KR101371851B1

KR101371851B1 - A Composition for Preventing Bird Flu Comprising Mx gene

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Publication number: KR101371851B1
Application number: KR1020110018242A
Authority: KR
Inventors: 양주성; 최시우; 진영훈; 류재규; 송창선; 허강녕
Original assignee: 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2011-02-28
Filing date: 2011-02-28
Publication date: 2014-03-14
Also published as: KR20120101247A

Abstract

본 발명은 조류인플루엔자 바이러스의 세포내 증식을 억제할 수 있는 Mx 단백질, 상기 Mx 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 조류독감 예방용 조성물, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 조류독감 예방용 DNA 백신 및 상기 폴리뉴클레오티드, 벡터, 조성물 또는 DNA 백신을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 조류독감을 예방하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법을 이용하면, 조류인플루엔자 바이러스의 감염에 의하여 야기되는 세포의 괴사 및 조류인플루엔자 바이러스의 증식을 억제할 수 있으므로, 조류인플루엔자 바이러스에 의해 발병되는 조류독감의 예방에 널리 활용될 수 있을 것이다.The present invention provides an Mx protein capable of inhibiting intracellular proliferation of avian influenza virus, a polynucleotide encoding the Mx protein, a vector comprising the polynucleotide, a composition for preventing avian influenza comprising the polynucleotide, or the vector. A method of preventing avian influenza comprising a DNA vaccine for preventing avian influenza comprising a polynucleotide or a vector and administering the polynucleotide, a vector, a composition or a DNA vaccine to a subject. By using the method of the present invention, it is possible to suppress necrosis of cells caused by avian influenza virus and proliferation of avian influenza virus, and thus will be widely used for the prevention of avian influenza caused by avian influenza virus. .

Description

Ｍｘ 유전자를 포함하는 조류독감 예방용 조성물{A Composition for Preventing Bird Flu Comprising Mx gene}A composition for preventing avian influenza comprising the MV gene {A Composition for Preventing Bird Flu Comprising Mx gene}

본 발명은 Mx 유전자를 포함하는 조류독감 예방용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 본 발명은 조류인플루엔자 바이러스의 세포내 증식을 억제할 수 있는 Mx 단백질, 상기 Mx 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 조류독감 예방용 조성물, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 조류독감 예방용 DNA 백신 및 상기 폴리뉴클레오티드, 벡터, 조성물 또는 DNA 백신을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 조류독감을 예방하는 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a composition for preventing avian influenza comprising the Mx gene, and more particularly, the present invention relates to an Mx protein capable of inhibiting intracellular proliferation of avian influenza virus, a polynucleotide encoding the Mx protein, and the poly A vector comprising a nucleotide, the polynucleotide or a bird flu prevention composition comprising the vector, a bird flu prevention DNA vaccine comprising the polynucleotide or vector and the polynucleotide, vector, composition or DNA vaccine for administering to the subject It relates to a method for preventing bird flu comprising the step.

인플루엔자 바이러스(Influenza virus)는 오르소믹소 계통(Family Orthomyxoviridae)에 속하는 RNA 바이러스로서 혈청형은 A형, B형 또는 C형 3가지로 구분된다. 그 중 A형은 사람, 말, 돼지, 기타 포유류 그리고 다양한 종류의 가금과 야생조류에서 감염이 확인되고 있어, 조류인플루엔자(Avian Influenza)라고도 알려져 있다(Selmons et al., Avian Dis., 18(1):119-124(1974); Turek R et al., Acta Virol., 27(6):523-527(1983); Webster RG et al., Microbiol Rev., 56(1):152-179(1992)). 이러한 조류인플루엔자는 전파가 빠르고 병원성이 다양하며, 닭, 칠면조, 야생 조류 등 여러 종류의 조류에 감염되며, 주로 닭과 칠면조에 피해를 주는 급성 바이러스성 전염병이다. 특히, 오리는 감염되더라도 임상증상이 잘 나타나지 않는 질병으로서, 이 중 고병원성 조류 인플루엔자(HPAI, Highly Pathogenic Avian Influenza)는 국제수역사무국(OIE)에서도 보고 의무가 있는 질병으로 규정하고 있으며, 1997년 홍콩에서의 조류인플루엔자바이러스에 의한 인체감염 사례가 처음 보고된 이래, 공중보건학적 측면에서도 매우 중요시되고 있는 질병이다.Influenza virus is an RNA virus belonging to the family Orthomyxoviridae, and serotypes are divided into three types: A, B or C. Among them, type A is known to be infected by humans, horses, pigs, other mammals, and various kinds of poultry and wild birds, also known as Avian Influenza (Selmons et al., Avian Dis., 18 (1) : 119-124 (1974); Turek R et al., Acta Virol., 27 (6): 523-527 (1983); Webster RG et al., Microbiol Rev., 56 (1): 152-179 ( 1992). The avian influenza is spread quickly and pathogenic, and is infected with various kinds of birds, such as chickens, turkeys, wild birds, mainly acute viral infectious diseases that damage chickens and turkeys. In particular, duck is a disease that does not show any clinical symptoms even if it is infected. Among them, Highly Pathogenic Avian Influenza (HPAI) is required to be reported by the International Water Agency (OIE). Since the first case of human infection caused by avian influenza virus has been reported, it is a disease that is very important in public health.

조류인플루엔자 바이러스의 혈청형은 바이러스 표면의 두 가지 단백질인 생물학적 글루티닌(Hemagglutinin, HA) 및 뉴라미니다아제(Neuraminidase, NA)의 종류에 따라 구분되며, 혈청형에 따라 144종류(HA 단백질 16종 및 NA 단백질 9종)로 분류할 수 있다. 상기 HA는 바이러스가 체세포에 부착하는 역할을 하며, NA는 바이러스가 세포 내로 침투할 수 있도록 하는 것으로 알려져 있는데(Alexander DJ, Vet. Microbiol., 74(1-2):3-13(2000)), 전 세계적으로 야생조류에 대한 인플루엔자 감염 역학조사를 실시한 결과 현존하는 모든 16종의 HA형과 9종의 NA형 인플루엔자 바이러스가 야생조류에서 감염되고 있음이 확인되었다(Selmons et al., Avian Dis., 18(1):119-124(1974)). A형으로 분류되는 조류인플루엔자 바이러스는 인수(人獸) 공통 전염병 바이러스로, 병원성에 따라 닭에 감염 시 가벼운 호흡기 증상을 유발하는 비병원성 조류 인플루엔자, 1-30% 내외의 폐사와 산란 저하를 유발하는 저병원성 조류인플루엔자(Low pathogenic avian influenza, LPAI) 그리고 95% 이상의 높은 치사율을 보이고 "조류독감(버드플루: Bird flu)"이라고도 불리는 고병원성 조류 인플루엔자(Highly pathogenic avian influenza, HPAI) 등 크게 3가지 병형으로 구분하고 있다(Alexander DJ, Vet. Microbiol., 74(1-2):3-13(2000)). Serotypes of avian influenza viruses are classified according to the two types of proteins on the surface of the virus, biological glutinin (Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA), and 144 types (HA protein 16) Species and 9 NA proteins). The HA is responsible for attaching the virus to somatic cells, and NA is known to allow the virus to penetrate into cells (Alexander DJ, Vet. Microbiol., 74 (1-2): 3-13 (2000)). A global epidemiological study of influenza infection in wild birds confirms that all existing 16 HA and 9 NA influenza viruses are infected in wild birds (Selmons et al., Avian Dis. , 18 (1): 119-124 (1974)). Avian influenza virus, classified as type A, is a common infectious disease virus, a non-pathogenic avian influenza that causes mild respiratory symptoms when infected with chickens, and is low pathogenic, causing death and scattering around 1-30%. Low pathogenic avian influenza (LPAI) and high pathogenic avian influenza (HPAI) with a high mortality rate of more than 95% and also called "bird flu" (Alexander DJ, Vet. Microbiol., 74 (1-2): 3-13 (2000)).

고병원성 조류 인플루엔자(HPAI)는 1980년도 이후 미국, 호주, 파키스탄 또는 홍콩 등 전 세계적으로 발생이 확인되고 있다. 특히 2003년 12월 한국을 시작으로 2004년 베트남, 일본 또는 태국 등 동남아시아와 극동아시아전 지역에서 거의 동시 다발적으로 혈청형 A/H5N1 고병원성 조류 인플루엔자가 발생되었다. 특히 베트남과 태국 등지에서 발생한 고병원성 조류 인플루엔자는, 인체에 감염이 안되는 전통적인 고병원성 조류 인플루엔자와는 달리 감염조류와 접촉 시 인체 감염이 가능한 변이형 조류독감(변이형 A/H5N1 HPAI) 바이러스임이 확인되었다(Song CS et al., Korean J.Poult. Sci., 31(2):129-136(2004)).High pathogenic avian influenza (HPAI) has been confirmed worldwide since 1980, including the United States, Australia, Pakistan or Hong Kong. In particular, in December 2003, serotype A / H5N1 highly pathogenic avian influenza occurred in Southeast Asia and the Far East Asia, including Vietnam, Japan or Thailand, in 2004. In particular, the highly pathogenic avian influenza in Vietnam and Thailand has been confirmed to be a mutant avian influenza (mutant A / H5N1 HPAI) virus that can infect a human body when contacted with an infected algae, unlike the traditional highly pathogenic avian influenza which does not infect the human body. Song CS et al., Korean J. Poult. Sci., 31 (2): 129-136 (2004).

인플루엔자 바이러스는 호흡기에 감염되어 전신증상을 일으키고, 주기적으로 모습을 바꿀 뿐 아니라, 숙주를 죽이지 않고 숙주가 죽기 전에 다른 숙주로 이동하기도 하는데, 이에 대한 예방백신이 개발되어 있기는 하지만 바이러스의 변이를 따라 잡지는 못하고 있는 실정이며, 아직 근본적인 바이러스 치료는 이루어지지 않고 있다. 한편, 아만타딘(amantadine)과 리만타딘(rimantadine)은 인플루엔자 바이러스의 M2 이온채널 단백질의 기능을 억제하는 물질로 생체 내 인플루엔자 바이러스의 증식을 억제하는 대표적인 항바이러스 제제들이다. 그러나 이들 두 가지 항바이러스 제제들은 인플루엔자 바이러스 M2 단백질의 이온채널기능에 영향을 미치지 못하는 변이 바이러스의 출현이 매우 쉽게 일어나는 단점이 있는 것으로 확인되고 있다. 이러한 단점을 보완하기 위하여 개발된 자나미비르(zanamivir)와 오셀타미비르(oseltamivir; 타미플루)는 인플루엔자 바이러스의 뉴라미니다제(neuraminidase) 단백질의 기능을 억제하는 물질로 생체 내 인플루엔자 바이러스의 증식을 억제하는 대표적인 항바이러스 제제들이다. 그러나 자나미비르는 흡입 및 정맥 투여해야 하는 단점이 있으며, 오셀타미비르는 경구투여가 가능하나 최근 내성 바이러스의 출현 보고와 경구투여시 구토와 현기증 등의 부작용이 있어 단점으로 지적되고 있다(Ward P et al., J. antimicrob. Chemother., 55:15-121(2005)).Influenza viruses infect the respiratory system, causing systemic symptoms, periodic changes in appearance, and not killing the host, but moving to another host before the host dies. Although the vaccine has been developed against it, The magazine is not available yet, and the fundamental virus treatment is not done yet. Meanwhile, amantadine and rimantadine are substances that inhibit the function of M2 ion channel protein of influenza virus and are representative antiviral agents that inhibit the growth of influenza virus in vivo. However, these two antiviral agents have been found to have the disadvantage that the emergence of a mutant virus that does not affect the ion channel function of the influenza virus M2 protein is very easy. Zanamivir and oseltamivir (Tamiflu), which are developed to compensate for these disadvantages, are substances that inhibit the function of the neuraminidase protein of influenza virus and inhibit the proliferation of influenza virus in vivo. Representative antiviral agents. However, zanamivir has the disadvantage of inhalation and intravenous administration, while oseltamivir can be administered orally, but it has been pointed out as a disadvantage due to side effects such as recent reports of the emergence of resistant virus and vomiting and dizziness upon oral administration (Ward P et. al., J. antimicrob. Chemother., 55: 15-121 (2005)).

