KR101372243B1 - Protein-stabilized gold nanoparticles and process for preparation thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 생체적합한 단백질로 안정화된 금나노입자의 제조방법에 관한 것으로서, 금나노입자를 생성하기 위해 일반적으로 사용되는 화학첨가제인, 환원제나 안정제를 사용하지 않고, 금염과 높은 친화도를 갖는 리소자임과 마이크로파 조사를 이용하여 열효과를 공급하므로써 합성되는 간단하고 용이한 생체적합성 금나노입자의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for preparing gold nanoparticles stabilized with a biocompatible protein, and is a lysozyme having high affinity with gold salts without using a reducing agent or stabilizer, which is a chemical additive generally used to generate gold nanoparticles. The present invention relates to a method for producing a simple and easy biocompatible gold nanoparticle synthesized by supplying a thermal effect using a microwave irradiation.
Description
본 발명은 생체적합한 단백질로 안정화된 금나노입자의 제조방법에 관한 것으로서, 일반적으로 사용되는 화학첨가제인, 환원제나 안정제를 사용하지 않고, 금속이온에 높은 친화도를 갖는 리소자임과 함께 마이크로파 조사를 이용하여 열효과를 공급하므로써 단시간에 합성되는 간단하고 용이한 생체적합한 단백질로 안정화된 금나노입자의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for preparing gold nanoparticles stabilized with a biocompatible protein, and using microwave irradiation with lysozyme having a high affinity to metal ions, without using a reducing agent or stabilizer, which is a commonly used chemical additive. The present invention relates to a method for preparing gold nanoparticles stabilized with a simple and easy biocompatible protein synthesized in a short time by supplying a thermal effect.
생체적합하고, 합성방법이 간단하며, 표면 변형이 용이하다는 금나노입자(AuNPs)의 특성으로 인하여 금나노입자는 금속나노입자 분야에서, 가장 연구가 많이 되는 것 중에 하나이다. 따라서, 금나노입자에 대한 관심은 점점 증가하고 있다. 나노스케일의 전자공학, 약물 전달 시스템, 유전자 전달 시스템, 바이오센서 및 영상화 탐침과 같은 전자 공학부터 생화학 응용분야까지 금나노입자는 다양한 분야에서 광범위하게 응용되어져 왔다. 나노크기 입자의 특성은, 환원제 및/또는 안정제의 입자의 크기, 모양, 및 특성에 크게 의존한다는 것은 공지된 사실이다. 생화학적 측면에서, 이러한 특성들은 세포 상호작용에 있어서 매우 중요한 요소이다.Gold nanoparticles are one of the most studied in the field of metal nanoparticles due to the characteristics of gold nanoparticles (AuNPs) that are biocompatible, simple to synthesize, and easy to modify surface. Therefore, interest in gold nanoparticles is increasing. From nanoscale electronics, drug delivery systems, gene delivery systems, biosensors and imaging probes such as imaging probes, gold nanoparticles have been widely applied in a variety of fields. It is well known that the properties of nanosize particles largely depend on the size, shape, and properties of the particles of the reducing agent and / or stabilizer. In biochemical terms, these properties are very important for cellular interaction.
금나노입자를 합성하기 위해 화학 환원반응과 같은 종래의 방법을 사용할 때에는, 일반적으로 금속 화합물, 용매, 환원제 및/또는 안정제를 필요로 한다. 의약분야에서 금나노입자의 사용에 있어서 주요 현안은 상기와 같은 화학 첨가제에 의해 발생되는 독성이다. 따라서, 공지된 생체적합한 계면활성제 폴리소르베이트 80, 단백질, 펩타이드, 아미노산, 및 식물 추출물과 같은 생체적합한 환원제 또는 안정제를 사용하는 다양한 합성방법이 개발되었다. 그러나, 이들 물질들은, 최종적으로 금나노입자를 얻기 위해 보조작용은 할 수 있으나, 이들 물질들은 특정한 반응 조건, 예를 들면, 특정한 pH 및 온도뿐만 아니라, 오랜 반응시간 및 추가의 환원제를 필요로 하는 등의 단점이 있다.When using conventional methods such as chemical reduction reactions to synthesize gold nanoparticles, metal compounds, solvents, reducing agents and / or stabilizers are generally required. The main issue in the use of gold nanoparticles in the pharmaceutical field is the toxicity caused by such chemical additives. Accordingly, various synthetic methods have been developed using biocompatible reducing or stabilizing agents such as known biocompatible
Journal of the American Chemical Society 2009, 131, (3), 888, Langmuir 2004, 20, (26), 11778 및 The Journal of Physical Chemistry C 2007, 111, (28), 10226에는 가장 풍부한 혈청 단백질인 소 혈청으로부터 얻어진 알부민(bovine serum Albumin(BSA))을, 환원제 및 안정제로 사용하여 금나노입자를 합성하는 방법에 대해 보고되어져 왔다. 그러나, BSA는 실온에서 2일 이상을 두어도 금염을 전혀 환원시키지 못하기 때문에, 추가적인 요건, 즉, 환원제나 보다 높은 온도의 반응조건, 그리고 특정한 pH를 필요로 했다.Bovine serum, the most abundant serum protein, in Journal of the American Chemical Society 2009, 131, (3), 888, Langmuir 2004, 20, (26), 11778 and The Journal of Physical Chemistry C 2007, 111, (28), 10226. Albumin (bovine serum Albumin (BSA)) obtained from the above has been reported for the synthesis of gold nanoparticles using a reducing agent and a stabilizer. However, BSA did not reduce the gold salt at all even after two days at room temperature, which required additional requirements, namely a reducing agent or higher temperature reaction conditions, and a specific pH.
