KR101360409B1 - 위암 암 줄기세포 특성에 기초한 위암의 치료용 타겟 - Google Patents

Abstract

본 발명은 위암 암 줄기세포 및 위암에 대한 신규한 분자 마커를 이용하여 위암 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다. 본 발명은 암 줄기세포 및 암에 대한 신규한 분자 마커를 이용하여 위암 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다. 본 발명의 위암 또는 암 치료제 타겟은 위암 암 줄기세포 또는 암 줄기세포에 특이적으로 작용하는 치료제 후보물질을 스크리닝 하는 데 매우 유용하다. 또한, 본 발명을 이용하면 위암 또는 암의 진단 및 예후를 정확하게 분석할 수 있다.

Description

위암 암 줄기세포 특성에 기초한 위암의 치료용 타겟{Novel Therapeutic Target for Gastric Cancer Based on Gastric Cancer Stem Cell}

본 발명은 위암 암 줄기세포 특성에 기초한 위암의 치료용 타겟 및 위암 암 줄기세포에 대한 신규 바이오마커에 관한 것이다.

암 조직에도 일반 장기처럼 암 조직을 유지하고 재생하는 암 줄기세포(cancer stem cells or tumor initiating cells)가 존재하며, 이들 암 줄기세포는 암의 최초 시작으로 암화과정에 관여하는 것으로 추측되고 있을 뿐 아니라, 암조직내의 신생혈관형성(angiogenesis, neovascularization)에도 관여하는 것으로도 보고되어 있다. 또한 암세포 침윤등을 가속화시켜 암 치료 후 줄어든 암세포의 재생하는 데 관여함으로써 암의 재발이나 전이 및 항암치료 내성 유발에 깊은 영향을 미친다고 보고된 바 있다(Y.-F. Ping and X.-W. Bian, Current Molecular Medicine, 11:69-75(2011), BB Zhou et al. Nature Reviews Drug Discovery, 8:806-823(2009)). 따라서 암을 근본적으로 진단 및 치료하기 위해서는 암 조직의 극히 일부만 차지하면서도 암의 발병과 유지, 항암제 내성, 재발에 핵심 구실을 하는 암 줄기세포에 초점을 맞추어야 하며, 암 줄기세포에 대한 더 많은 이해는 조기 진단을 위한 진단용 마커 및 치료용 마커 개발에 도움이 될 것이다.

암은 전 세계적으로 사망률 1-2 위를 차지하는 질환이며, 이 중 소화기암은 우리나라 전체 암 발생빈도의 45% 정도를 차지하고 있으며, 우리나라에서 위암은 암으로 인한 사망원인 중 높은 위치를 차지하고 있다. 소화기암은 근치적 절제만이 완치를 이룰 수 있으나 위암의 경우 진단 당시 20%의 환자가 근치적 절제가 불가능한 진행성 위암으로 판정되고 절제 후 재발한 환자 및 근치적 절제 후 수술후 보조항암치료 환자까지 포함하면 84% 이상의 위암 환자가 항암 약물치료의 대상이다. 그러나 기존 약제가 반응율이 높더라도 궁극적으로 환자의 생명연장에 의미있는 기여를 하지 못하는 이유는, 종양을 구성하는 암세포의 대부분에는 항암효과를 나타내어 종양의 크기를 감소시키는 데에는 기여하나, 궁극적으로 이런 항암 치료에도 생존해 있는 암 줄기세포 및 암 줄기세포 유래 항암제 내성 암세포까지는 표적화시키지 못함에 기인한 것으로 생각되고 있다. 이러한 암 줄기세포(cancer stem cell or cancer initiating cells)는 자가 재생(self renewal) 및 분화(differentiation), 분열(proliferation) 등 줄기세포의 특징을 가지고 있으며, 암 줄기세포의 존재는 유방암(M. Al-Hajj et al., Proc Natl Acad Sci USA.: 100(7), 3983-3988, 2003), 간암(ZF Yang et al., Cancer cell . 13, 153-166, 2008), 대장암(P. Dalerba et al., Proc Natl Acad Sci USA. 104(24), 10158-63, 2007), 췌장암(C. Li et al. Cancer Res. 67(3) 1030-1037, 2007) 등 다양한 암에서 이미 확인된 바 있다. 이들 암 줄기세포는 암의 최초 시작 및 암 치료 후에도 생존해 있다가 다시 암세포를 재생하는데 관여함으로써 암의 재발이나 전이 및 항암치료 내성 유발에 깊은 영향을 미친다고 알려져 있으며(BB Zhou et al., 8, 806-823, 2009), 인 비트로에서 부유 배양 시 스피어(sphere)를 형성하게 되고, 스피어 배양으로 얻은 세포는 원 세포주에 비해 강력한 암 형성 능력을 가진다고 보고된 바 있다(A. Dubrovska et al., Proc Natl Acad Sci USA. 106, 268-273, 2009). 따라서 항생제 내성 종양인 위암을 근본적으로 치료하기 위해서는, 기존의 암 치료와 더불어 암 조직의 일부만 차지하면서도 암의 발병과 유지, 신생혈관형성, 항암제 내성 및 재발에 핵심 구실을 하는 암 줄기세포에 초점을 맞춰야 한다.

본 발명에서는 암 줄기세포 특성을 가지는 스피어 세포를 배양하여 위암에서 암 줄기세포의 특성을 분석하고, 스피어 세포에서 cDNA 어레이를 통하여 위암 암 줄기세포 특이 표지자를 규명함으로써 조기진단 마커, 새로운 항암제 또는 기존 항암제에 내성을 보이는 위암을 치료하기 위한 암 줄기세포 특이 새로운 항암치료법을 개발하고자 한다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명은 위암 암 줄기세포 특성에 기초한 위암의 치료용 타겟 및 위암 암 줄기세포에 대한 신규 바이오마커를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 위암 암 줄기세포에서 특이적으로 발현되는 단백질들이 위암 치료용 분자 타겟이 될 수 있음을 발견하였다. 더불어, 본 발명자들은 발굴된 바이오 마커들이 위암 암 줄기세포 생물학적 특성에 근거한 진단, 특히 조기 진단할 수 있고, 예후를 판정할 수 있는 마커 및 향후 치료표적에 사용할 수 있는 표지자임을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 위암 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 암 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 위암 암 줄기세포 특이 바이오마커 검출용 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 암 줄기세포 특이 바이오마커 검출용 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 위암의 진단 또는 예후 분석용 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 암의 진단 또는 예후 분석용 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 위암 항암신약 개발을 위한 치료용 물질의 표적을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 암 항암신약 개발을 위한 치료용 물질의 표적을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 위암 예방, 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다:

(a) 서열목록 제1서열의 단백질, 서열목록 제3서열의 단백질, 서열목록 제5서열의 단백질, 서열목록 제7서열의 단백질 및 서열목록 제9서열의 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질 또는 서열목록 제2서열의 폴리뉴클레오타이드, 서열목록 제4서열의 폴리뉴클레오타이드, 서열목록 제6서열의 폴리뉴클레오타이드, 서열목록 제8서열의 폴리뉴클레오타이드 및 서열목록 제10서열의 폴리뉴클레오타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포 또는 조직에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; 및

(b) 상기 단계 (a)에서의 상기 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드의 발현량을 측정하는 단계로서, 상기 시료가 상기 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드의 발현을 감소시키는 경우에는 상기 시료는 위암의 예방, 또는 치료용 물질로 판정된다.

본 발명자들은 위암 암 줄기세포 특성에 기초한 위암의 치료용 타겟 및 위암 암 줄기세포에 대한 신규 바이오마커를 발굴하고자 예의 연구 노력하였으며, 그 결과, 위암 암 줄기세포에서 특이적으로 발현되는 단백질들이 위암 치료용 분자 타겟이 될 수 있음을 발견하였다. 더불어, 본 발명자들은 발굴된 바이오 마커들이 위암 암 줄기세포를 진단, 특히 위암을 조기 진단할 수 있고, 예후를 판정할 수 있는 마커임을 규명하였다.

본 발명은 위암 세포주로부터 분리된 위암 암 줄기세포로부터 특이적으로 발현하는 단백질을 동정하고 이들이 위암 치료 타겟이 될 수 있고, 위암을 조기에 매우 정확하게 진단 및 예후를 분석할 수 있는 특징을 가진다.

본 발명의 상기 5개 마커는 위암 암 줄기세포에서 특이적으로 발현된다. 더욱이, 상기 5개 마커는 위암 세포와 위암 암 줄기세포를 구별할 수 있는 능력, 즉 위암 세포와 비교하여 위암 암 줄기세포에서 고발현되는 발현 패턴을 나타내는 마커이다.

본 발명에서 위암 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝을 위하여 사용되는 표현“세포 또는 조직”은 암 줄기세포 또는 암 조직이며, 바람직하게는 위암 암 줄기세포 또는 위암 조직이다.

본 발명자들은 상기 단백질들로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질 또는 이들을 코딩하는 각각의 폴리뉴클레오타이드의 경우, 일반 위암세포와 달리 위암 암 줄기세포 내에서 그 발현이 현저히 증가한다는 사실을 발견하였다. 일반 위암세포와는 달리 위암 암 줄기세포 내에서 타겟 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 발현이 특이적으로 현저하게 증가한다는 것은 그것이 암 줄기세포의 생존에 있어 필수적인 요소임을 지시하며, 이의 발현을 차단하는 물질은 암 줄기세포의 성장 억제 및 사멸을 유도함으로써 위암의 근본적 치료에 도움이 되는 물질, 즉 위암 치료제로 판정된다.

