clavaspirin)가 세포막에 미치는 영향을 pH 5.5와 pH 7.4에서 확인하여 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명에서 제조한 항균 펩타이드(CSP-4)와 모체 항균 펩타이드의 세포막 분해를 나타낸 그림으로 (A) pH 5.5이고 (B) pH 7.4이며, 각각의 위쪽은 모체 항균 펩타이드이며, 아래쪽은 본 발명에서 제조한 펩타이드를 나타낸다.

이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 9번 및 12번째 아미노산에 위치한 이소루신(Isoleucine, I)을 라이신(Lysine, K)으로 치환된 항균 펩타이드를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 항균 펩타이드가 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 항균 펩타이드를 제공한다.

본 발명의 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열은 미더덕(Styela clava)에서 유래한 항균 펩타이드(Clavaspirin)로 당업계에 알려진 통상의 펩타이드 합성 방법에 의해 제조가 가능하며, 제조 방법이 특별히 한정되지 않는다.

기존의 알려진 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 모체 펩타이드인 Clavaspirin의 NMR 나선 구조 확인결과 펩타이드의 소수성(Hydrophobic)을 나타내는 부위로 9번과 12번에 나란히 위치한 두 개의 이소루이신(Isoleucine, I)에 의해 강한 소수성의 증가는 펩타이드와 펩타이드간에 소수성 상호작용(Hydrophobic interaction)으로 중성 pH에서 꼬인 코인(Coiled-coli)구조 형성에 의한 펩타이드의 뭉침 현상을 나타낸다. 서열번호 1로 기재된 항균 펩타이드(Clavaspiein)는 낮은 pH 환경에서 그람 양성균과 그람 음성균에 강한 활성을 보이지만 중성인 pH 환경에서는 낮은 활성과 정상 세포에 강한 세포독성이 일어난다.

이에, 본 발명의 일실시예에 있어서, 메리필드(Merrifield)의 액상 고상법 (Merrifield, RB., J.Am. Chem. Soc., 85, 2149, 196)에 따라, 모체 펩타이드의 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열의 나란히 위치한 두 개의 이소루신(Isoleusine, I)을 소수성이 낮은 라이신(Lysine, K)으로 치환하여 서열번호 2로 개재되는 아미노산 서열을 가지는 CSP-4 펩타이드를 제공한다(표 1참조). 본 발명의 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 항균 펩타이드는 당업계에 알려진 통상의 펩타이드 합성 방법에 의해 제조가 가능하며, 제조 방법이 특별히 한정되지 않는다.

본 발명의 상기 라이신(Lysine, K)은 이외에도, 양전하 아미노산인 아르기닌(Arginine, R) 또는 히스티딘(histidine, H)으로 치환이 가능하며, 바람직하게는 라이신(Lysine, K)이다.

본 발명에 따른 상기 항균 펩타이드(CSP-4)는 모체 펩타이드인 클라바스피린(Clavaspirin)과 대조결과 뭉치는 현상과 세포독성이 현저히 감소하고, pH에 영향을 받지 않는 강한 항균 활성을 나타낸다.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 9번 및 12번째 아미노산에 위치한 이소루신(Isoleucine, I)을 라이신(Lysine, K)으로 치환된 항균 펩타이드가 그람 음성균 또는 그람 양성균에 대해 항균 활성을 가지는 항균 펩타이드를 제공한다.

상기 그람 음성균은 예를 들면, 이에 한정되는 것은 아니지만 보데텔라속(The Genus Bordetella), 슈도모나스속(The Genera Pseudomonas), 버크홀데리아속(The Genus Burkholderia), 에어로모나스속(The Genera Aeromonas), 플레시오모나스속(The Genera Plesiomonas), 비브리오속(The Genera Vibrio), 모락셀라속(The Genera Moraxella), 네이세리아속(The Genera Neisseria), 악티노바실러스속(The Genus Actinobacillus), 만하이미아속(The Genera Mannheimia), 파스테우렐라속(The Genera Pasteurella), 해모필러스속(The Genera Haemophilus), 히스토필러스속(The Genera Histophilus), 테일로렐라속(The Genera Taylorella), 브루셀라속(The Genus Brucella), 프란시셀라속(The Genus Francisella), 에스케리시아속(The Genus Escherichia), 시겔라속(The Genus Shigella), 클레비시엘라속(The Genera Klebsiella), 엔테로박터속(The Genera Enterobacter), 시트로박터속(The Genera Citrobacter), 프로테우스속(The Genera Proteus), 모가넬라속(The Genera Morganella), 에드워드시엘라속(The Genera Edwardsiella), 살모넬라속(The Genus Salmonella) 또는 여시니아속(The Genus Yersinia)을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 대장균(Escherichia coli) 또는 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris)이다.