상기와 같이 이러한 합성방법은, 하기 표 1에 나타낸 종래의 합성방법과 같이, 환원제를 필요로 하고, 특정한 온도, 시간 또는 pH 등을 필요로 하여 금나노입자를 합성하는데에 어려움이 있었다.As described above, this synthesis method, like the conventional synthesis method shown in Table 1, requires a reducing agent and has a difficulty in synthesizing the gold nanoparticles by requiring a specific temperature, time, or pH.
일반적으로, 리소자임은 잘 알려진 효소로서 하기 표 1에 보고된 리툭시맙(Rituximab), 세툭시맙(Cetuximab), 및 녹색 형광 단백질(green fluorescence protein; GFP)에 비하여 쉽게 구입가능하다.In general, lysozyme is readily available compared to Rituximab, Cetuximab, and green fluorescence protein (GFP) reported in Table 1 as well known enzymes.
그러나, Langmuir 2007, 23, (21), 10533에는, 리소자임은 4℃에서 1달 동안 환원 능력이 없는 것으로 보고되어 있다, 따라서, 금나노입자를 형성하는데에 추가의 환원제 또는 안정제를 필수적으로 첨가해야 하는 것으로 밝혀졌다.However, Langmuir In 2007, 23, (21), 10533, lysozyme is reported to be incapable of reducing for 1 month at 4 ° C., therefore, it was found that additional reducing or stabilizing agent must be added to form gold nanoparticles. lost.
금나노입자들과 같은 생체이물이 살아있는 시스템으로 도입될 때, 세포이물이 세포독성을 일으키는지에 대해서 매우 중요하게 고려되는데, 일반적으로 금나노입자의 세포독성은 생쥐배아섬유 NIH-3T3 세포에 대해 MTT 분석에 의해 평가되고 있으며, 세포 독성의 측정에 있어서, 세포 상호작용뿐만 아니라, 화합물, 방출량, 노출 경로 및 기간, 입자 사이즈, 표면 화학, 또는 모든 것들이 금나노입자의 세포 독성을 평가하는 데에 있어 중요한 변수로 작용된다.When a foreign body such as gold nanoparticles is introduced into a living system, it is very important to consider whether the foreign body causes cytotoxicity. In general, the cytotoxicity of gold nanoparticles is MTT against mouse embryonic fiber NIH-3T3 cells. As assessed by assays, in measuring cytotoxicity, not only cellular interactions, but also compounds, releases, routes and durations of exposure, particle size, surface chemistry, or all of them, can be used to assess the cytotoxicity of gold nanoparticles. It is an important variable.
Small 2005, 1, (3), 325 및 Chemical Physics Letters 2008, 463, (1-3), 145에는 계면활성제인 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB)를 사용하여 합성된 금나노입자는 CTAB의 세포독성으로 인해, 인간 백혈병 K562 세포, 인간 피부 세포, HaCaT 케라티노사이트, 및 인간 표피 세포에 대해 독성을 갖고 있는 것으로 보고되었다. 그러나, 여러번의 세척 및 원심분리과정을 사용하여 언바운드된 CTAB가 제거된 후에는 금나노입자가 생체적합한 것으로 보고하고 있다. Small 2005, 1, (3), 325 and Chemical Physics Letters In 2008, 463, (1-3), and 145, gold nanoparticles synthesized using the surfactant cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) have been shown to have the effect of CTAB cytotoxicity. It has been reported to be toxic to the site, and human epidermal cells. However, gold nanoparticles are reported to be biocompatible after unbound CTAB is removed using multiple washing and centrifugation procedures.
따라서, 생체적합한 단백질을 이용하여 세포 독성이 없으면서도 간단하고 단시간에 합성이 가능한 금나노입자의 합성방법의 개발이 필요하다.Therefore, it is necessary to develop a method for synthesizing gold nanoparticles that can be synthesized simply and in a short time without cytotoxicity using biocompatible proteins.
본 발명의 목적은 상기와 같은 문제점을 해소하기 위하여, 화학첨가제인 환원제나 안정제를 사용하지 않으면서도, 수용액하에서 환원반응을 신속하게 일으킬 수 있는 마이크로파 조사를 이용하여, 단백질과 금염을 조합시켜 단시간에 금나노입자를 합성할 수 있으면서도 세포이입시 독성을 나타내지 않는 생체적합성 금나노입자의 제조방법에 관한 것이다.An object of the present invention is to solve the above problems by using a combination of protein and gold salt in a short time by using a microwave irradiation that can cause a reduction reaction in an aqueous solution without using a reducing agent or stabilizer as a chemical additive The present invention relates to a method for producing biocompatible gold nanoparticles which can synthesize gold nanoparticles but which do not exhibit toxicity upon cell introduction.
