KR101364590B1 - Construction of staphyloxanthin metabolic pathway and biosynthesis of staphyloxanthin like carotenoids through E.coli - Google Patents
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Abstract
본 발명은 스타필로잔틴 대사회로의 완성 및 대장균을 통한 신규 구조의 스타필로잔틴 유사 카로틴노이드의 생합성에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터 유래한 카로틴노이드 생합성 관련한 서열번호 1로 표시되는 신규 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 벡터를 이용하여 형질전환된 대장균 및 상기 대장균을 이용한 신규 카로틴노이드 유사 물질의 생합성에 관한 것이다. 본 발명은 대장균과 같은 외래 숙주에 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터 유래한 스타필로잔틴 대사회로를 완성함으로써, 스타필로잔틴을 비롯한 신규한 스타필로잔틴 유사 물질의 합성할 수 있으며, 유용물질의 대량생산을 가능하게 한다.The present invention relates to the completion of the staphyloxanthine metabolic circuit and the biosynthesis of a novel structure of the staphyloxanthine-like caroteneoid through Escherichia coli, and more specifically, the carotenoid biosynthesis derived from Staphylococcus aureus The present invention relates to the biosynthesis of a novel gene represented by SEQ ID NO: 1, a recombinant vector comprising the gene, E. coli transformed using the vector, and a new carotenoid-like substance using the E. coli. The present invention can synthesize a novel staphyloxanthine-like substance, including staphyloxanthin, by completing a staphyloxanthine metabolic circuit derived from Staphylococcus aureus in a foreign host such as Escherichia coli, Enables mass production of useful materials
Description
본 발명은 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터 유래한 카로틴노이드 생합성 관련 신규 유전자, 이를 포함하는 재조합 벡터, 상기 벡터를 이용하여 형질전환된 대장균 및 상기 대장균을 이용한 신규 카로틴노이드 유사 물질의 생합성에 관한 것이다.
The present invention relates to a novel gene related to carotenoid biosynthesis derived from Staphylococcus aureus , a recombinant vector comprising the same, E. coli transformed using the vector, and a novel carotenoid-like substance using the E. coli. It is about biosynthesis.
외래 숙주에 생합성 회로를 구축하기 위한 합성 생물과(synthetic biology) 대사공학 기술은 생산성의 향상, 원천 숙주의 제한성의 극복, 새로운 단백질의 기능 확인 등을 위해 널리 이용되고 있다. 게다가 외래 숙주에 외래 단백질을 발현하였을 때, 원천 숙주에서 발견되지 않는 새로운 활성이 발견되는 것을 확인할 수 있다. 이를 이용해 특히 카로틴노이드 분야에서 구조의 다양화와 새로운 구조의 발견을 위한 많은 연구가 이루어지고 있다.Synthetic biology and metabolic engineering techniques for constructing biosynthetic circuits in foreign hosts are widely used to improve productivity, overcome limitations of the source host, and confirm the function of new proteins. In addition, when the foreign protein is expressed in the foreign host, it can be confirmed that a new activity that is not found in the source host is discovered. Using this, a lot of research has been conducted to diversify structures and discover new structures, especially in the field of carotenoids.
카로틴노이드는 아이소프레노이드계 물질로 자연계에 널리 존재하며, 항산화 효과, 빛-포집, 에너지 전달, 막 유동성 조절 등 여러 기능을 하는 것으로 밝혀져 있다. 카로틴노이드는 특히 병원성 미생물 등에서 숙주의 면역 작용에 의해 발생하는 일중항 산소(singlet oxygen)이나 퍼옥시 라디칼(peroxy radical)에 저항하는 역할을 수행한다.Carotenoids are isoprenoid-based substances that are widely present in nature, and have been found to have various functions such as antioxidant effect, light-capturing, energy transfer, and control of membrane fluidity. Carotenoids play a role in resisting singlet oxygen or peroxy radicals generated by the host's immune function, especially in pathogenic microorganisms.
스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)는 금빛(aureus: 금을 의미하는 라틴어에서 유래)을 띄는 그람 양성균으로 메티실린(methicillin)과 모든 베타-락탐(β-lactam)계 항생제에 저항을 가지는 대표적인 병원성 미생물로 뛰어난 항생제 저항성으로 인해 많은 의료적인(clinical) 문제를 야기하고 있다. 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus)에서 발현되는 대표적인 카로틴노이드는 스타필로잔틴(staphyloxanthin)으로 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus)는 이 스타필로잔틴(staphyloxanthin)에 의해 금색을 띄게 된다. 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus)의 높은 항생제 내성으로 인해 새로운 항생제의 개발에 대한 연구가 많이 이루어지고 있으며, 특히 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus)의 생존률을 높여주는 요소인 스타필로잔틴(staphyloxanthin)을 타겟으로 하는 연구가 이루어지고 있다. Staphylococcus aureus is a gram-positive bacterium that has a golden color ( aureus : derived from Latin for gold) and is resistant to methicillin and all beta-lactam antibiotics. As a representative pathogenic microorganism, it causes many clinical problems due to its excellent antibiotic resistance. Staphylococcus aureus (S. aureus) is a typical solenoid-carotene as Staphylococcus Staphylococcus aureus (S. aureus) xanthine (staphyloxanthin) is expressed on the gold by the Staphylococcus xanthine (staphyloxanthin) Becomes visible. Due to the high antibiotic resistance of Staphylococcus aureus (S. aureus ), many studies are being conducted on the development of new antibiotics, and in particular, factors that increase the survival rate of Staphylococcus aureus (S. aureus). Research is being conducted targeting staphyloxanthin.
스타필로잔틴(staphyloxanthin)의 정성은 마셸(Marshall)과 윌모스(Wilmoth)에 의해 1981 년에 이루어졌으며, 1994 년 위랜드(Wieland)에 의해 CrtM(diapophytoene synthase)과 CrtN(diapophytoene desaturase)의 유전자가 밝혀졌다. 스타필로잔틴(staphyloxanthin) 생합성 유전자 클러스터(cluster)는 2005 년 Pelz에 의해 밝혀졌는데 이는 클러스터(cluster)를 카로틴노이드를 발현하지 않는 숙주인 스타필로코쿠스 카노서스(Staphylococcus carnosus)에 발현하여 이루어졌다. 그들은 스타필로잔틴(staphyloxanthin) 유전자 클러스터(cluster)를 스타필로코쿠스 카노서스(S. carnosus)에 발현시켜 결과적으로 스타필로잔틴(staphyloxanthin)을 생합성하였다. 2005 년 슈미트-다너트(Schmidt-dannert) 박사 그룹에서는 CrtP(4,4'-diaponeurosporene oxidase)의 기능을 대장균 내에서 발현하여 밝히고, 새로운 기질인 C40 카로틴노이드, 3,4-다이디하이드로라이코펜(3,4-didehydrolycopene)과 3,4,3',4'-테트라디하이드로라이코펜(3,4,3',4'-tetradehydrolycopene)에 CrtP를 작용시켜 새로운 카로틴노이드를 만들었다.The quality of staphyloxanthin was established in 1981 by Marshall and Wilmoth, and in 1994, the genes of diapophytoene synthase (CrtM) and diapophytoene desaturase (CrtN) were produced by Wieland in 1994. It turned out. The staphyloxanthin biosynthetic gene cluster (cluster) was identified by Pelz in 2005, which was achieved by expressing the cluster in Staphylococcus carnosus, a host that does not express carotenoids. They expressed the staphyloxanthin gene cluster in S. carnosus , resulting in biosynthesis of staphyloxanthin. In 2005, Dr. Schmidt-dannert's group revealed the function of CrtP (4,4'-diaponeurosporene oxidase) by expression in E. coli, and a new substrate, C 40 carotenoid, 3,4-didihydrolycopene. (3,4-didehydrolycopene) and 3,4,3',4'-tetradihydrolycopene (3,4,3',4'-tetradehydrolycopene) reacted with CrtP to create new carotenoids.
하지만 아직까지 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus)의 스타필로잔틴(staphyloxanthin) 생합성 유전자 클러스터(cluster)를 대장균에 발현시킬 시 대사회로가 완벽하게 연결되지 않아, 스타필로잔틴(staphyloxanthin)을 비롯한 대사물질의 합성이 이루어지지 못하고 있다는 문제점이 있다.
However, when the staphyloxanthin biosynthetic gene cluster of Staphylococcus aureus is expressed in E. coli, the metabolic circuit is not completely connected, so staphyloxanthin is not used. There is a problem in that the synthesis of metabolites, including metabolites, has not been achieved.
