KR101370023B1

KR101370023B1 - 합성고분자 나노섬유메시와 ｍｔａ를 포함하는 치수질환 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101370023B1
Application number: KR1020120036137A
Authority: KR
Inventors: 우경미; 이우철
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2012-04-06
Filing date: 2012-04-06
Publication date: 2014-03-06
Also published as: KR20130113724A

Abstract

본 발명은 합성고분자 나노섬유메시와 MTA(Mineral trioxide aggregate)를 포함하는 치수질환 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 치수에 합성고분자 나노섬유메시를 위치시키는 단계; 상기 합성고분자 나노섬유메시에 MTA (Mineral trioxide aggregate)를 위치시키는 단계;를 포함하는 상아질모세포 분화 촉진 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 합성고분자 나노섬유메시와 MTA를 포함하는 치수질환 치료용 약학적 조성물은, 기존 MTA를 단독으로 사용하는 치수질환 치료의 문제점으로 지적되었던 세포독성 문제를 개선하고 상아질교 형성 및 상아질모세포의 분화를 촉진하는 효과가 우수하다.

Description

합성고분자 나노섬유메시와 ＭＴＡ를 포함하는 치수질환 치료용 조성물{COMPOSITION FOR DISEASES OF DENTAL PULP CONTAINING SYNTHETIC POLYMER NANOFIBER MESH AND MTA}

본 발명은 합성고분자 나노섬유메시와 MTA(Mineral trioxide aggregate)를 포함하는 치수질환 치료용 약학적 조성물, 및 치수에 합성고분자 나노섬유메시를 위치시키는 단계; 상기 합성고분자 나노섬유메시에 MTA(Mineral trioxide aggregate)를 위치시키는 단계;를 포함하는 상아질모세포 분화 촉진 방법에 관한 것이다.

치아의 상아질-치수 복합체는 치아의 중심 부위를 차지하고 있다. 상아질은 생활력이 있는 경 조직으로 혈관 및 신경이 분포되어 있는 연 조직인 치수와 복합체를 이루고 있다. 치수는 상아질을 지지하고 다양한 자극에 반응하며 치질(상아질)의 재생과 치유를 담당하고 있다. 상아질-치수 복합체는 충치나 물리적인 손상 등에 의해 외부 환경에 노출될 수 있다. 치수 조직 세포가 상아질모세포로 분화되어 수복상아질을 형성시키기 위하여 외부 환경에 노출된 치수는 외부 자극으로부터 보호되어야 하며 이를 위한 적절한 수단이 필요하다.

기존에는 칼슘하이드록사이드를 치수복조(pulp capping)에 이용하였으나, 이를 이용할 경우 형성되는 상아질교(dentin bridge)가 다공성과 낮은 접착성을 보이는 단점 때문에 새로운 치수복조 물질 또는 효과적인 방법에 관한 연구가 계속되어왔다.

MTA는 1990년대 초반 근관치료 분야에서 다양한 적용을 위해 개발되었으며 1998년 미국 FDA(US Food and Drug Administration)의 승인을 받았다. MTA는 트리칼슘 실리케이트(tricalcium silicate), 트리칼슘 알루미네이트(tricalcium aluminate), 트리칼슘 옥사이드(tricalcium oxide), 실리케이트 옥사이드(silicate oxide)가 주성분이며 수분과 접촉하면 4시간 이내에 경화하는 친수성의 미세분말로, 경화 후 pH는 12.5 정도로 알려져 있고, 압축강도는 아말감보다는 낮지만 IRM, Super EBA와 유사한 수준이다. MTA는 생체 적합성이 우수하고 세포 부착과 성장 및 증식을 허용하여 치유를 촉진시키는 장점뿐만 아니라 치료시간을 단축하고 최종 수복과정이 늦어지면서 나타날 수 있는 치근 파절을 방지하며 수산화칼슘을 장기 사용 함으로써 나타나는 상아질의 물성약화를 막을 수 있는 장점도 가지고 있다. 또한 MTA는 줄기세포의 분화를 조절하는 전사 인자를 상향 발현되도록 하여 소구치와 상아질모세포의 분화를 촉진할 수 있으며 이러한 과정은 상아질교의 형성을 촉진할 수 있게 된다. 따라서, 최근에는 MTA를 이용하는 치수 질환 치료 방법이 널리 사용되고 있다. 그러나 MTA를 이용하는 치수질환 치료는 초기 수화과정 동안에 높은 알칼리성 pH를 띄어 상당한 세포 독성을 가져오는 것이 문제점으로 지적되고 있다.