한편, Mx 단백질은 단량체 GTPase로서, 바이러스 복제를 억제하므로, 일반적으로는 항바이러스 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다(Samuel, Virology 183:1-11(1991)). 이러한 Mx의 항바이러스 효과는 음성 가닥 RNA 바이러스(예를 들면 오소믹소바이러스(orthomyxovirus))를 대상으로 하여 검증되었으나, Mx 단백질 자체는 제1형 인터페론(IFN) 수용체를 갖는 모든 세포에서 발현되는데, 상기 Mx 단백질을 암호화하는 유전자는 바이러스의 감염에 대응하여 유도되는 체내의 IFN의 수준상승에 반응하여, 그의 발현이 유도되는 것으로 알려져 있다(Bazzigher, L., et al., Virology, 186:154-160, 1992). 이처럼 Mx 단백질의 발현은 체내의 IFN의 수준에 의존적이기 때문에, 체내의 IFN의 수준을 증가시키는 급성 및 만성 바이러스 감염시에도 Mx 단백질이 동일하게 발현된다(Fernandez, M., et al., J. Infectious Diseases, 180:262-267, 1999). On the other hand, the Mx protein is a monomeric GTPase, which inhibits viral replication, and thus is generally known to have an antiviral effect (Samuel, Virology 183: 1-11 (1991)). This antiviral effect of Mx has been demonstrated in negative strand RNA viruses (eg, orthomyxovirus), but the Mx protein itself is expressed in all cells with type 1 interferon (IFN) receptors. Genes encoding Mx proteins are known to induce their expression in response to elevated levels of IFN in the body induced in response to viral infections (Bazzigher, L., et al., Virology, 186: 154-160). , 1992). Since expression of Mx protein is dependent on the level of IFN in the body, the Mx protein is expressed equally in acute and chronic viral infections that increase the level of IFN in the body (Fernandez, M., et al., J. Infectious Diseases, 180: 262-267, 1999).

이러한 Mx 단백질은 지금까지는 바이러스성 질환의 진단에 사용되거나(Halminen, M, et al., Pediatric Research, 41(5):647-650, 1997; Forster, J., et al., Acta Paediatr., 85:163-167, 1996; Chieux V., J. Virological Methods, 70:183-191, 1998; Haller et al., Rev. Sci. Tech. 17:220-230, 1998), 환자 체내의 인터페론의 수준을 결정하기 위하여 사용되거나(미국특허 제 6,200,559(von Wussow); von Wussow, P., et al., AIDS, 4(2):119-124, 1990, Nieforth, KA, et al., Clinical Pharmacology & Therapeutics, 59(6):636-646, 1996; Oh, SK, J. Immunological Methods, 176:79-91, 1994), 인터페론 생산용 마커로서 사용되었을 뿐(Roers, A., et al., J. Infectious Disease, 169:807-813, 1994), 이를 이용하여 바이러스의 감염을 예방하는 기술은 지금까지 보고되지 않았다.Such Mx proteins have been used to date for the diagnosis of viral diseases (Halminen, M, et al., Pediatric Research, 41 (5): 647-650, 1997; Forster, J., et al., Acta Paediatr., 85: 163-167, 1996; Chieux V., J. Virological Methods, 70: 183-191, 1998; Haller et al., Rev. Sci. Tech. 17: 220-230, 1998), of interferon in the patient's body Used to determine levels (US Pat. No. 6,200,559 (von Wussow); von Wussow, P., et al., AIDS, 4 (2): 119-124, 1990, Nieforth, KA, et al., Clinical Pharmacology & Therapeutics, 59 (6): 636-646, 1996; Oh, SK, J. Immunological Methods, 176: 79-91, 1994), only used as markers for interferon production (Roers, A., et al., J. Infectious Disease, 169: 807-813, 1994), and techniques for preventing viral infection using it have not been reported until now.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 Mx 단백질과 조류인플루엔자 감염간의 관련성에 대해 예의 연구한 결과, Mx 단백질이 발현된 세포는 조류인플루엔자 바이러스의 감염에 대해 저항성을 나타내어, 조류인플루엔자 바이러스의 감염에 의한 세포괴사를 방지할 수 있을 뿐만 아니라, 감염된 세포내에서 조류인플루엔자 바이러스의 증식을 억제할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
Under these backgrounds, the present inventors have conducted extensive studies on the relationship between Mx protein and avian influenza infection. As a result, cells expressing Mx protein are resistant to infection with avian influenza virus, thereby preventing cell death by avian influenza virus infection. In addition to preventing, it was confirmed that the proliferation of avian influenza virus in infected cells was completed and the present invention was completed.

본 발명의 목적은 조류인플루엔자 바이러스의 세포내 증식을 억제할 수 있는 변이된 Mx 단백질을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a mutated Mx protein capable of inhibiting intracellular proliferation of avian influenza virus.

본 발명의 다른 목적은 상기 변이된 Mx 단백질을 암호화하는 유전자를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a gene encoding the mutated Mx protein.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide an expression vector containing the gene.

본 발명의 또 다른 목적은 세포내에서 조류인플루엔자 바이러스의 증식을 억제할 수 있는 Mx 단백질을 암호화하는 Mx 유전자를 포함하는 조류독감 예방용 조성물을 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide a composition for preventing avian influenza comprising an Mx gene encoding an Mx protein capable of inhibiting proliferation of avian influenza virus in a cell.

본 발명의 또 다른 목적은 세포내에서 조류인플루엔자 바이러스의 증식을 억제할 수 있는 Mx 단백질을 암호화하는 Mx 유전자를 포함하는 DNA 백신을 제공하는 것이다.It is still another object of the present invention to provide a DNA vaccine comprising an Mx gene encoding an Mx protein capable of inhibiting the proliferation of avian influenza virus in a cell.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 Mx 단백질을 암호화하는 유전자, 상기 조성물 또는 상기 DNA 백신을 개체에 투여하여 조류독감을 예방하는 방법을 제공하는 것이다.
Still another object of the present invention is to provide a method for preventing avian influenza by administering a gene encoding the Mx protein, the composition or the DNA vaccine to a subject.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시양태에 의하면, 본 발명의 조류인플루엔자 바이러스의 세포내 증식을 억제할 수 있는 변이된 Mx 단백질은 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함한다.
In order to achieve the above object, according to one embodiment of the present invention, the mutated Mx protein capable of inhibiting the intracellular proliferation of the avian influenza virus of the present invention comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2.

통상적으로 Mx 단백질은 단량체 GTPase로서, 바이러스 복제를 억제함에 따라 항바이러스 효과를 나타내는 것으로 알려져 있으므로, 상기 Mx 단백질을 암호화하는 유전자를 세포내에서 과발현시킬 경우, 조류인플루엔자 바이러스에 대한 저항성을 향상시킬 수 있을 것으로 예상하고, 이를 확인하려는 연구가 계속적으로 진행되어 왔으나, 지금까지는 Mx 단백질을 암호화하는 유전자를 세포내에서 과발현시킨다 하여도 조류인플루엔자 바이러스에 대한 저항성이 유의하게 변화되는 결과를 얻지는 못하였다(Benfield et al., JOURNAL OF VIROLOGY, p.7533-7539, 2008).
Typically, the Mx protein is a monomeric GTPase, which is known to have an antiviral effect by inhibiting viral replication. Therefore, when the gene encoding the Mx protein is overexpressed in the cell, resistance to avian influenza virus may be improved. Although studies have been conducted to confirm this, until now, overexpression of a gene encoding the Mx protein in the cell has not resulted in a significant change in resistance to avian influenza virus (Benfield). et al., JOURNAL OF VIROLOGY, p. 7533-7539, 2008).

본 발명자들은 Mx 단백질을 암호화하는 유전자를 세포내에서 과발현시킨다 하여도 조류인플루엔자 바이러스에 대한 저항성이 유의하게 변화되는 결과를 얻지는 못하는 이유가 Mx 유전자의 다형(polymorphism) 때문인 것으로 예상하였는 바, 다양한 다형을 가지는 Mx 유전자를 대상으로 하여 세포에 조류인플루엔자 바이러스에 대한 저항성을 유의하게 향상시키는 유전자(서열번호 3)를 검색하였다. 그 결과, 뉴클레오티드 상에서 10개의 염기가 변형되고 이에 따라 3개의 아미노산 서열이 변이된 Mx 단백질을 암호화하는 유전자가 세포내에 세포내에서 과발현될 경우, 조류인플루엔자 바이러스에 대한 저항성이 유의하게 향상됨을 확인하였다[뉴클레오티드(아미노산 변이) : A78C, A99G, A281G, C792T(Q->R), G813A, A922G(V->I), G1015A(T->A), C1203A, C1450T, G1545A].The inventors expected that the polymorphism of the Mx gene does not result in a significant change in resistance to avian influenza virus even when the gene encoding the Mx protein is overexpressed in the cell. Mx genes were detected for genes that significantly improved resistance to avian influenza virus (SEQ ID NO: 3). As a result, it was confirmed that the resistance to avian influenza virus is significantly improved when the gene encoding the Mx protein, which is modified on 10 nucleotides and thus 3 amino acid sequences on nucleotides, is overexpressed intracellularly. Nucleotides (amino acid variations): A78C, A99G, A281G, C792T (Q-> R), G813A, A922G (V-> I), G1015A (T-> A), C1203A, C1450T, G1545A].

아울러, 조류인플루엔자 바이러스에 대한 내재적 저항성이 높은 닭에서 얻어진 Mx 유전자는 통상적으로 631번 아미노산이 아스파라긴인 것으로 알려져 있고, 반대로 조류인플루엔자 바이러스에 대한 내재적 저항성이 낮은 닭에서 얻어진 Mx 유전자는 통상적으로 631번 아미노산이 세린인 것으로 알려져 있으므로, 631번 아미노산이 아스파라긴인 단백질(서열번호 1)을 암호화하는 상기 검색된 유전자(서열번호 3)를 변이시켜 631번 아미노산이 세린인 단백질(서열번호 2)을 발현할 수 있는 변이된 유전자(서열번호 4)를 수득하고, 변이되지 않은 유전자(서열번호 3)와 변이된 유전자(서열번호 4)가 각각 도입된 세포가 나타내는 조류인플루엔자 바이러스에 대한 저항성에 차이가 있는지의 여부를 확인하고자 하였다. 그 결과, 변이되지 않은 유전자(서열번호 3)와 변이된 유전자(서열번호 4)가 각각 도입된 세포는 조류인플루엔자 바이러스에 대한 저항성에서 유의한 차이를 나타내지 않음을 확인하였다.In addition, the Mx gene obtained from chickens with high intrinsic resistance to avian influenza virus is generally known as amino acid 631 asparagine, whereas the Mx gene obtained from chickens with low resistance to avian influenza virus is typically amino acid 631 Since it is known to be serine, it is possible to express the protein (SEQ ID NO: 2) which is serine amino acid 631 by mutating the searched gene (SEQ ID NO: 3), which encodes the protein of amino acid 631 (SEQ ID NO: 1). Obtaining a mutated gene (SEQ ID NO: 4) and determining whether there is a difference in resistance to avian influenza virus represented by the cells into which the mutated gene (SEQ ID NO: 3) and the mutated gene (SEQ ID NO: 4) are introduced, respectively. It was intended to confirm. As a result, it was confirmed that the cells into which the mutated gene (SEQ ID NO: 3) and the mutated gene (SEQ ID NO: 4) were introduced did not show a significant difference in resistance to avian influenza virus.