이에 본 발명자는 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus)의 스타필로잔틴(staphyloxanthin) 생합성 유전자 클러스터(cluster)가 기존에 밝혀져 있었으나, 대장균에 발현한 결과 CrtM, CrtN, crtP 까지만 대사회로가 구축되고, CrtQ 및 CrtO는 대장균 내에서 대사회로가 연결되지 않는다는 사실을 확인하고, 이를 해결하기 위해 연구, 노력한 결과 스타필로잔틴(staphyloxanthin) 생합성 회로상에 빠진 대사회로 효소를 코딩하는 유전자를 발견하였다. 또한 이를 이용해 스타필로잔틴(staphyloxanthin) 대사회로를 대장균 내에 구축하여 새로운 구조를 가진 스타필로잔틴(staphyloxanthin) 유사 카로틴노이드를 생합성할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.Accordingly, the present inventors have previously identified a staphyloxanthin biosynthetic gene cluster of S. aureus , but as a result of expression in E. coli, metabolic circuits are established only up to CrtM, CrtN, and crtP. CrtQ and CrtO confirmed the fact that metabolic circuits are not connected in E. coli, and as a result of research and efforts to solve this, a gene encoding a metabolic circuit enzyme missing in the staphyloxanthin biosynthetic circuit was discovered. In addition, the present invention was completed by confirming that staphyloxanthin-like caroteneoids having a new structure can be biosynthesized by constructing a staphyloxanthin metabolic circuit in E. coli using this.
따라서 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터 유래된 유전자를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a gene derived from Staphylococcus aureus having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1.
또한 본 발명은 상기 유전자를 포함한 재조합 벡터를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.In addition, another object of the present invention is to provide a recombinant vector including the gene.
또한 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 대장균을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.In addition, another object of the present invention is to provide E. coli transformed with the recombinant vector.
마지막으로 본 발명은 상기 형질전환된 대장균으로부터 카로틴노이드를 생산하는 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
Finally, another object of the present invention is to provide a method for producing carotenoids from the transformed E. coli.
상기 과제를 해결하기 위해,To solve the above problem,
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터 유래된 유전자를 제공한다.The present invention provides a gene derived from Staphylococcus aureus having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1.
또한 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터를 제공한다.In addition, the present invention provides a recombinant vector comprising the gene.
또한 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 것을 특징으로 하는 대장균을 제공한다.In addition, the present invention provides E. coli transformed with the recombinant vector.
마지막으로 본 발명은 (a) 제 5 항의 대장균을 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양액으로부터 카로틴노이드를 분리하는 단계를 포함하는 대장균으로부터 카로틴노이드를 생산하는 방법을 제공한다.
Finally, the present invention comprises the steps of (a) culturing the E. coli of
본 발명은 대장균과 같은 외래 숙주에 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터 유래한 스타필로잔틴 대사회로를 완성함으로써, 신규한 스타필로잔틴 유사 물질의 합성할 수 있으며, 유용물질의 대량생산을 가능하게 하였다. 또한 상기 대사회로는 다른 작용기의 선택적 첨가 등 다양한 적용 가능성을 열어주며, 이러한 새로운 작용기의 첨가는 물질의 용해도와 생리활성을 크게 높여 주는 역할을 한다.
The present invention can synthesize a novel staphyloxanthin-like substance by completing a staphylococcus aureus- derived staphylococcus aureus in a foreign host such as E. coli, and mass production of useful substances Made possible. In addition, the metabolic circuit opens the possibility of various applications such as selective addition of other functional groups, and the addition of such a new functional group plays a role of greatly increasing the solubility and physiological activity of the substance.
도 1은 대장균에 구축한 스타필로잔틴(staphyloxanthin) 대사회로와 생합성된 카로틴노이드(carotenoid) 물질들을 나타낸 그림이다[(A)는 재구축한 스타필로잔틴 대사회로를 통해 대장균에서 생합성이 확인된 카로틴노이드 대사회로이며, (B)는 자연계에서 발견되는 메틸로모나스(Methylomonas) sp . strain 16a와 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 C30 카로틴노이드(carotenoid) 생합성 유전자 클러스터를 비교한 그림이다].
도 2는 구축된 카로틴노이드(carotenoid) 생합성 유전자 모듈을 가진 대장균의 HPLC분석 결과이다[(A) pACM-MSA-NSA, (B) pACM-MSA-NSA -PSA, (C) pUC19-OPQMNSA].
도 3은 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에서 클로닝(cloning)한 알데하이드 탈수소화효소(aldehyde dehydrogenase) 유전자들의 기능 비교를 나타낸 그래프이다[(A) HPLC분석 결과, (B) UV/Vis 흡수 스펙트럼, (C) TLC분석 결과, (D) 형질 전환된 대장균 셀 펠렛(cell pellet)].
도 4는 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) KCTC 1928균주의 Ald 단백질의 계통수 분석 결과이다.
도 5는 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) KCTC 1928의 카로틴노이드(carotenoid) 프로파일과 대장균에 구축한 스타필로잔틴(staphyloxanthin) 대사회로를 통해 생합성된 카로틴노이드(carotenoid) 프로파일의 비교이다[(A) HPLC 분석, (B) cell pellet, (C) 각 peak의 UV/Vis 흡수 spectrum].
도 6은 형질전환된 대장균으로부터 얻은 추출물을 비누화(saponification)하여 에스테르 결합을 깬 결과(HPLC 결과와 TLC 결과)이다[(A) 비누화(saponification)하지 않은 조 추출물(crude extracts), (B) 비누화(saponification)시킨 샘플].
도 7은 스타필로잔틴(staphyloxanthin) 대사회로를 구축시킨 대장균의 HPLC 프로파일 (A)와 스타필로잔틴(staphyloxanthin) 유사 화합물들의 UV/Vis 흡수 스펙트럼 (B)의 비교이다.
도 8은 CrtQ 단백질의 발현 수준을 조절하여 비교한 결과와 pACM-MSA-NSA-PSA-QSA 유전자 모듈을 가진 대장균의 HPLC 분석 결과이다.
도 9는 스타필로잔틴(staphyloxanthin) 유사 물질들의 LC/MS 분석 결과이다[(A)스타필로잔틴, (B)테트라데카노일-글루코실-4,4'-디아포뉴로스포레노익산, (C)헥사데카노일-글루코실-4,4'-디아포뉴로스포레노익산].
도 10은 CrtQ의 N-terminal과 C-terminal의 motif를 잘라내어 비교한 결과이다.
도 11은 대장균에 구축된 C30 카로틴노이드(carotenoid) 대사회로에 의해 생합성된 카로틴노이드들의 LC/MS분석 결과이다(MS spectrum).1 is a diagram showing the staphyloxanthin metabolic circuit constructed in E. coli and the biosynthesized carotenoid substances [(A) is carotene whose biosynthesis was confirmed in E. coli through the reconstructed staphyloxanthin metabolic circuit. It is a metabolic cycle of the noid , and (B) is methylomonas found in nature. sp . This is a picture comparing the C 30 carotenoid biosynthetic gene cluster of
Figure 2 is a built-carotene carotenoids (carotenoid) is the HPLC analysis of the E. coli with the resulting module biosynthetic gene [(A) pACM-M SA -N SA, (B) pACM-M SA -N SA - P SA, (C) pUC19-OPQMN SA ].
3 is a graph showing a functional comparison of aldehyde dehydrogenase genes cloned from Staphylococcus aureus [(A) HPLC analysis results, (B) UV/Vis Absorption spectrum, (C) TLC analysis result, (D) transformed E. coli cell pellet].
Figure 4 is Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus ) It is the result of phylogenetic tree analysis of Ald protein of KCTC 1928 strain.
Figure 5 is Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus ) This is a comparison of the carotenoid profile of KCTC 1928 and the carotenoid profile biosynthesized through the staphyloxanthin metabolic circuit constructed in E. coli [(A) HPLC analysis, (B) cell pellet, (C) UV/Vis absorption spectrum of each peak].
6 is a result of breaking the ester bond by saponification of the extract obtained from transformed E. coli (HPLC result and TLC result) [(A) crude extracts without saponification, (B) saponification (saponification) sample].
7 is a comparison of the HPLC profile (A) of Escherichia coli with a staphyloxanthin metabolic circuit and the UV/Vis absorption spectrum (B) of staphyloxanthin-like compounds.
8 is a result of comparing and controlling the expression level of CrtQ protein and HPLC analysis results of Escherichia coli having the pACM-M SA -N SA -P SA -Q SA gene module.