상술한 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 (a) 금염과 단백질을 물에 첨가시켜 콜로이드 용액을 제조하는 단계; 및 (b) 제조된 상기 콜로이드 용액에 마이크로파를 조사하는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 단백질로 안정화된 금나노입자의 제조방법을 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention comprises the steps of (a) preparing a colloidal solution by adding gold salt and protein to water; And (b) irradiating the prepared colloidal solution with microwaves to provide a method for preparing gold nanoparticles stabilized with protein.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 금염은, 칼륨테트라클로로아우르산염(Ⅲ)(KAuCl4), 염화금산나트륨(NaAuCl4), 염화금산(HAuCl4), 브롬화금산나트륨(NaAuBr4), 염화금(AuCl), 염화금(III)(AuCl3) 또는 브롬화금(AuBr3) 등을 포함할 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the gold salt is potassium tetrachloroaurate (III) (KAuCl 4 ), sodium chloride (NaAuCl 4 ), gold chloride (HAuCl 4 ), sodium bromide (NaAuBr 4 ), Gold chloride (AuCl), gold (III) chloride (AuCl 3 ), or gold bromide (AuBr 3 );
본 발명의 바람직한 다른 일 실시예에 따르면, 상기 단백질은, 헤모글로빈, 트립신, 알부민, 리툭시맙, 세툭시맙, 녹색 형광 단백질 및 리소자임으로부터 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있다.According to another preferred embodiment of the invention, the protein may comprise one or more selected from hemoglobin, trypsin, albumin, rituximab, cetuximab, green fluorescent protein and lysozyme.
본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 금염과 단백질의 몰비율은 0.025~0.043인 것을 포함한다.According to another preferred embodiment of the present invention, the molar ratio of the gold salt and protein comprises 0.025 ~ 0.043.
본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 마이크로파는 마이크로웨이브 오븐을 스트롱 모드로 조절할 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the microwave may adjust the microwave oven in the strong mode.
본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 마이크로파는 2~4분 동안 조사할 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the microwave may be irradiated for 2 to 4 minutes.
본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기와 같은 방법으로 제조되는 금나노입자를 얻을 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, it is possible to obtain a gold nanoparticles prepared by the above method.
본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 금나노입자는 콜로이드 상에서 단백질로 안정화된 금나노입자를 포함한다.According to another preferred embodiment of the present invention, the gold nanoparticles include gold nanoparticles stabilized with protein on the colloid.
본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 금나노입자의 모양은, 삼각형, 오각형, 육각형 또는 원형을 포함할 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the shape of the gold nanoparticles may include a triangle, a pentagon, a hexagon or a circle.
본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 금나노입자는 세포내 이입시 세포독성이 없는 것을 제공할 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the gold nanoparticles may provide that there is no cytotoxicity when introduced into the cell.
본 발명에 따른 단백질로 안정화된 금나노입자의 제조방법에 의하면, 독성이 있는 화학 약품없이 마이크로파 조사를 이용하여 제조된 균일한 형태의 금나노입자를 제공할 수 있다.According to the method for preparing gold nanoparticles stabilized with a protein according to the present invention, it is possible to provide a uniform type of gold nanoparticles prepared using microwave irradiation without toxic chemicals.
또한, 본 발명에 따른 금나노입자의 제조방법에 의하면, 화학약품이 첨가되지 않아, 생체 내 이입시, 독성이 없는 금나노입자를 제공할 수 있다.In addition, according to the method for producing gold nanoparticles according to the present invention, since no chemicals are added, it is possible to provide gold nanoparticles having no toxicity upon in vivo migration.
도 1은 마이크로파 조사 하에서 리소자임으로 안정화된 금나노입자가 형성되는 도이다(리소자임 이미지는 단백질 데이터 뱅크로부터 다운로드 받았다(PDB ID: 3A3R).
도 2는 (1) 난백 리소자임, (2) KAuCl4, 및 (3) 비교예 1의 UV-가시 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 3은 비교예 1의 TEM 이미지를 나타내는 도이다.
도 4는 비교예 3의 TEM이미지를 나타내는 도이다.
도 5는 비교예 1 및 실시예 1, 2 및 3의 UV-가시 스펙트라를 나타내는 도이다.
도 6은 TEM에 의해 측정된 실시예 1, 2 및 3의 크기 분포도를 나타내는 도이다.
도 7은 X선 분광기(XRD)에 의해 측정된 것이고, 마이크로파 조사 하에서 얻어지는 XRD 패턴으로 실시예 1, 2 및 3의 결정상태를 나타낸 것으로서, 38.1, 44.5, 64.6, 및 77.5에서 회절 피크는, 각각 면심입방격자(FCC) 큐빅 결정 구조의 면인 (111), (200), (220), 및 (311)면과 일치하고, (111)면에 일치하는 상기 피크가 다른 면보다 세기가 더욱 큰 것을 나타내는 도이다.
도 8은 실시예 1~3의 Au의 4f(a)와 리소자임 및 실시예 1~3의 S 2p(b)의 고해상 XPS 스펙트럼의 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 NIH-3T3 세포에 대한 KAuCl4, 리소자임 및 수소화 붕소나트륨의 세포 생존율을 나타내는 도이다.
도 10은 1일 동안(a) 및 3일 동안(b) 배양한 NIH-3T3 세포에 대한 실시예 1~3 및 비교예 7의 세포 생존율을 나타내는 도이다.
도 11은 1일 및 3일 동안 배양한 후의 실시예 1~3 및 비교예 7의 세포 생존율을 그래프로 나타내는 도이다.1 is a diagram in which lysozyme-stabilized gold nanoparticles are formed under microwave irradiation (lysozyme images were downloaded from the protein data bank (PDB ID: 3A3R).
2 is a diagram showing the UV-visible spectrum of (1) egg white lysozyme, (2) KAuCl 4 , and (3) Comparative Example 1. FIG.
3 is a diagram illustrating a TEM image of Comparative Example 1. FIG.