상기 각 유전자를 도입한 세포에 조류인플루엔자 바이러스를 감염시키고, 시간의 경과에 따라 상기 세포에서 발현된 조류인플루엔자 바이러스유래 단백질의 수준을 측정한 결과, 바이러스유래 단백질의 수준이 감소됨을 확인하였다. 아울러, 호흡기를 통해 감염되는 바이러스의 주된 타깃이 되는 호흡기도 내 상피세포에서 상기 유전자를 도입한 다음, 조류인플루엔자 바이러스를 감염시키고, 시간의 경과에 따라 상기 세포에서 발현된 조류인플루엔자 바이러스유래 단백질의 수준을 측정한 결과, 호흡기도 내 상피세포에서도 상기 유전자로부터 발현된 Mx 단백질에 의하여 바이러스유래 단백질의 수준이 감소됨을 확인하였다.Avian influenza virus was infected to the cells into which each gene was introduced, and as a result of measuring the level of the avian influenza virus-derived protein expressed in the cells over time, it was confirmed that the level of the virus-derived protein was reduced. In addition, the gene is introduced into the epithelial cells in the respiratory tract, which is the main target of the virus infected through the respiratory tract, and then infected with avian influenza virus, and the level of avian influenza virus-derived protein expressed in the cells over time. As a result of the measurement, it was confirmed that the level of virus-derived protein was reduced by Mx protein expressed from the gene even in epithelial cells in the respiratory tract.

한편, Mx 단백질의 발현양과 상대적으로 분석하였을 때 Mx 단백질의 발현양이 증가됨에 따라서 인플루엔자 바이러스 단백질의 발현양이 감소됨을 확인하였을 뿐만 아니라, 상기 유전자가 세포에 도입된 양에 반비례하여 감염된 세포내의 바이러스 역가가 감소되는 것을 확인하였다.
On the other hand, it was confirmed that the expression level of influenza virus protein decreased as the expression level of Mx protein was increased when analyzed relative to the expression level of Mx protein, and the virus in infected cells was inversely proportional to the amount of the gene introduced into the cell. It was confirmed that the titer was reduced.

본 발명의 일 실시양태에 의하면, 본 발명의 조류인플루엔자 바이러스의 세포내 증식을 억제할 수 있는 변이된 Mx 단백질을 암호화하는 유전자는 서열번호 3 또는 4의 염기서열을 포함한다.
According to one embodiment of the invention, the gene encoding the mutated Mx protein capable of inhibiting the intracellular proliferation of the avian influenza virus of the present invention comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or 4.

본 발명의 다른 실시양태에 의하면, 본 발명은 Mx 단백질을 암호화하는 유전자를 유효성분으로 하고, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조류독감 예방용 약제학적 조성물을 제공한다.
According to another embodiment of the present invention, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing avian influenza, comprising a gene encoding the Mx protein as an active ingredient and a pharmaceutically acceptable carrier.

상술한 바와 같이, 본 발명의 Mx 유전자는 세포내에서 과발현될 경우, 상기 세포가 조류인플루엔자 바이러스에 대한 저항성을 나타내게 하므로, 상기 유전자를 유효성분으로 하는 조성물을 이용할 경우, 조류인플루엔자 바이러스에 의해 유발되는 조류독감을 예방할 수 있다.
As described above, when the Mx gene of the present invention is overexpressed in a cell, the cell exhibits resistance to avian influenza virus, and when the composition using the gene as an active ingredient is used, it is induced by avian influenza virus. Bird flu can be prevented.

본 발명의 또 다른 실시양태에 의하면, 본 발명은 Mx 단백질을 암호화하는 유전자를 유효성분으로 하고, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조류독감 예방용 DNA 백신을 제공한다.
According to another embodiment of the present invention, the present invention provides a DNA vaccine for preventing bird flu, comprising a gene encoding the Mx protein as an active ingredient and a pharmaceutically acceptable carrier.

본 발명에서 용어, "DNA백신"이란 기존 단백질 백신과는 다른 형태의 백신으로서 특정 항원을 암호화하며 유전자를 포함하고 있는 플라스미드 형태의 백신을 의미한다. 상기 DNA 백신은 면역화 시 백신 접종자 체내의 수지상 세포를 포함한 다양한 세포에 유입되어, 항원 유전자의 전사 및 항원의 생산을 유도하여, B세포와 T 세포에 항원을 제시 체액성 및 세포성 면역반응을 유도하므로, 인체에 큰 부작용이 없이 체내에서 지속적인 항원 발현을 유도할 수 있고, 세포성 면역 반응을 유도하는 데 보다 효과적이며, 제조와 생산이 쉽고, 상온에서도 안정하므로, 안정적인 보관 및 유통이 용이하다는 장점이 있다.
As used herein, the term "DNA vaccine" refers to a vaccine in the form of a plasmid that encodes a specific antigen and contains a gene as a vaccine different from the existing protein vaccine. The DNA vaccine is introduced into various cells including dendritic cells in the vaccinated body upon immunization, inducing transcription of antigen genes and production of antigens, and presenting antigens to B cells and T cells to induce humoral and cellular immune responses. Therefore, it is possible to induce continuous antigen expression in the body without major adverse effects on the human body, more effective in inducing cellular immune response, easy to manufacture and produce, and stable at room temperature, so that stable storage and distribution are easy. There is this.

본 발명의 다른 측면에 의하면, 본 발명은 상기 Mx 단백질을 암호화하는 유전자, 상기 조성물 또는 상기 DNA 백신을 개체에 투여하여 조류독감을 예방하는 방법을 제공한다.
According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method for preventing avian influenza by administering to a subject a gene encoding the Mx protein, the composition or the DNA vaccine.

본 발명에서 용어, "예방"이란 상기 Mx 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 조성물의 투여로 조류인플루엔자 바이러스 감염에 의한 질환 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. As used herein, the term "prevention" refers to any action of inhibiting or delaying the onset of a disease caused by avian influenza virus infection by administration of a composition comprising the gene encoding the Mx protein.

본 발명에서 용어, "개체"는 조류인플루엔자 바이러스 감염으로 인한 직, 간접적 원인에 의해 유발된 질환을 가진 닭, 오리 등의 가금류를 의미한다. 상기 핵산을 포함하는 본 발명의 유전자, 조성물 또는 DNA 백신을 개체에게 투여함으로써, 상술한 조류인플루엔자 바이러스 감염에 의한 유발되는 조류독감과 같은 질환을 효과적으로 예방할 수 있다. 본 발명의 조성물을 기존의 조류인플루엔자 바이러스 감염 질환 예방제와 병행하여 투여할 수도 있다.As used herein, the term "individual" refers to poultry such as chickens and ducks having diseases caused by direct and indirect causes due to avian influenza virus infection. By administering the gene, composition or DNA vaccine of the present invention comprising the nucleic acid to the subject, it is possible to effectively prevent diseases such as bird flu caused by the avian influenza virus infection described above. The composition of the present invention may be administered in parallel with an existing avian influenza virus infection disease prevention agent.

본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 바람직한 투여방식은 피하, 피내, 근육, 정맥 투여 등이다.As used herein, the term "administration" means introducing a predetermined substance into an individual in any suitable manner, and the route of administration of the composition of the present invention is oral or parenteral via any general route as long as it can reach the target tissue. May be administered. In addition, the composition may be administered by any device capable of transferring the active agent to the target cell. Preferred modes of administration are subcutaneous, intradermal, intramuscular, intravenous, and the like.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 용어, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체의 성별, 연령, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 상기 유효량은 당업자에게 인식되어 있듯이 처리의 경로, 부형제의 사용 및 다른 약제와 함께 사용할 수 있는 가능성에 따라 변할 수 있으나, 대체로 본 발명의 조성물의 유효용량은 성인을 기준으로 1회에 0.01 내지 0.2 ㎎/㎏이 바람직하며 2 내지 4주 간격으로 1회 이상 투여 가능하다.
The composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount. As used herein, the term "pharmaceutically effective amount" means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and an effective dose level refers to the sex, age, severity, activity of the drug of the individual. , Drug sensitivity, time of administration, route of administration and rate of release, duration of treatment, factors including concurrently used drugs, and other factors well known in the medical arts. The composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. It may be single or multiple doses. It is important to take into account all of the above factors and to administer the amount in which the maximum effect can be obtained in a minimal amount without adverse effect, and can be easily determined by those skilled in the art. The effective amount may vary depending on the route of treatment, the use of excipients and the possibility of use with other agents, as will be appreciated by those skilled in the art, but in general the effective dose of the composition of the present invention is 0.01 to 0.2 mg at a time per adult / Kg is preferred and can be administered one or more times at intervals of two to four weeks.

본 발명의 조성물 또는 DNA 백신은 상기 Mx 단백질을 암호화하는 유전자를 단독으로 투여되거나 당 분야에 공지된 다른 보조제 또는 사이토킨과 공동 투여될 수 있다. 공동 투여될 수 있는 면역 반응을 자극할 수 있는 사이토킨은 예를 들어 과립구-대식구 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(GCSF), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, TNF-α, INF-γ, Flt3 리간드 등을 포함할 수 있다.Compositions or DNA vaccines of the invention may be administered alone, or co-administered with other adjuvants or cytokines known in the art. Cytokines that can stimulate an immune response that can be coadministered include, for example, granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), granulocyte colony stimulating factor (GCSF), IL-1, IL-2, IL-3, IL -4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, TNF-α, INF-γ, Flt3 ligand, and the like.

본 발명의 조성물 또는 DNA 백신은 Mx 단백질을 암호화하는 유전자의 유입을 촉진시키는 제제 예를 들어, 리포좀을 이용하거나 콜레스테롤, 콜레이트 및 데옥시콜산을 비롯한 다수의 스테롤류중 1종의 친유성 담체와 함께 배합할 수도 있다. 또한, 세포에 의해 흡수되는 펩티드에 접합시킬 수도 있다. 유용한 펩타이드의 예로는 펩타이드 호르몬, 항원 또는 항체 및 펩타이드 독소 등이 있다.
The compositions or DNA vaccines of the present invention utilize agents that promote the influx of genes encoding the Mx protein, such as liposomes, or with one lipophilic carrier in a number of sterols, including cholesterol, cholate and deoxycholic acid. It can also mix | blend. It may also be conjugated to a peptide that is taken up by the cell. Examples of useful peptides include peptide hormones, antigens or antibodies and peptide toxins.