상기 단계 (a)에서 사용되는 시료는 단일 화합물 또는 화합물들의 혼합물(예컨대, 천연 추출물 또는 세포 또는 조직 배양물)이다. 시험 물질은 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 이러한 화합물의 라이브러리를 얻는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 합성 화합물 라이브러리는 Maybridge Chemical Co.(UK), Comgenex(USA), Brandon Associates(USA), Microsource(USA) 및 Sigma-Aldrich(USA)에서 상업적으로 구입 가능하며, 천연 화합물의 라이브러리는 Pan Laboratories(USA) 및 MycoSearch(USA)에서 상업적으로 구입 가능하다. 시료는 당업계에 공지된 다양한 조합 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있으며, 예를 들어, 생물학적 라이브러리, 공간 어드레서블 패러럴 고상 또는 액상 라이브러리(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries), 디컨볼루션이 요구되는 합성 라이브러리 방법, “1-비드 1-화합물” 라이브러리 방법, 그리고 친화성 크로마토그래피 선별을 이용하는 합성 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있다. 분자 라이브러리의 합성 방법은, DeWitt et al., Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 90, 6909, 1993; Erb et al. Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 91, 11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med. Chem . 37, 2678, 1994; Cho et al., Science 261, 1303, 1993; Carell et al., Angew . Chem . Int. Ed . Engl . 33, 2059, 1994; Carell et al., Angew . Chem . Int . Ed . Engl . 33, 2061; Gallop et al., J. Med . Chem . 37, 1233, 1994 등에 개시되어 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 다음의 단계를 포함하는 위암 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다:

(a) 서열목록 제1서열의 단백질, 서열목록 제3서열의 단백질, 서열목록 제5서열의 단백질, 서열목록 제7서열의 단백질 및 서열목록 제9서열의 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질을 준비하는 단계;

(b) 상기 단백질에 시험 물질을 접촉시키는 단계; 및

(c) 상기 시험 물질이 상기 단백질에 결합하는지 여부 또는 시험물질이 상기 단백질의 기능을 억제하는지 여부를 분석하는 단계; 상기 시험물질이 상기 단백질에 결합하거나 또는 단백질의 기능을 억제하면 위암의 예방 또는 치료용 물질로 판정된다.

본 발명의 스크리닝 방법에 따르면, 서열목록 제1서열의 단백질, 서열목록 제3서열의 단백질, 서열목록 제5서열의 단백질, 서열목록 제7서열의 단백질 및 서열목록 제9서열의 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질과 시험 물질을 접촉시킨다.

본 발명에서 이용되는 단백질은 세포 표면에 전시(displaying)되어 있는 형태, 바이러스(예컨대, 박테리오파아지) 표면에 전시되어 있는 형태, 분리된(isolated) 형태 또는 정제된(purified) 형태일 수 있다.

세포 표면 또는 바이러스 표면에 전시되어 있는 단백질을 이용하는 경우, 스크리닝의 신속화 또는 자동화를 위하여 상기 세포 또는 바이러스는 고상의 기질에 고정화시키는 것이 바람직하다. 또한, 분리된(isolated) 또는 정제된(purified) 형태의 단백질도 고상의 기질에 고정화시키는 것이 바람직하다. 기질로서 이용가능 한 것은, 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 것도 가능하며, 예를 들어, 폴리스틸렌과 폴리프로필렌과 같은 탄화수소 폴리머, 유리, 금속 및 젤을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 고상의 기질은 딥스틱, 마이크로타이터 플레이트, 입자(예컨대, 비드), 친화성 컬럼 및 면역블롯 막(예컨대, 폴리비닐리덴 플루오라이드 막)의 형태로 제공될 수 있다(참조: 미국 특허 제5,143,825호, 제5,374,530호, 제4,908,305호 및 제5,498,551호). 가장 바람직하게는, 상기 고상 기질은 마이크로타이터 플레이트이다.

본 발명의 스크리닝 방법은 다양한 방식으로 실시할 수 있으며, 특히 당업계에 공지된 다양한 결합 분석(binding assay)에 따라 고속(high throughput) 방식으로 실시할 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법에 있어서, 시험물질 또는 상기 단백질들은 검출가능한 표지(detectable label)로 레이블링 될 수 있다. 예를 들어, 상기 검출가능한 표지(detectable label)는, 화학적 표지(예컨대, 바이오틴), 효소 표지(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제, 알칼린 포스파타아제, 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제, β-갈락토시다아제 및 β-글루코시다아제), 방사능 표지(예컨대, C¹⁴, I¹²⁵, P³² 및 S³⁵), 형광 표지[예컨대, 쿠마린, 플루오레세인, FITC(fluoresein Isothiocyanate), 로다민 6G(rhodamine 6G), 로다민 B(rhodamine B), TAMRA(6-carboxy-tetramethyl-rhodamine), Cy-3, Cy-5, Texas Red, Alexa Fluor, DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole), HEX, TET, Dabsyl 및 FAM], 발광 표지, 화학발광(chemiluminescent) 표지, FRET(fluorescence resonance energy transfer) 표지 또는 금속 표지(예컨대, 금 및 은)이다.

검출가능한 표지가 레이블링된 단백질 또는 시험물질을 이용하는 경우, 단백질과 시험물질 사이의 결합 발생 여부는 표지로부터 나오는 시그널을 검출하여 분석할 수 있다. 예를 들어, 표지로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질을 이용하여 시그널을 검출한다. 표지로서 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌와 같은 기질을 이용하여 시그널을 검출한다.

택일적으로, 시험물질의 단백질로의 결합 여부는 상호작용물(interactants)의 레이블링 없이 분석할 수도 있다. 예를 들어, 마이크로피지오미터(microphysiometer)를 이용하여 시험물질이 QP-C에 결합하는 지 여부를 분석할 수 있다. 마이크로피지오미터는 LAPS(light-addressable potentiometric sensor)를 이용하여 셀이 그의 환경을 산성화하는 속도를 측정하는 분석 도구이다. 산성화 속도의 변화는, 시험물질과 QP-C 사이의 결합에 대한 지시자(indicator)로 이용될 수 있다(McConnell et al., Science 257:19061912(1992)).

시험물질의 단백질과의 결합 능력은 실시간 이분자 상호작용 분석(BIA)를 이용하여 분석할 수 있다(Sjolander & Urbaniczky, Anal . Chem . 63:23382345(1991), and Szabo et al., Curr . Opin . Struct. Biol . 5:699705(1995)). BIA는 실시간으로 특이적 상호작용을 분석하는 기술로서, 상호작용물(interactants)의 레이블링 없이 실시할 수 있다(예컨대, BIAcore™). 표면 플라즈몬 공명(SPR)에서의 변화는 분자들 사이의 실시간 반응에 대한 지시자(indicator)로 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 스크리닝 방법은, 투-하이브리드 분석 또는 쓰리-하이브리드 분석 방법에 따라 실시할 수 있다(U.S. Pat. No. 5,283,317; Zervos et al., Cell 72, 223232, 1993; Madura et al., J. Biol . Chem . 268, 1204612054, 1993; Bartel et al., BioTechniques 14, 920924, 1993; Iwabuchi et al., Oncogene 8, 16931696, 1993; 및 W0 94/10300). 이 경우, 상기 단백질을 베이트(bait) 단백질로 이용할 수 있다. 이 방법에 따르면, 상기 단백질에 결합하는 물질, 특히 단백질을 스크리닝 할 수 있다. 투-하이브리드 시스템은 분할 가능한 DNA-결합 및 활성화 도메인으로 구성된 전사인자의 모듈 특성에 기초한다. 간단하게는, 이 분석 방법은 두 가지 DNA 컨스트럭트를 이용한다. 예컨대, 하나의 컨스트럭트에서, 서열목록 제2서열의 폴리뉴클레오타이드, 서열목록 제4서열의 폴리뉴클레오타이드, 서열목록 제6서열의폴리뉴클레오타이드, 서열목록 제8서열의 폴리뉴클레오타이드 및 서열목록 제10서열의 폴리뉴클레오타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드를 공지의 전사 인자(예컨대, GAL-4)의 DNA 결합 도메인-코딩 폴리뉴클레오타이드에 융합시킨다. 다른 컨스트럭트에서, 분석 대상의 단백질(“프레이” 또는 “시료”)을 코딩하는 DNA 서열을 상기 공지의 전사인자의 활성화 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 융합시킨다. 만일, 베이트 및 프레이가 인 비보에서 상호작용하여 복합체를 형성하면, 전사인자의 DNA-결합 및 활성화 도메인이 인접하게 되며, 이는 리포터 유전자(예컨대, LacZ)의 전사를 촉발하게 된다. 리포터 유전자의 발현을 검출할 수 있으며, 이는 분석 대상의 단백질이 상기 단백질과 결합할 수 있음을 나타내는 것이며, 결론적으로 위암의 예방 또는 치료용 물질로 이용될 수 있음을 나타내는 것이다.

본 발명에서 이용되는 시료는 상술한 단일 화합물 또는 화합물들의 혼합물 이외에, 펩타이드, 항체, 펩타이드 앱타머, 어드넥틴(AdNectin), 어피바디(affibody, 미국 특허 제5,831,012호), 아비머(Avimer, Silverman, J. et al, Nature Biotechnology 23(12):1556(2005)) 또는 쿠니쯔 도메인(Kunitz domain, Arnoux B et al., Acta Crystallogr . D Biol . Crystallogr . 58(Pt 7):12524(2002)) 및 Nixon, AE, Current opinion in drug discovery & development 9(2):2618(2006))을 포함한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 암 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다:

(a) 서열목록 제3서열의 단백질 또는 서열목록 제4서열의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포 또는 조직에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; 및

(b) 상기 단계 (a)에서의 상기 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드의 발현량을 측정하는 단계로서, 상기 시료가 상기 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드의 발현을 감소시키는 경우에는 상기 시료는 암의 예방 또는 치료용 물질로 판정된다.

본 발명에서 암 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝을 위하여 사용되는 표현“세포 또는 조직”은 암 줄기세포 또는 암 조직이며, 바람직하게는 위암 암 줄기세포 또는 위암 조직이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 암 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다:

(a) 서열목록 제3서열의 단백질을 준비하는 단계;

(b) 상기 단백질에 분석하고자 하는 시험물질을 접촉시키는 단계; 및

(c) 상기 시험 물질이 상기 단백질에 결합하는지 여부 또는 시험물질이 상기 단백질의 기능을 억제하는 지 여부를 분석하는 단계; 상기 시험물질이 상기 단백질에 결합하거나 또는 단백질의 기능을 억제하면 암의 예방 또는 치료용 물질로 판정된다.