9 is an LC/MS analysis result of staphyloxanthin-like substances [(A) Staphyloxanthin, (B) tetradecanoyl-glucosyl-4,4'-diaponurosporenoic acid, (C ) Hexadecanoyl-glucosyl-4,4'-diaponurosporenoic acid].
10 is a result of comparing the motifs of the N-terminal and C-terminal of CrtQ cut out.
11 is an LC/MS analysis result of carotenoids biosynthesized by a C 30 carotenoid metabolic circuit constructed in E. coli (MS spectrum).
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터 유래된 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 대장균 및 상기 대장균을 이용한 신규 구조의 스타필로잔틴 유사 카로틴노이드 합성에 관한 것이다. The present invention uses a gene derived from Staphylococcus aureus having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, a recombinant vector containing the gene, E. coli transformed with the recombinant vector, and the E. coli. It relates to the synthesis of a new structure of staphyloxanthin-like carotenoid.
이하, 이들을 구체적으로 설명한다.Hereinafter, these will be described in detail.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus; S. aureus)로부터 유래된 알데히드 탈수소화 효소에 관련된 신규 유전자(ald)를 제공한다. 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 유전자는 카로틴노이드의 생합성 대사회로에서 4,4'-디아포뉴로스포렌-4-알(4,4'-diaponeurosporen-4-al)을 4,4'-디아포뉴로스포레노익산(4,4'-diaponeurosporenoic acid)으로 전환시키는 반응을 촉진하는 효소를 코딩하고 있으며, 상기 반응을 거치는 경우 카로틴노이드의 용해도가 크게 증가되며, 다른 치환기(글루코스 등)의 첨가가 쉽게 이루어질 수 있게 된다는 장점이 있다. The present invention provides a novel gene (ald ) related to an aldehyde dehydrogenase derived from Staphylococcus aureus ( S. aureus ) represented by SEQ ID NO: 1. The gene having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 is 4,4'-diaponeurosporen-4-al (4,4'-diaponeurosporen-4-al) in the biosynthetic metabolic circuit of carotenoids. Encodes an enzyme that promotes the reaction to convert to'-diaponeurosporenoic acid (4,4'-diaponeurosporenoic acid), and when this reaction is carried out, the solubility of carotenoids is greatly increased, and other substituents (glucose, etc.) There is an advantage that it can be easily added.
본 발명자는 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus)의 CrtQ와 CrtO가 대장균 내에서 성공적으로 작용하지 못하고 4,4'-디아포뉴로스포렌-4-알(4,4'-diaponeurosporen-4-al)을 남기는 문제의 해결을 위해 4,4'-디아포뉴로스포렌-4-알(4,4'-diaponeurosporen-4-al)을 4,4'-디아포뉴로스포레노익산(4,4'-diaponeurosporenoic acid)으로 전환하는 알데히드 탈수소화 효소(aldehyde dehydrogenase) 유전자를 찾기 위해 연구한 결과, 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus strain Newman)의 게놈(genome) 시퀀스에서 알데히드 탈수소화 효소(aldehyde dehydrogenase) 관련된 서열번호 1로 표시되는 유전자(ald)를 발견하였다. 상기 유전자는 카로틴노이드에 작용하여 4,4'-디아포뉴로스포레노익산(4,4'-diaponeurosporenoic acid) 및 4,4'-디아포라이코펜-4,4'-다이4'-diapolycopene-4,4'-dioic acid)을 발현하며, 또한 중간산물인 4,4'-디아포라이코페노익산(4,4'-diapolycopenoic acid)과 4,4'-디아포라이코펜-4'-알-4-오익산(4,4'-diapolycopen-4'-al-4-oic acid)을 발현한다.
The present inventors believe that CrtQ and CrtO of Staphylococcus aureus do not work successfully in E. coli and 4,4'-diaponeurosporen-4-al (4,4'-diaponeurosporen- To solve the problem of leaving 4-al), 4,4'-diaponeurosporen-4-al (4,4'-diaponeurosporen-4-al) was added to 4,4'-diaponeurosporenoic acid ( 4,4'-diaponeurosporenoic acid) to the aldehyde dehydrogenase gene (S. aureus strain Newman), as a result of a study to find the aldehyde dehydrogenase (S. aureus strain Newman) genome sequence of aldehyde dehydration. A gene (ald ) represented by SEQ ID NO: 1 related to an aldehyde dehydrogenase was found. The genes act on carotenoids to 4,4'-diaponeurosporenoic acid and 4,4'-diapolycopene-4,4'-di4'-diapolycopene-4. ,4'-dioic acid), and the
또한 본 발명은 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus; S. aureus)로부터 유래된 상기 서열번호 1로 표시되는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.In addition, the present invention is Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus ; S. aureus ) provides a recombinant vector comprising the gene represented by SEQ ID NO: 1 derived from.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 사용가능한 벡터는 특별히 제한되지 않으며, 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있으며, 예를 들어, pUC19, pSTV28, pBBR1MCS, pBluscriptII, pBAD, pTrc99A, pET, pACYC184, pBR322 등 당업계에서 상용화된 벡터를 사용할 수 있다. 바람직하게는, 증폭된 유전자 산물을 단백질이 지속적으로 발현되도록 프로모터 부분이 pUC19 벡터(제조사:NEB (New England Biolabs))로 부터 수정된 pUCM 벡터(C. Schmidt-Dannert et al. Nature Biotechnology 2000 vol.18 750-753를 참조하여 제조)를 사용하는 것이 좋다. 따라서, 본 발명에 따른 재조합 벡터는 상기 pUCM 벡터에 서열번호 1의 유전자를 삽입시켜 제조한 pUCM-aldSA 벡터일 수 있다.According to an embodiment of the present invention, the usable vector is not particularly limited, and a known expression vector may be used, for example, pUC19, pSTV28, pBBR1MCS, pBluscriptII, pBAD, pTrc99A, pET, pACYC184, pBR322, etc. Vectors commercially available in the industry can be used. Preferably, the promoter portion of the amplified gene product is modified from a pUC19 vector (manufactured by NEB (New England Biolabs)) so that the protein is continuously expressed (C. Schmidt-Dannert et al. Nature Biotechnology 2000 vol. It is recommended to use (manufactured with reference to 18 750-753). Accordingly, the recombinant vector according to the present invention may be a pUCM-ald SA vector prepared by inserting the gene of SEQ ID NO: 1 into the pUCM vector.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 서열번호 1의 신규한 유전자를 포함하는 재조합 벡터는 서열번호 1의 유전자를 중합효소연쇄반응(PCR)을 통하여 수득하고, 제한효소 EcoRI 및 XbaI로 처리한 벡터에 리가아제 등을 사용하여 삽입시켜 제조할 수 있다.According to an embodiment of the present invention, a recombinant vector comprising the novel gene of SEQ ID NO: 1 is obtained through a polymerase chain reaction (PCR) of the gene of SEQ ID NO: 1, and the vector is treated with restriction enzymes EcoRI and XbaI. It can be prepared by inserting it using a ligase or the like.
또한 상기 벡터는 카로틴노이드 합성에 필요한 유전자인 디아포파이토엔 신타제(CrtM; diapophytoene synthase) 유전자(서열번호 2), 디아포파이토엔 디새튜라제(CrtN; diapophytoene desaturase) 유전자(서열번호 3), 디아포뉴로스포렌 옥시다아제(CrtP; diaponeurosporene oxidase) 유전자(서열번호 4), 글리코실 트랜스퍼라아제(CrtQ; glycosyl transferase) 유전자(서열번호 5) 및 아실 트랜스퍼라아제(CrtO; acyl transferase) 유전자(서열번호 6)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 추가로 포함하여 구성될 수 있다. 상기 유전자는 모듈(module)화하여 사용할 수 있으며, 다양한 조합의 유전자 모듈로 제작하여 사용 가능하다.In addition, the vector includes a diapophytoene synthase (CrtM; diapophytoene synthase) gene (SEQ ID NO: 2), a diapophytoene desaturase (CrtN; diapophytoene desaturase) gene (SEQ ID NO: 3), which is a gene required for carotene synthesis, Diaponeurosporene oxidase (CrtP; diaponeurosporene oxidase) gene (SEQ ID NO: 4), glycosyl transferase (CrtQ; glycosyl transferase) gene (SEQ ID NO: 5) and acyl transferase (CrtO; acyl transferase) gene (sequence) It may be configured to further include one or more genes selected from the group consisting of number 6). The gene can be used as a module, and can be produced and used as a gene module of various combinations.