본 발명의 조성물 또는 DNA 백신은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 투여될 수 있으며, 경구 투여시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 주사제는 생리식염액, 링겔액 등의 수성용제, 식물유, 고급 지방산 에스텔(예, 올레인산에칠 등), 알코올류(예, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제(예, 아스코르빈산, 아황산수소나트퓸, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제(예, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약제학적 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 다양한 제형으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릴시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다.
The composition or DNA vaccine of the present invention may be administered with a pharmaceutically acceptable carrier, and upon oral administration, a binder, a suspending agent, a disintegrant, an excipient, a solubilizer, a dispersant, a stabilizer, a suspending agent, a pigment, a perfume, etc. In the case of topical administration, bases, excipients, lubricants, preservatives and the like can be used. Injections include non-aqueous solvents such as aqueous solvents such as physiological saline solution and ring gel solution, vegetable oils, higher fatty acid esters (e.g., oleic acid ethyl), and alcohols (e.g., ethanol, benzyl alcohol, propylene glycol, glycerin, etc.). Stabilizers (e.g. ascorbic acid, sodium bisulfite, sodium pyrosulfite, BHA, tocopherol, EDTA, etc.), emulsifiers, buffers for pH control, to prevent microbial development Preservatives such as mercury nitrate, chimerosal, benzalkonium chloride, phenol, cresol, benzyl alcohol, and the like. The pharmaceutical compositions of the present invention can be prepared in a variety of formulations. For example, it can be prepared in the form of tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers and the like in the case of oral administration, and in the case of injections, unit dosage ampoules or a plurality of dosage forms.

본 발명의 방법을 이용하면, 조류인플루엔자 바이러스의 감염에 의하여 야기되는 세포의 괴사 및 조류인플루엔자 바이러스의 증식을 억제할 수 있으므로, 조류인플루엔자 바이러스에 의해 발병되는 조류독감의 예방에 널리 활용될 수 있을 것이다.
By using the method of the present invention, it is possible to suppress necrosis of cells caused by avian influenza virus and proliferation of avian influenza virus, and thus will be widely used for the prevention of avian influenza caused by avian influenza virus. .

도 1은 Mx 유전자의 구조를 나타내는 모식도이다.
도 2는 절편 A와 B를 증폭시키기 위한 프라이머의 서열을 나타낸다.
도 3은 완전한 서열의 유전자를 확인하기 위한 전기영동 사진이다.
도 4는 아미노산의 변이를 나타내는 모식도이다.
도 5는 클로닝 프라이머의 서열을 나타낸다.
도 6은 631번 아미노산의 변이를 나타내는 모식도이다.
도 7은 유전자의 크기를 확인하기 위한 전기영동 사진이다.
도 8은 재조합 Mx 단백질의 발현여부를 확인하기 위한 공초점 현미경 사진이다.
도 9는 마우스 항-His 단클론항체를 이용한 웨스턴 블랏을 수행한 결과를 나타내는 사진이다.
도 10은 Mx 및 N631S 단백질에 대한 특이성을 검정하기 위한 웨스턴 블랏을 수행한 결과를 나타내는 사진이다.
도 11은 Mx가 발현된 세포주의 IFA 결과를 나타내는 사진이다.
도 12는 Mx 및 N631S가 발현된 세포주의 IFA 결과를 나타내는 사진이다.
도 13은 Mx 및 N631S가 발현된 세포주를 확인하기 위한 웨스턴 블랏을 수행한 결과를 나타내는 사진이다.
도 14는 RT-PCR을 수행한 결과를 나타내는 사진 및 그래프이다.
도 15는 바이러스 감염에 대한 저항성을 나타내는 사진 및 그래프이다.
도 16은 유세포분석기를 이용한 정량적 분석결과를 나타내는 히스토그램이다.
도 17은 바이러스 감염에 대한 저항성을 나타내는 사진 및 그래프이다.
도 18은 유세포분석기를 이용한 정량적 분석결과를 나타내는 히스토그램이다.
도 19는 실시간 RT-PCT용 프라이머의 서열을 나타낸다.
도 20은 조류인플루엔자 바이러스 단백질의 발현량 변화를 나타내는 그래프이다.
도 21은 Mx 단백질과 바이러스 PB2 단백질의 발현량간의 상관관계를 나타내는 사진 및 그래프이다.
도 22는 Mx 단백질과 바이러스 증식율 간의 상관관계를 나타내는 그래프이다.1 is a schematic diagram showing the structure of the Mx gene.
2 shows the sequence of primers for amplifying fragments A and B. FIG.
Figure 3 is an electrophoresis picture for identifying the gene of the complete sequence.
4 is a schematic diagram showing variation of amino acids.
5 shows the sequence of cloning primers.
6 is a schematic diagram showing the variation of amino acid number 631.
Figure 7 is an electrophoresis picture for checking the size of the gene.
Figure 8 is a confocal micrograph to confirm the expression of recombinant Mx protein.
9 is a photograph showing the results of Western blot using mouse anti-His monoclonal antibody.
10 is a photograph showing the results of Western blot for assaying specificity for Mx and N631S proteins.
11 is a photograph showing IFA results of a cell line expressing Mx.
12 is a photograph showing IFA results of cell lines expressing Mx and N631S.
Figure 13 is a photograph showing the results of Western blot for identifying cell lines expressing Mx and N631S.
14 is a photograph and a graph showing the result of performing RT-PCR.
15 is a photograph and graph showing resistance to viral infections.
16 is a histogram showing the results of quantitative analysis using a flow cytometer.
17 is a photograph and graph showing resistance to viral infections.
18 is a histogram showing the results of quantitative analysis using a flow cytometer.
19 shows the sequence of a primer for real-time RT-PCT.
20 is a graph showing a change in the expression level of avian influenza virus protein.
21 is a photograph and graph showing the correlation between the expression levels of Mx protein and viral PB2 protein.
22 is a graph showing the correlation between Mx protein and virus growth rate.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. However, these examples are for illustrative purposes only, and the scope of the present invention is not limited to these examples.

실시예Example 1: 닭의 1: of chicken MxMx 유전자 gene 클로닝Cloning

실시예Example 1-1: 1-1: 닭로부터From chickens MxMx genegene 클로닝Cloning

문헌을 통하여(Haller et al., 2007) NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov) 에서 유전자 검색을 통하여 Gallus gallus myxovirus(influenza virus) resistance 1인 닭의 Mx 유전자(chMx)를 선발하여 PCR 프라이머를 하기와 같이 설계하고, Mx를 두 개의 절편 A와 B로 나누어 PCR을 수행하였다(도 1). Through a gene search (Haller et al., 2007) NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov), the PCR primer was selected by selecting Mx gene (chMx) of chickens with Gallus gallus myxovirus (influenza virus) resistance 1 Was designed as follows, and PCR was performed by dividing Mx into two fragments A and B (FIG. 1).

설계된 프라이머의 서열은 다음과 같다(도 2):
The sequence of the designed primers is as follows (FIG. 2):

Fragment A primer Fragment A primer

Sense : 5' - cgccgcgcggccgcgccgccaccatgaacaatccatggtccaac-3'(서열번호 5)Sense: 5 '-cgccgcgcggccgcgccgccaccatgaacaatccatggtccaac-3' (SEQ ID NO: 5)

Antisense : 5'-cgccgcggatccacctcttgagcca-3'(서열번호 6)
Antisense: 5'-cgccgcggatccacctcttgagcca-3 '(SEQ ID NO: 6)

Fragment B primerFragment B primer

Sense : 5'-cgccgcggactcccacaggagaaagg-3'(서열번호 7)Sense: 5'-cgccgcggactcccacaggagaaagg-3 '(SEQ ID NO: 7)

Antisense : 5'- cgccgctctagacagagacttaaagtctaccag-3'(서열번호 8)Antisense: 5'- cgccgctctagacagagacttaaagtctaccag-3 '(SEQ ID NO: 8)

Mx 유전자는 약 2118bp로 구성되어 약 706개의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드를 암호화하고, 상기 프라이머를 이용하여 게놈 DNA로부터 Mx 유전자가 강하게 발현될 수 있도록 CEF DF-1 세포주에 LPS와 poly(I:C)를 처리후 16시간 후에 세포의 RNA를 추출하여 cDNA합성을 위해 poly A 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. cDNA를 가지고 상기 프라이머를 이용하여 Mx 유전자의 2개 절편 A와 B만을 증폭해 내었다. 이렇게 증폭된 Mx 유전자의 각 절편을 1% 아가로스 겔상에서 전기영동하여 목적하는 밴드를 확인한 다음, 추출키트(Core gel extraction Kit)를 사용하여 목적 밴드를 수득하고, 이를 T4 DNA 리가제를 이용하여 벡터(pGEM-T easy vector, Promega, USA)에 클로닝하였다. 상기 클로닝된 벡터를 제한효소 EcoRI로 절단할 경우, 원래의 벡터(pGEM-T easy vector)와 삽입된 절편이 정확한 크기로 분리됨을 확인하였다. 추가적으로 완전한 서열의 유전자를 구성하기 위하여 제한효소(BamHI과 EcoRI)를 절편 A와 B를 연결하였으며, 최종적으로 제한효소(NotI과 XbaI)을 이용하여 확인하였다(도 3). 분리된 플라스미드 DNA를 활용하여 염기서열 분석을 의뢰하여 처음 PCR 프라이머의 설계에 사용되었던 Mx 유전자의 염기서열과 비교하였다. 뉴클레오티드 상에서 총 10개의 변이를 발견하였으며 이중 3개의 변이에서 아미노산 서열의 변화를 야기시킴을 확인하였다[Nucleotide(아미노산 변이) : A78C, A99G, A281G, C792T(Q->R), G813A, A922G(V->I), G1015A(T->A), C1203A, C1450T, G1545A](도 4).
The Mx gene consists of about 2118 bp encoding a polypeptide consisting of about 706 amino acids, and LPS and poly (I: C) were added to the CEF DF-1 cell line to strongly express the Mx gene from genomic DNA using the primers. After 16 hours after treatment, RNA was extracted from the cells and RT-PCR was performed using poly A primer for cDNA synthesis. Only the two fragments A and B of the Mx gene were amplified using the primers with cDNA. Each fragment of the amplified Mx gene was electrophoresed on a 1% agarose gel to identify a desired band, and then a target band was obtained using a core gel extraction kit, which was then subjected to T4 DNA ligase. Cloned into a vector (pGEM-T easy vector, Promega, USA). When the cloned vector was digested with restriction enzyme EcoRI, it was confirmed that the original vector (pGEM-T easy vector) and the inserted fragment were separated to the correct size. In addition, restriction enzymes (BamHI and EcoRI) were linked to fragments A and B, and finally identified using restriction enzymes (NotI and XbaI) to construct a gene of a complete sequence (FIG. 3). Using the isolated plasmid DNA, the sequencing was requested and compared with the nucleotide sequence of the Mx gene used for the design of the PCR primer. A total of 10 mutations were found on the nucleotides, and three of them were found to cause changes in the amino acid sequence [Nucleotide (amino acid mutations): A78C, A99G, A281G, C792T (Q-> R), G813A, A922G (V -> I), G1015A (T-> A), C1203A, C1450T, G1545A] (FIG. 4).

실시예Example 1-2: 단일 아미노산 돌연변이에 의한 1-2: by single amino acid mutation Ser631AsnSer631Asn 유전자 gene 클로닝Cloning

문헌을 통해(Ko et al., 2004) 631번째 아미노산의 서열이 Mx 유전자의 항바이러스 효과에 영향을 미친다는 것을 확인하였고 클로닝된 Mx 유전자에서 Ser(AGT)인 631번째 아미노산을 Asn(AAT)으로 바꾸기 위해 하기의 클로닝 프라이머를 제작하였다(도 5).
The literature (Ko et al., 2004) confirmed that the sequence of amino acid 631 affects the antiviral effect of the Mx gene, and the amino acid 631, Ser (AGT), was cloned into Asn (AAT) in the cloned Mx gene. The following cloning primers were prepared for replacement (FIG. 5).