따라서, MTA 충전과정에서 발생할 수 있는 단점을 해결하면서 동시에 MTA의 목적하는 효과를 유지시킬 수 있는 방법에 대한 필요성이 절실히 요구되고 있다.

본 발명의 목적은 기존 MTA의 수복 상아질 형성 촉진 효과를 나타내면서, 수화 초기 MTA로 인한 세포독성을 차단하여 상아질교의 형성 및 상아질모세포의 분화를 촉진할 수 있게 하는 치수질환 치료용 약학적 조성물 및 상아모세포 분화 촉진 방법을 제공하는데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해서 본 발명은 합성고분자 나노섬유메시와 MTA(Mineral trioxide aggregate)를 포함하는 것을 특징으로 하는 치수질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 치수에 합성고분자 나노섬유메시를 위치시키는 단계; 상기 합성고분자 나노섬유메시에 MTA (Mineral trioxide aggregate)를 위치시키는 단계;를 포함하는 상아질모세포 분화 촉진 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 합성고분자 나노섬유메시와 MTA를 포함하는 치수질환 치료용 약학적 조성물은, 기존 MTA를 단독으로 사용하는 치수질환 치료의 문제점으로 지적되었던 세포독성 문제를 개선하고 상아질교 형성 및 상아질모세포의 분화를 촉진하는 우수한 효과가 있다.

도 1은 PCL-나노섬유메시(A)와 이의 지름의 분포(B)를 주사전자현미경으로 확인한 도이다(지름은 20,000배율의 주사전자현미경으로 측정).
도 2는 비글견에서의 치수절단술에 의한 소구치의 모습을 간략히 나타낸 도이다. 치수를 1mm 지름의 라운드바 드릴로 노출시켰다. 대조군인 MTA 단독 처리군은 MTA와 광중합수지(light curing resin)로 채워졌으며, 실험군인 PCL-나노섬유메시/MTA 처리군은 PCL-나노섬유메시 라이너를 노출 치수부위에 위치시킨 후 MTA를 얹고 광중합수지를 처리하였다.
도 3은 치수절제술 후 8주가 지난 후 소구치의 마이크로CT 사진을 나타낸 도이다(화살표: 상아질교).
도 4a의 a와 c는 MTA 단독 처리 대조군의, b와 d는 PCL-나노섬유메시/MTA 치수절제부위의 H-E 염색 결과를 나타낸 도이다(*: 상아질교, **: PCL-섬유의 잔여물, 회색화살표: 기존의 상아질과 새롭게 형성된 상아질의 경계, 검은 화살표: 상아모세포돌기 (odontoblast process) 부위).
도 4b는 DSP 면역염색결과이며 치수절제술 이후 MTA 단독 처리군(a,c)과 PCL-나노섬유메시/MTA처리군(b,d)를 각각 나타낸 도이다.
도 5의 A는 치수절제술 이후 상아질교의 두께를 100배율의 현미경 이미지를 이용하여 비교(n=9)한 결과를, B는 100배율의 현미경으로 관찰한, 형성되는 상아질의 부위를 나타낸 도이다(*는 MTA와 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다, p<0.05, ANOVA).
도 6은 MTA와 PCL-나노섬유메시/MTA 세포배양기를 제작 과정을 도식하여 나타낸 도이다.
도 7은 MDPC23 세포를 MTA(a,c,e,g)와 PCL-나노섬유메시/MTA(b,d,f,h)에서 배양한 주사전자현미경 결과를 나타낸 도이다. 세포들은 MTA 수화 한시간 이후(a~d) 또는 24시간 이후(e~h)에 놓아지고, 하루(a,b,e,f) 및 4일 동안(c,d,g,h) 배양하였다.
도 8은 MTA 또는 PCL-나노섬유메시/MTA에서 2시간 동안 배양된 세포에서의 세포독성을 SytoxGreen reagent를 사용하여 측정한 결과(n=5)를 나타낸 도이다(*는 MTA와 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다, p<0.05, ANOVA).
도 9는 MTA 또는 PCL-나노섬유메시/MTA에서 1일 또는 4일 동안 배양된 세포에서 PiciGreen reagent를 사용하여 측정한 세포분화 결과(n=5)를 나타낸 도이다(*는 MTA와 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다, p<0.05, ANOVA).
도 10은 상아질모세포 분화 정도를 나타낸 도이다(A: ALP(alkaline phosphatase; 알칼라인포스페이트) 와 DSPP(dentin sialoprotein)의 발현, B: 배지에서의 칼슘 침착 결과) MDPC23 세포는 MTA 또는 PCL-섬유/MTA 각각에서 7일 동안 분화배지를 이용하여 배양하였다. ALP 및 DSPP 전사체의 측정은 실시간 RT-PCT를 이용하여 측정하였으며, GAPDH를 이용하여 표준화하였다. (*은 MTA와 뚜렷한 차이를 도시한다, p<0.005 ANOVA).