상기 그람 양성균은 예를 들면, 이에 한정되는 것은 아니지만 악티노마이스속(The Genera Actinomyces), 아카노박테리움속(The Genera Arcanobacterium), 바실러스속(The Genus Bacillus), 코리니박테리움속(The Genus Corynebacterium), 더마토필러스속(The Genera Dermatophilus), 노카디아속(The Genera Nocardia), 리스테리아속(The Genera Listeria), 에리시펠로트릭스(The Genera Erysipelothrix), 마이코박테리움속(The Genus Mycobacterium) 또는 로도코커스속(The Genus Rhodococcus)을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 리스테리아 모노사이토젠스(Listeria monocytogenes) 또는 스타필로코커스 에피더미스(Staphylococcus epidermidis)이다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 항균 펩타이드인 CSP-4가 항균 균활성을 나타내는지 알아보기 위해 다양한 박테리아 균주에 대한 생육 최소저해농도(Minimal Inihibitory Concentration; 이하. MIC)를 측정하였다. 그 결과 본 발명의 항균 펩타이드는 그람 음성균인 대장균(Escherichia coli) 및 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris)에 대하여 pH에 관계없이 높은 항균 활성을 보였고, 그람 양성균인 리스테리아 모노사이토젠스(Listeria monocytogenes) 또는 스타필로코커스 에피더미스(Staphylococcus epidermidis)에 대해서도 pH에 관계없이 높은 항균 활성을 보였다.

본 발명은 항균 펩타이드(CSP-4)가 산성, 중성, 알칼리성에서 항균 활성을 보이는 항균 펩타이드를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 서열번호 1로 기재되는 모체 펩타이드(Clavaspirin)는 pH 6.2 또는 pH 7.4 이상에서 항균 활성이 현저하게 떨어진다. 또한 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 모체 펩타이드의 뭉침 현상을 형광광도 측정기를 이용하여 측정한 결과 pH 7.4에서 뭉침 현상이 증가한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 항균 펩타이드는 pH 7.4에서 항균 활성이 모체 펩타이드 항균 활성의 8배 내지 16배 였으며, pH 4 내지 10에서 모체 펩타이드보다 더 높은 항균 활성을 보이고, 바람직하게는 pH 6 내지 8.5이고 더더욱 바람직하게는 pH 7.4이다. 또한 pH 7.4에서 뭉침 현상의 증가도 관찰되지 않는다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 항균 펩타이드인 CSP-4 펩타이드가 세포막에 관한 작용을 확인하기위하여 pH 5.5와 pH 7.4에서 배양된 대장균 세포에 사이톡스-그린(SYTOX-Green)을 처리하여 15분에서 20분가량 빛이 들어오지 않는 배양기에서 반응을 시킨 후 펩타이드를 최소 억제 농도에서 처리하여 세포막에 작용을 측정을 하였다. 그 결과 본 발명의 항균 펩타이드(CSP-4)는 모체인 Clavaspirin 펩타이드에 비해 pH 5.5와 pH 7.4에서 강한 형광의 증가로 본 발명의 항균 펩타이드가 세포막에 강한 작용을 나타냈다. 따라서, 본 발명의 항균 펩타이드인 CSP-4 펩타이드는 pH 5.5와 pH 7.4에서 세포막에 강한 작용으로 pH에 영향을 받지 않음을 알 수 있었다(도 2 참조). 또한 상기 pH 조건 외에도 pH 4.0, pH 6.2, pH 8.5, pH 9.8에서도 측정한 결과 본 발명의 항균 펩타이드(CSP-4)는 산성, 중성, 염기성에서 빠른 박테리아 막 분해 작용을 가짐을 알 수 있었다(표 8 참조). 본 발명의 항균 펩타이드는 pH 7.4에서 빠른 박테리아 막 분해 활성을 보이는데, 이는 모체 펩타이드에 히스티딘 잔기가 많이 함유되어 있어 pH 6.04보다 낮을시 양이온 전극의 증가로 세포막에 강한 정전기적 상호작용을 보이지만, 본 발명의 항균 펩타이드는 pH 7.4에서는 히스티딘의 영향을 받지 않지 않기 때문이다.

따라서 본 발명에 따른 항균 펩타이드는 산성, 중성, 염기성에서 항균 활성을 보이며, 바람직하게는 pH 4.0 내지 10이며, 더욱 바람직하게는 pH 6 내지 8.5이고, 더더욱 바람직하게는 pH 7.4이다.

본 발명은 항균 펩타이드(CSP-4)가 세포독성이 현저히 감소된 항균 펩타이드를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 펩타이드의 세포독성을 확인하기 위해, 정상의 사람 혈액을 사용하여 항균 펩타이드에 대한 적혈구 용혈 활성을 측정하였다. 또한 본 발명의 일실시예에 있어서, 사람의 각질 형성 세포주(HaCaT cell line)에 항균 펩타이드를 처리한 후 세포 생존 정도를 확인하였다. 그 결과, 본 발명의 서열번호 2로 기재되는 항균 펩타이드는 서열번호 1로 기재되는 항균 펩타이드에 비해 용혈 작용이 거의 일어나지 않았으며, 높은 농도에서도 세포 생존력이 높게 유지되는 것을 확인하였다.