클로닝 프라이머Cloning primer

Sense : 5' - CACGTAAAGGCCTATTTCACTGGAGCAAGTAAACG -3'(서열번호 9)Sense: 5 '-CACGTAAAGGCCTATTTCACTGGAGCAAGTAAACG -3' (SEQ ID NO: 9)

Antisense : 5'- cgccgctctagacagagacttaaagtctaccag-3'(서열번호 10)
Antisense: 5'- cgccgctctagacagagacttaaagtctaccag-3 '(SEQ ID NO: 10)

상기 클로닝 프라이머를 이용하여 pGEM-Mx에서 PCR을 통하여 증폭시킨 삽입물을 Asn이 포함되어있는 부분을 자를 수 있는 제한효소(StuI와 XbaI)를 이용하여 pGEM-MxN631S 절편을 클로닝한 후 염기서열 분석을 의뢰하여 확인하였으며, 의도한대로 AAT에서 AGT로 변이하여 아스파라긴이 세린으로 변이되었음을 확인하였다(도 6).
Cloning the pGEM-MxN631S fragment using restriction enzymes (StuI and XbaI) that can cut a portion containing Asn to the amplified insert from pGEM-Mx by PCR using the cloning primer, and then sequence analysis As intended, it was confirmed that the asparagine was transformed into serine by changing from AAT to AGT (FIG. 6).

실시예Example 1-3: 포유동물 발현벡터 1-3: Mammalian Expression Vector 클로닝Cloning

분리된 chMx 유전자의 발현을 위해 pcDNA3.1a-V5/His 벡터를 선정하고, 이에 chMx 유전자를 삽입하기 위해 발현벡터의 다클로닝 부위를 인식하는 제한효소(NotI과 XbaI)를 이용하여 클로닝된 pGEM-Mx로부터 삽입물을 분리하여 pcMx를 클로닝하였으며, 제한효소를 이용하여 유전자를 크기를 통해 확인하였다. N631S 변이 유전자도 pcDNA3.1a-V5/His 벡터에 삽입하기 위해 발현벡터의 다클로닝 부위를 인식하는 제한효소(NotI과 XbaI)를 이용하여 클로닝된 pGEM-MxN631S로부터 삽입물을 분리하여 pcN631S을 클로닝하고, 제한효소 NotI과 XbaI를 이용하여 유전자를 크기를 확인하였다(도 7).
Select the pcDNA3.1a-V5 / His vector for expression of the isolated chMx gene, and clone the pGEM- cloned using restriction enzymes (NotI and XbaI) that recognize the polyclonal region of the expression vector to insert the chMx gene. Inserts were isolated from Mx and cloned pcMx, genes were identified by size using restriction enzymes. Cloning pcN631S by separating the insert from pGEM-MxN631S cloned using restriction enzymes (NotI and XbaI) that recognize the polycloning site of the expression vector for insertion of the N631S variant gene into the pcDNA3.1a-V5 / His vector, Genes were sized using restriction enzymes NotI and XbaI (FIG. 7).

실시예Example 2: 2: 동물세포주에서의In animal cell lines 발현 검정 Expression assay

클로닝된 유전자는 포유동물 세포에서 발현되는 것을 IFA와 웨스턴 블럿방법을 이용하여 확인하였다. 도입하기 전날, RD 세포를 10⁵개씩 12-웰 플레이트(Nunc)에 접종하였다. 접종전에 웰당 18mmΦ 커버글래스를 넣고 0.1% 아텔로콜라겐을 37℃에서 30분동안 처리해 주었다. 도입하기 1시간 전에 제조합 백신 바이러스를 접종되어 있는 세포에 감염시킴으로서 T7 프로모터를 활성화시켰다. 정제된 플라스미드 DNA pc-Mx를 5㎍씩 RD세포에 CaPO4 침전 방법을 이용하여 도입시켰다. 도입한지 16시간 뒤에, 세포를 무혈청배지로 2회 세척한 다음 PBS로 한번 세척하였다. 그리고 4% 포르말린을 포함하는 PBS 로 상온에서 15분동안 고정하였다. PBS로 2번 세척하고, 10% 염소혈청이 들어있는 0.1% TritonX-100 용액으로 30분 동안 블로킹과정을 거친 후 1차 항체인 마우스 항-His 단클론항체(IgTherapy)를 3% 염소혈청이 들어있는 0.1% tritonX-100에 1:1,000 의 비율로 희석해서 상온에서 90분 동안 반응시켰다. PBS로 3번 세척한 다음, 2차 항체인 염소 항-마우스 IgG,(H+L) FITC(fluorescein isothiocyanate)-결합 항체(Invitrogen™)를 3% 염소혈청이 들어있는 0.1% tritonX-100에 1:2,000의 비율로 희석해서 상온에서 90분 동안 반응시켰다. 다시 PBS로 3번 세척한후 핵을 염색하기 위해 DAPI(4,6-diamidino-2phenylindole)를 PBS에 1:1,000의 비율로 희석해서 15분동안 상온에서 반응시켰다. 3번 PBS로 세척한후에 적정량의 immu-mount를 슬라이드위에 넣고 커버글라스로 덮은 후 공초점현미경을 이용하여 발현 양상을 관찰하였다. pcMx와 pcN631S 공히 세포질에서 스팟의 형태와 퍼져있는 양상이 혼합된 형태로 발현되는 것을 확인하였다(도 8). The cloned gene was expressed in mammalian cells using IFA and Western blot. The day before introduction, 10 ⁵ RD cells were inoculated into 12-well plates (Nunc). 18 mmΦ cover glass was added per well before inoculation and treated with 0.1% atelocollagen at 37 ° C. for 30 minutes. One hour prior to introduction, the T7 promoter was activated by infecting cells inoculated with the synthetic vaccine virus. Purified plasmid DNA pc-Mx was introduced into RD cells using CaPO4 precipitation. After 16 hours of introduction, cells were washed twice with serum free medium and then once with PBS. And fixed with PBS containing 4% formalin at room temperature for 15 minutes. Washed twice with PBS, blocked with 0.1% TritonX-100 solution containing 10% goat serum for 30 minutes, and then the primary antibody, mouse anti-His monoclonal antibody (IgTherapy), contained 3% goat serum. Dilution at a rate of 1: 1,000 in 0.1% tritonX-100 was carried out for 90 minutes at room temperature. After washing three times with PBS, a secondary antibody goat anti-mouse IgG, (H + L) fluorescein isothiocyanate (FITC) -binding antibody (Invitrogen ™) was added to 0.1% tritonX-100 containing 3% goat serum. The reaction mixture was diluted at a ratio of 2,000 and reacted at room temperature for 90 minutes. After washing three times with PBS again, DAPI (4,6-diamidino-2phenylindole) was diluted in PBS at a ratio of 1: 1,000 in order to stain nuclei, and reacted at room temperature for 15 minutes. After washing with PBS three times, an appropriate amount of immu-mount was put on the slide, covered with a cover glass, and the expression pattern was observed using a confocal microscope. Both pcMx and pcN631S were found to be expressed in a mixed form of the spot and spread form in the cytoplasm (FIG. 8).

웨스턴 블랏을 수행하기 위하여 도입하기 전날, HEK293T 세포를 10⁶개씩 60㎜ 플레이트(Nunc)에 접종하였다. 정제된 플라스미드 DNA pc-Mx를 6㎍씩 HEK293T세포에 CaPO4 침전 방법을 이용하여 도입시켰다. 도입한지 48시간 후에 세포를 세포용해완충용액(RIPA lysis buffer: 150mM NaCl, 1% NP40, 0.5% deoxycholic acid, 50mM Tris-HCl, 0.2mM PMSF, protease inhibitor cocktail)을 이용하여 용해시키고 상층액을 분리하여 단백질을 8% SDS-PAGE에 적용하여 단백질의 크기에 따라 분리하였다. 상기 분리된 단백질을 PVDF 막(Millipore, Bedford, USA)에 에 전이시켰다. 이어, 공지된 방법에 따라, 마우스 항-His 단클론항체(IgTherapy)를 이용한 웨스턴 블랏을 수행하였다(도 9). 하우스키핑 유전자 발현물(house keeping gene product)인 베타액틴 단백질의 발현양을 기준으로 하여, 동일양의 DNA를 도입시에 사용하였을 경우, pcMx보다는 pcN631S의 발현수준이 더 높다는 것을 알 수 있었다.
The day before the introduction of the western blot, HEK293T cells were inoculated into 60 mm plates (Nunc) 10 ⁶ . Purified plasmid DNA pc-Mx was introduced into HEK293T cells by 6 µg using CaPO4 precipitation. After 48 hours of introduction, cells were lysed using a lysis buffer (RIPA lysis buffer: 150 mM NaCl, 1% NP40, 0.5% deoxycholic acid, 50 mM Tris-HCl, 0.2 mM PMSF, protease inhibitor cocktail) and the supernatant was separated. Proteins were separated by 8% SDS-PAGE by protein size. The isolated protein was transferred to PVDF membrane (Millipore, Bedford, USA). Then, according to the known method, Western blot using mouse anti-His monoclonal antibody (IgTherapy) was performed (FIG. 9). Based on the expression level of the beta-actin protein, which is a housekeeping gene product, it was found that the expression level of pcN631S was higher than that of pcMx when the same amount of DNA was used.

실시예Example 3: 3: MxMx 특이적인 항체의 제작 Construction of Specific Antibodies

Mx 특이적인 항체를 제작하기 위하여 Mx 유전자의 염기서열로부터 유추된 아미노산 서열을 기초로 다음과 같은 B 세포 에피토프 3군데를 추정하였다:In order to construct Mx specific antibodies, three B cell epitopes were estimated based on the amino acid sequence inferred from the base sequence of the Mx gene:

51 내지 65번 아미노산 서열(CAPELTDRKPEHEQK, 서열번호 11), Amino acid sequence 51-65 (CAPELTDRKPEHEQK, SEQ ID NO: 11),

68 내지 83번 아미노산 서열(KRLNDREEDKDEAAAC, 서열번호 12)Amino acid sequence 68-83 (KRLNDREEDKDEAAAC, SEQ ID NO: 12)

474 내지 490번 아미노산 서열(CSKLPKYEDQYRGREFP, 서열번호 13)
Amino acid sequence 474-490 (CSKLPKYEDQYRGREFP, SEQ ID NO: 13)

상기 각 펩타이드는 합성되어 높은 역가의 항체를 얻기 위해 반복적으로 면역되었으며, 획득한 각 펩타이드에 대한 면역혈청을 웨스턴 블럿 분석에 적용하여 동일양의 Mx 및 N631S 단백질에 대한 특이성을 검정하였다. 웨스턴 블럿 분석을 통한 분석 결과, 68 내지 83 펩타이드를 면역한 토끼에서 얻은 항혈청를 사용하였을 때 가장 좋은 Mx 및 N631S에 대한 활성을 나타냄을 확인하였다(도 10).
Each peptide was synthesized and repeatedly immunized to obtain high titers of antibodies, and immunosera for each peptide obtained was subjected to Western blot analysis to assay specificity for the same amount of Mx and N631S proteins. As a result of analysis by Western blot analysis, the antiserum obtained from rabbits immunized with 68 to 83 peptide showed the best activity against Mx and N631S (FIG. 10).

