KR101368333B1 - Bacteriophage T10-1, MY-1, and vegetable soft rot controlling composition containing the same - Google Patents
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Abstract
본 발명은 새롭게 분리, 동정된 박테리오파지 T10-1과 MY-1 및 이들 중 어느 하나, 또는 이들 모두를 유효성분으로 포함하는 채소 무름병 방제용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 박테리오파지 T10-1과 MY-1은 신선채소의 무름병에 방제 효과가 있어 채소의 무름병 방제를 위한 미생물 농약으로 활용될 수 있고, 항생제 대신 사용될 수 있으므로, 항생제 내성균 출현 가능성을 감소시키고, 환경 안전성을 높일 수 있다.The present invention relates to a newly isolated and identified bacteriophage T10-1 and MY-1, and any one or both of them as an active ingredient, a composition for controlling vegetable softening disease. Bacteriophage T10-1 and MY-1 of the present invention can be used as a microbial pesticide for the control of fresh vegetables because it can be used as a microbial pesticide for the control of vegetables, and can be used instead of antibiotics, reducing the possibility of antibiotic resistant bacteria, environmental It can increase safety.
Description
본 발명은 채소 무름병원균 억제 효과를 가지는 새롭게 분리, 동정된 신규 박테리오파지들 및 이들을 이용한 채소 무름병 방제용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for controlling vegetable soft rot using the newly isolated, identified novel bacteriophages having a vegetable soft rot inhibitory effect.
무름병은 독특한 냄새가 나면서 흐물흐물해져서 썩는 식물의 병해를 지칭하는 것으로, 흔히 연부병(軟腐病)이라고도 한다. 무름병에 걸리면 세포벽 중간층의 펙틴질이 녹아 처음에는 물기가 보이는 것에 그치나, 점차로 물러져 썩고 액체처럼 흐물흐물해진다. 무름병은 채소에 많이 나타나는 병해이나, 그 밖에 토마토, 고구마, 감자에도 많이 나타난다.Soft rot refers to a disease of a plant that decays due to its peculiar smell, and it is often referred to as soft rot (軟腐病). When you get a soft rot, the pectin in the middle layer of the cell wall melts and you only see moisture at first, but it gradually softens, rots, and becomes loose like a liquid. Soft rot is a disease that appears a lot in vegetables, but it also appears in tomatoes, sweet potatoes, and potatoes.
배추를 포함하는 야채에 무름병을 발생시키는 펙토박테리움 카로토보룸(Pectobacterium carotovorum subsp . carotovorum)은 생장 적온이 26~28℃이나, 다른 식물 병원 세균과는 달리 상온인 36℃ 정도에서도 잘 자라, 여름철 배추 생산에 가장 큰 장애 요인이다. 무름병균은 배추를 비롯하여 거의 모든 식물에 침입하여 발병할 수 있는데, 한번 침입하면 주변의 다른 채소로 옮겨가 발병을 전파한다. Pectobacterium carotoborum (Pectobacterium) causes soft rot in vegetables including Chinese cabbage carotovorum subsp . carotovorum ) has an appropriate growth temperature of 26~28℃, but unlike other plant pathogens, it grows well at room temperature of 36℃, which is the biggest obstacle to Chinese cabbage production in summer. The soft rot can invade almost all plants, including cabbage, and can cause disease. Once invaded, it moves to other vegetables and spreads the disease.
최근 웰빙 문화의 확산으로 신선 채소의 소비가 급증하고 있는데, 신선 채소에서도 무름병 발병이 급증하고 있다. 특히, 진열대에 진열한 신선 채소는 신선도 유지를 위하여 수분을 계속 공급하는데, 수분을 통해서도 무름병균이 전파된다. 무름병은 배추나 신선 채소에 한번 발생하면 방제가 매우 까다로운데, 소비자들이 배추나 채소를 익히지 않고, 대부분 그대로 섭취하기 때문이다. 또한, 병원균인 펙토박테리움 카로토보룸(Pectobacterium carotovorum subsp . carotovorum)은 토양에서 비교적 오랫동안 생존이 가능하며, 농약에 의한 방제 효과도 일반적으로 낮은 것으로 알려져 있다.Recently, the consumption of fresh vegetables is increasing rapidly due to the spread of well-being culture, and the incidence of soft rot is also increasing rapidly in fresh vegetables. In particular, fresh vegetables displayed on the display stand continue to supply moisture to maintain freshness, and soft rot germs are spread through the moisture. Soft rot is very difficult to control once it occurs on cabbage or fresh vegetables, because consumers do not cook cabbage or vegetables and consume most of them as they are. In addition, the pathogen Pectobacterium carotoborum (Pectobacterium carotovorum subsp . carotovorum ) can survive for a relatively long time in the soil, and it is known that the control effect by pesticides is generally low.