본 발명은 합성고분자 나노섬유메시와 MTA(Mineral trioxide aggregate)를 포함하는 치수질환 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 조성물에서 합성고분자 나노섬유메시는 다양한 나노섬유 직경을 갖도록 제조될 수 있다. 바람직하게는 MTA의 독성 물질이 치수와 직접 접촉하지 못하도록 차단하며 상아모세포로의 분화를 촉진할 수 있는 나노섬유 직경을 가질 수 있으며, 더욱 바람직하게는 100nm ~ 1100nm의 섬유 직경을 가질 수 있다. 특히, 300~600 nm의 직경을 가질 때 상아모세포의 분화가 더욱 촉진될 수 있다.

상기 합성고분자 나노섬유메시는 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 폴리ε-카프로락톤(Poly(ε-caprolactone)), 폴리락틱산(polylactic acid), 폴리글리콜릭산(polyglycolic acid), 및 키토산 (chitosan)으로 이루어진 군에서 선택된 1이상의 합성고분자를 용매에 용해하여 제조할 수 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위해서는 상기의 합성고분자를 이용하여 치수와 MTA의 직접적인 접촉 차단 및 수화과정의 독성물질을 차단할 수 있는 적절한 섬유 직경 및 섬유 밀도를 가진 합성고분자 나노섬유메시를 제조하여 사용할 수 있으며 본 명세서에서는 바람직한 일 예로써 폴리ε-카프로락톤을 사용하였다.

상기 용매는 디메틸포름아마이드, 디클로로메탄, 테트라히드로푸란, 클로로포름, 디옥산, 에탄올, 메탄올, 프로판올, 및 아세트산으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 용매를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 합성고분자 나노섬유메시는 당업계에 공지된 합성고분자 나노섬유메시를 제조하는 방법을 제한없이 사용하여 제조될 수 있다. 충분한 점도를 지닌 고분자 용액이나 용융체는 정전기력을 부여받을 때 섬유가 형성될 수 있으며, 특히 전기방사기술을 이용하면 마이크로미터부터 나노 단위까지의 섬유를 제조할 수 있다.

상기 전기방사공정은 고전압의 정전기력에 의해 낮은 점도 상태의 고분자를 고분자내의 표면장력보다 큰 정전기력을 가함으로써 순간적으로 섬유형태로 방사하는 공정을 말하며, 본 발명에서는 원하는 섬유 직경을 갖는 합성고분자 나노섬유메시의 제조를 위한 바람직한 일 예로써, 전기방사방식을 이용하여 제조하였다.

본 발명에 따른 치수질환 치료용 약학적 조성물에서 합성고분자 나노섬유메시와 MTA(Mineral trioxide aggregate)는 상아질교의 재형성을 유도하여 치수질환 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

상기 치수질환 치료용 약학적 조성물은 상아질-치수 복합체 재생 및 염증 반응을 조절할 수 있는 약물을 추가할 수 있다. 추가 가능한 약물은 히스톤 디아세틸라아제(histone deacetylases) 저해제, 항산화제, 포스포리파아제(phospholipases) 및 사이클로옥시게나아제(cyclooxygenase)저해를 주요 작용으로 하는 소염제, Wnt 신호전달 조절제, 항생제를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로는, 추가 가능한 약물은 트리코스타틴 A, 부틸레이트, 발프로익산, 아피시딘; N-아세틸 시스테인(N-acetyl cysteine); 아스피린, 타이레놀, 이부프로펜, 디클로페낙, 인도메타신, 케토프로펜, 볼타렌, 펠덴, 모빅; 페니실린, 세팔로스포린, 카나마이신, 겐타마이신, 시소마이신, 에리트로마이신, 반코마이신, 타이코플라닌, 퀴놀론, 이소옥사졸 유도체 및 리튬클로라이드로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상의 약물일 수 있다.

본 명세서의 치아복조(수)법은 치수가 노출되거나 피복하는 상아질이 대단히 얇아진 경우에 약제를 점포해서 치수를 보존하는 방법을 말한다. 노출된 치수를 직접 보호하는 방법은 직접 복조(수)법이라고 하며, 상아질의 박층을 매개로 보호하는 방법을 간접 복수법이라고 한다.