실시예Example 4: 4: MxMx 안정화된 세포주의 구축 Construction of Stabilized Cell Lines

유전자를 도입하기 위하여, 배양된 CEF DF-1 세포주에 트립신-EDTA(Gibco)를 처리하여 세포수를 계수한 다음, 10⁷개의 세포를 20ug의 pcMx 또는 pcN631S DNA와 얼음상에서 10분간 방치하고, 전기천공법(Electroporation method)을 사용하여 ㄷ도입하였으며, 이를 60㎜ 플레이트(Nunc)에 접종하였다. 2일이 경과한 후, G418을 1mg/ml의 농도로 1주일동안 처리하고, 도입된 세포를 선발하였으며, 선발된 세포를 10cm 플레이트에 접종하고, 콜로니를 형성할 때 까지 배양하였다. 이어, 형성된 콜로니를 Mx와 N631S 각각 5개씩 선발하여 12-웰 플레이트에 다시 접종하고, 배양하여, Mx와 N631S에 대한 안정화된 세포주를 구축하였다. 구축된 세포주를 IFA(도 11, 12)와 웨스턴 블랏 분석(도 13)을 통해 분석하여, 가장 발현율이 우수한 세포주를 각각 선발하였다. 그 결과, N631S는 전반적으로 성장률이 좋지 않았으며 IFA에서는 첫 번째 시도한 결과의 #5 세포주에서 발현을 확인하였으나 웨스턴 블랏 분석을 통해서는 확실한 N631S의 발현을 검정하지 못하였다(도 11, 12, 13). 그러나, RT-PCR을 수행하였을 때 N631S에서 Mx의 mRNA가 발현됨을 확인하였고, 실시간 RT-PCR 수행시 음성대조군인 CEF DF-1과 비교하였을 때 Mx #5 세포주에서 약 2.5배의 발현물의 양이, N631S #1에서 약 1.5 배의 발현물의 양이 발현됨을 확인하였으며, 이후 실험에 활용하였다(도 14).
To introduce the gene, the cultured CEF DF-1 cell line was treated with trypsin-EDTA (Gibco) to count the number of cells, and then 10 ⁷ cells were left on 20 ug of pcMx or pcN631S DNA for 10 minutes on ice, and It was introduced using the electroporation method and inoculated on a 60 mm plate (Nunc). After 2 days, G418 was treated for 1 week at a concentration of 1 mg / ml, the introduced cells were selected, the selected cells were inoculated into 10 cm plates and incubated until colonies were formed. Subsequently, 5 colonies formed of Mx and N631S were selected and inoculated again in 12-well plates, and cultured to construct stabilized cell lines for Mx and N631S. The constructed cell lines were analyzed by IFA (FIGS. 11 and 12) and Western blot analysis (FIG. 13), and cell lines having the highest expression rate were selected, respectively. As a result, the overall growth rate of N631S was poor and IFA confirmed the expression in the # 5 cell line of the first attempt, but Western blot analysis did not confirm the expression of certain N631S (FIGS. 11, 12, 13). . However, when RT-PCR was performed, it was confirmed that Mx mRNA was expressed in N631S, and compared with CEF DF-1, which is a negative control group, in real time RT-PCR, about 2.5-fold amount of expression was observed in Mx # 5 cell line. , N631S # 1 was confirmed that the expression of about 1.5 times the amount of expression, it was used in the experiment afterwards (Fig. 14).

실시예Example 5: 5: MxMx 또는 or N631SN631S 과발현 세포주의 Overexpressing Cell Line virusvirus replicationreplication 에 대한 저항성 검정Resistance test

감염시키기 하루 전에 Mx 안정화된 세포주와 CEF 세포주의 각각 1×10⁶개의 세포를 6-웰 플레이트에 접종하였다. 인플루엔자 바이러스인 H1N1 및 H9N2과, NDV를 0.5 M.O.I(mutiplicity of infection)으로 감염시켰으며 24시간과 48시간이 각각 경과하였을 때 세포를 수득하고, 이를 대상으로 하여 H1N1, H9N2 또는 NDV를 감염시킨 닭의 혈청, Mx 펩타이드 항체 및 ß-액틴 단클론항체를 noclonal antibody 를 사용하는 웨스턴 블랏 방법으로 분석하였다. 그 결과, ß-액틴의 발현양을 통한 상대적인 보정을 기초로 각 바이러스가 접종된 실험군은 대조군인 CEF DF-1 세포주와 비교하여 각 시간대 별로 감소된 바이러스 단백질 양을 보였으며 24시간보다는 48시간에 전반적으로 더 감소된 양상을 보였다. Quantity One® 을 통해 감염 후 24시간의 시료를 정량 분석을 하였을 때 각 바이러스 감염 실험군 모두 40% 가량의 감소된 발현양을 Mx와 N631S 과발현 세포주 모두에서 보임을 확인하였다(도 15).One day before infection, 1 × 10 ⁶ cells each of Mx stabilized and CEF cell lines were seeded in 6-well plates. Influenza viruses H1N1 and H9N2 and NDV were infected with 0.5 muiplicity of infection (MOV) and cells were obtained at 24 and 48 hours, respectively, and were subjected to H1N1, H9N2 or NDV infection. Serum, Mx peptide antibody and ß-actin monoclonal antibody were analyzed by Western blot method using noclonal antibody. As a result, on the basis of the relative correction through the expression of ß-actin, the experimental group inoculated with each virus showed a decreased amount of virus protein at each time period compared to the control CEF DF-1 cell line, and at 48 hours rather than 24 hours. Overall, there was a further decrease. Quantitative analysis of the samples 24 hours after infection through Quantity One® confirmed that 40% of the expression levels of each virus infection group were seen in both Mx and N631S overexpressing cell lines (FIG. 15).

동일한 실험방법으로 NDV-GFP 재조합 바이러스를 도입하여 24시간 또는 48시간 후에 회수한 뒤, 4% 포르말린을 이용해 고정하여 유세포분석기를 이용한 정량적인 분석에 활용하였다. 히스토그램 분석을 기초로 하여 상대적인 저해율을 계산하였을 때 Mx 또는 N631S 세포주에서 도입 후 24시간에서는 40%대의 저해율이, 48시간 뒤에는 20%대의 저해율이 나타남을 확인할 수 있었다(도 16).
In the same experimental method, NDV-GFP recombinant virus was introduced and recovered after 24 hours or 48 hours, and then fixed with 4% formalin and used for quantitative analysis using a flow cytometer. When the relative inhibition rate was calculated based on the histogram analysis, it was confirmed that the inhibition rate was 40% at 24 hours after the introduction into the Mx or N631S cell line, and the inhibition rate at 20% after 48 hours (FIG. 16).

실시예Example 6: 6: 호흡기도내Respiratory tract 상피세포( Epithelial cells ( tracheatrachea epithelialepithelial cellcell , , TECTEC )에서의 저항성 검정Resistance test at)

10일 된 수정란으로부터 호흡기도를 분리하여, 1cm의 크기로 세절하였다. 상기 세절된 20여개의 호흡기도를 0.1% DTT(D,L-dithiothreitol)가 포함된 PBS로 두 번 세척한 후 PBS와 DMEM으로 각각 한번씩 세척하였다. 30ml의 해리용액(MEM containing 1% P/S antibiotics, 0.2% type XIV protease from Streptomyces griseus, ad 0.02 DNase)으로 2시간 동안 37℃에서 분리한 호흡기도를 방치하였다. 2시간 후 5ml의 FBS를 첨가하여 반응을 중지시킨 후 40um의 여과기를 이용하여 여과한 후 200로 세포를 침강시켰다. DMEM에 재현탁시키고, 60%/40%/20% 불연속적 퍼콜구배에 적용한 후 400g에 5분, 800g에 15분 원심분리하였다. 두 개 층의 세포를 각각 분리하여 PBS로 두 번 세척한 후 DMEM과 호흡기도내 상피 성장배지 1:1로 섞인 용액을 이용해 재현탁시켰다. 분리된 기초세포를 6웰 플레이트에 3×10⁵개씩 접종한 후 4일 동안 반응시켰다.
The respiratory tract was separated from the 10-day-old fertilized egg and sliced to a size of 1 cm. The fragmented 20 or more respiratory tracts were washed twice with PBS containing 0.1% DTT (D, L-dithiothreitol) and then washed once with PBS and DMEM, respectively. The respiratory tract separated at 37 ° C. for 2 hours was left with 30 ml of dissociation solution (MEM containing 1% P / S antibiotics, 0.2% type XIV protease from Streptomyces griseus, ad 0.02 DNase). After 2 hours, the reaction was stopped by the addition of 5 ml of FBS, filtered using a 40um filter, and the cells were allowed to settle to 200. Resuspended in DMEM and subjected to a 60% / 40% / 20% discontinuous percol gradient and centrifuged at 400 g for 5 minutes and 800 g for 15 minutes. The cells of the two layers were separated, washed twice with PBS, and resuspended using a solution mixed with DMEM and epithelial growth medium 1: 1 in the respiratory tract. The isolated basal cells were inoculated in 3 × 10 ⁵ cells in 6-well plates and reacted for 4 days.

부착되어 분화된 기초세포는 하기의 상피세포 마커를 이용하여 섬유아세포인 CEF와 비교하였을 때 상피세포로 정상 분화되었음을 확인하였다.
The attached and differentiated basal cells were confirmed to be normally differentiated into epithelial cells when compared to CEF, which is a fibroblast, using the following epithelial cell marker.

Retinoic acid responder [Accession # : AJ307060] Retinoic acid responder [Accession #: AJ307060]

Sense : 5'-ACATCAACTCCCACGAGGCGTCC-3'(서열번호 14)Sense: 5'-ACATCAACTCCCACGAGGCGTCC-3 '(SEQ ID NO: 14)

Antisense : 5'-ACTGCTGCCAACAATGGCCAAGC-3'(서열번호 15)
Antisense: 5'-ACTGCTGCCAACAATGGCCAAGC-3 '(SEQ ID NO: 15)

Keratin 14 [Accession # : AY574987] Keratin 14 [Accession #: AY574987]

Sense : 5'-CACTGCCAGCCCGCTGTGCT-3'(서열번호 16)Sense: 5'-CACTGCCAGCCCGCTGTGCT-3 '(SEQ ID NO: 16)

Antisense : 5'-ACCTTGTCCAGGTAGGCGGCC-3'(서열번호 17)
Antisense: 5'-ACCTTGTCCAGGTAGGCGGCC-3 '(SEQ ID NO: 17)

Cytochrome P-450 2C45 responder [Accession # : AJ430583] Cytochrome P-450 2C45 responder [Accession #: AJ430583]

Sense : 5'-CCACGTGGGAGATGTTGCTCCTG-3'(서열번호 18)Sense: 5'-CCACGTGGGAGATGTTGCTCCTG-3 '(SEQ ID NO: 18)

Antisense : 5'-TGGCAGCAAACTCATCCGCACG-3'(서열번호 19)
Antisense: 5'-TGGCAGCAAACTCATCCGCACG-3 '(SEQ ID NO: 19)