따라서, 친환경적이면서도 효과적인 방제기술 개발이 시급한데, 지금까지 각종 작물의 병 방제는 주로 저항성 품종의 개발과 농약 사용에 의한 화학적 약제에 크게 의존하였다. 이 중 저항성 품종의 개발에는 많은 기술적경제적 그리고 시간적 제약이 따르며, 새로운 저항성 품종을 선발하여도 번식 속도가 빠른 세균이 바로 적응할 수 있는 능력을 키우게 되어 저항성을 상실하게 되는 문제가 발생한다. 그리고 화학 약제로 알려진 항생제는 동물세균에도 같이 작용하여 항생제 저항성 균을 조장할 수 있는 문제를 발생한다.Therefore, the development of eco-friendly and effective control technology is urgent. Until now, disease control of various crops has largely depended on the development of resistant varieties and chemical drugs by the use of pesticides. Among them, the development of resistant varieties is subject to many technical, economic and time constraints, and even if a new resistant variety is selected, a problem arises that the bacteria with a fast breeding speed develop the ability to adapt immediately, resulting in a loss of resistance. And antibiotics, known as chemical drugs, also act on animal bacteria, causing a problem that can promote antibiotic-resistant bacteria.
이에 대한 대응책으로 생물학적 방제 기법이 현재 부각되고 있는데, 병원균에 대해 길항 및 경쟁 미생물을 분리하여 배양한 후, 토양, 종자 또는 식물체에 직접 처리하여 병원균의 침입을 막거나, 살균 물질을 분비하여 병원성 세균의 증식을 억제하는 방법이 알려져 있고, 세균만을 특이적으로 공격하여 용균시키는 박테리오파지란 바이러스를 이용하는 방법이 알려져 있다. 이와 같은 생물학적 방제는 유기 합성 농약이 가지는 환경오염, 약해 및 잔류 독성의 문제가 없다는 점에서 매우 바람직한 것으로 받아들여지고 있다.As a countermeasure against this, biological control techniques are currently emerging.After cultivating antagonists and competing microorganisms by separating and culturing pathogens, they are treated directly to soil, seeds or plants to prevent invasion of pathogens, or by secreting sterilizing substances to prevent pathogenic bacteria. A method of inhibiting the proliferation of bacterium is known, and a method of using a bacteriophage virus that specifically attacks and lyses only bacteria is known. Such biological control is considered to be very desirable in that organic synthetic pesticides do not have environmental pollution, weakness, and residual toxicity.
파지가 발견된 1910년부터 1930년대에 걸쳐 파지는 숙주 특이성과 숙주 세균의 내독소, 외독소 등 그 당시 과학적으로 풀지 못하는 문제 및 1929년 플래밍에 의해 발견된 페니실린과 1943년 워크스만에 의한 스트렙토마이신으로 대표되는 화학적 치료제(약)의 발견으로 인해 그 활용 및 개발이 잠시 주춤하였다.From 1910 to 1930, when phages were discovered, phages were not scientifically solved at that time, such as host specificity, endotoxins and exotoxins of host bacteria, and penicillin discovered by Flaming in 1929 and Strepto by Worksman in 1943. Due to the discovery of a chemotherapeutic agent (drug) represented by mycin, its utilization and development have been delayed for a while.
한편, 그 당시에 파지를 치료제로 사용하기에는 몇 가지 문제가 있었다. 그 중, 특이성이 높아 몇몇 균주에만 특이적으로 작용하는 점과 저항성이 높아 사용 후 바로 저항성 균이 나타나 치료제로서의 효과가 바로 없어진다는 것이 가장 문제였다. 반면에 화학적 치료제는 항균 범위가 넓으며, 최초 적용시에는 내성균 문제도 없었기 때문에 광범위하게 활용되었고, 그 결과 파지 요법은 거의 사라지게 되었다. 그 후로 1950년대에 WHO에 의해 파지 요법은 무효 선언되었으며, 동구권과 구소련연방에서만 그 명맥이 겨우 유지되어 왔다. Meanwhile, there were some problems in using phage as a treatment at that time. Among them, the most problematic was the high specificity that it acts specifically on only a few strains, and that the resistant bacteria appear immediately after use due to high resistance, and the effect as a treatment disappears immediately. On the other hand, chemotherapy has a wide antibacterial range, and since there was no problem with resistant bacteria at the time of initial application, it was widely used, and as a result, phage therapy almost disappeared. Since then, phage therapy was declared invalid by the WHO in the 1950s, and it has only been maintained in the Eastern Bloc and the former Soviet Union.
그러나, 1980년대에 들어 파지 요법에 대한 생각이 바뀌게 되는데, 1982년 영국의 연구자그룹인 스미스와 휴긴스는 마우스를 이용한 뇌막염 치료 모델 실험을 하였다. 마우스의 피하 근육 내에 균을 주사하고 반대쪽의 피하에는 균의 특이적인 용균 파지를 주사한 결과, 파지를 주사하지 않은 대조군은 100% 폐사한 것에 비해 파지를 주사한 경우(실험군) 100% 생존하였으며, 항생제(스트렙토마이신 등)의 효과보다도 우월한 것이 확인되었다. 이때, 파지의 저항성 문제도 여러 종류의 파지를 칵테일로 사용하여 해결할 수 있었다. However, in the 1980s, the idea of phage therapy changed. In 1982, a group of British researchers Smith and Huggins conducted a model experiment for meningitis treatment using mice. As a result of injecting a fungus into the subcutaneous muscle of the mouse and injecting a specific lytic phage in the subcutaneous side of the other side, the control group that did not inject the phage survived 100% when injected with phage (experimental group) compared to 100% dying. It was confirmed that it was superior to the effect of antibiotics (such as streptomycin). At this time, the problem of resistance to phage could also be solved by using various types of phage as a cocktail.