4 is a view showing a TEM image of Comparative Example 3.
FIG. 5 is a diagram showing UV-visible spectra of Comparative Example 1 and Examples 1, 2, and 3. FIG.
6 is a diagram showing the size distribution diagrams of Examples 1, 2, and 3 measured by TEM.
FIG. 7 shows the crystal states of Examples 1, 2, and 3 as measured by X-ray spectroscopy (XRD) and obtained under microwave irradiation, and diffraction peaks in 38.1, 44.5, 64.6, and 77.5, respectively. This peak coincides with the (111), (200), (220), and (311) planes, which are planes of the face-centered cubic (FCC) cubic crystal structure, and indicates that the peak coinciding with the (111) plane is greater in intensity than the other planes. It is also.
Fig. 8 shows the results of high resolution XPS spectra of 4f (a) and lysozyme of Au of Examples 1 to 3 and S 2p (b) of Examples 1 to 3;
9 is a diagram showing cell viability of KAuCl 4 , lysozyme and sodium borohydride against NIH-3T3 cells.
Figure 10 is a diagram showing the cell viability of Examples 1-3 and Comparative Example 7 for NIH-3T3 cells cultured for 1 day (a) and 3 days (b).
11 is a graph showing the cell viability of Examples 1 to 3 and Comparative Example 7 after culturing for 1 day and 3 days.
상술한 바와 같이 종래의 단백질을 이용하여 금염과 반응시켜 금나노입자를 제조하는 방법은, 환원제나 안정제를 사용해야만 하고, 특정한 온도나 pH 등을 조절해야 하는 문제점이 있었고, 또한 상기 방법으로 제조된 금나노입자는 세포이입시 화학약품으로 인하여 독성을 나타내는 문제점이 있었다.As described above, a method of preparing gold nanoparticles by reacting with a gold salt using a conventional protein has to use a reducing agent or a stabilizer, and has a problem of adjusting a specific temperature or pH. Gold nanoparticles had a problem of toxicity due to chemicals during cell introduction.
이에 본 발명의 한 측면에 따르면 (a) 금염과 단백질을 물에 첨가시켜 콜로이드 용액을 제조하고, 제조된 상기 콜로이드 용액에 마이크로파를 조사하여 단백질로 안정화시키는 금나노입자의 제조방법을 제공하여 상술한 문제점을 해결하였다. 이를 통해 종래의 단백질로 안정화된 금나노입자를 제조하기 위해서 화학약품이나 온도 또는 pH 등을 조절할 필요없이, 금염과 단백질을 물에 넣어 콜로이드 용액으로 제조한 후, 마이크로파를 단시간에 조사함으로써 화학약품을 사용하지 않아 독성이 없어 세포생존율이 우수한 단백질로 안정화된 금나노입자를 얻을 수 있어 상술한 문제점을 해결하였다(도 11 참조).According to an aspect of the present invention (a) by adding a gold salt and a protein to water to prepare a colloidal solution, by providing a method for producing gold nanoparticles to stabilize the protein by irradiating microwaves to the prepared colloidal solution I solved the problem. In this way, to prepare gold nanoparticles stabilized with conventional protein, there is no need to adjust chemicals, temperature, or pH, and prepare gold-collar and protein in colloidal solution, and then irradiate microwaves for a short time. There is no toxicity because it is not used to obtain a gold nano-particles stabilized with a protein having excellent cell survival rate solved the above problems (see Fig. 11).
먼저, 금염을 설명한다.First, the gold salt is explained.
본 발명에 사용되는 금염은, 칼륨테트라클로로아우르산염(Ⅲ)(KAuCl4), 염화금산나트륨(NaAuCl4), 브롬화금산나트륨(NaAuBr4), 염화금(AuCl), 염화금(III)(AuCl3) 및 브롬화금(AuBr3) 등으로부터 선택되는 1종 이상을 사용할 수 있다.Geumyeom used in the present invention, potassium tetrachloro acid salt (Ⅲ) (KAuCl 4), chloroauric acid sodium (NaAuCl 4), brominated Keumsan sodium (NaAuBr 4), yeomhwageum (AuCl), yeomhwageum (III) (AuCl 3) And one or more selected from gold bromide (AuBr 3 ) and the like.
다음, 단백질을 설명한다.Next, the protein will be described.
본 발명에 사용되는 단백질은, 전자 주게 작용기로서 작용할 수 있고, 금속 이온과 결합하도록 작용할 수 있는 카르복실기, 히드록실기, 아민기 및 티올기 등과 같은 다양한 작용기를 포함한다. 단백질은 상기와 같은 작용기를 포함하고 있는 아미노산으로 구성되어 있는 것으로서, 예를 들면, 히스티딘, 트립토판, 시스테인, 페닐알라닌, 타이로신, 아르기닌, 라이신, 글루타민 및 메티오닌 등과 같은 아미노산 등은 금속이온과 강하게 상호작용하여 금속 이온과 강한 친화성을 갖는다.The protein used in the present invention includes various functional groups such as carboxyl groups, hydroxyl groups, amine groups and thiol groups which can act as electron donor functional groups and can act to bind metal ions. Proteins are composed of amino acids containing such functional groups. For example, amino acids such as histidine, tryptophan, cysteine, phenylalanine, tyrosine, arginine, lysine, glutamine and methionine interact strongly with metal ions. It has a strong affinity with metal ions.