본 명세서의 치수질환이란 치아의 치수에 생기는 병변으로 구체적으로는 치수충혈,　치수염,　치수변성, 치수의 괴사 등이 해당될 수 있다. 치수에 물리적 · 화학적 또는 세균성의 자극이 가해지면 처음에는 치수의 혈관이 확장되어 충혈을 볼 수 있고(치수충혈), 이 자극이 계속되면 치수에 염증이 생기게 되며 이를 치수염이라고 한다. 본 발명의 치료제는 이러한 치수질환에 의하여 생길 수 있는 치수충혈, 치수염 치수변성, 치수의 괴사, 치근단 병변, (치)근첨 형성, 치아 우식증으로 인한 치수의 손상을 치료하기 위하여 제한 없이 사용될 수 있다. 보다 구체적으로 본 발명은 치수질환으로 인하여 공간이 생긴 치수에서 상아질교를 효과적으로 형성하고 상아질모세포의 분화를 촉진시킴으로써 치수의 재생을 촉진시킬 수 있다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 합성고분자 나노섬유메시와 MTA에 의하면 MTA 단독 처리군에 비하여 상아질교의 재형성을 효과적으로 촉진할 수 있으며, 원하는 위치에서만 상아질교가 재형성될 수 있도록 함으로써 치수의 공간을 줄이지 않아 이후의 치료를 용이하게 할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 합성고분자 나노섬유메시와 MTA를 통해 상아질교의 재형성을 유도하여 치수질환 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 합성고분자 나노섬유메시와 MTA와 함께 치수질환 치료를 위한 공지의 유효 성분을 1종 이상을 함유할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 예를 들어 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 텍스트로오스, 슈크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물을 제제화할 경우에는 통상적으로 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조할 수 있다.

비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 다양한 경로로 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 유효 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어서 투여할 수도 있는바, 상기 투여 방법이 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 제조예 및 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 제조예 및 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 제조예 및 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

제조예1 . PCL 섬유 메트릭스의 제조

합성고분자 섬유 메시를 제조하기 위하여 폴리ε-카프로락톤(Poly(ε-caprolactone), 이하 PCL) 섬유 메트릭스를 디클로로메탄(dichloromethane; 이하, MC) 및 디메틸포름아마이드(dimethylformamide; DMF)가 4:6으로 혼합된 10 % (w/v) PCL 용액을 이용하여 전기 방사 방식으로 제조하였다. 보다 구체적으로는, PCL을 MC에 용해시키고 PCL이 완전히 용해된 이후, DMF를 PCL-MC 용액에 추가한 후 천천히 흔들며 섞어주었다. PCL 용액을 스테인레스 실린지 주사바늘(27G)을 이용하여 10mm의 실린지에 붓고 전기방사를 드럼 콜렉터에 대하여 수행하였다(드럼의 지름 10cm, 25rpm 회전). 전위 및 콜렉터까지의 거리는 각각 15kV 및 10cm이었다. 이후 실험에서의 사용을 위하여 PCL-나노섬유 메시는 잘라서 건조기에서 보관하였다.

제조예2 . 실험동물의 제조

본 발명의 모든 동물 실험 과정은 서울대학교의 윤리위원회의 승인을 받아 이루어졌으며 3마리의 18개월령 건강한 수컷 비글을 실험에 사용하였다. 비글은 조절된 온도, 광, 식이 조건에서 각각 분리되어 사육되었다.

1mg/kg의 케타민(ketamine)을 정맥주사를 통해 주입하여 무감각증을 유도하였다. 전신마취는 티오펜탈 나트륨(thiopental sodium)을 근육주사를 통해 주입함으로써 유도되었다.

상악골과 하악골 두번째 및 세번째 소구치를 랜덤하게 나누어 실험그룹을 구별하였다. 치아의 구멍를 분석하기 위하여, 높은 속도의 핸드피스에서 #4 라운드바 드릴을 이용하여 표준화된 치수의 노출(지름 1.5mm)을 얻었으며 지혈은 식염수 세척 및 솜 펠렛을 이용하여 수행하였다. 그 후 노출된 공간들은 합성물의 복원을 통하여 재생되었다. 치수복조(pulp capping)는 MTA 를 단독으로 처리하거나 또는 PCL-나노섬유메시와 MTA를 함께 처리하는 PCL-나노섬유메시/MTA를 통하여 수행하였다. MTA는 워터 파우더와 3:1(v/v)로 혼합하였으며 MTA applicator를 이용하여 노출부위에 적용하였다.

MTA만을 처리한 MTA 그룹(n=6)에서, MTA 2-3mm를 치수 노출 부위에 위치시켰으며, PCL-나노섬유메시/MTA 그룹에서는 PCL-나노섬유메시 1mm를 MTA 도포 전에 치수 노출 부위에 위치시켰다.