상기 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 동정되는 암 치료제는 암 조직의 대부분을 차지하는 일반 암세포만를 타겟으로 하는 것이 아니라, 암 조직의 극히 일부만 차지하면서도 암의 발병과 유지, 재발에 핵심 구실을 하는 암 또는 암 줄기세포를 그 타겟으로 하므로, 암 또는 암의 근본적인 치료를 가능하게 한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열의 단백질, 서열목록 제3서열의 단백질, 서열목록 제5서열의 단백질, 서열목록 제7서열의 단백질 및 서열목록 제9서열의 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질에 특이적으로 결합하는 결합제 또는 서열목록 제2서열의 폴리뉴클레오타이드, 서열목록 제4서열의 폴리뉴클레오타이드, 서열목록 제6서열의폴리뉴클레오타이드, 서열목록 제8서열의 폴리뉴클레오타이드 및 서열목록 제10서열의 폴리뉴클레오타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 위암 암 줄기세포 검출용 키트를 제공한다.

본 발명에서 단백질에 특이적으로 결합하는 결합제는 예를 들어, 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 또는 앱타머(aptamer)이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 서열목록 제1서열의 단백질, 서열목록 제3서열의 단백질, 서열목록 제5서열의 단백질, 서열목록 제7서열의 단백질 및 서열목록 제9서열의 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질에 특이적으로 결합하는 결합제 또는 서열목록 제2서열의 폴리뉴클레오타이드, 서열목록 제4서열의 폴리뉴클레오타이드, 서열목록 제6서열의 폴리뉴클레오타이드, 서열목록 제8서열의 폴리뉴클레오타이드 및 서열목록 제10서열의 폴리뉴클레오타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 위암 진단 또는 예후 분석용 키트를 제공한다.

특히, 본 발명의 위암 진단 또는 예후 분석용 키트는 위암 암 줄기세포에 의해 유래되는 위암 진단 또는 예후 분석용 키트이다.

본 명세서에서 표현 “위암 진단 또는 예후 분석용 키트”는 위암의 진단 또는 예후 분석용 조성물이 포함된 키트를 의미한다. 따라서, 상기 표현 “위암의 진단 또는 예후 분석용 키트”는 “위암의 진단 또는 예후 분석용 조성물”과 서로 교차 또는 혼용하여 사용이 가능하다.

본 명세서에서 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정, 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.

본 발명에서 용어 “위암(gastric cancer)”이란 일반적으로 위 세포에서 기원하는 암을 의미한다. 위암은 위산이 적게 분비되어, 살균력이 감소하고 장내 세균들이 증가하여 니트로소 화합물을 많이 생성하는 것이 주원인으로, 위가 시작되는 부분인 분문부에서 십이지장으로 이행되며 위가 끝나는 유문부사이 어느 곳에서든 발생할 수 있다. 위의 점막 세포에서 발생한 암세포는 점막, 점막하층, 근육층 및 장막층을 따라서 깊이 파고들며 심하면 위벽을 뚫어 주위에 있는 다른 장기까지 침범하게 된다. 위암의 정확한 원인은 다른 암종에 있어서와 마찬가지로 아직 정확히 밝혀지지는 않았으나, 위암 발생을 높이는 위험 요인의 식품으로는 염장 또는 훈제식품, 질산, 아질산 염 가공식품이나 그 함량이 높은 채소류 또는 식수, 그리고 맵고 짠 음식 등이며, 또 위점막내 헬리코박터 파이로라는 세균의 감염이 위암의 위험인자로 알려져 있다. 특히, 위암은 초기에 아무런 증상이 없어, 조기발견이 어려울 뿐만 아니라, 증상이 상복부 불쾌감, 동통, 식사 후 소화 불량, 식후 팽만감, 식욕 부진 등으로 급, 만성 위염이나 십이지장, 위궤양의 증세 등 우리나라 사람들에 흔한 질환의 증상과 유사하여 조기발견이 더욱 어렵다.

본 발명자들은 본 발명의 마커를 사용하면, 개체로부터 위암의 발병여부에 대해 민감도 및 신뢰도가 높은 결과를 얻을 수 있음을 확인하였다.

본 발명에서 위암을 진단하는데 있어서 사용되는 표현 “단백질 발현수준 측정”은 생물학적 시료에서 상기 유전자들로부터 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 바람직하게는, 상기 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인하는 것을 의미한다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 상기 예에 의해 본 발명의 분석방법이 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 단백질에 특이적으로 결합하는 결합제는 예를 들어, 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 또는 앱타머(aptamer)이다.

본 발명에서 “항체”란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.

상기한 바와 같이 새로운 위암 마커 단백질이 규명되었으므로, 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.

다클론 항체는 상기한 위암 마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.

단일클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein (1976) European Journal of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol . Biol ., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전지영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다.

또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

본 발명에서 효소의 활성형에 결합하는 앱타머는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 Bock LC et al., Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K “Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine”. J Mol Med . 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R . “An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library”. Proc Natl Acad Sci USA . 95(24):142727(1998)에 상세하게 개시되어 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 위암 암 줄기세포 및/또는 위암을 진단하기 위하여 상기 단백질군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질과 각각 특이적으로 결합하는 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 또는 앱타머(aptamer)을 포함하며, 보다 바람직하게는 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 또는 키메릭 항체이고, 보다 더 바람직하게는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체이며, 가장 바람직하게는 모노클로날 항체이다.

본 발명에서, 상기 항체는 미소입자(micro particle)와 접합된 항체(conjugated antibody)인 것이 바람직하다. 또한 상기 미소입자는 착색된 라텍스(colored latex) 또는 콜로이드성 금 입자(colloidal gold particle)인 것이 바람직하다. 본 발명에서, 상기 항체는 상기 서술한 20개의 마커에 대한 공지의 mRNA 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있는 어떠한 항체도 될 수 있으나, 바람직하게는, 상기 키트는 면역분석(immunoassay)용 키트이며, 가장 바람직하게는 상기 키트는 루미넥스 분석 키트, 단백질 마이크로어레이 키트 또는 ELISA 키트이다.

상기 루미넥스 어세이 키트, 단백질 마이크로어레이 키트 및 엘라이자 키트는 상기 단백질군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 단백질에 대한 다클론 항체 및 단일클론 항체, 그리고 표지물질이 결합된 상기 다클론 항체와 단일클론 항체에 대한 2차 항체를 포함한다.

본 발명에서 키트의 종류의 예로는 면역크로마토그래피 스트립 키트, 루미넥스 어세이 키트, 단백질 마이크로어레이 키트, 엘라이자 키트, 또는 면역학적 도트 키트등이 있으나, 상기 예에 의해 본 발명에서 사용 가능한 키트의 종류가 제한되는 것은 아니다.

상기 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 추가적으로 포함할 수 있다. ELISA 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단일클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

또한, 상기 키트는 복합마커를 동시에 분석하기 위하여 단백질 마이크로어레이를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 추가적으로 포함할 수 있다. 마이크로어레이 키트는 고체상에 결합된 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단일클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 단백질 마이크로어레이 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 단백질 마이크로어레이 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단, 효소(예: 항체와 융합됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 단백질 마이크로어레이를 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여, 위암 진단에 필요한 정보를 제공할 수 있다.

루미넥스 어세이(Luminex Assay)는 소량(10-20 ㎕)의 환자 시료를 전 처리하지 않은 상태에서 최대 100종류의 어낼라이트(analyte)를 동시에 측정할 수 있는 고용량(high-throughput) 정량분석방법으로서 감도가 좋고(pg 단위), 빠른 시간내에 정량이 가능하여(3-4시간), 기존의 엘라이자(ELISA)나 엘리스팟(ELISPOT)을 대체할 수 있는 분석방법이다. 상기 루미넥스 어세이(Luminex Assay)는 96-웰 플레이트(well plate)에 있는 각각의 웰에서 100가지 이상의 생물학적 시료를 동시에 분석할 수 있는 멀티플렉스 형광 마이크로플레이트(multiplexed fluorescent microplate) 분석방법으로 두 종류의 레이져 감지기(laser detector)를 사용하여 실시간으로 신호전달을 진행시킴으로 100개 이상의 다른 색깔 군의 폴리스티렌 비드(polystyrene bead)를 구별하여 정량한다. 상기 100개의 비드는 다음과 같은 방법으로 구별되도록 구성된다. 한쪽은 붉은 형광 비드(red fluorescence bead)가 열 단계 이상으로 나뉘어 있고, 다른 한 쪽은 오렌지 형광 비드(orange fluorescence bead)가 열 단계로 나뉘어 강도(intensity)의 차이를 보이며 그 사이의 비드(bead)들은 레드(red)와 오렌지(orange)의 비율(ratio)이 각각 다른 비율로 섞여 있어 전체적으로 100개의 색-코드 비드 세트(color-coded bead set)를 구성하고 있다. 또한 각각의 비드에는 분석하고자 하는 단백질의 항체가 부착되어 있어 이를 이용한 면역항체반응으로 단백질 정량이 가능하다. 이 시료는 두개의 레이저(laser)를 사용하여 분석하는데, 하나의 레이저(laser)는 비드(bead)를 감지(detection)하여 비드 고유번호를 알아내고, 다른 레이저는 비드에 붙어 있는 항체와 반응한 시료 속의 단백질을 감지하게 된다. 따라서 한 웰에서 동시에 100가지의 생체 내 단백질 분석이 가능하다. 이 분석은 15 ㎕ 정도의 적은 시료로도 감지가 가능한 장점이 있다.

본 발명의 루미넥스(Luminex) 어세이를 수행할 수 있는 루미넥스(Luminex) 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단일클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 루미넥스 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 루미넥스 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단, 효소(예: 항체와 접합됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 상기 항체는 미소입자(micro particle)와 접합된 항체(conjugated antibody)일 수 있으며, 또한 상기 미소입자는 착색된 라텍스(colored latex) 또는 콜로이드성 금 입자(colloidal gold particle)일 수 있다.