상기 단백질은, 그 종류에 특별히 한정이 없고, 예를 들면, 헤모글로빈, 트립신, 알부민, 리소자임, 리툭시맙(Rituximab), 세툭시맙(Cetuximab), 및 녹색 형광 단백질(green fluorescence protein; GFP) 등이 있으며, 특히 리소자임이 다른 단백질에 비해 용이하게 입수가능하고 금속이온에 강한 친화성을 가지므로 바람직하다.The protein is not particularly limited in kind, and examples thereof include hemoglobin, trypsin, albumin, lysozyme, rituximab, cetuximab, green fluorescence protein (GFP), and the like. In particular, lysozyme is preferred because it is readily available compared to other proteins and has a strong affinity for metal ions.
다음, 리소자임을 설명한다.Next, the lysozyme is explained.
본 발명에 사용되는 리소자임은 4개의 디설파이드 다리 가교화 폴리펩타이드 체인에 의해 유지되는 치밀한 3차 구조를 가지는 단백질로서, 0.78%의 히스티딘, 6.20% 시스테인, 2.33% 페닐알라닌, 2.33% 타이로신, 4.65% 라이신, 2.33% 글루타민, 및 1.55% 메티오닌을 갖는 129개의 아미노산 잔기로 구성되어 있어, 금속 이온에 대하여 강한 친화성을 갖는다.Lysozyme used in the present invention is a protein with a dense tertiary structure maintained by four disulfide bridge crosslinked polypeptide chains, 0.78% histidine, 6.20% cysteine, 2.33% phenylalanine, 2.33% tyrosine, 4.65% lysine, Consists of 129 amino acid residues with 2.33% glutamine, and 1.55% methionine, having a strong affinity for metal ions.
다음, 본 발명에 포함된 성분의 몰비율을 설명한다.Next, the molar ratio of the component contained in this invention is demonstrated.
본 발명에 사용되는 금염과 단백질의 몰비율은 0.025~0.043인 것이 바람직한데, 0.025 미만이면 단백질과 금염이 결합을 형성하지 않아 금나노입자가 형성되지 않으므로 바람직하지 않고, 0.043을 초과하면 생성된 금나노입자의 형태가 불균일하여 바람직하지 않다.The molar ratio of gold salt to protein used in the present invention is preferably 0.025 to 0.043. If it is less than 0.025, gold nanoparticles are not formed because the protein and gold salt do not form a bond. The shape of the nanoparticles is heterogeneous and therefore not preferred.
다음, 마이크로파를 설명한다.Next, the microwave will be described.
본 발명에 사용되는 마이크로파 조사는, 화학 및 생물분야, 예를 들면 유기 합성, 펩타이드 합성 및 효소 촉매에서 일상 생활에서 수많은 응용분야에 적용될 수 있는 합성방법으로서, 용액 내에서 금염과 단백질을 콜로이드 상태로 만든 후, 여기에 마이크로파를 조사하여 단백질로 안정화된 금나노입자를 제조할 수 있는데, 마이크로파를 조사함으로써, 물 및 극성 분자들은 더욱 빠르고 균일하게 데워질 수 있고, 마이크로파를 조사하는 동안, 마이크로파의 정량 에너지가 너무 작아 화학 결합이 깨지기 때문에 열 효과가 지배적이다. 또한, 균일한 마이크로파 조사열이 균일한 핵 생성 및 성장 조건을 제공할 수 있기 때문에 최종적으로, 균일한 나노물질을 형성할 수 있다. 상기 마이크로파 조사는, 리소자임을 변성된 상태가 되도록 유도하여, Au(Ⅲ) 및 리소자임 사이의 상호작용을 향상시킬 수 있다.Microwave irradiation used in the present invention is a synthetic method that can be applied to numerous applications in daily life in the chemical and biological fields, such as organic synthesis, peptide synthesis and enzyme catalysts, in the colloidal state of gold salt and protein in solution After making, it can be irradiated with microwaves to produce protein stabilized gold nanoparticles. By irradiating microwaves, water and polar molecules can be warmed faster and more uniformly, while quantifying microwaves while irradiating microwaves The thermal effect is dominant because the energy is so small that the chemical bonds are broken. In addition, since uniform microwave irradiation heat can provide uniform nucleation and growth conditions, it is possible to finally form a uniform nanomaterial. The microwave irradiation may induce the lysozyme to be in a denatured state, thereby improving the interaction between Au (III) and lysozyme.
상기 단백질과 금염의 용액을 마이크로파로 조사할 때, 용액 내의 온도를 72℃ 이상으로 유지하는 것이 바람직한데, 72℃ 미만이면 단백질의 변성이 일어나지 않아 바람직하지 않다.When irradiating the solution of the protein and the gold salt with microwave, it is preferable to maintain the temperature in the solution at 72 ℃ or more, if less than 72 ℃ undesired protein does not occur is not preferable.
상기 마이크로파는, 마이크로웨이브 오븐을 스트롱 모드(strong mode)로 조절하여 2~4분 동안 조사하는 것이 바람직한데, 마이크로파의 조사시간은 2분 미만이면 금나노입자가 형성되지 않아 바람직하지 않고, 4분을 초과하면 형성된 금나노입자가 용기의 표면에 흡착하여 바람직하지 않다.The microwave is preferably irradiated for 2 to 4 minutes by adjusting the microwave oven in the strong mode (strong mode), the microwave irradiation time is less than 2 minutes is not preferable because the gold nanoparticles are not formed, 4 minutes If it exceeds, the formed gold nanoparticles adsorb on the surface of the container, which is not preferable.