따라서 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 9번 및 12번째 아미노산에 위치한 이소루신(Isoleucine, I)을 라이신(Lysine, K)으로 치환된 항균 펩타이드를 제공하며, 상기 항균 펩타이드는 그람 양성 및 그람 음성균 모두에 항균 활성을 가지며, 세포독성이 없고, pH 변화에도 항균 활성이 영향을 받지 않는 것을 특징으로 하는 항균 펩타이드를 제공한다.

본 발명은 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균 또는 방부용 조성물로 이용될 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명에 따른 항균 펩타이드는 세포독성이 없으며, pH에 관계없이 그람 음성균 및 그람 양성균에 대하여 항균 활성을 가지므로, 미생물이 증식할 수 있는 모든 물질 및 식품에 있어서 방부용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다. 상기 용도는 식품의 방부용 조성물에 한정되지 않으며, 화장품 보존제, 의약품 보존제 등 항균 활성이 필요한 모든 물질에 미생물의 증식을 억제하는 보존제 등으로 사용이 가능하다.

본 발명은 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항생용 약학적 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 병원성 세균 감염의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명에 따른 항균 펩타이드는 pH에 관계 없이 그람 음성 및 그람 양성균에서 항균 활성을 가지며, 세포독성이 없고, 뭉침현상이 없어 항생용 약학적 조성물 또는 병원성 세균 감염의 예방 및 치료용 약학적 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

상기 본 발명의 항균 펩타이드를 포함하는 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 항균 펩타이드를 0.1 내지 50 중량%로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 조성물은 약제의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여법이라면 어느 것이나 사용 가능하고, 전신 투여 또는 국소 투여가 가능하나, 전신 투여가 더 바람직하며, 정맥 내 투여가 가장 바람직하다.

본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 항균 펩타이드의 유효용량은 1∼2 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.5∼1 ㎎/㎏ 이며, 하루 1 내지 3회 투여될 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항생제는 거환(bolus) 형태 혹은 상대적으로 짧은 기간 동안 확산(infusion) 등에 의해 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 항균 펩타이드의 투여 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수 뿐만 아니라 환자의 나이 및 건강상태 등 다양한 요인들을 고려하여 환자의 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 이 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 연고, 크림등의 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액 등을 비롯하여 약제학적 제제에 적합한 어떠한 형태로든 사용할 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항생용 식품첨가제를 제공한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명에 따른 항균 펩타이드는 pH에 관계 없이 그람 음성 및 그람 양성균에서 항균 활성을 가지며, 세포독성이 없고, 뭉침현상이 없어 항생용 식품첨가제로 유용하게 이용될 수 있다. 또한 본 발명의 항균 펩타이드는 식품첨가제뿐만 아니라 이를 유효성분으로 함유하는 사료첨가제로도 유용하게 이용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 비스켓, 떡, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.

본 발명의 항균 펩타이드는 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 중의 상기 항균 펩타이드의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

본 발명의 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 항균 펩타이드를 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 항균 펩타이드는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 항균 펩타이드는 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 항균 펩타이드 100 중량부 당 0.1 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예, 실험예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명 내용이 하기 실시예, 실험예 및 제조예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 펩타이드의 합성 및 분리정제

본 발명자들은 메리필드(Merrifield)의 액상 고상법 (Merrifield, RB., J.Am. Chem. Soc., 85, 2149, 196)에 따라, 모체 펩타이드의 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 가지는 Clavaspirin(Lee et al., J. peptide Res. 58, 2001/445-456)으로부터 소수성(Hydrophobic) 부분인 9번과 12번 위치에 이소루이신(Isoleucine, I)을 라이신(Lysine, K)으로 치환하여 CSP-4 펩타이드 (서열번호 2)를 합성하였다(표 1).

구체적으로, 본 발명에서 설계한 펩타이드의 카르복실말단이 NH2 형태인 펩타이드는 Rink Amide MBHA-Resin을 출발물질로 사용하였으며, 카르복실말단이 OH 형태의 펩타이드는 Fmoc-아미노산-Wang Resin을 출발물질로 사용하였다.