본 발명의 위암 진단 또는 예후 분석용 키트에서, 상기 위암 진단용 면역크로마토그래피 스트립을 포함하는 위암 진단 키트는, 5분내 분석결과를 알 수 있는 래피드 테스트(Rapid test)를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. 상기 면역크로마토그래피 스트립은 (a) 시료가 흡수되는 샘플패드(sample pad); (b) 시료 내의 상기 20개의 유전자 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 단백질과 결합하는 결합 패드(conjugate pad); (c) 상기 20개의 유전자 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 단백질에 대한 단일클론 항체를 포함하는 반응선(test line) 및 대조선(control line)이 처리되어 있는 반응 막(test membrane); (d) 잔량의 시료가 흡수되는 흡수패드(absorption pad); 및 (e) 지지체를 포함하는 것이 바람직하다. 또한 면역크로마토그래피 스트립(Immunochromatographic strip)을 포함하는 래피드 테스트 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 상기 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단일클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 래피드 테스트 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 래피드 테스트 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 특이항체와 2차 항체가 고정된 나이트로셀룰로오스 멤브레인, 항체가 결합된 비드에 결합된 멤브레인, 흡수 패드와 샘플 패드 등 진단에 필요한 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

본 발명에서 면역학적 도트 어세이에 의한 단백질 발현 수준의 측정은 (a) 막에 생물학적 시료를 점적(dotting)하는 단계; (b) 상기 20 개의 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 단백질에 특이적인 항체를 상기 점적된 막에 반응시키는 단계; 및 (c) 상기 반응시킨 막에 표시체가 접합된 2차 항체를 첨가하고 발색시키는 단계를 포함하는 것이 바람직하고, 상기 엘라이자 어세이는 (a) 상기 20개의 마커에 대한 염기서열을 갖는 유전자 군에서 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 단백질에 특이적인 항체 1을 고상체에 흡착시키는 단계; (b) 상기 고상체에 흡착된 항체 1과 위암 의심 환자의 생물학적 시료를 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성하는 단계; (c) 표지물질이 결합된 상기 20개의 마커에 대한 염기서열을 갖는 유전자 군에서 선택된 1개 이상의 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 특이적인 항체 2를 처리하여 상기 복합체와 결합시키는 단계; 및 (d) 상기 표지물질을 검출하여 단백질의 농도를 측정하는 단계를 포함하는 샌드위치 엘라이자 어세이인 것이 바람직하며, 상기 단백질 마이크로어레이 어세이는 (a) 상기 20개의 마커로 구성된 유전자 군에서 선택된 1개 이상의 유전자의 단백질에 특이적인 다클론 항체를 칩에 고정시키는 단계; (b) 상기 고정된 다클론 항체 1을 위암 의심 환자의 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성하는 단계; (c) 표지물질이 결합된 상기 20개의 마커에 대한 염기서열을 갖는 유전자 군에서 선택된 어느 하나 이상의 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 특이적인 단일클론 항체를 처리하여 상기 복합체와 결합시키는 단계; 및 (d) 상기 표지물질을 검출하여 단백질의 농도를 측정하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.

상기 분석 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 항원-항체 복합체의 형성량과 위암 의심 환자에서의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, 위암 마커 유전자에서 단백질로의 유의한 발현량의 증가 여부를 판단하여, 위암 의심 환자의 실제 위암 발병 여부를 진단할 수 있다.

본 발명에서 용어 “항원-항체 복합체”란 위암 마커 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.

이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자 (microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4 W(CN)8 , [Os(bpy) 3 ] 2+ ,[RU(bpy) 3 ] 2+, [MO(CN) 8 ] 4- 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I , 186Re 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다.

단백질 발현수준 측정은 바람직하게는, ELISA법을 이용하는 것이다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 보다 바람직하게는, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출한다. 위암 마커 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여, 위암 발병 여부를 확인할 수 있다.

또한, 바람직하게는, 상기 위암 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 이용하는 것이다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀루로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 유전자의 발현에 의해 생성된 단백질의 양을 확인하여, 위암 발병 여부를 확인할 수 있다. 상기 검출 방법은 대조군에서의 마커 유전자의 발현량과 위암이 발병한 세포에서의 마커 유전자의 발현량을 조사하는 방법으로 이루어진다. mRNA 또는 단백질 수준은 상기한 마커 단백질의 절대적(예: ㎍/㎖) 또는 상대적(예: 시그널의 상대 강도) 차이로 나타낼 수 있다.

또한, 바람직하게는, 상기 위암 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 면역조직 염색을 실시하는 것이다. 정상 위 조직 및 위암으로 의심되는 조직을 채취 및 고정한 후, 당업계에서 널리 공지된 방법으로 파라핀 포매 블록을 제조한다. 이들을 수 ㎛ 두께의 절편으로 만들어 유리 슬라이드에 붙인 후, 이와 상기의 항체 중 선택된 1개와 공지의 방법에 의하여 반응시킨다. 이후, 반응하지 못한 항체는 세척하고, 상기에 언급한 검출라벨 중의 하나로 표지하여 현미경 상에서 항체의 표지 여부를 판독한다.

또한, 바람직하게는, 상기 위암 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용하는 것이다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여 위암 발병 여부를 확인할 수 있다.

본 발명에서의 생물학적 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 또는 뇨를 의미하고, 바람직하게는 혈액 또는 혈청을 의미하며, 가장 바람직하게는 혈청을 의미한다.

본 발명에서 위암을 진단하기 위하여 사용되는 표현“폴리뉴클레오타이드 측정”은 생물학적 시료에서 본원 발명의 단백질 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 폴리뉴클레오타이드의 양을 측정하는 것을 의미한다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블럿팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 마커로 사용되는 상기 단백질군으로부터 선택되는 각각의 단백질 마커를 코딩하는 염기서열은, 이들 서열과 상동성을 갖는 염기서열을 포함할 수 있다.

바람직하게는, 본 발명에서의 폴리뉴클레오타이드는 DNA 또는 mRNA의 단편을 의미한다.

본 발명의 진단용 키트에서 이용되는 프로브 또는 프라이머는 상기 각각의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열 및 폴리뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는다.

본 발명의 “프라이머”는 짧은 자유 3말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명의 프라이머는, 각 마커 유전자 특이적인 프라이머로 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산이다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다.

본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 또한 검출 가능한 시그널을 직접 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 표지의 예로는 방사성 동위원소, 형광성 분자, 바이오틴 등이 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 “프로브”는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타깃 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화 할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다. 본 발명의 프로브는 바람직하게는 단일쇄이며, 올리고디옥시리보뉴클레오타이드이다.

프로브를 이용하는 경우, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시킨다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 상기 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0.5 M NaHPO₄, 7% SDS(sodium dodecyl sulfate), 1 mM EDTA에서 65℃ 조건으로 혼성화하고, 0.1 x SSC(standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 또는, 고 엄격조건은 6 x SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 저 엄격조건은 예를 들어, 0.2 x SSC/0.1% SDS에서 42℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 서열목록 제3서열의 단백질에 특이적으로 결합하는 결합제 또는 서열목록 제4서열의 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 암 줄기세포 검출용 키트를 제공한다.

상기 암은 예를 들어, 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 대장암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 두경부암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암 및 요관암을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 서열목록 제1서열의 단백질, 서열목록 제3서열의 단백질, 서열목록 제5서열의 단백질, 서열목록 제7서열의 단백질 및 서열목록 제9서열의 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질에 특이적으로 결합하는 결합제 또는 서열목록 제2서열의 폴리뉴클레오타이드, 서열목록 제4서열의 폴리뉴클레오타이드, 서열목록 제6서열의폴리뉴클레오타이드, 서열목록 제8서열의 폴리뉴클레오타이드 및 서열목록 제10서열의 폴리뉴클레오타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 위암 진단 또는 예후 분석용 키트를 제공한다.

본 명세서에서 표현 “위암 진단 또는 예후 분석용 키트”는 위암의 진단 또는 예후 분석용 조성물이 포함된 키트를 의미한다. 따라서, 상기 표현 “위암의 진단 또는 예후 분석용 키트”는 “위암의 진단 또는 예후 분석용 조성물”과 서로 교차 또는 혼용하여 사용이 가능하다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 서열목록 제3서열의 단백질에 특이적으로 결합하는 결합제 또는 서열목록 제4서열의 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 암 진단 또는 예후 분석용 키트를 제공한다.

본 명세서에서 표현 “암 진단 또는 예후 분석용 키트”는 암의 진단 또는 예후 분석용 조성물이 포함된 키트를 의미한다. 따라서, 상기 표현 “암의 진단 또는 예후 분석용 키트”는 “암의 진단 또는 예후 분석용 조성물”과 서로 교차 또는 혼용하여 사용이 가능하다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 위암 암 줄기세포 및 위암에 대한 신규한 분자 마커를 이용하여 위암 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

(ⅱ) 본 발명은 암 줄기세포 및 암에 대한 신규한 분자 마커를 이용하여 위암 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

(ⅲ) 본 발명의 위암 또는 암 치료제 타겟은 위암 암 줄기세포 또는 암 줄기세포에 특이적으로 작용하는 치료제 후보물질을 스크리닝 하는 데 매우 유용하다.

(ⅳ) 또한, 본 발명을 이용하면 위암 또는 암의 진단 및 예후를 정확하게 분석할 수 있다.