실시예 1. PCL - 나노섬유메시 / MTA 의 상아질교 형성효과

1.1 상아질교 형성효과 비교

전기방사(electrospinning)를 이용하여 10% PCL(poly(ε-caprolactone)) 용액으로부터 PCL-나노섬유(fiber)메시를 준비하였다(도 1). 제조된 평균 섬유의 지름은 600nm이었다. 비글견의 소구치에서 치수절단술을 수행하였으며, 노출된 치수에 드레싱하여 PCL-나노섬유메시의 상아질교 형성 효과를 측정하였다. PCL-나노섬유 메시를 치수 위에 위치시켰고 그 위에 MTA를 위치시켜 직접적으로 MTA와 노출된 치수가 접촉되지 않도록 하였다. 이의 대조군으로 노출된 치수에 MTA를 접촉시킨 MTA의 일반적인 적용방식을 설정하였다. 각각의 모식도를 도 2에 나타내었다.

치수에 MTA 또는 PCL-나노섬유메시/MTA 처리 8주 후에 마이크로CT를 수행하였다. 마이크로CT를 위하여 비글은 8주 후 희생되었으며, 상위 턱뼈를 잘라내고 다듬은 후 24시간 동안 4℃에서 4%의 파라포름알데하이드와 혼합하였다. 마이크로CT 이미지는 PCL-나노섬유메시에 의한 공간과 PCL-나노섬유/MTA 그룹에서의 상아질교(dentin bridge)의 형성을 보여주었다(도3).

MTA을 처리한 그룹에서는 상아질교가 뚜렷하게 구별되지 않는 것을 확인하였다. 그러나, MTA 그룹에서 근관(root canals)로의 침투는 관찰 가능하였다.

표본들은 Plank-Rychlo's solution을 이용하여, 실온에서 3달 동안 탈칼슘화 하였으며, 탈수화한 후, 파라핀에 고정하여 6μm로 잘라낸 후 H&E 염색을 수행하였다. 면역조직학적인 관찰을 위하여 잘라진 슬라이드들은 30분 동안 0.3% H₂O₂에 넣어두었으며, 한 시간 동안 PCS에서 1%의 BSA(bovine serum albumin)에서 차단(blocking)되었다. 그 후 단편들을 항 DSP 항체와 함께 60분 동안 배양하고 2차 항체와 함께 30분 동안 배양하였다. 최종적으로 DAB 용액과 1분 동안 반응시켰으며 H-E 염색 및 IHC 이미지를 Leica DM2500 현미경으로 관찰하였다.

도 4a에 나타낸 바와 같이, MTA 단독 처리 그룹보다 PCL-나노섬유메시/MTA 처리군에서 치수 조직이 더욱 잘 형성되고 상아질교가 더욱 두껍게 형성되는 것을 조직학적으로 확인할 수 있었다. 또한, 풍부한 상아모세포돌기와 관형 상아질유사 메트릭스가 PCL-나노섬유/MTA 처리군에서 뚜렷히 관찰되었다.

1.2 PCL -나노섬유/ MTA 가 치수 챔버에 미치는 효과

또한, PCL-섬유/MTA 처리군에서는 상아질교가 치수 챔버의 열린 부위에서만 특이적이고 연속적으로 형성되어 챔버의 공간을 좁히지 않으면서 메우고자 하는 부위만을 효과적으로 메울 수 있었다. 이와 비교하여 MTA만 처리된 대조군은 좁은 상아질교를 형성할 뿐만 아니라 비특이적 부위에서 형성되어 치수 챔버의 공간을 줄이게 되는 것을 확인할 수 있었다.

보다 구체적으로, MTA 단독 처리군과 PCL-나노섬유메시/MTA 처리군에서 치수 세포의 상아질 모세포 표현형으로의 분화에 관여하는 상아질 시알로단백질(dentin sialoprotein, DSP)의 면역염색을 수행하였다.

도 4b에 나타낸 바와 같이 MTA 단독 처리군에서의 3차 상아질은 치수 챔버 벽의 상아질에 인접해서 이전에 존재하고 있던 상아질과 새롭게 형성되는 상아질 사이에 분명한 경계를 만들면서 형성되었다. 이러한 과정에 의하여 치수 챔버가 좁아지는 결과를 관찰할 수 있었다. MTA에서의 상아질의 형성은 상아질 세관(dentinal tubules)을 거의 관찰할 수 없는 무정형의 메트릭스처럼 관찰됨을 확인하였다(도 4b의 a,c)

PCL-나노섬유메시/MTA 처리군에서는 상아질시알로단백질이 매우 많이 발현되는 것을 확인할 수 있었다(도 4b의 b,d)). PCL-섬유/MTA 처리군은 MTA 처리 대조군과 비교하여 더욱 강한 발현을 나타내는 것을 확인하였다.