Fmoc-아미노산의 커플링(coupling)에 의한 펩타이드 사슬(chain)의 연장은 DCC(N-hydroxybenzo triazole(HOBt)-dicyclo-hexycarbodiimide) 법에 의해 실시하였다. 각 펩타이드의 아미노말단의 Fmoc-아미노산을 커플링(coupling) 시킨 후, NMP(20% piperidine/N-methyl pyrolidone) 용액으로 Fmoc기를 제거하고 NMP 및 DCM(dichoromethane)으로 여러 번 씻어준 다음 질소 가스로 건조시켰다. 여기에 TFA(trifluoroacetic acid)-phenol-thioanisole-H2O-triisopropylsilane(85:5:5:2.5:2.5,vol./vol.)용액을 가하고 2~3시간 반응시켜 보호기의 제거 및 레진으로부터 펩타이드를 분리시킨 후, 디에틸에테르(diethylether)로 펩타이드를 침전시켰다. 상기의 방법으로 얻은 크루드(crude) 펩타이드는 0.05% TFA가 포함된 아세토니트릴 농도구배(acetonitrile gradient)에서 정제형 역상(reverse phase, RP)-HPLC 컬럼(Delta Pak, C18300A, 15,19.0mm×30 cm, Waters, USA)을 이용하여 정제하였다. 합성 펩타이드를 6 N HCl로 110℃에서 가수분해한 후 잔사를 감압 농축하고, 0.02 N HCl에 녹여서 아미노산 분석기(Hitachi 8500 A)로 아미노산 조성을 측정하였다. 상기의 방법으로 조성된 펩타이드들의 순도를 확인한 결과 95% 이상의 순도를 나타내었으며, MALDI 질량 분석법(Hill, et al ., Rapid Commun. Mass Spectrometry, 5: 395, 1991)을 이용하여 분자량을 아미노산 서열로부터 계산하여 얻은 분자량과 비교한 결과, 그 값이 일치하는 것을 확인하였다.

펩타이드 서열, 분자량 및 보유 시간

펩타이드	아미노산 서열	분자량	보유 시간
Clavaspirin	FLRFIGSVIHGIGHLVHHIGVAL-NH2 (서열번호 1)	2492.01	35.2
CSP-4	FLRFIGSVKHGKGHLVHHIGVAL-NH2 (서열번호 2)	2522.04	20.2

< 실험예 1> 항균 펩타이드의 항균 활성 분석

본 발명자들은 상기 <실시예 1>의 방법으로 제조된 펩타이드들의 항균 활성을 비교하기 위하여, 균체가 분열되지 않는 펩타이드의 최소 농도인 생육 최소저해농도(MIC) 값을 측정하였다.

구체적으로, 그람 음성균으로 대장균(Escherichia coli), P 불가리스(Proteus vulgaris)를, 그람 양성균으로 L. 모노사이토젠스(Listeria monocytogenes), S. 에피더미스(Staphylococcus epidermidis)를 사용하였으며, 대장균(Escherichia coli )(ATCC 25922), 및 리스테리아 모노사이토젠스(Listeria monocytogenes)(ATCC 19115)는 "American Type Culture Collection"으로부터 분양받았고, 스타필로코커스 에피더미스(Staphylococcus epidermidis)(KCTC 3096), 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris )(KCTC 2433)는 "Korean Collection for Type Cultures"로부터 분양받아, 각 균주를 LB 배지(1% 박토 트립톤, 0.5% 박토 이스트 추출물, 1% 염화나트륨; Sigma, USA) pH 5.5, pH 6.2, pH 8.5 및 pH 9.8에서 중간-로그 상(mid-log phase)까지 배양한 다음 1% 박토 펩톤 배지(Difco, USA)로 5×10⁵세포/100㎕의 균체 농도로 희석하여 마이크로 타이트레이트 플레이트(Nunc, USA)에 접종하였다. 상기 <실시예 1>에서 합성한 본 발명의 항균 펩타이드 및 모체 펩타이드를 각각 96 웰(well)로부터 1/2배씩 pH 5.5, pH 6.2, pH 8.5 및 pH 9.8에서 희석하여 플레이트에 첨가한 후 37℃에서 12시간 동안 배양하였고, 마이크로 타이트레이트 플레이트 판독기(Merck Elisa reader, 독일)를 이용하여 620nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 각 균주의 MIC 값을 결정하였으며, 그 결과를 하기 표 2 내지 표 5에 나타내었다.

대장균(그람 음성균)에 대한 항균 펩타이드의 항균 활성

펩타이드	생육 최소저해 농도 (μM)
	대장균(그람 음성균)
	pH 4.0	pH 5.5	pH 6.2	pH 7.4	pH 8.5	pH 9.8
Clavaspirin	2	2	32	64	128	180
CSP-4	2	2	4	4	16	96

P . 불가리스(그람 음성균)에 대한 항균 펩타이드의 항균 활성

펩타이드	생육 최소저해 농도 (μM)
	P. 블가리스(그람 음성균)
	pH 4.0	pH 5.5	pH 6.2	pH 7.4	pH 8.5	pH 9.8
Clavaspirin	8	8	32	64	80-90	85-100
CSP-4	4	4	8-10	8	24	83

L . 모노사이토젠스(그람 음성균)에 대한 항균 펩타이드의 항균 활성

펩타이드	생육 최소저해 농도 (μM)
	L. 모노사이토젠(그람 양성균)
	pH 4.0	pH 5.5	pH 6.2	pH 7.4	pH 8.5	pH 9.8
Clavaspirin	16	16	64	64	120-130	150
CSP-4	4	4	4	4	16	80-90

S . 에피더미스(그람 음성균)에 대한 항균 펩타이드의 항균 활성

펩타이드	생육 최소저해 농도 (μM)
	S. 에피더미스(그람 양성균)
	pH 4.0	pH 5.5	pH 6.2	pH 7.4	pH 8.5	pH 9.8
Clavaspirin	4	4	32	32	60-70	128
CSP-4	4	4	4	4	8	60-65