도 1은 11종의 인체 위암 세포주 중에서 스피어를 형성하는 세포주를 나타낸 그림이다.
도 2는 위암 세포주 N87의 접착세포 및 스피어 세포에서 줄기세포 관련 유전자 발현변화를 나타낸 그림이다. RT-PCR 데이터는 베타액틴(Beta-actin) 유전자의 mRNA 수준에 맞추어 표준화하였다.
도 3은 N87 및 SNU484 세포로부터 배양한 스피어 세포에서 위암 암 줄기세포 관련 신규 표지자들의 유전자 발현변화를 나타낸 그림이다. RT-PCR 데이터는 베타액틴(Beta-actin) 유전자의 mRNA 수준에 맞추어 표준화하였다.
도 4는 인체 위암 환자의 조직 TMA에서 위암 암 줄기세포 관련 신규 표지자들의 발현변화를 면역조직 화학염색을 통하여 나타낸 그림이다.(10 X 10 배율).
(a) 항-ABCA5 항체, (b) 항-LINGO2 항체, (c) 항-LGR4 항체, (d) 항-LRRN3 항체, (e) 항-Ero1L 항체
도 5는 인체 위암 환자의 조직 TMA에서 위암 암 줄기세포 관련 신규 표지자들의 발현변화를 면역조직 화학염색을 통하여 나타낸 그림이다(40 X 10 배율).
(a) 항-ABCA5 항체, (b) 항-LINGO2 항체, (c) 항-LGR4 항체, (d) 항-LRRN3 항체, (e) 항-Ero1L 항체
도 6은 정상 배지에서 배양된 인체 위암 세포주 N87 및 SNU484세포를 ABCA5, LINGO2, LGR4 및 LRRN3 항체를 이용하여 간접 FACS 염색 후 세포 분류를 나타낸 그림이다.
(a) 항-ABCA5 항체를 이용하여 분류한 세포, (b) 항-LINGO2 항체를 이용하여 분류한 세포, (c) 항-LGR4 항체를 이용하여 분류한 세포, (d) 항-LRRN3 항체를 이용하여 분류한 세포
도 7은 각 표지자 항체에 의해 분리된 세포들의 암 줄기세포 특성을 웨스턴 블랏을 통해 나타낸 그림이다. 데이터는 GAPDH 단백질의 발현 수준에 맞추어 표준화하였다.
도 8은 각 표지자 항체에 의해 분리된 세포들의 암 줄기세포 특성을 집락형성 분석법(clonogenic assay)을 통해 나타낸 그림이다.
(a) 항-ABCA5 항체를 이용하여 분류한 세포, (b) 항-LINGO2 항체를 이용하여 분류한 세포, (c) 항-LGR4 항체를 이용하여 분류한 세포
도 9는 LGR4를 발현하는 세포를 면역제어 마우스(NOD-SCID)에 피하주사하고 10주간 관찰한 후 해부하여 면역염색을 수행한 그림이다.
(a) 종양크기 비교, (b) H & E 염색을 통한 병리 조직학적 형태 확인
도 10는 LINGO2를 발현하는 세포를 면역제어 마우스(NOD-SCID)의 양 옆구리에 피하주사하고 15주간 관찰한 후 해부하여 면역염색을 수행한 그림이다.
(a) 피하주사 후 시간에 따른 종양크기 변화, (b) 피하주사 세포 수에 따른 종양크기 차이, (c) 항-CD34 항체 또는 항-pVEGFR2 항체를 이용하여 면역염색.
도 11은 AGS, N87, SNU1, SNU5, SNU16, SNU484, SNU601, SNU638 및 SNU668 의 9종의 위암 세포주에서 mRNA를 추출 후 RT-PCR을 통해 LINGO2의 발현을 확인한 결과이다. RT-PCR 데이터는 베타액틴(Beta-actin) 유전자의 mRNA 수준에 맞추어 표준화하였다.
도 12는 위암 세포주 SNU484에 LINGO2 shRNA 플라스미드를 형질주입 후, LINGO2의 발현 감소를 웨스턴 블랏 및 유세포 분석으로 확인한 결과이다. 웨스턴 블랏 데이터는 GAPDH 단백질의 발현 수준에 맞추어 표준화하였다.
(a) 웨스턴 블랏, (b) 유세포 분석
도 13은 LINGO2 넉-다운(k/d)에 따른 암세포의 다양한 특성들의 변화를 분석한 결과이다.
(a) 세포의 모양(cell morphology), (b) 세포증식 그래프(Proliferation assay), (c) 세포 증식이동 분석(Wound healing assay), (d) 암세포 전이 분석 (Migration assay), (e) 암세포 침윤 분석(Invasion assay)
도 14는 LINGO2 발현 억제에 따른 세포내 다양한 신호체계의 변화를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다. 웨스턴 블랏 데이터는 GAPDH 단백질의 발현 수준에 맞추어 표준화하였다. [상피 중간엽 세포이행(Epithelial to Mesenchymal transition) 관련 단백질, PI3K 신호 체계 그리고 MAPK 신호체계]
도 15는 LINGO2 넉-다운(k/d) 세포주 배양액 내 MMP 단백질들의 발현 및 활성 변화를 웨스턴 블랏 및 자아모그래피(Zymography)를 통해 확인한 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험 재료 및 방법

인체 위암 세포주로부터 암 줄기세포의 특성을 갖는 스피어 분리 및 배양

인체 위암 세포주 11종 중 N87, AGS, SNU1, SNU5 , SNU16 그리고 마우스 섬유아 세포인 NIH3T3는 ATCC(American Type Culture Collection; Manassas, VA)로부터 구입하였으며, 인체 위암 세포주 SNU216, SNU484, SNU601, SNU638, SNU668 및 SNU719는 한국 세포주 은행(KCLB, Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea)에서 구입하였다. ATCC와 한국 세포주 은행에 의해 제시된 프로토콜에 의해 세포주들을 10% 우태아혈청(FBS; Hyclone, Logan, UT)을 포함하는 RPMI1640(Invitrogen Gibco, Grand Island, NY) 성장배지에서 배양하였다. 스피어(Sphere) 배양을 위하여 위암 세포주들을 EGF(10 ng/㎖, R&D Systems Inc., Minneapolis, MN), bFGF(10 ng/㎖, R&D Systems Inc.), 1ITS(insulin transferring selenium, Gibco) 및 0.5% BSA(Invitrogen Gibco, Grand Island, NY)를 보충한 혈청 프리 RPMI 배지에 1000 세포/㎖ 의 비율로 6-웰 울트라 로우 클러스터 플레이트(Corning Inc., Corning NY)에 접종 후 7-10일 동안 배양하였다(D. Ponti et al., Cancer Res. 65(13), 5506-5511(2005)). 같은 배양액으로 배양 접시(Nalgene Nunc Int., Rochester, NY)에 부착시켜 접합(adherent) 상태에서 키운 세포를 대조군으로 하였다. NIH3T3 세포의 배양 상층액을 세포 전이 및 침윤분석에 사용하였다.

스피어 세포에서 암줄기세포관련 유전자들의 발현분석

RNAeasy Mini kit(QIAGEN, Valencia, CA)를 사용하여 N87 및 SNU484의 접착세포 및 스피어 세포로부터 총 RNA를 추출하였다. Superscript II (Gibco BRL, Grand Island, NY)의 반응을 통하여 42℃에서 한 시간 동안 추출된 각각의 RNA 2 ㎍를 역전사 반응시켰다. 암 줄기세포 관련 유전자들의 프라이머와 Taq 폴리머라아제에 의한 PCR을 통하여 스피어 세포에서의 암 줄기세포 관련 유전자들의 발현을 분석하였고, 베타액틴(Beta-actin)유전자의 발현을 대조군으로 하였다. 암 줄기세포 관련 유전자들의 프라이머 염기 서열, PCR 반응 온도 및 싸이클수는 하기 표 1에 나타내었다.

유전자	정방향 프라이머 염기서열 (5’-3’)	역방향 프라이머 염기서열 (5’-3’)	Tm/사이클
Jagged 2	GTGGATGTCGACCTTTGTGA	GGCAGTCGTCAATGTTCTCA	61℃/30
Notch3	ATGGTGGGAACTAAACACAGCT	ATGACCCTGGAGGAAGCACA	55℃/35
Hes1	GTGCTGTCTGGATGCGGAGT	GAACACTCACACTCAAAGCCC	55℃/35
Ihh	CCTGAACTCGCTGGCTATCT	AATACACCCAGTCAAAGCCG	56℃/35
Smo	GAATCGCTACCCTGCTGTTA	TGAGCAGGTGGAAGTAGGAG	59℃/30
Gli1	AGAGTCCAGGGGGTTACATA	AGAGTCCAGGGGGTTACATA	57℃/35
FZD7	CCAACGGCCTGATGTACTTT	GCCATGCCGAAGAAGTAGAG	61℃/30
β-catenin	GTATGAGTGGGAACAGGGATTT	CCTGGTCCTCGTCATTTAGC	52℃/25
Nanog	ACTGTCTCTCCTCTTCCTTCCT	AGAGTAAAGGCTGGGGTAGGTA	61℃/30
Oct4	GTGGAGGAAGCTGACAACAA	AGCAGCCTCAAAATCCTCTC	62℃/27
PTEN	GGACGAACTGGTGTAATGAT	CAGACCACAAACTGAGGATT	56℃/30
β -actin	GGCATCCTCACCCTGAAGTA	GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA	55℃/25

cDNA 마이크로어레이

RNAeasy Mini kit(QIAGEN, Valencia, CA)를 사용하여 제조사 지시에 따라 N87 및 SNU484의 접착세포 및 스피어 세포로부터 총 RNA를 추출하였다. 총 RNA를 ND-1000 나노드롭 분광기(NanoDrop Technologies, Inc., DE)를 사용하여 정량 분석하고, Agilent 2100 생분석기(Agilent Technologies, Santa Clare, CA)에 의해 RNA 6000 나노 칩(Agilent Technologies)을 사용하여 정성 분석하였다. 마이크로어레이 실험 절차는 제조사 프로토콜에 따라 수행하였다. 디지털 제노믹스(Seoul, Korea)에서 cDNA 마이크로어레이 분석을 수행하였다. 각각의 총 RNA 6 ㎍ 분량을 사용하여 이중사 cDNA를 준비하고, 비오틴-표지(IVT 라벨링 키트; Affymetrix)를 하여 증폭하였다. 상기 표지된 cDNA를 조각내어 Affymetrix GeneChip 인간 지놈 U133 플러스 2.0 고농도 올리고뉴클레오타이드 어레이(Affymatrix, Santa Clara, CA)에 혼성화시켰다. 그 다음 마이크로어레이를 Genechip Fluidics 스테이션 450(Affymetrix)으로 세척하고 Genechip 어레이 스캐너 3000 7G (Affymetrix)를 사용하여 스캔하였다. Affymetrix 발현 Console 소프트웨어 버전 1.1을 사용하여 발현 데이터를 생성시키고, 이를 MAS5 알고리즘 표준화하였다. raw .cel 파일 내 발현 강도 데이터는 MAS5 알고리즘으로 표준화하여 잡음을 감소시켰다. 적어도 하나의 샘플 군 내 50%가 넘는 샘플에서, MAS5 탐지 콜에 의할 때 프레즌트 콜이 아닌 프로브 세트는 걸러내었다. 두 그룹 간에 다르게 발현하는 유전자를 결정하기 위하여 MASS 발현 값에 대하여 짝지은 t-테스트를 수행하였고, 1.5배가 넘는 차이를 보이는 유전자를 고려하였다. 모든 개별적인 칩 분석은 독립적인 총 RNA 샘플에 대하여 2회 반복 수행하였다.

cDNA 어레이 결과 도출된 위암 암 줄기세포 관련 타겟들의 발현 확인

1) 반정량적 RT-PCR

RNAeasy Mini kit(QIAGEN, Valencia, CA)를 사용하여 N87 및 SNU484의 접착세포 및 스피어 세포로부터 총 RNA를 추출하였다. Superscript II (Gibco BRL, Grand Island, NY)의 반응을 통하여 42℃에서 한 시간 동안 추출된 각각의 RNA 2 ㎍를 역전사 반응시켰다. cDNA array 분석으로부터 도출된 위암 암 줄기세포 관련 타겟 유전자들의 프라이머와 Taq 폴리머라아제에 의한 PCR을 통하여 스피어 세포에서의 발현을 분석하였고, 베타액틴(Betaactin) 유전자의 발현을 대조군으로 하였다.