파지의 크기는 세균의 약 1/10로 그 모양은 전자현미경으로 관찰할 수밖에 없다. 그러나, 파지가 균을 용균하면 한천 배지 상에 증식한 세균 집락에 투명한 반점(플라크)이 형성되기 때문에 파지의 존재를 육안으로도 확인할 수 있다. The size of the phage is about 1/10 of that of bacteria, and its shape can only be observed with an electron microscope. However, when the phage dissolves the bacteria, transparent spots (plaques) are formed on the bacterial colonies that have grown on the agar medium, so that the presence of the phage can be confirmed visually.
파지는 세균 감염 후 약 30분경에 100~200개의 새로운 파지를 만들고, 세균의 막을 파괴하며 밖으로 나온다. 세균은 2분열 증식을 하는데, 빠른 것은 약 20분에 2개의 개체, 40분에 4개의 개체, 60분에 8개의 개체로 된다. 파지의 경우에는 약 30분에 100개 이상의 새로운 파지가 생성되는데, 증식의 속도에서 세균에 비해 훨씬 우세하다. 특정 세균이 20분에 1회씩 무제한으로 증식한다면 하나의 세포에서 출발한 세균이 지구와 같은 무게가 되는 데는 단지 36시간밖에 걸리지 않으므로, 세균의 증식을 억제할 수 있는 중요한 후보로 파지가 고려될 수 있다.Phages make 100 to 200 new phages about 30 minutes after bacterial infection, destroy the bacterial membrane and come out. Bacteria multiply in two divisions, and the fastest one becomes 2 individuals in about 20 minutes, 4 individuals in 40 minutes, and 8 individuals in 60 minutes. In the case of phage, more than 100 new phages are produced in about 30 minutes, which is far superior to bacteria in the rate of proliferation. If a specific bacterium proliferates indefinitely once every 20 minutes, it takes only 36 hours for a bacterium starting from a single cell to become the same weight as the earth, so phage can be considered as an important candidate to inhibit the proliferation of bacteria. have.
파지는 용균 파지와 용원성 파지로 분류되며, 용균 사이클만 반복하는 것을 용균(virulent) 파지, 용원 사이클만 반복하는 것을 약독성(temperate) 파지로 정의한다. 약독성 파지(temperate phage)는 숙주세균의 유전체에 파지의 유전자 정보를 삽입하기 때문에 파지의 모양은 사라지고, 숙주세균이 파괴되지도 않는다. 이러한 상태는 숙주 세균이 좋은 환경조건에 있는 한 계속되는데, 숙주 세균의 환경이 악화되면, 숙주세균의 유전자에 있던 파지 유전자는 파지 입자를 만든 후, 용균 사이클로 변환되어 숙주세균을 용균시키고, 숙주세포 밖으로 탈출한다.Phage is classified into lytic phage and soluble phage, and repeating only the lysis cycle is defined as a virulent phage, and only repeating the lysis cycle is defined as a temperate phage. Because temperate phage inserts the genetic information of the phage into the genome of the host bacteria, the shape of the phage disappears and the host bacteria are not destroyed. This condition continues as long as the host bacteria are in good environmental conditions. When the environment of the host bacteria deteriorates, the phage gene in the host bacteria's gene creates phage particles and then converts into a lysis cycle to lyse the host bacteria, and host cells To escape outside.
한편, 파지가 항생제에 비교하여 가지는 여러 가지 장점들을 나열하여 보면 다음과 같다. 첫째, 파지는 숙주가 있는 경우에만 복제가 가능하다. 둘째, 파지는 자연상태로 존재하며 세균이 있는 곳에는 어디서든 다 존재한다. 셋째, 파지는 어떤 진핵세포의 생물에도 안전하다. 넷째, 특이성이 높아 이로운 다른 세균에는 안전하다. 다섯째, 파지는 준비가 매우 쉽다. On the other hand, a list of several advantages of phage compared to antibiotics is as follows. First, phage can only be replicated in the presence of a host. Second, phages exist in their natural state, and wherever there are bacteria, they exist everywhere. Third, phage is safe for any eukaryotic organism. Fourth, it is safe against other beneficial bacteria due to its high specificity. Fifth, the gripping is very easy to prepare.
상기와 같은 여러 가지의 장점 때문에, 최근 점점 더 많은 파지가 개발되고 있는 실정이다.Due to the various advantages described above, more and more phages are being developed in recent years.
이에 본 발명은 무름병 세균의 사멸을 유도할 수 있는 새로운 박테리오파지를 분리하고 이를 함유하는 무릅병균 증식 억제용 또는 사멸용 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a composition for inhibiting proliferation or killing of soft rot bacteria, and isolating a new bacteriophage capable of inducing the death of soft rot bacteria.
상기의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 채소 무름병에 대해 방제능을 발휘하는 새롭게 분리, 동정된 박테리오파지 T10-1 (KACC 97008P) 및 MY-1 (KACC 97009P)을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a newly isolated, identified bacteriophage T10-1 (KACC 97008P) and MY-1 (KACC 97009P) exhibiting a control ability against vegetable soft rot.