그 결과, 상기 표 2 내지 5에서 보는 바와 같이 본 발명의 서열번호 2로 기재된 펩타이드(CSP-4)는 서열번호 1로 기재되는 펩타이드(Clavaspirin)에 비해 MIC가 pH 5.5 이하에서는 동일하거나 낮았고, pH 6.2, pH 7.4, pH 8.5, pH 9.8에서는 모체 펩타이드(Clavaspirin)에 비해 월등히 높은 항균활성을 보였다. 따라서, 그람 양성균과 그람 음성균에서 모체 펩타이드(Clavaspirin)는 pH 5.5 이하에서 강한 활성을 보이지만 pH 6.2 이상에서는 모든 균주에서 낮은 활성을 보이는 반면, 본 발명의 항균 펩타이드(CSP-4)는 대부분의 균주에서 pH와 무관하게 높은 항균 활성을 보임을 알 수 있었다(표 2 내지 5).

< 실험예 2> 항균 펩타이드의 용혈 활성 분석

본 발명자들은 상기 <실시예 1>의 방법으로 제조된 펩타이드들의 세포독성을 비교하기 위하여, 펩타이드들의 적혈구 용혈 활성을 측정하였다.

우선, 인간 적혈구를 8%의 농도가 되도록 인산염 완충용액(PBS, pH 7.0)으로 희석하고 여기에 12.5μM/웰부터 1/2의 농도로 표 1에 서열번호 1 내지 2로 기재된 펩타이드들을 각각 연속적으로 희석하여 37℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 이후, 1,000 g로 원심 분리하여 그 상등액 속에 포함된 헤모글로빈 량을, 414nm파장에서 흡광도를 측정하여 조사하였다. 세포 파괴 정도를 비교 조사하기 위하여 1% 트리톤 X-100(sigma, USA)을 인간 적혈구 세포에 첨가하여 그 상등액의 흡광도를 측정하였다. 상기 1% 트리톤 X-100의 세포 파괴능을 100%로 하고, 하기 [수학식 1]에 따라 본 발명의 항균 펩타이드(CSP-4) 및 모체 펩타이드들(Clavaspirin)의 적혈구 파괴능을 계산하였고, 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.

수학식 1

상기 식에서, 흡광도 A는 414nm파장에서 펩타이드 용액의 흡광도, 흡광도 B는 414nm파장에서 PBS의 흡광도 그리고 흡광도 C는 414nm파장에서 1% 트리톤 X-100의 흡광도를 나타낸다.

항균 펩타이드의 용혈 활성 측정

펩타이드	% 적혈구 파괴능 (각 펩타이드 농도, μM)
	200	100	50	25	12.5
Clavaspirin	66	62	42	22	7
CSP-4	10	1	0	0	0

그 결과, 상기 표 3에서 보는 바와 같이 서열번호 1로 기재된 모체 펩타이드(Clavaspirin)는 200μM에서 66%의 용혈작용이 일어난 반면, 본 발명의 서열번호 2로 기재되는 펩타이드(CSP-4)는 동일 농도에서 용혈작용이 10%밖에 일어나지 않았다.

따라서, 본 발명의 항균 펩타이드는 세포독성이 거의 일어나지 않는 것을 알 수 있다(표 6).

< 실험예 3> 항균 펩타이드의 정상 세포주에서 세포독성 분석

본 발명자들은 상기 <실시예 1>의 방법으로 제조된 펩타이드들의 정상 세포주에서의 세포독성을 확인하기 위해, 사람의 각질 형성 세포주(HaCaT cell line, Dr. NE. Fusenig, Heidelberg, Germany)을 이용하여 독성을 측정하였다.

구체적으로, 10% FBS(Fetal Bovine Serum)가 함유된 DMEM 배지에서 배양된 사람의 각질 형성 세포주(HaCaT cell line)를 3×10³씩 96 웰 플레이트에 분주하고 24시간 배양한 후, 상기 <실시예 1>에서 제조한 펩타이드들을 각각 농도별로 처리하여 24시간 동안 5% CO₂ 인큐베이터에서 반응시켰다. 배양 후, 5 mg/ml 농도로 인산 완충액 생리식염수(phosphate buffered saline; PBS)에 녹인 MTT(Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide) 용액 20㎕를 각 웰에 넣고 4시간 동안 반응시켰다. 상층액을 제거하고, 200㎕의 DMSO를 넣어 형성된 MTT 크리스탈을 녹여, 560nm에서 결과를 확인하였고, 그 결과는 표 7에 나타내었다.

항균 펩타이드 세포독성 측정

펩타이드	% HaCa T 세포 생존력 (각 펩타이드 농도, μM)
	200	100	50	25	12.5
Clavaspirin	16	66	100	100	100
CSP-4	88	100	100	100	100

그 결과, 표 7에서 보는 바와 같이 사람의 각질 형성 세포주(HaCaT cells)에서 서열번호 1로 기재되는 모체 펩타이드(Clavaspirin)는 높은 독성을 나타내는 반면에, 본 발명의 서열번호 2로 기재되는 본 발명의 펩타이드(CSP-4)는 세포 독성을 거의 나타내지 않았다.