2) 면역조직 화학염색을 통한 인체 위암 조직에서의 위암 암 줄기세포 관련 타겟들의 발현 분석

인체 위암 조직 슬라이드를 자일렌 내에서 탈파라핀화시키고 등급별 알코올 내에서 재수화시켰다. 내생성 퍼옥시다제 활성을 상온에서 20분 동안 0.3%의 과산화수소 포함 메탄올 용액으로 블록킹하였다. 마이크로웨이브 항원 검색을 시트레이트 완충액(0.01 M, pH 6.0)에서 5분 동안 실시하였다. 그 다음, 슬라이드를 10% 노말 당나귀 혈청 용액으로 1시간 동안 배양시켜서 비-특이적인 배경 염색을 감소시켰다. 1:200으로 희석하여 반응시킨 1차 항체는 마우스 모노클로날 LINGO2 (Lifespan biosciences, seattle, WA), 고트 폴리클로날 ABCA5(Abnova corporation, Taipei), 래빗 폴리클로날 LGR4(Sigma, St. Louis, MO), 래빗 폴리클로날 LRRN3(Abcam, Cambridge, UK), 마우스 모노클로날 Ero1L(santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA) 이다. 블록화된 섹션을 1차 항체와 4℃에서 하룻밤 배양시켰다. 그 이후의 반응은 Envision 키트(DakoCytomation, Carpineteria, CA, USA) 또는 Goat HRP-Polymer 키트(Biocare medical, Pike Lane Concord, CA)에 포함된 권장 과정을 이용하여 실시하였다. 마지막으로, 슬라이드를 3,3’-디아미노벤지딘(3,3’-diaminobenzidine; DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA)로 배양시키고, 변형된 해리스 헤마톡실린(Harris hematoxylin, Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO)용액으로 대조 염색하였다.

3) 위암 암 줄기세포 관련 표지자 항체에 의한 세포분리 및 분리된 세포의 암 줄기 세포 특성확인

정상 배양액에서 배양된 위암 세포주 N87 또는 SNU484 세포에 아큐타아제 (Accutase; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)를 처리하여 동일한 수의 단일세포 현탁액을 제조하였다. 그 다음 본 발명에서 도출된 위암 암 줄기세포 관련 타겟의 항체로 in direct 염색을 수행하였다. 1차 항체 또는 각 항체에 해당하는 아이소타입 컨트롤로 20분간 배양하였으며, 이후 형광 염료가 접합된 2차 항체로 아이스에서 20분간 배양하였다. 1차 항체는 마우스 모노클로날 LINGO2 (Lifespan biosciences, seattle, WA), 고트 폴리클로날 ABCA5(Abnova corporation, Taipei), 래빗 폴리클로날 LGR4(Sigma, St. Louis, MO), 래빗 폴리클로날 LRRN3(Abcam, Cambridge, UK)이다. 아이소타입 컨트롤 및 형광 2차 항체는 정제된 마우스 IgG2a, k 아이소타입 컨트롤, PE 고트 안티-마우스 IgG(BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA), 노말 래빗 IgG, 고트 안티-래빗 IgG-PE(santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA), 노말 고트 IgG 및 동키 안티-고트 IgG-PE(santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA)이다. 세포 분류는 FACSAria II(BD Immunocytochemistry System, Franklin Lakes, NJ)를 이용하였다.

4) 위암 암 줄기세포 관련 타겟 항체에 의해 분리된 세포의 암 줄기세포 관련 단백질들의 발현 분석

본 발명에서 도출된 위암 암 줄기세포 관련 타겟들의 항체에 의해 분류된 세포들을 동일한 수로 배양하여 7-10일간 배양한 후 단백질을 추출하였고, SDS-폴리아크릴아미드 젤에 로딩(loading)한 후 전기영동하였다. 전기영동에 의해 크기별로 분획된 단백질들을 PVDF 멤브레인(Millipore corporation, Billerica, MA, USA)으로 이동시킨 후, 비특이적 반응을 감소시키기 위하여 5% 논-팻 밀크(non-fat milk)를 첨가한 TBS-T(Tris-buffered saline/0.05% Tween-20)에 1시간 동안 블록킹하였다. 그 다음, 각각의 멤브레인을 잘 알려진 암 줄기세포 관련 단백질들에 해당하는 1차 항체와 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. 1차 항체는 래빗 폴리클로날 OCT4(Cell Signaling Technology, Inc., Danver, MA), 래빗 폴리클로날 Sox2(Cell Signaling Technology, Inc., Danver, MA), 마우스 모노클로날 PTEN(santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA), 래빗 폴리클로날 GLI1(santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA), 래빗 폴리클로날 HEY1(santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA) 및 마우스 모노클로날 GAPDH(santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA)를 사용하였다. 1차 항체와 반응한 각각의 멤브레인을 TBS-T 버퍼에 세척시킨 후, HRP(horseradish peroxidase)이 접합된 2차 항체(santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA)와 1시간 동안 반응시켰다. 각각의 단백질을 Enhanced chemiluminescence system(PIERCE, Rockford, IL)을 이용하여 검출하였다.

5) 위암 암 줄기세포 관련 타겟 항체에 의해 분리된 세포의 군락형성 확인

반고형 한천 군락 형성 시험(soft agar colony forming assay)의 표준 프로토콜을 변형하여 수행하였다(MJ Son. et al., Cell stem cells . 4, 440-452, 2009). Difco agar noble(Becton, Dickinson company, Sparks, MD)을 사용하였으며, 2X 스피어 배양액과 1:1의 비율로 0.6%의 하층 아가(bottom agar)를 24웰 플레이트에 넣은 후 실온에서 굳어지게 하였다. 스피어 배양액에 현탁시킨 분류된 세포들과 아가를 혼합시켜 0.3%의 상층 아가(top agar)를 만들어 하층 아가 위에 분주하였다. 성장요소(Growth factor)가 포함된 스피어 배양액은 2-3일마다 새로 바꾸어 주었다. 2-3주간 37℃ CO₂ 배양기에서 배양한 후 크리스탈 바이올렛 용액으로 염색하였고 세포 군락(cell colonies)을 세어 자가 재생(self renewal) 및 비부착증식(anchorage independent growth)를 비교 분석하였다.

6) 위암 암 줄기세포 관련 타겟 항체에 의해 분리된 세포의 암화능력 확인

FACS를 통해 분류한 세포는 무혈청 HBSS(Gibco BRL, Grand Island, NY)로 세척 후, 무혈청 RPMI(Gibco BRL, Grand Island, NY)/Matrigel(BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA)(1:1 volume)에 현탁시켰다(C. Li. et al., Cancer Res. 67(3) 1030-1037, 2007). 이후 누드 마우스(Orientbio, Seoul) 또는 NOD-SCID 마우스(FOX Chase Cancer Center, Philadelphia, PA)의 양 옆구리에 피하주사하였다. 이후 14-16 주간 관찰한 후 해부하였다.

7) CD34 & pVEGFR2 면역조직화학 염색

LINGO2 항체를 이용하여 분류한 세포를 마우스에 피하주사하여 수득한 마우스 암의 조직 슬라이드는 자일렌 내에서 탈파라핀화시키고 등급별 알코올 내에서 재수화시켰다. 내생성 퍼옥시다제 활성을 상온에서 20분 동안 0.3%의 과산화수소 포함 메탄올 용액으로 블록킹하였다. 마이크로웨이브 항원 검색을 시트레이트 완충액(0.01M, pH 6.0)에서 5분 동안 실시하였다. 그 다음, 슬라이드를 10% 노말 당나귀 혈청 용액으로 1시간 동안 배양시켜서 비-특이적인 배경 염색을 감소시켰다. 혈관형성을 확인하기 위하여 랫 모노클로날 CD34(Abcam, Cambridge, UK) 및 래빗 폴리클로날 phospho-VEGFR2(Cell signaling technology, Inc., Danver, MA) 항체를 1: 50 으로 희석하여 4℃에서 하룻밤 배양시켰다. CD34에 대한 2차 항체는 anti-rat IgG-HRP(santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA)를 1:200으로 희석하여 실온에서 1시간 동안 배양시켰다. pVEGFR2에 대한 반응은 Envision 키트(DakoCytomation, Carpineteria, CA, USA) 에 포함된 권장 과정을 이용하여 실시하였다. 마지막으로, 슬라이드를 3,3’-디아미노벤지딘(3,3’-diaminobenzidine; DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA)로 배양시키고, 변형된 해리스 헤마톡실린(Harris hematoxylin, Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO)용액으로 대조 염색하였다.

위암 세포주에서의 LINGO2 mRNA 발현 확인

RNAeasy Mini kit(QIAGEN, Valencia, CA)를 사용하여 총 9주의 위암 세포주 (AGS, N87, SNU1, SNU5, SNU16, SNU484, SNU601, SNU638 및 SNU668)로부터 총 RNA를 추출하였다. Superscript II (Gibco BRL, Grand Island, NY)의 반응을 통하여 42℃에서 한 시간 동안 추출된 각각의 RNA 2 ㎍를 역전사 반응시켰다. LINGO2 유전자의 프라이머와 Taq 폴리머라아제에 의한 PCR을 통하여 위암 세포주에서의 LINGO2 발현을 분석하였고, 베타액틴(Beta-actin)유전자의 발현을 대조군으로 하였다.