본 발명자들은 고창, 무안, 제주, 태백, 해남, 평창 등 배추, 상추 등의 채소 재배로 유명한 지역의 토양 샘플 약 130여종을 채취하고, 이러한 토양 중에 존재하는 무름병균의 박테리오파지들을 분리, 동정하였으며, 분리된 박테리오파지들의 무름병균 용균 효과, 기주 범위 등을 평가하여 2개의 우수한 효과를 가지는 박테리오파지를 선별하였고, 이를 각각 T10-1과 MY-1로 명명하였다. The present inventors collected about 130 kinds of soil samples from regions famous for cultivation of vegetables such as cabbage and lettuce such as Gochang, Muan, Jeju, Taebaek, Haenam, and Pyeongchang, and separated and identified bacteriophages of soft rot bacteria present in these soils, Bacteriophages having two excellent effects were selected by evaluating the bacteriophage lysis effect and host range of the isolated bacteriophages, and they were named T10-1 and MY-1, respectively.
도 1에 나타나는 바와 같이, 파지 T10-1을 현미경으로 관찰한 결과 수축되지 않는 매우 짧은 꼬리를 가지고 있는 등 포도비리데(Podoviridae)의 형태학적 특성을 지녀 포도비리데(Podoviridae)에 속하는 것으로 판명되었고, 이를 KACC(농업미생물 자원센타)에 2010년 11월 22일자로 기탁하여 기탁번호 KACC 97008P를 부여받았다. 또 파지 MY-1을 현미경으로 관찰한 결과 매우 긴 꼬리를 가지고 있는 등 시포비리데(Siphoviridae)의 형태학적 특성을 지녀 시포비리데(Siphoviridae)에 속하는 것으로 판명되었고, 이를 KACC(농업미생물 자원센타)에 2010년 11월 22일자로 기탁하여 기탁번호 KACC 97009P를 부여받았다. As shown in FIG. 1, as a result of observing phage T10-1 under a microscope, it was found to belong to Podoviridae because it has the morphological characteristics of Podoviridae, such as having a very short tail that does not contract. , It was deposited with KACC (Agricultural Microorganism Resource Center) on November 22, 2010, and was given the deposit number KACC 97008P. In addition, as a result of observing the phage MY-1 under a microscope, it was found to belong to Siphoviridae because it possesses the morphological characteristics of Siphoviridae, such as having a very long tail, and it was found to belong to the KACC (Agricultural Microbiological Resource Center). On November 22, 2010, it was deposited with the deposit number KACC 97009P.
염기서열 상동성을 NCBI의 blast 2 프로그램을 이용하여 조사한 결과 파지 T10-1은 알려진 파지인 Enterobacter phage SP6와 약 16%의 상동성을 나타내었고, 파지 MY-1은 알려진 파지인 Bacteriopharge T5와 약 4%의 상동성을 나타내었다.As a result of investigation of nucleotide sequence homology using NCBI's blast 2 program, phage T10-1 showed about 16% homology with the known phage Enterobacter phage SP6, and phage MY-1 was about 4 with the known phage Bacteriopharge T5. % Homology.
본 발명의 박테리오파지들은 채소 무름병균을 숙주로 하여 수행한 실험에서 플라크를 형성하여 무름병균을 용해(lysis)시킴을 확인할 수 있었으며, 한국 전 지역에서 입수한 다양한 무름병균을 폭넓게 용균시킬 수 있다는 사실을 실험을 통해 확인할 수 있었다. The bacteriophages of the present invention formed plaques in an experiment conducted with vegetable soft rot as a host to dissolve soft rot bacteria, and it was found that various soft rot fungi obtained from all regions of Korea can be widely lysed. It was confirmed through an experiment.
따라서, 본 발명은 박테리오파지 T10-1 (KACC 97008P)을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 채소 무름병 방제용 조성물을 제공한다.Accordingly, the present invention provides a composition for controlling vegetable soft rot, comprising bacteriophage T10-1 (KACC 97008P) as an active ingredient.
본 발명은 또한 박테리오파지 MY-1 (KACC 97009P)을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 채소 무름병 방제용 조성물을 제공한다.The present invention also provides a composition for controlling soft rot of vegetables, comprising the bacteriophage MY-1 (KACC 97009P) as an active ingredient.
보다 바람직하게, 본 발명은 박테리오파지 T10-1 (KACC 97008P) 및 박테리오파지 MY-1 (KACC 97009P)를 유효성분으로 함께 포함하는 것을 특징으로 하는 채소 무름병 방제용 조성물을 제공한다.More preferably, the present invention provides a composition for controlling soft rot of vegetables, characterized in that it comprises bacteriophage T10-1 (KACC 97008P) and bacteriophage MY-1 (KACC 97009P) together as an active ingredient.
복수의 무름병균 용균성 박테리오파지들을 함께 사용함으로써 보다 폭넓은 무름병균 균주들에 대해 방제 효과를 나타낼 수 있을 뿐만 아니라, 사용된 박테리오파지 저항성 무름병균 변이체의 발생도 효율적으로 감소시킬 수 있을 것으로 생각된다.By using a plurality of soft rot lytic bacteriophage together, it is believed that not only can exhibit a control effect against a wider range of soft rot strains, but also the occurrence of used bacteriophage resistant soft rot mutants can be effectively reduced.