세포가 안정화 되었을 때 유전자 도입시약(Viva magic transfection reagent)을 이용하여 pcMx DNA나 pcN631S DNA 2ug 씩을 도입하였으며 48시간동안 반응시킨 후, 인플루엔자 바이러스 H1N1, H9N2 또는 NDV 각각을 0.1 M.O.I로 감염시킨 후 24시간, 48시간에 세포를 회수하여 안정화된 세포를 활용한 실험에서와 같이 웨스턴 블럿 분석을 통해 분석하였다. 분리된 TEC는 섬유아세포 계열인 CEF와 비교하여 레티노인산 응답물(Retinoic acid responder), 케라틴 14(Keratin 14) 또는 시토크롬 P-450 2C45 응답물(Cytochrome P-450 2C45 responder)등과 같은 상피세포 마커의 mRNA가 높은 수준으로 발현됨을 RT-PCR을 통해 검정하였다. 감염 후 24시간, 48시간 후에 얻어진 세포는 용해완충용액(RIPA lysis buffer)을 활용하여 용해시킨 후 웨스턴 블럿 분석을 통해 분석하였으며 각각 바이러스를 감염시킨 면역혈청을 활용하여 단백질을 검출하였다. pcMx와 N631S가 과발현 된 경우 감염 후 24시간, 48시간 모두에서 아무것도 도입되지 않은 대조군에 비해 줄어든 바이러스 단백질 양을 보였으며 인플루엔자 바이러스의 경우, 감염 후 24시간 보다는 48시간에 보다 더 줄어든 단백질 양을 보였다. NDV의 경우는 24시간 보다는 48시간에 오히려 단백질의 양이 증가하는 패턴을 보였다. 검출된 단백질을 정량적으로 분석하기 위하여 프로그램(Quantity one®)을 통해 웨스턴 블럿 분석 신호의 밀도를 측정하였으며 분석 결과, 감염 후 24시간 후 대조군보다 pcMx나 N631S가 도입된 시료에서 60%가량 감소된 발현양을 보이는 것으로 확인되었다(도 17). 동일한 실험 방법으로 NDV-GFP를 도입하여 유세포분석기(flow cytometry)를 이용한 GFP 신호의 양을 측정하여 정량적인 분석에 이용하였다. 안정화 된 기초세포에 상기와 동일한 대조군으로 pcMx 또는 N631S를 2ug씩 도입하였으며 24시간, 48시간 후에 세포를 회수한 후 4% 포르말린으로 고정하여 실험에 사용하였다. 유세포분석기를 통해 히스토그램을 얻었으며 상대적인 GFP 발현양을 비교하기 위해 대조군을 기준으로 추가적인 분석을 하였으며 pcMx나 N631S가 일시적으로 도입되었을 경우 20% 가량 감소된 발현율을 보이는 것으로 확인되었다(도 18).
When the cells were stabilized, 2 μg of pcMx DNA or pcN631S DNA were introduced using a Viva magic transfection reagent and reacted for 48 hours, and then infected with influenza virus H1N1, H9N2 or NDV with 0.1 MOI for 24 hours. The cells were harvested at 48 hours and analyzed by Western blot analysis as in the experiment using stabilized cells. Isolated TECs compared to fibroblast-like CEF, mRNAs of epithelial markers such as retinoic acid responders, keratin 14, or cytochrome P-450 2C45 responders. Expression at high levels was assayed via RT-PCR. Cells obtained 24 hours and 48 hours after infection were lysed using a lysis buffer (RIPA lysis buffer) and analyzed by Western blot analysis. Proteins were detected using immune serum infected with viruses. Overexpression of pcMx and N631S resulted in decreased viral protein levels in both 24 and 48 hours post-infection compared to the control group where none were introduced, and influenza viruses showed a lower protein content at 48 hours than 24 hours post-infection. . In the case of NDV, the amount of protein increased at 48 hours rather than 24 hours. In order to quantitatively analyze the detected protein, Western blot analysis signal density was measured through a program (Quantity one®). As a result, the expression was reduced by 60% in the sample introduced with pcMx or N631S after 24 hours after infection. It was confirmed to show a sheep (FIG. 17). In the same experimental method, NDV-GFP was introduced to measure the amount of GFP signal using flow cytometry and used for quantitative analysis. 2 μg of pcMx or N631S were introduced into the stabilized basal cells as the same control group, and cells were recovered after 24 hours and 48 hours, and then fixed with 4% formalin and used in the experiment. The histogram was obtained by flow cytometry, and further analysis was performed based on the control group to compare the relative GFP expression levels, and when pcMx or N631S was temporarily introduced, the expression rate was reduced by about 20% (FIG. 18).

실시예Example 7: 기초세포에서 실시간 7: Real time in basal cell RTRT -- PCRPCR 을 통한 정량적 저항성의 검정Of quantitative resistance through

도면 17의(B)와 같은 스킴으로 안정화된 기초세포에 인플루엔자 바이러스 H1N1 또는 H9N2를 감염시킨 후 24시간, 48시간 뒤 배양액과 세포를 회수하여 그중 세포 침전물을 추출키트(GeneAll® Ribospin kit)에 적용하여 RNA를 추출하였다. 추출된 총 RNA로부터 합성된 cDNA를 이용하여 정량 후 100ng을 주형으로 사용하여 실시간 RT-PCR을 수행하였다. IDT(www.idtdna.com)의 프라이머 설계 프로그램을 이용하여, H1N1과 H9N2의 8개 분절 mRNA에 대한 프라이머를 제작하여 시험한 뒤 정상적으로 사용 가능함을 확인했다(도 19). 이중 중합효소 복합체를 대표하는 PB2와 외측 당단백질을 대표하는 HA에 대한 프라이머를 선정하여 실험에 사용하였다. SYBR green PCR premix(Bioneer)를 이용하였으며 PCR 반응시 94℃ 10분의 시간으로 안정화를 꾀하였으며, 94℃ 10초, 62℃ 30초의 시간을 40회 반복하였다. 반응 후 해리곡선을 확인하여, 바이러스 유전자의 정확한 증폭이 일어났는지 확인하였다. 바이러스 각 각의 유전자에 대한 일반화를 위하여 GAPDH 유전자에 대한 프라이머로 같은 반응을 수행하였으며 GAPDH에 대한 바이러스 유전자의 Ct값의 차인 △CT를 2-△CT값으로 처리한 뒤 통계 처리 분석하여 상대적인 발현비율의 변화를 알아보았다. 인플루엔자 바이러스 H1N1나 H9N2가 감염된 시료 공히 pcMx나 N631S가 일시적으로 도입되었을 때 대조군인 mock 도입에 비하여 유의하게 감소한 메시지 수준을 보였다. H1N1 PB2 유전자의 경우 24시간에 15-20 배 가량 감소되었으며 48시간에는 7-8 배 가량 감소했다. HA 유전자 역시 저해되는 양상에서는 유사한 패턴을 보였으며 24시간에는 2-7배, 48시간에는 4 배 가량 감소한 양상을 보였다. H9N2의 PB2는 24시간에 0.9-1배 가량 감소되었으며 48시간에는 0.4배가량 감소되었다. HA의 경우 24시간에 1-1.5배 가량, 48시간에 0.5배 가량 감소되는 양상을 보였다(도 20).
After infecting the influenza virus H1N1 or H9N2 to the basal cells stabilized by the scheme as shown in FIG. 17 (B), the culture medium and the cells were recovered after 24 hours and 48 hours, and the cell precipitates were applied to the extraction kit (GeneAll® Ribospin kit). RNA was extracted. Real-time RT-PCR was performed using 100ng as a template after quantification using cDNA synthesized from the extracted total RNA. Using the primer design program of IDT (www.idtdna.com), primers were prepared and tested for 8 segment mRNAs of H1N1 and H9N2 and confirmed that they were normally used (FIG. 19). Primers for PB2 representing the double polymerase complex and HA representing the outer glycoprotein were selected and used in the experiment. SYBR green PCR premix (Bioneer) was used to stabilize the PCR reaction time of 94 ℃ 10 minutes, repeated 40 times of 94 ℃ 10 seconds, 62 ℃ 30 seconds. After the reaction, the dissociation curve was checked to confirm that the exact amplification of the viral gene occurred. For generalization of each gene of the virus, the same reaction was carried out with primers for the GAPDH gene, and the relative expression ratio was analyzed by treating the ΔCT, which is the difference in the Ct values of the viral genes against GAPDH, with 2- △ CT values, and then performing statistical analysis. Learned the change. Samples infected with influenza virus H1N1 or H9N2 showed a significantly reduced message level compared to the introduction of the mock control when pcMx or N631S were transiently introduced. The H1N1 PB2 gene was reduced by 15-20 fold in 24 hours and 7-8 fold in 48 hours. The HA gene also showed a similar pattern of inhibition, with a decrease of 2 to 7 times at 24 hours and 4 times at 48 hours. PB2 of H9N2 decreased 0.9-1 fold in 24 hours and 0.4 fold in 48 hours. HA was reduced by 1-1.5 times at 24 hours and 0.5 times at 48 hours (FIG. 20).

실시예Example 8: 8: pcMxpcMx 의 of 발현양에On the expression level 따른 비례적인 바이러스 복제 Proportional virus replication 억제능Inhibition 검정 black

닭의 TEC에 일시적으로 도입되는 pcMx의 양이 증가함에 따라 인플루엔자 바이러스의 복제가 추가적으로 더 억제되는지의 여부를 확인하기 위한 실험이 진행되었다. 분리된 기초세포를 6-웰 플레이트의 한 개의 웰에 3×10⁵개의 세포를 접종한 후 안정화되도록 충분히 방치하였다. 아무것도 도입하지 않은 대조군(0ug)을 기준으로 pcMx를 1ug과 2ug씩 일시적으로 도입하였으며 48시간 뒤에 인플루엔자 바이러스 H1N1 또는 H9N2를 0.1 m.o.i.가 되도록 감염시켰다. 24시간 뒤 배양액과 세포를 회수하였으며 그중 세포는 앞서 언급한 방법을 이용 용해시킨 후 웨스턴 블럿 분석법을 통해 발현된 단백질의 양을 확인하였다. 정량적인 분석을 위해 분석프로그램(Quantity One® program)을 활용하여 웨스턴 블럿 밴드 밀도를 분석하였다. Experiments were conducted to determine whether further replication of influenza virus was further inhibited as the amount of pcMx transiently introduced into chicken TEC increased. The isolated basal cells were inoculated with 3 × 10 ⁵ cells in one well of a 6-well plate and allowed to stand to stabilize. Based on the control group (0ug) which was not introduced anything, pcMx was temporarily introduced by 1ug and 2ug, and after 48 hours, the influenza virus H1N1 or H9N2 was infected to 0.1 moi. After 24 hours, the culture medium and the cells were recovered, and the cells were lysed using the aforementioned method, and the amount of protein expressed was confirmed by Western blot analysis. Western blotting band density was analyzed using a Quality One® program for quantitative analysis.

웨스턴 블럿 분석 결과, pcMx의 일시적으로 도입 되는 양이 증가됨에 따라서 바이러스의 복제는 저해되는 것을 확인 할 수 있었다. 밴드의 밀도를 측정한 결과를 바탕으로 Mx 단백질의 발현양과 상대적으로 분석하였을 때 Mx 단백질의 발현양이 증가됨에 따라서 인플루엔자 바이러스 단백질의 발현양이 감소됨을 확인하였다.
As a result of Western blot analysis, it was confirmed that the replication of the virus was inhibited as the temporary amount of pcMx was increased. Based on the result of measuring the density of the band, it was confirmed that the expression level of the influenza virus protein decreased as the expression level of the Mx protein was increased relative to the expression level of the Mx protein.