따라서, 본 발명의 항균 펩타이드는 세포독성을 거의 보이지 않는 것을 알 수 있었다(표 7).

< 실험예 4> 항균 펩타이드의 pH 에 따른 뭉침 현상

본 발명자들은 상기 <실시예 1>의 방법으로 제조된 펩타이드를 pH 5.5와 pH 7.4에서 뭉침 현상을 비교하기 위해, 각각의 펩타이드 농도별로 완충제에 처리하여 값을 측정하였다. 항균 펩타이드가 각각의 pH 5.5 와 pH 7.4의 10 mM sodium phosphate 버퍼에서 형태적으로 변하는 현상을 확인하기 위해 Perkin-Elmer LS55 형광광도 측정기 이용으로 90℃ 빛의 산란을 모체 펩타이드(Clavaspirin)와 본 발명의 항균 펩타이드(CSP-4)에서 확인한 것으로, 펩타이드를 pH 5.5 와 pH 7.4 버퍼에서 서로 다른 농도를 처리하여 12시간 동안 반응시킨 후 형광광도 측정기에서 400nm로 결과를 확인하였다.

그 결과, 도 1에서 보는 바와 같이 서열번호 1로 기재되는 모체 펩타이드(Clavaspirin)는 pH 7.4에서 높은 빛의 산란이 일어나는 현상을 확인하였으나 서열번호 2로 기재되는 본 발명의 항균 펩타이드(CSP-4)는 pH 5.5와 pH 7.4에서 낮은 빛의 산란을 보인다.

따라서, 본 발명의 항균 펩타이드(CSP-4)는 pH변화에도 크게 영향을 받지 않는다는 것을 알 수 있었다(도 1).

< 실험예 5> pH 에 따른 항균 펩타이드의 사이톡스 -그린( SYTOX - Green ) 형광 빛 광도 분석

본 발명자들은 상기 <실시예 1>의 방법으로 제조된 펩타이드를 pH 4.0, pH 5.5, pH 6.2, pH 7.4, pH 8.5, pH 9.8에서 사이톡스-그린(SYTOX-Green) 형광 및 광도를 시간단위로 측정하였다.

구체적으로, 대장균(E. coli)을 pH 5.5와 pH 7.4의 LB 브로스로 37℃에서 배양한 후 각각의 pH인 10mM sodium phosphate 완충제에서 대장균 세포를 2× 10⁷cells/ml로 맞추었다. 이들 대장균 세포에 사이톡스-그린(SYTOX-Gree)을 1 μM을 처리하여 15분에서 20분 가량 빛이 들어오지 않은 배양기에서 반응을 시킨 후 비교군(Clavaspirin)과 실험군(CSP-4) 펩타이드를 최소억제농도(MIC)로 처리하고 pH에 따른 사이톡스-그린(SYTOX-Green)으로부터 형광 빛 광도 증가를 발광파장 485nm와 방사파장 520nm에서 측정하여 결정한 값으로, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

그 결과, 상기 도 2에서 보는 바와 같이 본 발명의 서열번호 2로 기재되는 펩타이드(CSP-4)는 서열번호 1로 기재되는 모체 펩타이드(Clavaspirin)에 비해 pH 5.5에서는 본 발명의 항균 펩타이드가 모체 펩타이드에 비해 형광 빛 강도가 60분에서 2배가량 높음을 나타냈고, pH 7.4에서는 모체 펩타이드는 아무런 반응을 보이지 않으나 본 발명의 항균 펩타이드에서는 아주 높은 형광 빛 강도를 보였다.

또한 대장균을 pH 4.0, pH 5.5, pH 6.2, pH 7.4, pH 8.5, pH 9.8의 LB 브로스로 37℃에서 배양한 후 각각의 pH인 10mM sodium phosphate 완충제에서 대장균 세포를 2× 10⁷cells/ml로 맞추었다. 이들 대장균 세포에 사이톡스-그린(SYTOX-Gree)을 1 μM을 처리하여 15분에서 20분 가량 빛이 들어오지 않은 배양기에서 반응을 시킨 후 모체 펩타이드(Clavaspirin)와 본 발명의 항균 펩타이드(CSP-4)를 최소억제농도(MIC)로 처리하고 pH에 따른 사이톡스-그린(SYTOX-Green)으로부터 형광 빛 광도 증가를 발광파장 485nm와 방사파장 520nm에서 측정하기 시작한 후 30분 때의 형광 빛 강도를 기록하였다(표 8). 그 결과 본 발명의 항균 펩타이드는 pH에 관계 없이 높은 형광 빛 강도를 보이는 것으로 나타났다.