(서열번호)designation
(SEQ ID NO:)
스타필로코쿠스 아우레우스
(KCTC 1928)
Staphylococcus aureus
(KCTC 1928)
ald
(서열번호 1)
ald
(SEQ ID NO: 1)
5`-GCTCTAGAAGGAGGATTACAAAATGAATATCATTGAGCAA-3` Forward (SEQ ID NO: 7)
5`-GCTCTAGAAGGAGGATTACAAAATGAATATCATTGAGCAA-3`
5`-CCGGAATTCTTAATTTTTAAAGAAAGCTTT-3` Reverse (SEQ ID NO: 8)
5`-CCGGAATTCTTAATTTTTAAAGAAAGCTTT-3`
CrtM
(서열번호 2)
CrtM
(SEQ ID NO: 2)
5`-GCTCTAGAAGGAGGATTACAAAATGACAATGATGGATATGAA-3`
역방향(서열번호 10)
5`-CCGGAATTCCTATATTCTATGATATTTAC-3` Forward (SEQ ID NO: 9)
5`-GCTCTAGAAGGAGGATTACAAAATGACAATGATGGATATGAA-3`
Reverse (SEQ ID NO: 10)
5`-CCGGAATTCCTATATTCTATGATATTTAC-3`
CrtN
(서열번호 3)
CrtN
(SEQ ID NO: 3)
5`-GCTCTAGAAGGAGGATTACAAAATGAAGATTGCAGTAATTG-3`
역방향(서열번호 12)
5`-CCGGAATTCTTAGACTACTCCCTTATAC-3` Forward (SEQ ID NO: 11)
5`-GCTCTAGAAGGAGGATTACAAAATGAAGATTGCAGTAATTG-3`
Reverse (SEQ ID NO: 12)
5`-CCGGAATTCTTAGACTACTCCCTTATAC-3`
CrtP
(서열번호 4)
CrtP
(SEQ ID NO: 4)
5`-GCTCTAGAAGGAGGATTACAAAATGACTAAACATATCATCG-3`
역방향(서열번호 14)
5`-CCGGAATTCTCACTTCCTATTCTTCGC-3`Forward (SEQ ID NO: 13)
5`-GCTCTAGAAGGAGGATTACAAAATGACTAAACATATCATCG-3`
Reverse (SEQ ID NO: 14)
5`-CCGGAATTCTCACTTCCTATTCTTCGC-3`
CrtQ
(서열번호 5)
CrtQ
(SEQ ID NO: 5)
5`-GCTCTAGAAGGAGGATTACAAAATGAAATGGTTATCACGAA-3`
역방향(서열번호 16)
5`-CCGGAATTCTTATTGTTCTTTAGATATAG-3` Forward (SEQ ID NO: 15)
5`-GCTCTAGAAGGAGGATTACAAAATGAAATGGTTATCACGAA-3`
Reverse (SEQ ID NO: 16)
5`-CCGGAATTCTTATTGTTCTTTAGATATAG-3`
CrtO
(서열번호 6)
CrtO
(SEQ ID NO: 6)
5`-GCTCTAGAAGGAGGATTACAAAATGAAAACCATGAAAAAATAT-3`
역방향(서열번호 18)
5`-TTCCCTTGCGGCCGCTTAGTCATGACGTTCACC-3`Forward (SEQ ID NO: 17)
5`-GCTCTAGAAGGAGGATTACAAAATGAAAACCATGAAAAAATAT-3`
Reverse (SEQ ID NO: 18)
5`-TTCCCTTGCGGCCGCTTAGTCATGACGTTCACC-3`
상기 서열번호 1 내지 6의 염기서열을 갖는 유전자들은 상호 조합에 의해서, 혹은 기존에 공지된 카로틴노이드 생합성에 사용되는 효소를 코딩하는 유전자와의 조합에 의해서 재조합 벡터 제조에 이용될 수 있다.
The genes having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 6 may be used in combination with each other or with a gene encoding an enzyme used for biosynthesis of carotenoids.
본 발명의 다른 관점은 전술된 재조합 벡터로 형질전환된 대장균에 관한 것이다. 대장균 균주로는 XL1-Blue, SURE, Top10, BL21(DE3), DH5α, DH10B 등이 이용될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 SURE를 사용하는 것이 카로틴노이드의 발현에 좋고 생장속도가 빠르기 때문에 좋다.Another aspect of the present invention relates to E. coli transformed with the above-described recombinant vector. As the E. coli strain, XL1-Blue, SURE, Top10, BL21 (DE3), DH5α, DH10B, and the like may be used, but are not limited thereto. Preferably, the use of SURE is good because it is good for the expression of carotenoids and the growth rate is fast.
이러한 대장균 균주를 본 발명의 형질전환용 벡터로 형질전환시키기 위해서는 먼저 세포막을 수용성(competent)으로 만들어야 한다. 이러한 방법은 대장균 세포를 염화칼슘(CaCl2) 용액 또는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)과 염화마그네슘(MgCl2)의 혼합 용액에 노출시킴으로써 수행할 수 있지만 여기에 한정되는 것은 아니다. 이러한 화합물들은 DNA와 복합체를 형성하여 세포 내로 DNA의 유입을 용이하게 해주는 역할을 한다. 또한 대장균 세포막은 전기천공에 의해서도 수용성이 될 수 있는데, 상기 전기 전류는 DNA가 세포 내로 유입되도록 세포막을 파열시키는 역할을 한다.In order to transform the E. coli strain with the vector for transformation of the present invention, the cell membrane must first be made into a water-soluble (competent). This method may be performed by exposing the E. coli cells to a calcium chloride (CaCl 2 ) solution or a mixed solution of polyethylene glycol and magnesium chloride (MgCl 2 ), but is not limited thereto. These compounds form complexes with DNA and play a role in facilitating the influx of DNA into cells. In addition, the E. coli cell membrane may be water-soluble by electroporation, and the electric current serves to rupture the cell membrane so that DNA is introduced into the cell.
상기 형질전환된 대장균은 도 1에 나타난 여러 종류의 카로틴노이드를 생산할 수 있다. 예를 들어, 4,4'-디아포뉴로스포레노익산(4,4'-diaponeurosporenoic acid), 4,4'-디아포라이코펜-4,4'-다이오익산(4,4'-diapolycopene-4,4'-dioic acid), 4,4'-디아포라이코페노익산(4,4'-diapolycopenoic acid), 4,4'-디아포라이코펜-4'-알-4-오익산(4,4'-diapolycopen-4'-al-4-oic acid) 등의 카로틴노이드를 생산할 수 있다. 또한 중간 물질인 글루코실-4,4'-디아포뉴로스포레노익산(Glucosyl-4,4'-Diaponeurosporenoic acid)을 생성할 수 있으며, 이를 거쳐 스타필로잔틴(staphyloxanthin), 테트라데카노일-글루코실-4,4'-디아포뉴로스포레노익산(tetradecanoyl-glucosyl-4,4'-diaponeurosporenoic acid) 및 헥사데카노일-글루코실-4,4'-디아포뉴로스포레노익산(hexadecanoyl-glucosyl-4,4'-diaponeurosporenoic acid)을 생성할 수 있다. 상기 물질 중 테트라데카노일-글루코실-4,4'-디아포뉴로스포레노익산과 헥사데카노일-글루코실-4,4'-디아포뉴로스포레노익산은 아직까지 알려지지 않은 신규한 스타필로잔틴 유사물질에 해당한다.The transformed E. coli can produce various types of carotenoids shown in FIG. 1. For example, 4,4'-diaponeurosporenoic acid (4,4'-diaponeurosporenoic acid), 4,4'-diapolycopene-4,4'-dioic acid (4,4'-diapolycopene-4 ,4'-dioic acid), 4,4'-diapolycopenoic acid (4,4'-diapolycopenoic acid), 4,4'-diapolycopene-4'-al-4-oic acid (4,4 It can produce carotenoids such as'-diapolycopen-4'-al-4-oic acid). It can also produce intermediate substances, glucosyl-4,4'-diaponurosporenoic acid, through which staphyloxanthin, tetradecanoyl-glucosyl -4,4'-tetradecanoyl-glucosyl-4,4'-diaponeurosporenoic acid and hexadecanoyl-glucosyl-4,4'-diaponeurosporenoic acid (hexadecanoyl-glucosyl-4) ,4'-diaponeurosporenoic acid) can be produced. Among the above substances, tetradecanoyl-glucosyl-4,4'-diaponurosporenoic acid and hexadecanoyl-glucosyl-4,4'-diaponurosporenoic acid are novel staphyloxanthines that are not yet known. Corresponds to similar substances.