LINGO2 발현 저해(넉-다운, k/d) 세포주 구축

LINGO2의 발현 저해로 인한 다양한 특성 변화를 확인하기 위하여 LINGO2 shRNA 플라스미드 및 대조군 shRNA 플라스미드(SureSiliencing shRNA plasmids)를 QIAGEN사로부터 구입하였고(QIAGEN, Valencia, CA), SNU484 세포주에 형질 주입하여 LINGO2 넉-다운(k/d) 세포주를 수립하였다.

본 발명에 사용된 LINGO2에 대한 shRNA의 서열은 AGA CTT GAG TGA CAA CAT CAT이고, 대조군 shRNA의 서열은 GGA ATC TCA TTC GAT GCA TAC이며, 선별 마커로는 퓨로마이신 2.0 ㎍/㎖(Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO)을 사용하였다. LINGO2 shRNA 플라스미드 및 대조군 shRNA 플라스미드를 세포에 형질 주입할 때에는 리포펙타민2000(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하였다. 24시간 후, 배양액을 2 ㎍/㎖ 퓨로마이신이 포함된 배양액으로 바꾸어 준 후, 3일 이상 지속배양 하였다. 퓨로마이신 배양액에서 살아남은 세포를 100 mm 플레이트에 20-30 개의 적은 수로 부착시켜 배양시킨 후, 클로닝 실린더(Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO)를 이용하여 단일 콜로니를 선별하였다. 이후 웨스턴 블랏과 유세포 분석을 통해 LINGO2 넉-다운을 확인하였다.

LINGO2 넉- 다운(k/d)세포주의 다양한 특성 변화 확인

1) 세포 증식 속도 ( Proliferation assay )

각 세포를 1.1 × 10⁴ 개씩 24웰-플레이트에 부착시킨 후, 8일간 매 2일마다 일정시간에 세포를 0.25% 트립신37 EDTA로 분리하고 세포 계수기(hematocytometer)에서 세포수를 측정하였다.

2) 세포 증식이동 분석( wound healing assay )

세포배양 시 세포의 수가 웰에 100% 가까이 채워지고 난 후 200 μl 팁을 이용하여 스크래치를 주고, 시간에 따른 스크래치 회복능력을 현미경하에서 관찰을 통해 수행하였다.

3)암세포 전이분석( migration assay )과 암세포 침윤분석( invasion assay )

암세포 전이 및 침윤분석은 트랜스웰(Corning Inc., Tewksbury MA)에서 수행되었다. 암세포 침윤분석의 경우, 무혈청 배지(serum free media)에 4분의 1로 희석된 마트리겔(BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA)을 상부 웰에 85 μl씩 넣고 37℃에서 고형화시켜 사용하였다. 상부 웰에는 무혈청 배지에 현탁시킨 세포를 1.0 X 10⁴개씩, 하부 웰(lower well)에는 NIH3T3 섬유아 세포의 배양액을 500 μl씩 분주한 후 전이분석은 24시간, 침윤분석은 72시간 배양하였고, 필터를 통과하여 필터 아래쪽에 부착된 세포를 고정 및 염색한 후 현미경 관찰을 통하여 전이 및 침윤된 세포수를 측정하였다.

4) 웨스턴 블랏

LINGO2 발현 저해에 의한 다양한 신호체계를 알아보기 위한 웨스턴 블랏에 사용된 1차 항체는 마우스 모노클로날 LINGO2(Lifespan biosciences, seattle, WA), 래빗 폴리클로날 E-cadherin(santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA), 마우스 모노클로날 N-cadherin(Abcam plc., Cambridge, MA), 래빗 폴리클로날 phospho-GSK3(Cell Signaling Technology, Inc., Danver, MA), 래빗 폴리클로날 phospho-AKT(Cell Signaling Technology, Inc., Danver, MA), 래빗 폴리클로날 AKT(santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA), 래빗 폴리클로날 phospho-MEK(Cell Signaling Technology, Inc., Danver, MA), 래빗 폴리클로날 MEK(santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA), 래빗 폴리클로날 phospho-ERK(Cell Signaling Technology, Inc., Danver, MA), 고트 폴리클로날 ERK(santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA), 마우스 모노클로날 MMP-1(santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA), 래빗 모노클로날 MMP-9(Abcam plc., Cambridge, MA) 및 마우스 모노클로날 GAPDH(santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA)이다.

5) 자이모그래피( Zymography )

대조군(mock)과 LINGO2 넉-다운(k/d) 세포의 배양액 내 MMP2와 MMP9의 젤라티네이즈 활성을 알아보기 위하여 자아모그래피를 수행하였다. 5 X 10⁵의 동일 갯수의 세포를 각각 100 mm 디쉬에 분주한 후, 무혈청 RPMI 배지(Invitrogen, Carlsbad, CA) 10 ml 을 넣고 48시간 배양하였다. 이후 배양 상층액은 원심분리를 통하여 수득한 후 3 kDa 분자-매스 컷오프(molecular-mass cut off: MWCO)를 가진 아미콘 울트라 센트리퓨갈 필터 디바이스(Milipore ireland Ltd., Tullagreen)를 사용하여 농축시켰다. 농축액을 각각 20 μl 씩 샘플 버퍼와 1:1의 비율로 혼합 후 10% 자이모그램 겔(Bio-rad, Hercules CA)에 로딩(loading) 후 100 V에서 90분간 전기영동하였다. 2.5% 트리톤 X100 이 포함된 버퍼에 겔을 담근 후 상온에서 30분간 재생(renaturing) 시킨 후, 디벨롭먼트 용액(Bio-rad, Hercules CA)으로 바꾸어 주고 37℃에서 하룻밤 반응시켰다. 이후 쿠마시 블루(Bio-rad, Hercules CA)로 염색 후, MMP2와 MMP9의 젤라티네이즈 활성을 나타내는 투명한 밴드가 선명하게 확인될 때까지 탈색하였다. 겔은 건조시킨 후 스캔하였다.

실험 결과

인체 위암 세포주로부터 암 줄기세포의 특성을 갖는 스피어 분리 및 배양

암 줄기세포의 특성을 나타내는 스피어 형성 유무를 확인한 결과, 총 11종의 인체 위암 세포주 중 N87 및 SNU484 세포주에서 스피어가 형성됨을 확인하였다(도 1).

스피어 세포에서 암 줄기세포 관련 유전자들의 발현 분석

반정량적 RT-PCR을 수행한 결과 위암 세포주 N87의 접착세포에 비해 스피어 세포에서 Notch, Hedgehog 및 Wnt 등 줄기세포 관련 신호전달 체계가 활성화되어 있는 것을 확인하였다. 또한 줄기세포의 다분화 능력을 나타내는 oct4, nanog 및 줄기세포의 유지에 관여하는 PTEN 등이 증가되어 있어 스피어 세포내에 다량의 암 줄기세포가 포함되어 있음을 확인하였다(도 2).

위암 암 줄기세포 관련 표지자 규명을 위한 암 줄기세포 유전자 데이터베이스 구축

N87 및 SNU484 세포의 스피어 및 부착 세포 내 다르게 발현되는 유전자를 분석하고 위암 암 줄기세포 관련 타겟 표지자를 규명하기 위하여 Affymetrix GeneChip HG U133을 사용하여 cDNA 마이크로어레이를 수행한 결과, 위암 세포주로부터 형성된 스피어 세포에서 발굴한 위암 암 줄기세포 관련 표지자들을 표2 에 나타내었다.

스피어	유전자 기호	유전자명	발현량의 비율 변화	RefSeq Transcript ID
N87 SNU484	ABCA5	ATP-binding cassette, sub-family A (ABC1), member 5	1.631 2.306	NM_018672
N87	ERO1L	ERO1-like (S. cerevisiae)	2.245	NM_014584
SNU484	LGR4	Leucine-rich repeat-containing G protein-coupled receptor 4	2.684	NM_018490
SNU484	LINGO2	Leucine rich repeat and Ig domain containing 2	2.881	NM_152570
SNU484	LRRN3	Leucine rich repeat neuronal 3	6.658	NM_001099658

위암 암 줄기세포 관련 신규 표지자들의 mRNA 발현 확인

위암 암 줄기세포 관련 신규 표지자들의 mRNA 발현 검증을 위해 N87 및 SNU484 세포로부터 배양한 스피어 세포에서 RT-PCR을 수행하였고, 해당 유전자에 대한 프라이머 염기서열을 표 3에 나타내었다.

유전자	정방향 프라이머 염기서열 (5’-3’)	역방향 프라이머 염기서열 (5’-3’)
ABCA5	CATGCTTTTGCCATTGAAGA	GCGTTCTTGGTTCTCCAGTT
Ero1L	CACCTCAGCCTCCCAAGTAG	GAGGGCACGATTTTGAGGTA
LGR4	TGTGGCTTCTGTTCATTTCG	TGGCCTTACAAAATTACAACACA
LINGO2	TTGCAAATATTGGCGTTCTG	TGATGCAAGGCTTTAACAAATG
LRRN3	AGGCCAATTCAGTTTTGGTG	GTGCAAACCTTTGGTGGTG

RT-PCR 결과 ABCA5 및 LINGO2의 mRNA 발현이 N87 및 SNU484의 스피어 모두에서 증가되어 있음을 확인할 수 있었으며, Ero1L, LGR4 및 LRRN3의 발현이 N87 또는 SNU484 스피어에서 증가되어 있음을 검증하였다(도 3). 도 2에서 나타난 기존에 암 줄기세포의 특성을 나타내는 유전자들과 마찬가지로 본 연구에서 발굴한 유전자들이 스피어 세포에서 증가되어 있음은 위암 암 줄기세포 관련 신규 표지자로써의 가능성을 나타낸다고 할 수 있다.