pH 에 따른 펩타이드의 형광 빛 강도

펩타이드	형광 빛 강도(arbiratry uints)
	대장균
	pH 4.0	pH 5.5	pH 6.2	pH 7.4	pH 8.5	pH 9.8
MIC of Clavaspirin	66±5.211)	65±6.45	38±4.23	12±1.25	15±3.48	10±2.36
MIC of CSP-4	72±6.33	78±5.46	129±8.17	218±8.55	115±6.27	13±1.92

¹⁾Mean±S.D. (n=5)

따라서, 본 발명의 항균 펩타이드(CSP-4)는 모체 펩타이드인 Clavaspirin과 대조결과 서로 다른 pH에서도 강한 형광 빛 강도를 보이는 것으로 대장균 막 파괴가 모체 펩타이드에 비해 강한 작용을 보이는 것을 알 수 있었다(도 2 및 표 8).

< 실험예 6> 인위적으로 만든 거대 단일막 소포( GUVs )에 항균 펩타이드가 각각의 pH 에 따라 나타내는 구조적 현상 분석

본 발명자들은 상기 <실시예 1>의 방법으로 제조된 펩타이드를 인위적으로 만든 거대 리포좀에 펩타이드를 처리하여 각각의 pH에 따라 나타나는 구조적 현상을 측정하였다.

우선, 거대 단일막 소포(Gient unilamellar vesicles: GUVs)를 여러 인지질(phospholipide)을 희석하여 전기적 자극으로 만든 것으로 포스파티딜 에타놀아민/포스파티딜 글라이세롤(PE/PG)또는 포스파티딜 에타놀아민/포스파티딜글라이세롤/포스파티딜 에타놀아민-로다민 (PE/PG/PE-Rhodamin, 69/30/1)을 희석하였다. 희석된 인지질 수용액을 인디윰 틴 옥사이드(indium tin oxide: ITO) 코팅 유리(25x35x1.1 mm Sigma-Aldrich, st, Louis, MO)위에 희석된 지질 100㎕ 올린 후 스핀코트에서 5분 동안 600rpm으로 인지질을 펼쳤다. 이후, 진공 배기 상태에서 최소 2시간 동안 지질과 희석된 유기용매를 제거한다. 지질이 부착된 인디윰 틴 옥사이드(ITO)와 부착이 되지 않은 인디윰 틴 옥사이드(ITO)를 결합시 중간에 전기 주조를 위해(electroformation chamber, 25x25x1 mm) 다이메틸실록산(dimethylsiloxane)의 폴리요소 섬유를 삽입 고정하여 챔버를 만들고, 0.1M 자당(sucrose)이 첨가된 5 mM HEPES 완충제(pH 5.5, pH 7.4)로 각각의 pH 별로 챔버 내부에 주입한다. 그리고 인디윰 틴 옥사이드(ITO) 유리에 발전기(generator-Agilent 33220A, Agilent Technology, US)를 이용해 1.7 V의 전극과, 10 Hz 진동수(frequency)를 주입하여 1시간 30분간 반응 후 4 V, 10 Hz 주파수를 변환하여 10분간 반응시킨다.

전기형성 챔버에서 리포솜 수용액을 제거하고, 리포솜 수용액에 0.1M 포도당(glucose)이 첨가된 5mM HEPES 완충제(pH 5.5, pH 7.4)를 희석한다. 이것은 거대 단일 막 리포솜(GUVs)이 삼투압현상에 의해 터지는 것을 예방하는 것과 외부의 포도당(180.16 MW)과 내부의 자당(342.30 MW)의 무게를 이용하여 슬라이드 글라스에 잘 침전이 이루어 질 수 있도록 하기 위함이다. 이후 형광현미경 표면 대조(fluorescence phase contrast) 현미경(Ix71, Olympus, Tokyo, Japan)의 디지털 CCD 카메라(DP71, Olympus)를 이용하여 현상을 촬영/분석하였다.

그 결과, 상기 도 3에서 보는 바와 같이 A(pH 5.5), B(pH 7.4)로 각각의 pH에서 모체 펩타이드(Clavaspirin)와 본 발명의 항균 펩타이드(CSP-4)에서 각각의 다른 현상을 볼 수 있는 것으로 A(pH 5.5)의 상단은 모체 펩타이드(Clavaspirin)이며, 하단은 본 발명의 항균 펩타이드(CSP-4)로 모체 펩타이드에 비해 본 발명의 항균 펩타이드가 아주 빠른 시간에 지질 막 분해가 이루어진 것을 알 수 있었으며, B(pH 7.4)의 상단은 모체 펩타이드(Clavaspirin)로 지질 막에 작용에 긴 시간의 경과에도 거의 일어나지 않음을 알 수 있었으나 본 발명의 항균 펩타이드(CSP-4)는 아주 빠른 시간에 지질 막에 작용하여 파괴시키는 걸 확인하였다.

따라서, 본 발명의 항균 펩타이드는 pH의 반응에 거의 영향을 받지 않으며, 빠른 시간에 지질 막에 작용하여 막을 파괴하는 것을 알 수 있다(도 3).