대장균 같은 외래 숙주를 이용한 대사회로의 구축은 새로운 물질로의 유도나 다른 작용기의 선택적 첨가 등 다양한 적용 가능성을 열어주며, 이러한 새로운 작용기의 첨가는 물질의 용해도와 생리활성을 크게 높여 주는 역할을 한다.
The construction of metabolic circuits using foreign hosts such as E. coli opens up the possibility of various applications such as induction to new substances or selective addition of other functional groups, and the addition of these new functional groups plays a role of greatly enhancing the solubility and physiological activity of substances.
본 발명의 또 다른 관점은 (a)상기 형질전환용 벡터로 형질전환된 대장균을 배양하는 단계와 (b)상기 배양액으로부터 카로틴노이드를 분리하는 단계를 포함하는 형질전환된 대장균으로부터 카로틴노이드를 생산하는 방법에 관한 것이다.Another aspect of the present invention is to produce carotenoids from transformed E. coli, comprising the steps of (a) culturing the transformed E. coli with the transformation vector and (b) separating carotenoids from the culture medium. It's about the method.
상기 배양 단계는 당업계에 공지된 대장균 배양 방법에 따라 진행될 수 있다. 본 발명에서는 한 양태로 영양배지 TB를 이용하여 약 20 ~ 40 ℃, 200 ~ 300 rpm에서 약 24 ~ 48 시간 동안 배양한다.The culturing step may be performed according to a method for culturing E. coli known in the art. In the present invention, in one embodiment, the nutrient medium TB is used and cultured at about 20 to 40° C. and 200 to 300 rpm for about 24 to 48 hours.
이러한 배양 과정을 통하여 얻은 배양물로부터 카로틴노이드를 분리 및 정제하기 위하여 대장균 균체만을 원심 분리한 후 여기에 유기용매를 처리하고 섞어준 다음 색이 완전히 빠질 때까지 반복적으로 추출한다. 상기 유기용매로는 아세톤, 메탄올, 헥산 등을 사용할 수 있으나, 보다 바람직하게는 아세톤을 이용하는 것이 좋다.In order to separate and purify carotenoids from the culture obtained through this culture process, only E. coli cells are centrifuged, treated with an organic solvent, mixed, and repeatedly extracted until the color completely disappears. As the organic solvent, acetone, methanol, hexane, etc. may be used, but acetone is more preferably used.
상기 추출된 용액을 진공 원심 건조기를 이용해 농축하고, 농축된 용액에 에틸 아세테이트 등을 가하여 섞어 준 후, NaCl 용액을 가하여 용액 층을 분리한다. 색이 포함된 상층을 분리 후, 물로 세척하여 남은 수분을 제거한 후, 진공 원심 건조기를 이용해 완전히 말리는 과정을 거침으로써 카로틴노이드를 분리할 수 있다.The extracted solution was concentrated using a vacuum centrifugal dryer, ethyl acetate or the like was added to the concentrated solution to mix, and NaCl solution was added to separate the solution layer. After separating the upper layer containing the color, washing with water to remove remaining moisture, and then completely drying using a vacuum centrifugal dryer, carotenoids can be separated.
본 발명은 상기와 같은 과정을 통해 4,4'-디아포뉴로스포레노익산(4,4'-diaponeurosporenoic acid), 4,4'-디아포라이코펜-4,4'-다이오익산(4,4'-diapolycopene-4,4'-dioic acid), 4,4'-디아포라이코페노익산(4,4'-diapolycopenoic acid), 4,4'-디아포라이코펜-4'-알-4-오익산(4,4'-diapolycopen-4'-al-4-oic acid) 등의 카로틴노이드와 자연계에서 희소한 카로틴노이드인 스타필로잔틴(staphyloxanthin) 및 이와 유사한 신규 물질인 테트라데카노일-글루코실-4,4'-디아포뉴로스포레노익산(tetradecanoyl-glucosyl-4,4'-diaponeurosporenoic acid), 헥사데카노일-글루코실-4,4'-디아포뉴로스포레노익산(hexadecanoyl-glucosyl-4,4'-diaponeurosporenoic acid) 등을 대량으로 대장균 내에서 생산할 수 있다.
The present invention provides 4,4'-diaponeurosporenoic acid (4,4'-diaponeurosporenoic acid), 4,4'-diapolycopene-4,4'-dioic acid (4,4 '-diapolycopene-4,4'-dioic acid), 4,4'-diapolycopenoic acid, 4,4'-diapolycopene-4'-al-4-o Carotenoids such as iksan (4,4'-diapolycopen-4'-al-4-oic acid), staphyloxanthin, a rare carotene in nature, and a similar new substance, tetradecanoyl-glucosyl- 4,4'-diaponeurosporenoic acid (tetradecanoyl-glucosyl-4,4'-diaponeurosporenoic acid), hexadecanoyl-glucosyl-4,4'-diaponeurosporenoic acid (hexadecanoyl-glucosyl-4, 4'-diaponeurosporenoic acid) can be produced in E. coli in large quantities.
이하. 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Below. The present invention will be described in detail by examples. However, the following examples are merely illustrative of the present invention, and the contents of the present invention are not limited to the following examples.
실시예Example 1: 본 발명에 사용된 대사회로 유전자의 모듈화 방법 1: Modular method of metabolic circuit gene used in the present invention
디아포파이토엔 신타제(CrtM; diapophytoene synthase), 디아포파이토엔 디새튜라제(CrtN; diapophytoene desaturase), 디아포뉴로스포렌 옥시다아제(CrtP; diaponeurosporene oxidase), 글리코실 트랜스퍼라아제(CrtQ; glycosyl transferase), 아실 트랜스퍼라아제(CrtO; acyl transferase), 알데히드 탈수소화효소(ald; aldehyde dehydrogenase), 글라이신 베타인 알데히드 탈수소화효소(gbsA; glycine betaine aldehyde dehydrogenase), 알데히드 탈수소화효소 호몰로그(aldA; aldehydro dehydrogenase homolog) 및 알데히드 탈수소화 효소 패밀리 단백질(aldehyde dehydrogenase family protein)을 코드하는 유전자들은 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) subsp. aureus KCTC1928로부터 PCR을 이용해 증폭하였다. pUC19벡터의 lac 프로모터는 pUCM_F, pUCM_R primer를 이용하여 증폭 후, EcoRI 처리하여 셀프 라이게이션(self ligation) 처리를 거쳐 지속적인 발현이 이루어지도록 수정되어 pUCM으로 만들었다(C. Schmidt-Dannert et al. Nature Biotechnology 2000 vol.18 750-753 참조). 이 pUCM 벡터에 각각의 유전자 들을 클로닝(cloning)하여 각각 유전자들이 constitutive한 프로모터(promoter)의 조절 하에 발현이 이루어지도록 모듈화하였다. 서브클로닝(Subcloning)시에는 각각의 프로모터(promoter)가 포함되도록 pUCM에 클로닝(cloning)된 유전자를 각각의 제한효소 자리가 삽입된 프라이머(primer)를 이용해 증폭하였고, 이를 pACYC184 플라스미드(plasmid)에 서브클로닝(subcloning)하여 유전자 모듈을 제작했다. 이 방식으로 pACM-MSA-NSA, pACM-MSA-NSA-PSA, pACM-MSA-NSA-PSA-QSA 유전자 모듈을 제작하였다. 스타필로잔틴(Staphyloxanthin) 유전자 클러스터(cluster)인 crtOPQMN은 crtO _F primer와 제한효소 자리를 바꾼 crtN _R primer를 이용해 증폭 후, pUC19에 클로닝(cloning)하였다. ald 유전자는 또한 pBBR1MCS-2 벡터에 EcoRI, XbaI 제한효소 자리에 클로닝(cloning)되었다. 각각 프라이머(primer)에 대한 시퀀스는 하기 표 2에 나타내었다.Diapophytoene synthase (CrtM; diapophytoene synthase), diapophytoene desaturase (CrtN; diapophytoene desaturase), diaponeurosporene oxidase (CrtP; diaponeurosporene oxidase), glycosyl transferase (CrtQ; glycosyl transferase) ), acyl transferase (CrtO; acyl transferase), aldehyde dehydrogenase (ald; aldehyde dehydrogenase), glycine betaine aldehyde dehydrogenase (gbsA; glycine betaine aldehyde dehydrogenase), aldehyde dehydrogenase homolog (aldA; aldehydrogenase) dehydrogenase homolog) and aldehyde gene encoding a dehydrogenation enzyme family protein (aldehyde dehydrogenase family protein) are Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus ) subsp. aureus KCTC1928 was amplified using PCR. The lac promoter of the pUC19 vector was amplified using pUCM_F and pUCM_R primers, and then subjected to self ligation by EcoRI and modified to be continuously expressed, and made into pUCM (C. Schmidt-Dannert et al. Nature Biotechnology). 2000 vol. 18 750-753). Each gene was cloned into the pUCM vector, and each gene was modularized to be expressed under the control of a constitutive promoter. During subcloning, the gene cloned into pUCM to include each promoter was amplified using a primer into which each restriction enzyme site was inserted, and this was amplified into the pACYC184 plasmid. Genetic modules were constructed by subcloning. In this way pACM-M SA -N SA , pACM-M SA -N SA -P SA , pACM-M SA -N SA -P SA -Q SA gene The module was built. Staphylococcus xanthine (Staphyloxanthin) after amplification crtOPQMN gene cluster (cluster) is using the primer changed crtN _R the restriction position and crtO _F primer, was cloned (cloning) in pUC19. The ald gene was also cloned into the pBBR1MCS-2 vector at the site of EcoRI and XbaI restriction enzymes. Sequences for each primer are shown in Table 2 below.