상아질교의 두께를 비교하기 위하여 조직형태계측을 추가적으로 수행하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, PCL-나노섬유메시/MTA의 상아질교는 MTA 처리 대조군에 비하여 약 4배 정도 더 두껍게 형성되었다(도 5의 A). 그러나 새롭게 형성되는 상아질의 총 면적은 PCL-나노섬유메시/MTA 처리군이 대조군에 비하여 약 3배 정도 넓은 것을 확인할 수 있었다(도 5의 B). 이러한 결과는 MTA 처리군에서 3차 상아질의 상당한 양이 목적하는 장소가 아닌 치수 챔버의 벽에서 형성된다는 것을 추가적으로 확인시켜 주었다. 상아질교의 두께와 상아질 형성 부위간의 차이는 통계학적으로 유의하였다(ANOVA, p<0.05).

이를 통해 본 발명의 PCL-나노섬유메시를 이용한 드레싱은 치수절단 시 MTA를 적용하는 데 있어서, 두꺼운 상아질교를 형성하는데 매우 유용하며, 특히 MTA 만을 단독 처리하는 것과 비교하여 치수 챔버의 부피를 줄이지 않으면서 상아질교만을 특이적으로 형성할 수 있는 것을 확인하였다.

2차 상아질교의 형성 등 치수의 벽에서 형성되는 상아질교에 의하여 치수가 좁아지는 경우, 향후 치료가 어려운 점에 비추어 본 발명의 PCL-섬유/MTA는 상아질교를 형성하는데 MTA 단독 처리에 비하여 매우 유용할 수 있다.

실시예2 . PCL -섬유의 세포보호 효과

PCL-나노섬유메시/MTA를 치수 노출 부위에 처리하였을 때와 MTA를 단독으로 처리하였을 때의 치수 세포의 반응을 비교하기 위하여 세포 배양을 수행하였다.

세포배양기는 도6에서 도식화하고 있는 방법을 사용하여 제조하였다. 보다 구체적으로 6.4mm의 폴리스티렌 튜브(외부지름 6.4mm, 내부지름 4.9mm)를 1mm의 두께의 링 형태로 절단하고 7.9mm의 튜브(외부지름 7.9mm, 내부지름 6.5mm)를 1.5mm두께의 실린더 형태로 절단하였다. PCL-나노섬유메시는 1x1cm로 자른 후 멸균시켜 준비하였다. orthMTA와 증류수(600μL 증류수/1g MTA)를 혼합하고 6.4mm 지름의 링에 이동시킨 후 다른 유리 플레이트로 상부를 덮었다. 혼합 1시간 후 상부 유리 커버를 제거하고 MTA로 채워진 6.4mm 지름의 링을 뒤집었다. MTA 대조군을 제조하기 위해서 상기 링을 7.9mm지름의 실린더에 삽입하였다. 실험군인 PCL-나노섬유메시/MTA를 제조하기 위해서는 1x1cm PCL-나노섬유메시 조각을 MTA로 채워진 6.4mm 지름의 링에 덮는 과정을 추가하였고 이를 다시 7.9mm 실린더로 삽입하였다. 혼합 후 2시간 후에 세포를 놓아 실험에 사용하였다.

세포의 배양은 쥐과의 소구치 세포주인 MDPC23을 10%의 FBS를 포함하는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)에 배양하는 방법으로 수행하였다. MDPC23 세포는 12웰 플레이트에 1 × 10⁵ cells/well의 밀도로 분주되었고 MTA 또는 PCL-나노섬유메시/MTA 유니트당 1.5 × 10⁴ cells/well로 놓여졌다. 세포를 놓은 지 약 1일이 경과한 후에 세포들을 5% FBS, 50μg/ml 아스코르브산, 10mM 베타글리세로포스페이트를 포함하는 DMEM에서 배양하였다.

MTA 또는 PCL-나노섬유메시/MTA를 처리하지 않은 세포배양기는 세포 독성을 나타내지 않는 것을 확인하였으며, 제조된 세포배양기는 MTA 또는 PCL-나노섬유메시/MTA의 기질을 세포에 공급하였다.

주사 전자 현미경을 통해 PCL-나노섬유메시/MTA에 놓인 MDPC23 세포를 관찰하였다. 세포독성을 확인하기 위한 방법으로 sytox green reagent 용액을 사용하였다. 해당 용액을 제조자의 방법에 따라 각각의 실험군에 10μl씩 주입하였다. 세포들은 메트릭스에 부착되어 있었으며, MTA 수화 후 30분이 경과해도 건강하게 성장하는 것을 확인하였다. 반면에 MTA 대조군의 세포들은 사멸하였고 오직 세포의 잔해들만 MTA 수화 30분 후에 관찰할 수 있었다(도 7).