이상의 결과로 본 발명에 따른 항균 펩타이드는 서열번호 1로 기재되는 항균 펩타이드에 비해 세포독성이 거의 없고, 뭉침 현상도 보이지 않으며, pH에 관계 없이 강한 항균 활성을 보이고, pH에 관계없이 빠른 시간에 지질 막에 작용하여 막을 파괴한다는 것을 확인하였다.

하기는 본 발명의 항균 펩타이드를 함유시킨 몇몇 제제화 방법을 예시한 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

< 제조예 1> 약학적 제제의 제조

<1-1> 정제(직접 가압)

항균 펩타이드 5.0mg을 체로 친 후, 락토스 14.1mg, 크로스포비돈 USNF 0.8mg 및 마그네슘 스테아레이트 0.1mg을 혼합하고 가압하여 정제로 제조하였다.

<1-2> 정제(습식 조립)

항균 펩타이드 5.0mg을 체로 친 후, 락토스 16.0mg과 녹말 4.0mg을 섞었다. 폴리솔베이트80 0.3mg을 순수한 물에 녹인 후 이 용액의 적당량을 첨가한 다음, 미립화하였다. 건조 후에 미립을 체질한 후 콜로이달 실리콘 디옥사이드 2.7mg 및 마그네슘 스테아레이트 2.0mg 과 섞었다. 미립을 가압하여 정제로 제조하였다.

<1-3> 분말과 캡슐제

항균 펩타이드 5.0mg을 체로 친 후에, 락토스 14.8mg , 폴리비닐 피롤리돈 10.0mg , 마그네슘 스테아레이트 0.2mg 와 함께 혼합하였다. 상기 혼합물을 적당한 장치를 사용하여 단단한 No. 5 젤라틴 캡슐에 채웠다.

<1-4> 주사제

항균 펩타이드 100mg을 함유시키고, 그 밖에도 만니톨 180mg, Na₂HPO₄12H₂O 26mg 및 증류수 2974mg를 함유시켜 주사제를 제조하였다.

< 제조예 2> 식품의 제조

<1-2> 항균용 식품의 제조

항균 펩타이드 100 ㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B1 0.13 ㎎

비타민 B2 0.15 ㎎

비타민 B6 0.5 ㎎

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 항균용 식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 항균용 식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

<1-2> 항균용 보조음료의 제조

항균 펩타이드 100 ㎎

구연산 100 ㎎

올리고당 100 ㎎

매실농축액 2 ㎎

타우린 100 ㎎

정제수를 가하여 전체 500 ㎖

통상의 보조음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 1 ℓ용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

이상의 본 발명은 상기에 기술된 실시예, 실험예 및 제조예들에 의해 한정되지 않고, 당업자들에 의해 다양한 변형 및 변경을 가져올 수 있으며, 그 효능에 따라 인체에 얇게 도포하여 바를 수 있는 약제 즉, 연고로 제조에 이용될 수 있고, 이는 첨부된 청구항에서 정의되는 본 발명의 취지와 범위에 포함된다.

본 발명에 따르면, 세포독성이 거의 없고 pH 변화에 영향을 받지 않고 우수한 항균 활성을 가지는 항균 펩타이드를 생산하는 것이 가능해진다. 따라서 본 발명의 항균 펩타이드는 병원성 세균 감염의 예방 및 치료분야에 유용하게 이용될 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (11)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 9번 및 12번째 아미노산에 위치한 이소루신(Isoleucine, I)이 라이신(Lysine, K)으로 치환된 항균 펩타이드.
   
2. 제 1항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 항균 펩타이드.
   
3. 제 1항에 있어서, 상기 펩타이드는 그람 음성균 또는 그람 양성균에 대해 항균 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 항균 펩타이드.
   
4. 제 3항에 있어서, 상기 그람 음성균은 대장균(Escherichia coli) 또는 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris)이고, 상기 그람 양성균은 리스테리아 모노사이토젠스(Listeria monocytogenes) 또는 스타필로코커스 에피더미스(Staphylococcus epidermidis)인 것을 특징으로 하는 항균 펩타이드.
   
5. 제 1항에 있어서, 상기 펩타이드는 산성, 중성, 알칼리성에서 항균 활성을 보이는 것을 특징으로 하는 항균 펩타이드.
   
6. 제 5항에 있어서, 상기 펩타이드는 pH 6 내지 8.5에서 항균 활성을 보이는 것을 특징으로 하는 항균 펩타이드.
   
7. 삭제
8. 삭제
9. 치료적 유효량의 제 1항에 기재된 펩타이드를 유효성분으로 함유하는, 대장균, 프로테우스 불가리스, 리스테리아 모노사이토젠스 및 스타필로코커스 에피더미스로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나에 대한 항균용 약학적 조성물.
   
10. 삭제
11. 제 1항의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는, 대장균, 프로테우스 불가리스, 리스테리아 모노사이토젠스 및 스타필로코커스 에피더미스로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나에 대한 항균용 식품첨가제.

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