((
EnzymeEnzyme
sitesite
))
실시예Example 2: 본 발명에 사용된 대장균 배양 및 2: E. coli culture used in the present invention and 카로틴노이드Carotenoids 생산 방법 Production method
pBBR1MCS 벡터를 제외한 클로닝(cloning)과 카로틴노이드의 생산을 위해 대장균(Escherichia coli) strain SURE를 사용하였으며, pBBR1MCS로의 클로닝(cloning)과 pBBR1MCS 벡터를 포함한 유전자 모듈의 발현에는 대장균(E. coli) XL1-Blue strain을 사용하였다. 카로틴노이드의 생산을 위해 S. aureus는 LB 50 ml에 37 ℃, 250 rpm에서 24 시간 배양하였으며, 재조합 대장균은 TB 50 ml 혹은 200 ml에 30 ℃, 250 rpm에서 36 시간 배양하였고 형질 전환된 플라스미드(plasmid)에 따라 적절한 항생제를 첨가하였다(chloramphenicol 50 μg/ml, ampicillin 100 μg/ml, kanamycin 50 μg/ml).
Escherichia (Escherichia ) for cloning and carotenoid production except pBBR1MCS vector coli ) strain SURE was used, and the E. coli XL1-Blue strain was used for cloning into pBBR1MCS and expression of the gene module including the pBBR1MCS vector. For the production of carotenoids, S. aureus was incubated in 50 ml of LB at 37°C and 250 rpm for 24 hours, and recombinant E. coli was incubated in 50 ml or 200 ml of TB at 30°C and 250 rpm for 36 hours. plasmid), appropriate antibiotics were added (
실시예Example 3: 본 발명에 사용된 3: used in the present invention 카로틴노이드의Carotenoid 분리 방법 Separation method
카로틴노이드의 분리를 위해 배양한 세포를 원심 분리 후, 아세톤(acetone) 5 ml 혹은 10 ml로 색이 완전히 빠질 때 까지 반복적으로 추출하였다. 추출된 용액을 진공 원심 건조기(EZ2-Plus, Genevac)를 이용해 농축하였으며, 농축된 용액에 5 ml의 에틸아세테이트(ethyl acetate)를 가하여 섞어 준 후, 5 N NaCl 용액을 가하여 용액 층을 분리하였다. 색이 포함된 상층을 분리 후, 3 차수로 2 번 세척하여 남은 수분을 제거한 후, 진공 원심 건조기를 이용해 완전히 말렸다. 완전히 마른 샘플에 100 ~ 200 μl의 에틸아세테이트(ethyl acetate)를 가하여 녹여서 추후의 분석에 이용하였다.After centrifugation of the cultured cells for separating carotenoids, the cells were repeatedly extracted with 5 ml or 10 ml of acetone until the color completely disappeared. The extracted solution was concentrated using a vacuum centrifugal dryer (EZ2-Plus, Genevac), 5 ml of ethyl acetate was added to the concentrated solution, mixed, and then 5 N NaCl solution was added to separate the solution layer. The upper layer containing the color was separated, washed twice with a third order to remove remaining moisture, and then completely dried using a vacuum centrifugal dryer. 100 to 200 μl of ethyl acetate was added to the completely dried sample to dissolve it and used for further analysis.
비누화(Saponification) 실험을 위해서는 추출 시에 아세톤(acetone) 대신 6 % KOH를 녹인 메탄올(methanol)을 사용하여 카로틴노이드를 추출 후, 4 ℃에서 14 시간 반응하여 진행하였다. LC/MS 분석을 위해, 위의 과정을 거친 샘플을 실리카(silica) 컬럼에 로딩(loading)한 후 hexane:ethyl acetate (9:1) 용액에 아세톤(acetone)을 조금씩 높여가며 분획을 나누어 일루션(elution)하였다. 일루션된 샘플은 TLC와 HPLC 분석을 통해 순도(purity)를 확인 후, LC/MS분석에 사용하였다.
For the saponification experiment, caroteneoids were extracted using methanol in which 6% KOH was dissolved instead of acetone, and then reacted at 4° C. for 14 hours. For LC/MS analysis, after loading the sample through the above process on a silica column, gradually increasing acetone in a hexane:ethyl acetate (9:1) solution, dividing the fraction and dividing the illusion ( elution). The illuminated sample was used for LC/MS analysis after confirming the purity through TLC and HPLC analysis.
실시예Example 4: 본 발명에 사용된 4: used in the present invention 카로틴노이드의Carotenoid 분석 방법 Analysis method
카로틴노이드의 TLC분석은 hexane:ethyl acetate:acetone (9:1:1) 용액을 이용해 전개하였다. 글루코실화(glucosylated)된 물질의 분석에는 9:1:3 용액을 사용하였다. 10 ~ 20 μl의 준비된 샘플을 이용해 HPLC 분석을 진행하였으며 HPLC는 80% 아세토나이트릴(acetonitrile), 15% 메탄올(methanol), 5% 이소프로판올(isopropanol) 용액을 이동상으로, Zorbax eclipse XDB-C18 컬럼(4.6 X 150 mm, 5 μm; Agilent Technology)을 고정상으로 1 ml/min의 유속으로 분석하였다. 구조분석을 위해, HPLC retention time과 흡수 스펙트럼, 질량 스펙트럼(mass spectrum)을 비교하여 분석하였다. 질량 스펙트럼(Mass spectrum)은 Varian 1200L LC/MS system을 이용하여 positive 모드와 negative 모드를 동시에 모니터하였고, 이온화에는 APCI(atmosphere pressure chemical ionization) 모듈을 사용하였다.
TLC analysis of carotenoids was performed using a hexane:ethyl acetate:acetone (9:1:1) solution. A 9:1:3 solution was used to analyze the glucosylated material. HPLC analysis was performed using 10 to 20 μl of the prepared sample, and HPLC was performed using a solution of 80% acetonitrile, 15% methanol, and 5% isopropanol as a mobile phase, and a Zorbax eclipse XDB-C18 column ( 4.6 X 150 mm, 5 μm; Agilent Technology) was analyzed on a stationary bed at a flow rate of 1 ml/min. For structural analysis, HPLC retention time, absorption spectrum, and mass spectrum were compared and analyzed. For mass spectrum, positive and negative modes were simultaneously monitored using a Varian 1200L LC/MS system, and an atmosphere pressure chemical ionization (APCI) module was used for ionization.
실험예Experimental example
(1) (One) CC 3030 카로틴노이드Carotenoids 발현 유전자 모듈의 제작 Construction of the expressed gene module
ald 유전자(서열번호 1)가 포함되지 않은 기존 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus)의 C30 카로틴노이드 생합성에 관련된 유전자들을 모듈화하여 4,4'-디아포라이코펜(4,4'-diapolycopene), 4,4'-디아포뉴로스포렌-4알(4,4'-diaponeurosporen-4-al)의 생합성 모듈을 제작하였다(도 2). 각각의 모듈을 대장균 내에 형질전환시켰을 때, 재조합 대장균은 성공적으로 카로틴노이드를 발현하였으며, 각각 모듈에 따른 발현 카로틴노이드는 하기 표 3에 나타내었다.4,4'-diapolycopene (4,4'-) by modularizing genes related to the biosynthesis of C 30 carotenoids of the existing Staphylococcus aureus (S. aureus) that does not contain the ald gene (SEQ ID NO: 1). diapolycopene), 4,4'-diaponeurosporen-4-al (4,4'-diaponeurosporen-4-al) biosynthetic module was prepared (Fig. 2). When each module was transformed into E. coli, the recombinant E. coli successfully expressed carotenoids, and the expressed carotenoids according to each module are shown in Table 3 below.