본 발명은 또한 무름병 원인균들 중에 특히 펙토박테리움 카로토보룸(Pectobacterium carotovorum subsp . carotovorum) 증식 억제 및 사멸 효과가 뛰어난 조성물을 제공할 수 있으며, 이러한 조성물은 파지 T10-1 (KACC 97008P) 또는 파지 MY-1 (KACC 97009P)을 유효성분으로 포함하고, 바람직하게는 이들 모두를 함께 유효성분으로 포함한다. The present invention also relates to Pectobacterium carotoborum, especially among the bacteria that cause soft rot. carotovorum subsp . carotovorum ) can provide a composition having excellent proliferation inhibition and killing effect, and such a composition contains phage T10-1 (KACC 97008P) or phage MY-1 (KACC 97009P) as an active ingredient, preferably all of them together. Included as an active ingredient.
본 발명에 따른 무름병 방제용 조성물은 무름병이 발생할 수 있는 채소 및 과일들, 예를 들어, 상추, 무, 배추, 토마토, 고구마, 감자 등에 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 특히 펙토박테리움 카로토보룸(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum)으로 인해 발병되는 배추 또는 상추의 무름병 방제에 효과적이다.The composition for controlling soft rot according to the present invention may be used for vegetables and fruits that may cause soft rot, for example, lettuce, radish, cabbage, tomato, sweet potato, potato, etc., but is not limited thereto, and in particular pectobacter It is effective in controlling soft rot of Chinese cabbage or lettuce caused by Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum.
한편, 본 발명의 채소 무름병 방제용 조성물과 펙토박테리움 카로토보룸(Pectobacterium carotovorum subsp . carotovorum) 증식 억제 또는 사멸용 조성물 중 선택되는 어느 하나는, 실제 포장에서 사용하기 적합한 안정적인 제제화를 목적으로 생화학 농약으로 사용가능한 계면활성제 또는 증량제 등을 사용하여 수화제, 입상수화제, 액상수화제, 액제, 수용제, 수용성입제 또는 캡슐화제의 형태로 제조될 수 있다. 상기 계면활성제의 일예로 알킬(C8~C12)아릴설포네이트, 디알킬(C3~C6)아릴설포네이트, 디알킬(C8~C12)설포숙시네이트, 리그닌설포네이트, 나프탈렌설포네이트축합물, 나프탈렌설포네이트포르말린축합물, 알킬(C8~C12)나프탈렌설포네이트포르말린축합물, 폴리옥시에틸렌알킬(C8~C12)페닐설포네이트와 같은 설포네이트 화합물의 나트륨염 또는 칼슘염, 알킬(C8~C12)설페이트, 알킬(C8~C12)아릴설페이트, 폴리옥시에틸렌알킬(C8~C12)설페이트, 폴리옥시에틸렌알킬(C8~C12)페닐설페이트와 같은 설페이트 화합물의 나트륨염 또는 칼슘염, 폴리옥시알킬렌숙시네이트와 같은 숙시네이트화합물의 나트륨염 또는 칼슘염, 나트륨 벤조에이트, 알킬카르복실레이트 등의 음이온성 계면활성제, 폴리옥시에틸렌알킬(C12~C18)에테르, 폴리옥시에틸렌알킬(C8~C12)페닐에테르, 폴리옥시에틸렌알킬(C8~C12)페닐폴리머, 에틸렌옥사이드 프로필렌옥사이드 코폴리머와 같은 비이온성 계면활성제, 폴리카복실레이트, 트리톤 100 및 트윈 80으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상이 혼합되어 사용될 수 있으며, 이들 이외의 다른 계면활성제들도 사용될 수 있음은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 갖은 자에게는 용이하게 이해될 수 있을 것이다. On the other hand, the composition for controlling vegetable soft rot of the present invention and Pectobacterium carotoborum (Pectobacterium carotovorum subsp . carotovorum) Any one selected from the composition for inhibiting proliferation or killing is a hydrating agent, a granular hydrating agent , a liquid hydrating agent, a liquid hydrating agent, using a surfactant or extender that can be used as a biochemical pesticide for the purpose of stable formulation suitable for use in actual packaging. It may be prepared in the form of a second, water-soluble granule or encapsulating agent. Examples of the surfactant include alkyl (C 8 ~ C 12 ) aryl sulfonate, dialkyl (C 3 ~ C 6 ) aryl sulfonate, dialkyl (C 8 ~ C 12 ) sulfosuccinate, lignin sulfonate, naphthalene Sodium salt of a sulfonate compound such as a sulfonate condensate, a naphthalene sulfonate formalin condensate, an alkyl (C 8 to C 12 ) naphthalene sulfonate formalin condensate, a polyoxyethylene alkyl (C 8 to C 12) phenylsulfonate, or Calcium salt, alkyl (C 8 ~ C 12 ) sulfate, alkyl (C 8 ~ C 12 ) aryl sulfate, polyoxyethylene alkyl (C 8 ~ C 12 ) sulfate, polyoxyethylene alkyl (C 8 ~ C 12 ) phenyl sulfate Sodium or calcium salts of sulfate compounds such as, sodium or calcium salts of succinate compounds such as polyoxyalkylene succinate, anionic surfactants such as sodium benzoate and alkyl carboxylate, polyoxyethylene alkyl (C 12 ~ C 18 ) ether, polyoxyethylene alkyl (C 8 ~ C 12 ) phenyl ether, polyoxyethylene alkyl (C 8 ~ C 12 ) phenyl polymer, nonionic surfactant such as ethylene oxide propylene oxide copolymer, polycarboxyl One or two or more selected from the group consisting of Rate, Triton 100 and Tween 80 may be mixed and used, and that other surfactants other than these may be used, it is easily understood by those of ordinary skill in the art. It will be possible.