도 8에서 나타낸 바와 같이, PCL-나노섬유메시/MTA는 세포의 죽음을 대조군의 7.9%까지 감소시키는 것을 확인하였다. 이러한 차이는 통계학적으로 유의하였다((ANOVA, p<0.05).

또한 PCL-나노섬유메시/MTA에서 세포 배양을 하는 경우, 세포의 증가도 MTA 처리 대조군에 비하여 활발한 것으로 나타났다. MTA 수화 24시간 후에 두 개의 기질에 세포를 위치시켰다. 분화 테스트를 위하여 배양 1일째와 5일째에 100μL 의 MLB를 추가한 후 10 μL의 피코그린 reagent를 각각의 샘플에 첨가하여 형광을 측정하였다. 배양 첫 날에는 대조군에 비하여 약 2.4배 많은 DNA의 양을 확인할 수 있었으며, 배양 4일째는 PCL-나노섬유메시/MTA에서의 DNA의 양이 대조군인 MTA 처리군에 비하여 35배 이상 많은 것을 확인하였다(도9). 이러한 차이는 통계적으로 유의하였으며(ANOVA, p<0.05) 이러한 결과로부터 PCL-나노섬유메시는 MTA의 독성으로부터 세포를 보호하며 세포의 분화, 증가에 적합한 마이크로 환경을 공급할 수 있음을 확인하였다.

실시예3 . in vitro 배양에서의 상아질모세포의 분화

상아질모세포의 분화에서 PCL-나노섬유메시가 미치는 영향을 분석하기 위하여 실시간 RT-PCR을 통해 전사체의 발현의 양을 측정하였다. RNA의 흡광도는 230, 260, 280nm에서 측정하였다. PrimeScript™ RT reagent kit를 제조업자의 매뉴얼에 따라 수행하였다. 다음 표 1은 사용된 마우스 프라이머 서열을 나타낸다.

시험관 내에서 세포의 골형성능력을 측정하기 위하여 ALP(알칼라인포스페이트)의 활성도 평가가 일반적으로 사용될 수 있고 DSPP(dentin sialoprotein)는 상아질모세포 분화 특이 마커로 알려져 있다. 따라서, ALP 및 DSPP의 발현을 실시간 RT-PCR을 이용하여 측정하였고, 그 결과 PCL-나노섬유메시/MTA에서 자란 MDPC 23 세포가 대조군에 비하여 DSPP 및 ALP를 각각 약 2배, 3배 정도 더 많이 발현하며 성장하는 것을 확인하였다(도 10의 A). 반복 실험을 수행하여 발현의 차이가 통계적으로 유의함을 확인하였다(ANOVA, p<0.05).

실시예4 . PCL -섬유의 생광물화 촉진

생광물화(biomineralization)에 미치는 PCL-나노섬유메시의 효과를 칼슘 침착 에세이를 통하여 확인하였다. 칼슘 침착은 칼슘 에세이 키트를 이용하였으며, 일주일간 MDPC 23 세포를 배양한 후 평가하였다. MDPC 23세포의 배양은 0.5 N HCl에서 24시간 동안 수행하였고, 이후 칼슘 시약 표준용액을 각각의 실험군에 첨가하여 수행하였다. 흡광도는 575nm에서 측정하였다.

MTA는 칼슘 이온을 유출하기 때문에, MTA에 직접적으로 배양되는 세포에서는 평가가 어려운 점이 있어 MTA 추출 DMEM을 이용하여 실험을 수행하였다. MTA 추출 DMEM 배지는 다음과 같이 제조되었다. 200mg MTA 분말과 120μL의 증류수를 30분 동안 원뿔형(conical) 튜브에서 혼합하였다. 그 후 50ml의 DMEM을 추가하였고 부드럽게 하루 동안 흔들어주었다. MTA 추출 배지를 획득하기 위하여, 튜브를 원심분리하였다. 신선한 DMEM은 튜브로 주입되었으며 원심분리 이후에 첫 번째 및 두 번째 MTA 추출물을 얻고, 이를 0.2μm 필터로 걸러서 최종적으로 MTA 추출 DMEM을 얻었다.

준비된 MTA 추출 DMEM과 MDPC 23 세포들을 조직배양디시(tissue culture dish, TCD) 및 PCL-나노섬유메시에서 각각 배양하였다. 각각의 배양의 결과물에서 칼슘 침착은 뚜렷한 차이를 나타냈으며, PCL-나노섬유메시에서의 배양은 TCD에서의 침착보다 약 2배 이상의 많은 것으로 나타났다(도 10의 B). 이를 통해 PCL-나노섬유메시/MTA에서 칼슘의 침착이 대조군에 비하여 유의성있게 증가하였음을 알 수 있다.