알려진 유전자들을 모듈화하여 대장균 내에서 발현시킨 결과 CrtP 이후의 대사회로는 대장균 내에서 구축되지 못하고 4,4'-디아포뉴로스포렌-4알(4,4'-diaponeurosporen-4-al)을 축적하는 것을 확인할 수 있었다. 문제 해결을 위해 CrtQ의 기능적 발현에 목적을 두었고, N-terminal, C-terminal motif절단(도 10A), lac-프로모터를 이용한 CrtQ 발현 수준의 조절 등이 시도되었으나 이 접근은 대장균 생장에만 긍정적 효과를 가져왔고, 카로틴노이드 프로파일(profile)을 변화시키진 못했다(도 8, 10B).As a result of modularizing known genes and expressing them in E. coli, the metabolic circuit after CrtP could not be established in E. coli, and 4,4'-diaponeurosporen-4-al (4,4'-diaponeurosporen-4-al) was accumulated. I was able to confirm that. To solve the problem, the purpose of functional expression of CrtQ was aimed at, and N-terminal, C-terminal motif cleavage (FIG. 10A), and control of CrtQ expression level using a lac -promoter were attempted, but this approach had a positive effect only on E. coli growth. And did not change the carotenoid profile (Figs. 8, 10B).
유전자 모듈의 조합으로 형질전환된 대장균에서 발견된 카로틴노이드Staphylococcus aureus identified in the present invention ( Staphylococcus aureus ) with KCTC1928
Carotenoids found in E. coli transformed with a combination of gene modules
((
ExpressedExpressed
genesgenes
))
((
nmnm
))
기존 대사회로Existing dialogue circuit
4,4'-diaponeurosporenoic acid (5)Staphyloxanthin (10)
4,4'-diaponeurosporenoic acid (5)
[M-H]-=431.15[M] - =818.57
[MH] - =431.15
453, 478463, 487
453, 478
4,4'-diaponeurosporene (2)4,4'-diapolycopene (1)
4,4'-diaponeurosporene (2)
[M]+=402.70[M] + =400.44
[M] + =402.70
415, 439, 468440, 468, 498
415, 439, 468
4,4'-diapolycopene-dial (4)4,4'-diaponeurosporen-al (3)
4,4'-diapolycopene-dial (4)
[M+H]+=429.15[M+H] + =417.07
[M+H] + =429.15
474, 502, 535468, 487
474, 502, 535
(2) (2) aldald 유전자(서열번호 1) 탐색 및 기능적 확인 Gene (SEQ ID NO: 1) search and functional confirmation
상기한 바와 같이, 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus)의 CrtQ와 CrtO가 대장균 내에서 성공적으로 작용하지 못하고 4,4'-디아포뉴로스포렌-4-알(4,4'-diaponeurosporen-4-al)을 남기는 문제의 해결을 위해 메틸로모나스(Methylomonas sp. strain 16a)의 대사회로를 참고하여 4,4'-디아포뉴로스포렌-4-알(4,4'-diaponeurosporen-4-al)을 4,4'-디아포뉴로스포레노익산(4,4'-diaponeurosporenoic acid)으로 전환하는 알데히드 탈수소화효소(aldehyde dehydrogenase) 유전자가 존재할 것임을 유추, NCBI 데이터베이스로부터 S. aureus strain Newman의 게놈(genome) 시퀀스에서 알데히드 탈수소화효소(aldehyde dehydrogenase) 관련 유전자를 탐색하였다. 탐색 결과 7 개의 유전자를 찾을 수 있었고(표 4), 그 중 4 개 유전자를 pUCM 벡터에 클로닝(cloning)하여 pACM-MSA-NSA-PSA 플라스미드(plasmid)로 형질전환된 대장균에 발현하여 기능을 확인하였다(도 3). 확인 결과 1 개의 유전자(ald)만 카로틴노이드에 작용하여 우리가 예상한 대로 4,4'-디아포뉴로스포레노익산(4,4'-diaponeurosporenoic acid)을 발현하였고, 또한 4,4'-디아포라이코펜-4,4'-다이오익산(4,4'-diapolycopene-4,4'-dioic acid)을 발현하였다. 또한 LC/MS 분석 결과 회로 중간 물질인 4,4'-디아포라이코페노익산(4,4'-diapolycopenoic acid)과 4,4'-디아포라이코펜-4'-알-4-오익산(4,4'-diapolycopen-4'-al-4-oic acid)도 확인되었다(도 11). 확인된 ald 유전자를 이용해 계통수 분석을 해 본 결과 바실러스(Bacillus), 조류(algae), 시아노박테리아(cyanobacteria)를 포함한 여러 군의 미생물에서 유사성이 발견되었고, 메틸로모나스(Methylomonas) 속과는 연관성이 적은 것을 확인하였다(도 4).As described above, CrtQ and CrtO of Staphylococcus aureus did not work successfully in E. coli, and 4,4'-diaponeurosporen-4-al (4,4'- diaponeurosporen-4-al) to solve the problem of leaving 4,4'-diaponeurosporen-4-al (4,4'-diaponeurosporen) by referring to the metabolic circuit of methylomonas (Methylomonas sp.
((
CarotenoidCarotenoid
biosynthesisbiosynthesis
))
(Amino acid metabolism)Amino acid metabolism
(Amino acid metabolism)
(Glycolysis)Glycolysis
(Glycolysis)
(Glycolysis)Glycolysis
(Glycolysis)
(Amino acid metabolism)Amino acid metabolism
(Amino acid metabolism)
(3) 완성된 (3) completed 스타필로잔틴Staphyloxanthin (( staphyloxanthinstaphyloxanthin ) ) 생합성회로의Biosynthetic circuit 대장균에서의In E. coli 구축 build
생합성 대사회로의 빠진 산화(oxidation) 단계를 찾음으로써 대장균 내에 완성된 스타필로잔틴(staphyloxanthin) 대사회로를 구축할 수 있었다. 이는 두 가지 유전자 모듈의 조합으로 이루어졌는데, 첫 번째는 pACM-MSA-NSA-PSA-QSA, pUCM-OSA 및 pBBR-aldSA의 조합이었고, 두 번째는 pUC19-OPQMNSA과 pBBR-aldSA의 조합이었다(표 5 및 도 5). 두 가지 조합을 이용해 대장균 내에 스타필로잔틴(staphyloxanthin) 대사회로를 구축한 결과, 두 번째 조합에선 4,4'-디아포뉴로스포레노익산(4,4'-diaponeurosporenoic acid)이 주 물질로 발현되었고, 글루코실-4,4'-디아포뉴로스포레노익산(glucosyl-4,4'-diaponeurosporenoic acid)이 소량 발현되었다. 이는 LC/MS분석을 통해 확인되었다(도 11D). 첫 번째 조합을 이용해 구축한 결과는 스타필로잔틴(staphyloxanthin)과 매우 유사한 UV/Vis 흡수 스펙트럼(spectrum)을 가진 물질들이 생합성 되었다. 이들의 UV/Vis 흡수 스펙트럼(spectrum)은 모두 매우 유사하였으며(도 7), 그 중 두 가지 물질이 주로 발현되었다. 두 번째 조합을 구축한 대장균으로부터 카로틴노이드를 추출하여 비누화(saponification) 실험을 진행해 본 결과 이 스타필로잔틴(staphyloxanthin) 유사 물질들은 모두 사라지고 4,4'-디아포뉴로스포레노익산(4,4'-diaponeurosporenoic acid)의 양이 증가하는 것을 확인하였다(도 6). 이를 통해 이 물질이 스타필로잔틴(staphyloxanthin)과 매우 유사하지만 다른 극성을 지닌 물질임을 확인하였고 에스터(ester)결합을 통해 이 결합이 이루어져 있음을 확인하였다. 이러한 극성의 차이는 지방산 사슬 길이의 차이에 기인한 것이라 추측하였고, 이를 확인하기 위해 LC/MS분석을 진행하였다. MS 스펙트럼(spectrum)을 확인한 결과, 에스터(ester)결합으로 이루어진 조각(fragment)들을 모두 확인할 수 있었다(도 9). LC/MS 분석을 통해 우리는 발현된 두 가지 주 물질이 테트라데카노일-글루코실-4,4'-디아포뉴로스포레노익산(tetradecanoyl-glucosyl-4,4'-diaponeurosporenoic acid)과 헥사데카노일-글루코실-4,4'-디아포뉴로스포레노익산(hexadecanoyl-glucosyl-4,4'-diaponeurosporenoic acid)임을 확인할 수 있었다. 이러한 비 특이적 기질을 통한 새로운 구조의 발현은 대장균 내의 지방산 프로파일(profile)이 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus)에서와 다름에서 기인한 것이다. 결과적으로 대장균 내에 구축된 C30 카로틴노이드의 생합성 회로를 도 1에 나타내었다.The completed staphyloxanthin metabolic circuit could be built in E. coli by finding the step of the oxidation of the biosynthetic metabolic cycle. It consisted of a combination of two gene modules, the first was a combination of pACM-M SA -N SA -P SA -Q SA , pUCM-O SA and pBBR-ald SA , and the second was pUC19-OPQMN SA and pBBR -ald SA was a combination (Table 5 and Figure 5). As a result of constructing staphyloxanthin metabolic circuit in E. coli using two combinations, 4,4'-diaponeurosporenoic acid (4,4'-diaponeurosporenoic acid) was expressed as the main substance in the second combination. , Glucosyl-4,4'-diaponeurosporenoic acid (glucosyl-4,4'-diaponeurosporenoic acid) was expressed in a small amount. This was confirmed through LC/MS analysis (Fig. 11D). As a result of constructing using the first combination, substances with UV/Vis absorption spectrum very