증량제로는 벤토나이트(bentonite), 활석, 클레이, 카올린, 탄산칼슘, 규사, 경석, 규조토, 산성 백토, 제올라이트, 펄라이트, 화이트 카본, 암모늄 설페이트, 요소, 포도당, 덱스트린(dextrin), 콩가루, 쌀, 밀, 황토, 포도당 및 전분, 물 등이 단독으로 또는 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있으며, 이들 이외의 다른 증량제들도 사용될 수 있음은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 갖은 자에게는 용이하게 이해될 수 있을 것이다.Bentonite, talc, clay, kaolin, calcium carbonate, silica sand, pumice stone, diatomaceous earth, acid clay, zeolite, perlite, white carbon, ammonium sulfate, urea, glucose, dextrin, soy flour, rice, wheat , Loess, glucose and starch, water, etc. may be used alone or in combination of two or more, and that other extenders other than these may also be used, it may be easily understood by those of ordinary skill in the art. will be.
상기에서 살펴본 바와 같이 본 발명에서 새롭게 분리한 박테리오파지 T10-1 및 MY-1은 신선채소의 무름병에 방제 효과가 있어 수확 후 농산물의 유통 및 저장 중 부패에 의한 손실을 막을 수 있고, 농작물의 무름병 방제를 위한 미생물 농약으로도 활용될 수 있다.As described above, the bacteriophage T10-1 and MY-1 newly isolated in the present invention have a control effect on soft rot of fresh vegetables, so that loss due to decay during distribution and storage of agricultural products after harvesting can be prevented, and control of soft rot of crops It can also be used as a microbial pesticide for
또한, 본 발명의 세균 생육 억제 또는 사멸능이 있는 박테리오파지는 항생제 대신 사용될 수 있으므로, 항생제 사용 절감을 통해 항생제 내성균 출현 가능성을 감소시키고, 환경 안전성을 높일 수 있다.In addition, since the bacteriophage capable of inhibiting or killing bacteria of the present invention can be used instead of antibiotics, the possibility of the appearance of antibiotic-resistant bacteria can be reduced by reducing the use of antibiotics, and environmental safety can be increased.
도 1은 본 발명에서 분리, 동정한 박테리오파지들의 전자현미경 사진이다.
도 2는 본 발명에서 분리, 동정한 박테리오파지들의 DNA를 제한효소 처리 후 나타나는 패턴들을 보여주는 사진이다.1 is an electron micrograph of bacteriophages isolated and identified in the present invention.
Figure 2 is a photograph showing patterns appearing after treatment with a restriction enzyme DNA of bacteriophages isolated and identified in the present invention.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.Hereinafter, examples, etc. will be described in detail to aid understanding of the present invention. However, the embodiments according to the present invention may be modified in various forms, and the scope of the present invention should not be construed as being limited to the following examples. The embodiments of the present invention are provided to more completely describe the present invention to those of ordinary skill in the art.
실시예Example 1: 박테리오파지 분리 1: Separation of bacteriophage
배추 무름병이 발생한 식물이 재배되고 있는 토양으로부터 배추 무름병 균에 대한 박테리오파지를 분리하고자 하였다.It was attempted to separate the bacteriophage against the cabbage soft rot bacteria from the soil where the cabbage soft rot-producing plants are grown.
토양을 50 mL 튜브에 약 30 mL이 되도록 넣고, 10 mM MgSO4를 넣어 전체 45 mL 정도가 되도록 하였다. 기주가 되는 펙토박테리움 카로토보룸(Pectobacterium carotovorum subsp . carotovorum) Pcc3을 16시간 배양하여 각 토양 샘플에 1 mL씩 첨가하였다. 16시간 동안 28℃에서 160 rpm으로 배양한 후, 30분 동안 정치시켜 상층액을 수득하였다. 분리한 상층액에 클로로포름(chloroform)을 첨가한 후, 3800 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 잔여물을 제거하였다. 상기 샘플 0.1 mL과 12시간 이상 배양한 배추 무름병균 1 mL의 현탁액을 피펫으로 추출한 후에 섞어주었다. 이 혼합액을 아가(0.6%) 배지와 함께 섞어서 1.5% 아가 배지를 포함하는 플래이트에 부은 후, 28℃에서 하룻밤 동안 배양하였다.The soil was put in a 50 mL tube to make about 30 mL, and 10 mM MgSO 4 was added to make a total of about 45 mL. Pectobacterium carotoborum (Pectobacterium) , which is the host carotovorum subsp . carotovorum ) Pcc3 was incubated for 16 hours and 1 mL was added to each soil sample. After incubation at 160 rpm at 28° C. for 16 hours, it was allowed to stand for 30 minutes to obtain a supernatant. After adding chloroform to the separated supernatant, the residue was removed by centrifugation at 3800 rpm for 10 minutes. A suspension of 0.1 mL of the sample and 1 mL of cabbage soft rot cultured for more than 12 hours was extracted with a pipette and then mixed. The mixed solution was mixed with agar (0.6%) medium, poured onto a plate containing 1.5% agar medium, and incubated overnight at 28°C.