본 발명에 따른 단백질로 안정화된 금나노입자는 상기 제조방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 한다.Gold nanoparticles stabilized with a protein according to the invention is characterized in that it is prepared by the above production method.
이하, 바람직한 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to preferred examples, but the scope of the present invention is not limited to these examples.
<물성 측정 방법>≪ Method for measuring physical properties &
1. 콜로이드 금나노입자의 분산도 및 광학 특성은 UV-가시 분광법(UV-visible spectroscopy)(애질런드 8453)에 의해 측정되었다.1. The dispersion and optical properties of the colloidal gold nanoparticles were measured by UV-visible spectroscopy (Agilent 8453).
2. 단백질로 안정화된 금나노입자의 형성은 X-선 회절분석법(X-ray diffractometry) (Rigaku XRD, Cu radiation, λ=0.1546nm), 투과형 전자 현미경(TEM, JEOL TEM-2100, 가속전압 = 200kV), 및 X-선 광분자분광법(X-ray photoelectron spectroscopy)(화학분석을 위한 전자 분광장치, VG Multilab 2000, Thermo Electron Corp.)에 의해 측정되었다.2. Formation of protein- stabilized gold nanoparticles is characterized by X-ray diffractometry (Rigaku XRD, Cu radiation, λ = 0.1546 nm), transmission electron microscope (TEM, JEOL TEM-2100, acceleration voltage = 200 kV), and X-ray photoelectron spectroscopy (electron spectroscopy for chemical analysis, VG Multilab 2000, Thermo Electron Corp.).
3. 수용액상 금나노입자의 크기 및 표면 전하 특성은 ELS8000(Otsuka Electronics Co., Ltd.)을 사용하여 광산란에 의해 측정되었다.3. The size and surface charge characteristics of the gold nanoparticles in aqueous solution were measured by light scattering using ELS8000 (Otsuka Electronics Co., Ltd.).
<< 실시예Example 및 And 비교예Comparative Example >>
실시예Example 1 One
칼륨테트라클로로아우르산염(Ⅲ)(2.6mM)(시그마 알드리치)와 난백 리소자임(chicken egg white lysozyme, 제조사: SERVA Electrophoresis)(0.07mM)(분자량: ca. 14,400kg/mol)을 4mL의 물에 준비하였다. 유리 바이알 내의 상기 혼합물을, 마이크로웨이브 오븐 내에 넣고, 마이크로웨이브 오븐을 "스트롱 모드(strong mode)"(최대전력 1050W에서의 주파수 2450MHz, LG microwave, M-206A)로 조절한 후, 2분 동안 반응시켰다. 상기 리소자임과 칼륨테트라클로로아우르산염(Ⅲ) 사이의 몰비율은 0.027이었고, 제조된 리소자임으로 안정화된 금나노입자의 측정결과는 도 5, 도 6 및 표 2에 나타내었다.Potassium tetrachloroaurate (III) (2.6 mM) (Sigma Aldrich) and egg egg white lysozyme (Manufacturer: SERVA Electrophoresis) (0.07 mM) (molecular weight: ca. 14,400 kg / mol) were prepared in 4 mL of water. It was. The mixture in the glass vial was placed in a microwave oven and the microwave oven was adjusted to "strong mode" (frequency 2450 MHz at maximum power 1050 W, LG microwave, M-206A) and then reacted for 2 minutes. I was. The molar ratio between the lysozyme and potassium tetrachloroaurate (III) was 0.027, and the measurement results of the prepared gold nanoparticles stabilized with lysozyme are shown in FIGS. 5, 6, and 2.
실시예Example 2 2
칼륨테트라클로로아우르산염(Ⅲ)(2.6mM) 및 난백 리소자임(0.09mM)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하였으며, 상기 리소자임과 금염사이의 몰비율은 0.034이었고, 제조된 금나노입자의 측정결과는 도 5, 도 6 및 표 2에 나타내었다.Except for using potassium tetrachloroaurate (III) (2.6mM) and egg white lysozyme (0.09mM) was prepared in the same manner as in Example 1, the molar ratio between the lysozyme and gold salt was 0.034, the prepared gold The measurement results of the nanoparticles are shown in FIGS. 5, 6 and Table 2.
실시예Example 3 3
칼륨테트라클로로아우르산염(Ⅲ)(2.6mM) 및 난백 리소자임(0.105mM)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하였으며, 상기 리소자임과 금염사이의 몰비율은 0.040이었고, 제조된 금나노입자의 측정결과는 도 5, 도 6 및 표 2에 나타내었다.Except for using potassium tetrachloroaurate (III) (2.6mM) and egg white lysozyme (0.105mM) was prepared in the same manner as in Example 1, the molar ratio between the lysozyme and gold salt was 0.040, the prepared gold The measurement results of the nanoparticles are shown in FIGS. 5, 6 and Table 2.
(총합)3) Number of particles counted
(Total) 3)
(nm)4) Average size
(nm) 4)
±2.48-23.99
± 2.48
±1.1120.49
± 1.11
주) 1) 콜로이달 입자 간의 정전기 상호작용의 크기의 인덱스로 사용되는 것으로, 용액의 안정성을 측정한다. 즉, -30mV 미만 또는 30 mV을 초과하는 제타 포텐셜을 갖는 입자는 정전기적 상호작용으로부터 안정하다고 할 수 있으나, -30mV 및 30mV 사이의 제타-포텐셜을 갖는 입자는, 그것들이 입체적으로 안정된다면 여전히 안정될 수 있다.NOTE 1) Used as an index of the magnitude of the electrostatic interaction between colloidal particles, the stability of the solution is measured. That is, particles having a zeta potential below -30 mV or above 30 mV can be said to be stable from electrostatic interactions, while particles with a zeta-potential between -30 mV and 30 mV are still stable if they are stericly stable. Can be.