similar to staphyloxanthin were biosynthesized. Their UV/Vis absorption spectra were all very similar (FIG. 7), and two of them were mainly expressed. As a result of saponification experiments by extracting caroteneoids from Escherichia coli that constructed the second combination, all of these staphyloxanthin-like substances disappeared and 4,4'-diaponurosporenoic acid (4,4'). It was confirmed that the amount of -diaponeurosporenoic acid) increased (FIG. 6). Through this, it was confirmed that this material is very similar to staphyloxanthin, but has a different polarity, and it was confirmed that this bond was formed through an ester bond. This difference in polarity was assumed to be due to the difference in fatty acid chain length, and LC/MS analysis was performed to confirm this. As a result of confirming the MS spectrum, all fragments made of ester bonds were confirmed (FIG. 9). Through LC/MS analysis, we found that the two main substances expressed were tetradecanoyl-glucosyl-4,4'-diaponeurosporenoic acid and hexadecanoyl. -Glucosyl-4,4'-diaponeurosporenoic acid (hexadecanoyl-glucosyl-4,4'-diaponeurosporenoic acid) was confirmed. The expression of the new structure through this non-specific substrate is due to the difference in the fatty acid profile in E. coli from that in Staphylococcus aureus. As a result, the biosynthetic circuit of C 30 carotenoids constructed in E. coli is shown in FIG. 1.
유전자 모듈의 조합으로 형질전환된 대장균에서 발견된 카로틴노이드(carotenoid)들Staphylococcus aureus identified in the present invention ( Staphylococcus aureus ) with KCTC1928
Carotenoids found in E. coli transformed with a combination of gene modules
((
ExpressedExpressed
genesgenes
))
((
nmnm
))
기존 대사회로Existing dialogue circuit
4,4'-diaponeurosporenoic acid (5)Staphyloxanthin (10)
4,4'-diaponeurosporenoic acid (5)
[M-H]-=431.15[M] - =818.57
[MH] - =431.15
453, 478463, 487
453, 478
4,4'-diaponeurosporene (2)4,4'-diapolycopene (1)
4,4'-diaponeurosporene (2)
[M]+=402.70[M] + =400.44
[M] + =402.70
415, 439, 468440, 468, 498
415, 439, 468
4,4'-diapolycopene-dial (4)4,4'-diaponeurosporen-al (3)
4,4'-diapolycopene-dial (4)
[M+H]+=429.15[M+H] + =417.07
[M+H] + =429.15
474, 502, 535468, 487
474, 502, 535
본원발명
Main invention
+ pUCM-aldSA pACM-M SA -N SA -P SA
+ pUCM-ald SA
4,4'-diapolycopene-4,4'-dioic acid (6)
4,4'-diapolycopene-4'-al-4-oic acid (7)
4,4'-diapolycopenoic acid (8)4,4'-diaponeurosporenoic acid (5)
4,4'-diapolycopene-4,4'-dioic acid (6)
4,4'-diapolycopene-4'-al-4-oic acid (7)
4,4'-diapolycopenoic acid (8)
[M-H]-=459.18
[M-H]-=443.08
[M-H]-=429.01[MH] - =431.15
[MH] - =459.18
[MH] - =443.08
[MH] - =429.01
464, 491, 520
456, 483, 514
448, 475, 507453, 478
464, 491, 520
456, 483, 514
448, 475, 507
+ pBBR-aldSA pUC19-OPQMN SA
+ pBBR-ald SA
Glucosyl-4,4'-diaponeurosporenoic acid (9)4,4'-diaponeurosporenoic acid (5)
Glucosyl-4,4'-diaponeurosporenoic acid (9)
[M-H]-=593.34[MH] - =431.15
[MH] - =593.34
456, 482453, 478
456, 482
+ pUCM-OSA pACM-M SA -N SA -P SA -Q SA +pBBR-ald SA
+ pUCM-O SA
tetradecanoyl-glucosyl-4,4'-
diaponeurosporenoic acid (11)
Hexadecanoyl-glucosyl-4,4'
-diaponeurosporenoic acid (12)4,4-diaponeurosporenoic acid (5)
tetradecanoyl-glucosyl-4,4'-
diaponeurosporenoic acid (11)
Hexadecanoyl-glucosyl-4,4'
-diaponeurosporenoic acid (12)
[M-H]-=803.5
[M-H]-=832.66
[MH] - =431.15
[MH] - =803.5
[MH] - =832.66
463, 487
463, 487
453, 478
463, 487
463, 487
서열목록 전자파일 첨부Attach electronic file of sequence list
Claims (7)
A gene derived from Staphylococcusaureus having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, a diapophytoene synthase (CrtM) gene (SEQ ID NO: 2), and a diaphophytoene desatur Laze (CrtN; diapophytoene desaturase) gene (SEQ ID NO: 3), diaponurosporene oxidase (CrtP) gene (SEQ ID NO: 4), glycosyl transferase (CrtQ) gene (SEQ ID NO: 5) And tetradecanoyl-glucosyl-4,4'-diaponurosporenoic acid or hexadecanoyl-glucosyl-4,4 'comprising an acyl transferase (CrtO) gene (SEQ ID NO: 6). Recombinant vectors for the production of diaponurosporenoic acid.
The recombinant vector of claim 5, wherein the recombinant vector is prepared using pUCM.
Escherichia coli transformed with the recombinant vector of claim 5.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020130071042A KR101364590B1 (en) | 2013-06-20 | 2013-06-20 | Construction of staphyloxanthin metabolic pathway and biosynthesis of staphyloxanthin like carotenoids through E.coli |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020130071042A KR101364590B1 (en) | 2013-06-20 | 2013-06-20 | Construction of staphyloxanthin metabolic pathway and biosynthesis of staphyloxanthin like carotenoids through E.coli |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020110042098A Division KR101293076B1 (en) | 2011-05-03 | 2011-05-03 | Construction of staphyloxanthin metabolic pathway and biosynthesis of staphyloxanthin like carotenoids through E.coli |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20130086586A KR20130086586A (en) | 2013-08-02 |
| KR101364590B1 true KR101364590B1 (en) | 2014-02-18 |
Family
ID=49213760
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020130071042A KR101364590B1 (en) | 2013-06-20 | 2013-06-20 | Construction of staphyloxanthin metabolic pathway and biosynthesis of staphyloxanthin like carotenoids through E.coli |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101364590B1 (en) |
-
2013
- 2013-06-20 KR KR1020130071042A patent/KR101364590B1/en active IP Right Grant
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Applied and Environmental Microbiology. Vol.71, No. 6, pp. 3294-3301 (2005) * |
| Journal of Biological Chemistry. Vol. 280, No. 37, pp. 32493-32498 (2005) * |
| Journal of Biological Chemistry. Vol. 280, No. 37, pp. 32493-32498 (2005)* |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20130086586A (en) | 2013-08-02 |
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