목적하는 박테리오파지가 플래이트 상에 나타난 경우, 독립되고 투명한 플라그(plaque)가 관찰되었다. 이 플라그 영역을 백금 루프를 이용하여 분리해 낸 다음, 새로운 박테리아 배양액에 넣었는데, 배양액이 맑아짐을 관찰할 수 있었다. When the desired bacteriophage appeared on the plate, independent and transparent plaques were observed. The plaque area was separated using a platinum loop, and then put into a new bacterial culture solution, and it was observed that the culture solution became clear.
그 후에 배양액을 원심분리한 후, 상층액만을 취해 박테리오파지만을 포함하는 여과액을 회수할 수 있었다. 회수된 박테리오파지 여과액을 아가 배지 상에 다르게 희석하여 주입한 후, 3회에 걸친 플라그의 재분리를 통해 순수한 박테리오파지를 얻을 수 있었다.Thereafter, after centrifuging the culture solution, only the supernatant was taken and the filtrate containing only bacteriophage could be recovered. The recovered bacteriophage filtrate was diluted differently on an agar medium and injected, and then pure bacteriophage was obtained through re-separation of the plaque over three times.
이와 같이 얻은 박테리오파지들 중 무름병균주의 기주 범위가 넓고, 사멸효과가 우수하며, 기주 범위가 다른 박테리오파지 2개를 선정하고, 이를 각각 T10-1 및 MY-1로 명명하였으며, 농업미생물자원센터에 2010년 11월 22일자로 기탁하여 각각 기탁번호 KACC 97008P 및 KACC 97009P를 부여받았다.Among the bacteriophages obtained in this way, two bacteriophages with a wide host range, excellent killing effect, and different host ranges were selected and named T10-1 and MY-1 respectively. It was deposited on November 22, 2010 and has been assigned the deposit numbers KACC 97008P and KACC 97009P, respectively.
실시예Example 2: 획득한 파지의 모양 및 분류 2: Shape and classification of acquired phage
실시예 1에서 획득한 박테리오파지들의 전자현미경 사진을 분석하였다(도 1). 전자현미경은 에너지 여과 투과 전자현미경(Energy-Filtering Transmission Electron Microscope)을 사용하였다. 관찰하고자 하는 박테리오파지 샘플을 탄소를 입힌 구리 그리드(grid)에 올리고, 2% 액상 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)로 음성 염색을 하였다. 염색된 시료를 80 kV의 전압의 에너지 여과 투과 전자현미경 (LIBRA 120, Carl Zeiss)을 이용하여 관찰하였다. The electron micrographs of the bacteriophages obtained in Example 1 were analyzed (FIG. 1). The electron microscope was used as an energy-filtering transmission electron microscope (Energy-Filtering Transmission Electron Microscope). The bacteriophage sample to be observed was put on a copper grid coated with carbon, and negatively stained with 2% liquid uranyl acetate. The stained sample was observed using an energy filtration transmission electron microscope (LIBRA 120, Carl Zeiss) at a voltage of 80 kV.
이렇게 관찰된 박테리오파지는 모양으로 분류하는 기준으로 보았을 때 박테리오파지 T10-1은 수축되지 않은 매우 짧은 꼬리를 가지고 있어 포도비리데(Podoviridae) 계열, 박테리오파지 MY-1은 긴 꼬리를 가진 시포비리데(Siphoviridae) 계열의 바이러스인 것으로 판명되었다.As for the bacteriophage observed in this way, bacteriophage T10-1 has a very short tail that is not contracted, so the bacteriophage MY-1 is Siphoviridae with a long tail. It turned out to be a family of viruses.
실시예Example 3: 획득한 파지의 염기서열 분석 3: nucleotide sequence analysis of the obtained phage
분리한 파지의 염기서열 분석을 위하여 파지 유전자를 분리하였다. 순수분리된 박테리오파지 1 mL에 0.5 M EDTA(pH 8.0), 프로테이나아제(proteinase) K, SDS를 첨가하되, 시약을 첨가한 후의 농도가 각각 20 mM, 50ug/mL, 0.5%가 되도록 하였다. 혼합된 용액은 2시간 동안 56℃로 온도를 유지하며 이후 상온에서 식혔다. 동량의 페놀을 넣고 3000 g에서 5분 동안 원심분리 하였으며, 상층액만을 얻어 PC(phenol-chloroform)를 다시 한번 처리하고, 동일한 조건의 원심분리를 수행하였다. 위에서 획득한 상층액에 동량의 클로로포름(chloroform)을 첨가하여 원심분리하였다. 이 과정을 반복하고 95% 에탄올 1 mL과 3 M 소디움 아세테이트(Sodium acetate, pH5.2)를 50 uL 첨가하여 15분 동안 원심분리한 후, 70% 에탄올을 첨가하여 한번 더 원심분리하였다. 에탄올을 모두 제거하여 DNA pellet만 남긴 후, 1X TE 버퍼에 DNA를 녹였다. 분리한 DNA를 제한효소 EcoRI, HindIII, ClaI 등으로 자른 후, 유전자의 분리 정도를 확인하였다(도 2). The phage gene was isolated for nucleotide sequence analysis of the isolated phage. 0.5 M EDTA (pH 8.0), proteinase K, and SDS were added to 1 mL of the purified bacteriophage, but the concentrations after the addition of the reagents were 20 mM, 50 ug/mL, and 0.5%, respectively. The mixed solution was maintained at 56° C. for 2 hours and then cooled at room temperature. The same amount of phenol was added and centrifuged at 3000 g for 5 minutes, and only the supernatant was obtained, and PC (phenol-chloroform) was treated once again, and centrifugation was performed under the same conditions. The same amount of chloroform was added to the supernatant obtained above, followed by centrifugation. This process was repeated, 1 mL of 95% ethanol and 50 uL of 3 M sodium acetate (pH 5.2) were added, followed by centrifugation for 15 minutes, followed by addition of 70% ethanol and centrifugation once more. After removing all ethanol, leaving only the DNA pellet, the DNA was dissolved in 1X TE buffer. After cutting the isolated DNA with restriction enzymes EcoRI, HindIII, ClaI, etc., the degree of isolation of the gene was confirmed (FIG. 2).