2), 3) 및 4) TEM 이미지에 의해 측정됨.2), 3) and 4) measured by TEM image.
표 2, 도 5 및 도 6에 나타낸 바와 같이, 실시예 1~3은 마이크로파 조사에 의해 균일한 모양을 갖는 리소자임으로 안정화된 금나노입자가 규칙적인 다양한 모양으로 균일하게 생성되었음을 알 수 있다.As shown in Table 2, Figure 5 and Figure 6, Examples 1 to 3 it can be seen that the gold nanoparticles stabilized with lysozyme having a uniform shape by microwave irradiation was uniformly produced in a variety of regular shapes.
하기 표 3은 X-선 광전자 분광기에 의해 리소자임 및 실시예 1~3의 리소자임으로 안정화된 금나노입자의 형성을 확인하는 결합에너지의 값을 나타내었다.Table 3 below shows the binding energy values confirming the formation of lysozyme and gold nanoparticles stabilized with lysozyme of Examples 1 to 3 by X-ray photoelectron spectroscopy.
비교예Comparative Example 1 One
칼륨테트라클로로아우르산염(Ⅲ)(12mM) 및 난백 리소자임(1mM)을 4mL의 물에서 혼합시킨 후, 6개월 이상을 유지하였다. 상기 리소자임과 금염사이의 몰비율은 0.083이었으며, 제조된 금나노입자의 측정결과는 도 5에 나타내었고, 흡광도가 545nm에서 매우 약한 SPR이 나타나므로써, 매우 적은 양의 금나노입자가 형성되었음을 알 수 있다.Potassium tetrachloroaurate (III) (12 mM) and egg white lysozyme (1 mM) were mixed in 4 mL of water and maintained for at least 6 months. The molar ratio between the lysozyme and the gold salt was 0.083, and the measurement results of the prepared gold nanoparticles are shown in FIG. 5, and the light absorbance showed very weak SPR at 545 nm, indicating that very small amounts of gold nanoparticles were formed. have.
비교예Comparative Example 2 2
칼륨테트라클로로아우르산염(Ⅲ)(2.6mM) 및 난백 리소자임(0.05mM)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하였으며, 상기 리소자임과 금염사이의 몰비율은 0.019이었고, 제조된 금나노입자의 형성을 측정한 결과 금나노입자는 나타나지 않았다.Except for using potassium tetrachloroaurate (III) (2.6mM) and egg white lysozyme (0.05mM) was prepared in the same manner as in Example 1, the molar ratio between the lysozyme and gold salt was 0.019, the prepared gold As a result of measuring the formation of nanoparticles, gold nanoparticles did not appear.
비교예Comparative Example 3 3
칼륨테트라클로로아우르산염(Ⅲ)(2.6)mM 및 난백 리소자임(0.122mM)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하였으며, 상기 리소자임과 금염사이의 몰비율은 0.047이었고, 제조된 금나노입자는 도 4에 나타낸 바와 같이 매우 불규칙한 형태의 금나노입자가 합성되었다.Except for using potassium tetrachloroaurate (III) (2.6) mM and egg white lysozyme (0.122 mM) was prepared in the same manner as in Example 1, the molar ratio between the lysozyme and gold salt was 0.047, the gold produced As shown in FIG. 4, gold nanoparticles having a very irregular shape were synthesized.
비교예Comparative Example 4 4
마이크로파를 30초간 조사한 것을 제외하고는 실시예 3과 동일한 방법으로 제조하였다. TEM 이미지의 결과 제조된 금나노입자가 발견되지 않았다.It was prepared in the same manner as in Example 3 except that the microwave was irradiated for 30 seconds. As a result of the TEM image, no manufactured gold nanoparticles were found.
비교예Comparative Example 5 5
마이크로파를 5분간 조사한 것을 제외하고는 실시예 3과 동일한 방법으로 제조하였으나, 형성된 나노입자가 용기 표면에 흡착되는 결과를 나타냈다.Except that the microwave was irradiated for 5 minutes, it was prepared in the same manner as in Example 3, but the resulting nanoparticles were adsorbed on the surface of the container.
비교예Comparative Example 6 6
마이크로웨이브 오븐을 위크 모드(weak mode)로 설정한 것을 제외하고는 실시예 3과 동일한 방법으로 제조하였다. TEM 이미지의 결과 제조된 금나노입자가 발견되지 않았다.A microwave oven was prepared in the same manner as in Example 3 except that the microwave oven was set to a weak mode. As a result of the TEM image, no manufactured gold nanoparticles were found.
상기 실시예 1~3 및 비교예 1~6에 나타낸 바와 같이, 실시예 1~3은 균일하고 다양한 형상의 리소자임으로 안정화된 금나노입자를 제조할 수 있었으나, 본 발명의 범위를 벗어나는 비교예 1~6의 경우에는 리소자임과의 결합이 형성되지 않아 금나노입자를 얻을 수 없거나, 또는 불규칙한 형태의 금나노입자를 얻었다.As shown in Examples 1 to 3 and Comparative Examples 1 to 6, Examples 1 to 3 were able to produce gold nanoparticles stabilized by lysozyme of uniform and various shapes, Comparative Example 1 outside the scope of the present invention In the case of ˜6, gold nanoparticles could not be obtained because no bond with lysozyme was formed, or gold nanoparticles having an irregular shape were obtained.