한편, 회수한 세포를 추출키트(GeneAll® Ribospin kit)에 적용하여 RNA를 추출하였다. 총 RNA를 이용하여 cDNA를 합성한 후 100ng/1ul가 되도록 희석하였으며(주)바이오니아의 SYBR green master mix reagent와 real-time RT-PCR thermo-block 장비를 활용하여 실시간 RT-PCR을 수행하였다. 94℃에서 10분간 안정화시킨 뒤 94℃ 10초, 62℃ 30초로 40 cycle동안 증폭시켰으며 반응 종료 후 94℃에서 65℃까지 단계적으로 용융시켜 특이적인 반응이 일어났는지의 여부를 확인하였다. 이때, 사용된 프라이머의 서열은 다음과 같다(표 1).
Meanwhile, the recovered cells were applied to an extraction kit (GeneAll® Ribospin kit) to extract RNA. CDNA was synthesized using total RNA and diluted to 100ng / 1ul, and real-time RT-PCR was performed using SYBR green master mix reagent of Bioneer Inc. and real-time RT-PCR thermo-block equipment. After 10 minutes of stabilization at 94 ° C for 10 cycles of 94 ° C and 62 ° C for 30 seconds, amplification was carried out for 40 cycles. At this time, the sequence of the primer used is as follows (Table 1).

실시간 RT-PCR 시에 사용된 각 프라이머의 염기서열Base sequence of each primer used in real time RT-PCR 바이러스
virus
표적
Target
위치
location
염기서열
(F : sense, R : Antisense)Base sequence
(F: sense, R: Antisense) 서열번호SEQ ID NO: H1N1H1N1 Segment1_PB2Segment1_PB2 180-1297
180-1297
F :5` AGAGACGAACAGTCGATTGCCGAA
R :5` ATCGCTGATTCGCCCTATTGACGA F: 5` AGAGACGAACAGTCGATTGCCGAA
R: 5` ATCGCTGATTCGCCCTATTGACGA 20
2120
21 Segment2_PB1Segment2_PB1 368-1530
368-1530
F :5` ATGAAGGGATTCAAGCCGGAGTCA
R :5` GGAAGCTCCATGCTGAAATTGGCAF: 5` ATGAAGGGATTCAAGCCGGAGTCA
R: 5` GGAAGCTCCATGCTGAAATTGGCA 22
2322
23 Segment3_PASegment3_PA 899-2059
899-2059
F :5` AGGAAGGTTCCATTGGGAAGGTCT
R :5` ATCAAAGGTCCCAGGTTCCAGGTTF: 5` AGGAAGGTTCCATTGGGAAGGTCT
R: 5` ATCAAAGGTCCCAGGTTCCAGGTT 24
2524
25 Segment4_HASegment4_HA 73-450
73-450
F :5` ACTCACTGCTTCCAGCGAGATCAT
R :5` TTGTGGTTGGGCCATGAACTTTCCF: 5` ACTCACTGCTTCCAGCGAGATCAT
R: 5` TTGTGGTTGGGCCATGAACTTTCC 26
2726
27 Segment5_NPSegment5_NP 19-529
19-529
F :5` AACGGCTGGTCTGACTCACATGAT
R :5` AGTGAGCACATCCTGGGATCCATTF: 5` AACGGCTGGTCTGACTCACATGAT
R: 5` AGTGAGCACATCCTGGGATCCATT 28
2928
29 Segment6_NASegment6_NA 96-836
96-836
F :5` AGTAATGGGCTGGCCTCGTACAAA
R :5` TCTGCACACACACATCACTTTGCCF: 5` AGTAATGGGCTGGCCTCGTACAAA
R: 5` TCTGCACACACACATCACTTTGCC 30
3130
31 Segment7_M1,M2Segment7_M1, M2 10-217
10-217
F :5` TGCAGGGAAGAACACCGATCTTGA
R :5` ACGGTGAGCGTGAACACAAATCCTF: 5` TGCAGGGAAGAACACCGATCTTGA
R: 5` ACGGTGAGCGTGAACACAAATCCT 32
3332
33 Segment8_NS1,NEPSegment8_NS1, NEP 68-368
68-368
F :5` TGCATCGCGCTACCTAACTGACAT
R :5` TTCTGATACAAAGAGGGCCTGCCAF: 5` TGCATCGCGCTACCTAACTGACAT
R: 5` TTCTGATACAAAGAGGGCCTGCCA 34
3534
35 H9N2
H9N2
Segment1_PB2Segment1_PB2 99-858
99-858
F :5` TTTGACTCAAGGAACCTGCTGGGA
R :5` ACCATGACACATCTCCAAGAGCGAF: 5` TTTGACTCAAGGAACCTGCTGGGA
R: 5` ACCATGACACATCTCCAAGAGCGA 36
3736
37 Segment2_PB1Segment2_PB1 8-191
8-191
F :5` TACAGCCATGGAACAGGAACAGGA
R :5` GGTGCTCCAGTTTCGGTGTTTGTTF: 5` TACAGCCATGGAACAGGAACAGGA
R: 5` GGTGCTCCAGTTTCGGTGTTTGTT 38
3938
39 Segment3_PASegment3_PA 47-805
47-805
F :5` ACCAAAGTCTCCCACCGAACTTCT
R :5` TAAGAGGGCGTGGTGTTGTTCTCAF: 5` ACCAAAGTCTCCCACCGAACTTCT
R: 5` TAAGAGGGCGTGGTGTTGTTCTCA 40
4140
41 Segment4_HASegment4_HA 271-1398
271-1398
F :5` ACCAAATACAGGACATCTGGGCGT
R :5` TGAACCCAATGCTCTCTTCACCTTF: 5` ACCAAATACAGGACATCTGGGCGT
R: 5` TGAACCCAATGCTCTCTTCACCTT 42
4342
43 Segment5_NPSegment5_NP 55-503
55-503
F :5` ATCTGGCGTCAAGCGAATAATGGG
R :5` TGCATCAGAGAGCACATTCTGGGAF: 5` ATCTGGCGTCAAGCGAATAATGGG
R: 5` TGCATCAGAGAGCACATTCTGGGA 44
4544
45 Segment6_NASegment6_NA 67-413
67-413
F :5` ACCGCAGTGTCAGATTACAGGGTT
R :5` GTTCCCTGCCCAAGTGCAAATTGAF: 5` ACCGCAGTGTCAGATTACAGGGTT
R: 5` GTTCCCTGCCCAAGTGCAAATTGA 46
4746
47 Segment7_M1,M2Segment7_M1, M2 47-746
47-746
F :5` AGCACCACAGCTAAGGCTATGGAA
R :5` TGCATTTGCACTCCCATCCGTTTCF: 5` AGCACCACAGCTAAGGCTATGGAA
R: 5` TGCATTTGCACTCCCATCCGTTTC 48
4948
49 Segment8_NS1,NEPSegment8_NS1, NEP 4-165
4-165
F :5` CCGCAAACGATTTGCAGACCAAGA
R :5` TTCGATGTCCAGACCAAGAGTGCTF: 5` CCGCAAACGATTTGCAGACCAAGA
R: 5` TTCGATGTCCAGACCAAGAGTGCT 50
5150
51

실시간 RT-PCR을 통해 발현된 메시지 수준의 상대적 발현비율을 보면, 웨스턴 블럿 분석결과에서처럼 Mx의 메시지의 비율이 0.7-0.8로 급격히 증가됨에 따라 각 바이러스 PB2 유전자의 메시지 수준이 2배 가량 눈에 띄게 감소되는 양상을 확인할 수 있었다(도 21).
The relative expression rate of the message levels expressed by real-time RT-PCR shows that the message level of each viral PB2 gene is noticeably doubled as the rate of Mx message increases rapidly to 0.7-0.8, as shown by Western blot analysis. The decreasing aspect was confirmed (FIG. 21).

실시예Example 9: 닭의 9: of chicken 호흡기도내Respiratory tract 상피세포에서 In epithelial cells pcMxpcMx DNADNA 의 양에 비례한 Proportional to 자손바이Offspring 러스 생산의 감소와의 상관관계 분석Correlation with Reduction of Russ Production

앞서 수행했던 TEC를 이용한 감염 실험에서 확보한 배양액을 활용하여 배양액 내 포함된 자손 바이러스의 역가를 측정함으로써 Mx 과발현이 자손 바이러스 형성에 미치는 영향을 추가적으로 확인하였다. H1N1 감염 배양액을 하루 전 96-웰 플레이트에 접종된 MDCK 세포에 재차 감염시켜 TCID50(tissue culture infectious dose 50)를 계산하였으며 도표화 하였다. 감염 후 24시간 후의 시료의 경우 아무것도 도입되지 않은 대조군에 비해 pcMx 또는 N631S가 도입된 경우 1 Log₁₀TCID50/ml 가량 낮은 역가를 보였고, 48시간에서는 그보다는 차이가 적은 0.3~0.4 Log₁₀TCID50/ml 가량의 역가차이를 보였다. pcMx의 양에 따른 바이러스 복제 감소와의 상관관계의 분석에서 확보한 H1N1 감염 세포 배양액의 역가측정결과도 웨스턴블럿 분석이나 실시간 RT-PCR와 유사한 패턴으로 pcMx의 도입된 양이 증가됨에 따라서 배양액 내의 바이러스 역가가 감소되는 것을 확인하였다. 상기 대조군에 비하여 1ug의 pcMx가 도입된 시료에서 유래한 배양액의 경우 0.3 Log₁₀TCID50/ml, 1ug의 pcMx가 도입된 시료에서 유래한 배양액의 경우 1.1 Log₁₀TCID50/ml 정도의 역가가 감소되는 것을 확인 할 수 있었다(도 22). The effect of Mx overexpression on progeny virus formation was further confirmed by measuring the titer of progeny virus contained in the culture medium using the culture solution obtained in the infection experiment using TEC. The tissue culture infectious dose 50 (TCID50) was calculated and tabulated by re-infecting H1N1 infected culture medium with MDCK cells inoculated in 96-well plates the day before. If the pcMx or N631S introduced than in the control group are not introduced into any case of the samples after 24 hours after infection 1 Log ₁₀ TCID50 / ml for about showed a low activity, in the 48 hours rather, 0.3 ~ 0.4 Log differ less ₁₀ TCID50 / ml There was a difference in potency. The titer of H1N1 infected cell culture obtained from the analysis of the correlation with the decrease in virus replication according to the amount of pcMx also showed that the amount of pcMx in the culture medium was increased in a pattern similar to Western blotting or real-time RT-PCR. It was confirmed that the titer was reduced. That 1ug pcMx the case of the resulting culture broth in the introduced sample _{0.3 Log 10 TCID50 / ml, 1ug} pcMx the case of the resulting culture broth in the introduced sample 1.1 Log ₁₀ TCID50 / ml about titer reduction of the comparison to the control group It could be confirmed (Fig. 22).

서열목록 전자파일 첨부Attach an electronic file to a sequence list

Claims

삭제delete

서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 Mx 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 하고, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조류독감 예방용 약제학적 조성물.
A pharmaceutical composition for preventing avian influenza comprising a polynucleotide encoding an Mx protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or a vector including the polynucleotide as an active ingredient and a pharmaceutically acceptable carrier.

제5항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 것인 조성물.
The composition of claim 5, wherein the polynucleotide is represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.

서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 Mx 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 하고, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조류독감 예방용 DNA 백신.
A polynucleotide encoding the Mx protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or a vector containing the polynucleotide as an active ingredient, and a DNA vaccine for avian influenza comprising a pharmaceutically acceptable carrier.

제7항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 것인 DNA 백신.
The DNA vaccine of claim 7, wherein the polynucleotide is represented by a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4. 9.

서열번호 4의 염기서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 조성물, 또는 상기 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 DNA 백신을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 조류독감을 예방하는 방법.
Administering a polynucleotide represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, a vector comprising the polynucleotide, a composition comprising the polynucleotide or vector, or a DNA vaccine comprising the polynucleotide or vector to an individual except a human Including, how to prevent bird flu.

제9항에 있어서, 상기 개체는 가금류인 것인 조류독감을 예방하는 방법.The method of claim 9, wherein the subject is poultry.