순수 분리된 총 유전자의 염기서열을 결정하였으며, 박테리오파지 T10-1의 염기서열은 총 45,673 bp (서열번호 1) 크기이었고, 박테리오파지 MY-1의 염기서열은 총 109,170 bp (서열번호 2) 크기이었으며, 각각의 염기서열은 서열번호 1 및 2에 나타내었다. 결정된 염기서열을 'Blast program'을 이용하여 분석하였다. 분석한 결과, 각각의 유전자를 대표하는 오픈리딩프레임은 도 2와 같았고, 각각 유전자의 추정되는 기능은 하기 표 1 (T10-1) 및 표 2 (MY-1)와 같았다.The nucleotide sequence of the purely isolated total genes was determined, and the nucleotide sequence of the bacteriophage T10-1 was a total size of 45,673 bp (SEQ ID NO: 1), and the nucleotide sequence of the bacteriophage MY-1 was a total size of 109,170 bp (SEQ ID NO: 2), Each nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 1 and 2. The determined nucleotide sequence was analyzed using the'Blast program'. As a result of the analysis, the open reading frame representing each gene was shown in FIG. 2, and the estimated functions of each gene were shown in Table 1 (T10-1) and Table 2 (MY-1) below.
(nucleotides) CDS length
(nucleotides)
실시예Example 4: 분리한 박테리오파지에 대한 4: for the separated bacteriophage 기주범위Host range (( hosthost rangerange ) 결정) decision
분리한 박테리오파지에 대한 기주 범위는 적하법(Dropping method)을 통해 결정하였다. The host range for the separated bacteriophage was determined through a dropping method.
3시간 배양된 세균 배양액과 0.6%의 아가 배지를 섞은 후, 플래이트에 부어서 28℃에서 15분간 건조하였고, 그 위에 희석된 파지를 떨어뜨리고, 상온에서 말린 후 28℃에서 10시간 정치 배양시켰다. 균주가 파지에 대해 감수성을 갖는 경우, 플래이트상에 투명한 영역, 즉 플라크(plaque)를 보이는데, 이는 세균 세포가 완전하게 용해(lysis)된 결과임을 증명하는 것이다. 만약 감수성이 약한 경우는 뿌연 영역이 생기거나, 독립적인 볼드 스팟이 나타난다.After mixing the bacterial culture medium cultured for 3 hours and 0.6% agar medium, poured on a plate and dried at 28°C for 15 minutes, the diluted phage was dropped thereon, dried at room temperature, and allowed to stand still at 28°C for 10 hours. When the strain is sensitive to phage, a transparent area, ie, plaque, appears on the plate, which proves that the bacterial cells are completely lysed. If the sensitivity is weak, a hazy area or an independent bold spot appears.
하기 표 3은 본 발명의 박테리오파지 T10-1과 MY-1의 펙토박테리움 카로토보룸 종(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum species) 균주들에 대한 감수성을 조사한 결과이다. Table 3 is a result of investigating the susceptibility of the bacteriophage T10-1 and MY-1 of the present invention to the Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum species strains.
상기 표 3에 나타나는 바와 같이, 본 발명에 따른 무름병균 용균성 박테리오파지 T10-1 및 MY-1는 다양한 펙토박테리움 카로토보룸(Pectobacterium carotovorum subsp . carotovorum) 균주를 폭넓게 용해시킬 수 있음이 확인할 수 있었다. 또한 파지 T10-1과 MY-1의 기주 범위와 용해성이 달라 두 개의 파지를 혼합하여 사용할 경우 무름병 방제 효과가 매우 탁월할 것으로 생각된다.As shown in Table 3 above, it can be seen that the soft rot lytic bacteriophage T10-1 and MY-1 according to the present invention can widely dissolve various Pectobacterium carotovorum subsp . carotovorum strains. there was. In addition, since the host range and solubility of the phages T10-1 and MY-1 are different, it is thought that the effect of controlling soft rot will be very excellent when two phages are used in combination.
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