비교예Comparative Example 7 7
공지된 Langmuir 2007, 23, (21), 10533에 기재되어 있는 방법으로부터 수소화 붕소나트륨을 환원제로 사용하여 리소자임으로 안정화된 금나노입자를 제조하였다.Gold nanoparticles stabilized with lysozyme were prepared using sodium borohydride as the reducing agent from the method described in known Langmuir 2007, 23, (21), 10533.
<생체 외(<In vitro ( inin vitrovitro )에서의 세포독성 측정>Cytotoxicity Measurement at
상기 실시예 1~3 및 비교예 7에서 제조된 리소자임으로 안정화된 금나노입자의 세포독성은 온도 감응성 우태아혈청(FBS, WelGENE Inc.) 및 1% 항생제(WelGENE Inc.)를 포함하는 RPMI 1640 (WelGENE Inc.) 내의 생쥐배아섬유아 NIH-3T3세포를 이용하여 MTT(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움브로마이드)비색분석법(colorimetric assay)을 사용하여 측정하였다. 상기 NIH-3T3세포들은 한국세포주은행(KCLB)으로부터 구입하였으며, 상기 세포들을 5×103 cells/well의 농도에서 96-웰 플레이트(well plate)에 뿌린 후, 하룻밤 동안(37℃, 5% CO2) 배양하였다. 24시간 후에, 상기 배지를 다른 농도의 샘플을 포함하는 새로운 배지로 대체하였고, 그런 다음 1일과 3일 동안 배양하였다. 이어서 새로운 배지와 MTT 용액(PBS 내에서 5mg/ml, 티아조일 블루 테트라졸리움 브로마이드(MTT), >= 97.5% TLC, Sigma-Aldrich)을 첨가하였고, DMSO(Junsei Chemical Co., Ltd)를 MTT 포르마잔을 용해시키기 위해 첨가하였다. 마지막으로 상기 용액이 포함된 96-웰 플레이를 570nm에서 효소 면역 반응 측정기(Microplate Reader; 단백질 시료분석) (FL600, Microplate Fluorescence Reader, Bio-Tek)를 사용하여 측정하였다.Cytotoxicity of the lysozyme stabilized gold nanoparticles prepared in Examples 1 to 3 and Comparative Example 7 was RPMI 1640 containing a temperature sensitive fetal calf serum (FBS, WelGENE Inc.) and 1% antibiotic (WelGENE Inc.) MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide) colorimetric assay using mouse embryonic fibroblast NIH-3T3 cells in WelGENE Inc. ) Was measured. The NIH-3T3 cells were purchased from the Korea Cell Line Bank (KCLB), and the cells were seeded in a 96-well plate at a concentration of 5 × 10 3 cells / well, and then overnight (37 ° C., 5% CO). 2 ) incubated. After 24 hours, the medium was replaced with fresh medium containing different concentrations of samples and then incubated for 1 and 3 days. Fresh medium and MTT solution (5 mg / ml in PBS, thiazoyl blue tetrazolium bromide (MTT),> = 97.5% TLC, Sigma-Aldrich) were then added and DMSO (Junsei Chemical Co., Ltd) was added to the MTT form Mazan was added to dissolve. Finally, 96-well play containing the solution was measured at 570 nm using an enzyme immunoplate assay (Microplate Reader; Protein Sample Analysis) (FL600, Microplate Fluorescence Reader, Bio-Tek).
도 10(a)를 참고로 하면, 200㎍/ml에서 1일 동안 배양한 실시예 1~3은 세포 생존율이 약 83~약 100%로, 비교예 7의 세포 생존율인 약 50%보다 훨씬 우수한 수치를 나타냄을 알 수 있고, Referring to FIG. 10 (a), Examples 1 to 3 cultured at 200 μg / ml for 1 day had a cell viability of about 83 to about 100%, far superior to the cell viability of Comparative Example 7, about 50%. You can see that it represents a number,
또한, 도 10(b)를 참고로 하면, 200㎍/ml에서 3일 동안 배양한 세포 생존율 또한, 실시예 1~3은 약 55~약 72%인 반면에 비교예 7은 약 25% 이하이므로 실시예 1~3의 세포 생존율이 비교예 7의 세포 생존율보다 훨씬 높음을 알 수 있다.In addition, referring to Figure 10 (b), cell viability incubated for 3 days at 200 µg / ml Also, Examples 1 to 3 is about 55 to about 72% whereas Comparative Example 7 is about 25% or less It can be seen that the cell viability of Examples 1 to 3 is much higher than the cell viability of Comparative Example 7.
이는 강한 환원제인 수소화 붕소나트륨을 사용한 비교예 7은 수소화 붕소나트륨이 독성이 있기 때문에, 세포 생존율이 떨어짐을 알 수 있다.This can be seen that in Comparative Example 7 using sodium borohydride, which is a strong reducing agent, because sodium borohydride is toxic, cell viability is reduced.
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| Hui Wei et al. Analyst. June 2010, Vol. 135, pp. 1406-1410* |
| Zhi Liang Jiang et al. Chinese Chemical Letters. 2001, Vol. 12, No. 6, pp. 551-554 * |
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