이러한 차이는 본 발명의 PCL-섬유가 상아질 모세포의 분화 및 생광물화를 촉진하는 것을 증명하는 것이다.

Claims

합성고분자 나노섬유메시와 무기질 트리옥사이드 집합체 (Mineral trioxide aggregate, MTA)를 포함하는 치수질환 치료용 약학적 조성물에 있어서,
상기 합성고분자 나노섬유메시는 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 폴리(ε-카프로락톤)(Poly(ε-caprolactone)), 폴리락틱산(polylactic acid), 폴리글리콜릭산(polyglycolic acid) 및 키토산(chitosan)으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 합성고분자를 용매에 용해하여 제조되는 것을 특징으로 하는 치수질환 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 합성고분자 나노섬유메시는 무기질 트리옥사이드 집합체의 독성물질을 차단할 수 있는 100~1100nm의 섬유 직경 및 섬유 밀도를 가진 것을 특징으로 하는 치수질환 치료용 약학적 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 용매는 디메틸포름아마이드, 디클로로메탄, 테트라히드로푸란, 클로로포름, 디옥산, 에탄올, 메탄올, 프로판올 및 아세트산으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 용매인 것을 특징으로 하는 치수질환 치료용 약학적 조성물.
제1항, 제2항 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치수질환은 치수충혈, 치수염 치수변성, 치수의 괴사, 치근단 병변, 치근첨 형성, 및 치아우식증으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 질환인 것을 특징으로 하는 치수질환 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 합성고분자 나노섬유메시와 무기질 트리옥사이드 집합체는 상아질교의 재형성을 유도하는 것을 특징으로 하는 치수질환 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 치수질환 치료용 약학적 조성물은 트리코스타틴 A, 부틸레이트, 발프로익산, 아피시딘, N-아세틸 시스테인(N-acetyl cysteine), 아스피린, 타이레놀, 이부프로펜, 디클로페낙, 인도메타신, 케토프로펜, 볼타렌, 펠덴, 모빅; 페니실린, 세팔로스포린, 카나마이신, 겐타마이신, 시소마이신, 에리트로마이신, 반코마이신, 타이코플라닌, 퀴놀론, 이소옥사졸 유도체, 및 리튬클로라이드로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상의 약물을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 치수질환 치료용 약학적 조성물.
인간을 제외한 동물의 치수에 합성고분자 나노섬유메시를 위치시키는 단계; 및
상기 합성고분자 나노섬유메시에 무기질 트리옥사이드 집합체 (Mineral trioxide aggregate, MTA)를 위치시키는 단계; 를 포함하는 상아질모세포 분화 촉진 방법에 있어서,
상기 합성고분자 나노섬유메시는 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 폴리(ε카프로락톤)(Poly(ε-caprolactone)), 폴리락틱산(polylactic acid), 폴리글리콜릭산(polyglycolic acid); 및 키토산(chitosan)으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 합성고분자를 용매에 용해하여 제조되는 것을 특징으로 하는 상아질모세포 분화 촉진 방법.
삭제
제8항에 있어서, 상기 합성고분자 나노섬유메시는 무기질 트리옥사이드 집합체의 독성물질을 차단할 수 있는 100nm~1100nm의 섬유 직경 및 섬유 밀도를 가진 것을 특징으로 하는 상아질모세포 분화 촉진 방법.
제8항에 있어서, 상기 용매는 디메틸포름아마이드, 디클로로메탄, 테트라히드로푸란(tetrahydrofuran), 클로로포름, 디옥산, 에탄올(ethanol), 메탄올(methanol), 프로판올(propanol) 및 아세트산(acetic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 용매인 것을 특징으로 하는 상아질모세포 분화 촉진 방법.
제8항에 있어서, 상기 합성고분자 나노섬유메시는 트리코스타틴 A, 부틸레이트, 발프로익산, 아피시딘, N-아세틸 시스테인(N-acetyl cysteine), 아스피린, 타이레놀, 이부프로펜, 디클로페낙, 인도메타신, 케토프로펜, 볼타렌, 펠덴, 모빅, 페니실린, 세팔로스포린, 카나마이신, 겐타마이신, 시소마이신, 에리트로마이신, 반코마이신, 타이코플라닌, 퀴놀론, 이소옥사졸 유도체, 및 리튬클로라이드로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상의 약물을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 상아질모세포 분화 촉진 방법.