인체 위암 조직에서 위암 암 줄기세포 관련 신규 표지자들에 대한 발현 분석

위암 암 줄기세포 관련 신규 표지자들의 발현을 인체 위암 환자의 조직 TMA에서 면역조직 화학염색을 통하여 검증하였다(도 4a-e 및 도 5). ABCA5를 비롯한 5개의 위암 암 줄기세포 관련 신규 표지자들은 인접한 정상세포에서는 발현을 하지 않는 반면, 전암 병변으로 알려진 선종성 용종(Adenomatous polyp)과 위암 조직 50% 이상에서 발현하는 양상을 나타내어 이들 표지자들이 위암의 초기 암화 과정부터 관여하고 있음을 알 수 있다. 도 5는 위암 조직에서 각 표지자들의 발현을 큰 배율의 사진으로 나타낸 것이다.

위암 암 줄기세포 관련 표지자 항체에 의한 세포 분리 및 분리된 세포의 암 줄기세포 특성 확인

본 발명에서 도출한 위암 암 줄기세포 관련 표지자 항체에 의해 분리된 세포들의 암 줄기세포 연관성을 검증하기 위하여, 정상 배지에서 배양된 인체 위암 세포주 N87 과 SNU484세포를 ABCA5, LINGO2, LGR4 및 LRRN3 항체를 이용하여 in direct FACS 염색 후 세포 분류 여부를 확인하였다.

위암 세포주 N87 및 SNU484 세포에서 ABCA5의 발현은 5.7%와 18.1%(도 6a), LINGO2의 발현은 68.8%와 81.5%(도 6b), LGR4의 발현은 38.2%와 87.7%(도 6c) 그리고 LRRN3의 발현은 각각 27.5 % 및 9.2%(도 6d)로 나타났다. 각 표지자 그리고 세포주에 따라 발현차이가 다르게 나타나는 것을 알 수 있었다. 이러한 차이는 위암 환자에서는 더 크게 나타나리라 생각되며, 이미 다양한 암 줄기세포 마커로 알려진 CD44, CD24 및 ESA 마커들의 발현도 여러 명의 환자 조직에서 큰 차이를 보여주고 있음은 C. Li. 등이 2007년 Cancer Res.에 보고한 결과에서도 확인할 수 있다(C. Li. et al., Cancer Res. 67(3) 1030-1037(2007)). 신규 표지자 ABCA5, LINGO2, LGR4 및 LRRN3 항체에 의한 세포 분리가 가능한 것으로 확인되었으며(도 6a-6d), 각 표지자에 의해 분리된 세포들의 암 줄기세포 특성을 확인하기 위하여, 웨스턴 블랏 및 집락형성 분석법(clonogenic assay)을 수행하였다(도 7 및 도 8a-c).

위암 암 줄기세포 관련 신규 표지자 ABCA5 또는 LGR4 항체에 의해 분리된 세포 중, 각 표지자를 많이 발현하는 세포에서 줄기세포의 다분화 능력을 나타내는 OCT4및 SOX2의 발현이 증가되어 있음을 확인하였다(도 7(B) 및 (C)). LINGO2 항체에 의해 분리된 세포의 경우(도 7(A))도 마찬가지로, LINGO2를 높게 발현하는 세포에서 OCT4, 줄기세포 유지에 관여하는 PTEN, 암 줄기세포에서 활성화되어 있는 시그널인 Hedgehog 경로(pathway)의 전사인자 GLI1 및 Notch 경로의 전사인자인 HEY1이 증가되어 있어, 이들 신규 표지자들이 암 줄기세포와 밀접하게 연관되어 있음을 검증하였다. 또한 암 줄기세포의 가장 중요한 특징인 자가 재생과 비부착 증식을 알아보기 위한 집락형성 분석 결과를 도 8a-c에 나타내었다.

위암 암 줄기세포 관련 각 표지자 LINGO2, ABCA5, LRRN3 및 LGR4를 높게 발현하고 있는 세포들에서 더 많은 군락 형성하는 결과를 나타내어, 암 줄기세포의 특성인 자기 재생 능력 및 비부착 증식를 보여주고 있음을 확인하였다.

위암 암 줄기세포 신규 표지자 LGR4 에 의해 분리된 LGR4 - high 세포의 암화능력 검증

상기 실험을 통하여 줄기세포의 특성을 가지고 있음이 확인된 LGR4를 높게 발현하는 세포(LGR4-high 세포)의 종양형성 가능성을 확인하기 위하여 NOD-SCID 마우스의 양 옆구리에 LGR4를 낮게 발현하는 세포(LGR4-low 세포) 및 LGR4-high 세포를 1,000개씩 피하주사하였다. 10주간 관찰하고 해부한 결과를 도 9에 나타내었다. 그리고 종양 개시(initiating) 여부를 확실히 하기 위하여 제한희석법(limited dilution assay)을 통해 500개 및 1000개 세포 그룹으로 나누어 피하주사하였다. 도 9a에서 볼 수 있듯이 500개의 세포를 피하주사한 경우 LGR4를 낮게 발현하는 세포는 종양을 전혀 형성하지 않는 반면 LGR4를 높게 발현하는 세포는 모두 종양을 형성하여, LGR4가 위암 줄기세포 관련 마커 및 위암 치료제 타겟으로서의 가능성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.

위암 암 줄기세포 신규 표지자 LINGO2 에 의해 분리된 LINGO2 - high 세포의 암화능력 및 신생혈관형성 연관성 검증

스피어 세포에서의 mRNA 및 세포 표면에서 발현이 증가하였고 위암의 초기 암화과정부터 관여하고 있으며, 다양한 암 줄기세포의 특성을 가지고 있음이 확인된 LINGO2를 높게 발현하는 세포(LINGO2-high 세포)의 소집단이 in vivo 상에서 종양형성 가능성을 갖는지 여부를 확인하기 위하여 FACS를 통해 분류한 LINGO2-high 세포 및 LINGO2를 높게 발현하는 세포(LINGO2-low 세포)를 1차적으로 누드 마우스에 피하주사하여 예비 실험을 수행하였으며, 결과는 도 10a 에 나타내었다. LINGO2 항체를 이용하여 세포를 분리하였으며, 분리된 LINGO2-low 세포와 LINGO2-high 세포를 각각 누드 마우스의 양 옆구리에 500 개씩 피하 주사하고 15주 후에 해부한 결과를 도 10a에 나타냈다.

LINGO2 표지자 항체에 의해 분리된 세포를 500개씩 주입한 경우, 15주 후 LINGO2-high 세포를 주입한 마우스에서 형성된 종양의 크기 및 무게가 LINGO2-low 세포를 주입한 마우스에 비해 1.5배 정도 높은 것을 확인하였다. 또한 LINGO2-high 세포로부터 형성된 종양의 경우 LINGO2-low 세포의 종양에 비해 혈관이 훨씬 더 많이 형성되는 결과를 보여주어 LINGO2 표지자가 신생혈관형성과 연관성이 있음을 알 수 있었다. 보다 정확한 검증을 위하여 면역제어 마우스(NOD-SCID)에 LINGO2 표지자에 의해 분리된 세포를 250개 및 1000개의 세포를 각각 피하주사하여 15주간 관찰한 후의 결과를 도 10b와 10c에 나타내었다.

누드 마우스에서의 결과와 마찬가지로 LINGO2-high 세포를 주입한 경우 종양이 더 크게 형성되었으며, 신생혈관형성이 강하게 되는 것을 다시 확인할 수 있었다. 또한, LINGO2 및 신생혈관형성과의 연관성 검증을 위하여 LINGO2-high 세포를 마우스에 주입하여 수득한 종양 및 LINGO2-low 세포를 마우스에 주입하여 수득한 종양을 신생혈관형성 마커인 CD34와 phospho VEGFR2로 면역염색한 결과, LINGO2-high 종양에서 CD34와 phospho VEGFR2의 발현이 더 강하게 되는 것을 확인하였다.

LINGO2 발현 저해(넉-다운, k/d) 세포주 구축 및 특성 분석

LINGO2 발현 저해 세포주를 구축하기 전에 위암 세포주들에서의 LINGO2 발현 여부를 RT-PCR로 확인한 결과, 9개의 위암 세포주 모두가 LINGO2를 발현하고 있음을 알 수 있었다(도 11).

LINGO2의 발현 억제시 나타나는 다양한 특성을 분석하기 위하여, LINGO2 에 대한 shRNA 플라스미드 및 대조군 shRNA 플라스미드를 SNU484 세포에 영구 주입하여 LINGO2 넉-다운(k/d) 세포주를 수립하였다. 확립된 LINGO2 넉-다운(k/d) 세포주는 대조군에 비해 LINGO2 단백질의 발현이 감소되어 있음을 확인하였다(도 12a-b). LINGO2의 발현 억제 시 세포 증식속도에서는 큰 차이를 보이지 않지만(도 13b), 세포증식 이동속도(도 13c), 암세포 전이능력(도 13d) 및 암세포 침윤능력(도 13e)이 대조군에 비해 현저히 떨어지는 결과를 나타냈다. 또한, LINGO2의 발현이 억제되었을 때, 중간엽 세포의 마커인 N-cadherin 발현의 감소, AKT와 ERK의 인산화 활성이 크게 감소됨을 확인할 수 있었다(도 14).

도 15는 대조군 세포와 LINGO2 넉-다운(k/d) 세포의 배양액에서 MMP 단백질들의 발현 및 활성 변화를 확인한 결과이다. MMP 단백질들은 신생혈관형성에 중요한 역할을 하는 단백질들로, 대조군 세포에 비해 LINGO2의 발현이 억제된 세포에서 MMP1과 MMP9의 분비가 현저히 적게 되는 것을 확인하였으며 더불어 MMP9의 젤라티네이즈 활성 또한 저해되는 것을 알 수 있었다.

상피 중간엽 세포이행을 통해 암화과정, 재발 및 전이가 발생하고, 다양한 기관의 암세포들에서 AKT 및 ERK 인산화를 통해 세포 생존, 약물 저항성 등이 나타나게 됨은 이미 밝혀진 바 있다. 또한 이들 단백질의 인산화에 의한 신호체계의 활성화로 신생혈관형성에 큰 역할을 하는 MMP2, MMP9 등의 발현 및 활성화가 촉진되는 것으로 알려져 있다(Lionel Larue and Alfonso Bellacosa, Oncogene, 24: 7443-7454(2005)). 결론적으로 이러한 일련의 과정들은 암 줄기세포에 의해 시작 및 가속화된다는 보고와 위의 결과들을 바탕으로, LINGO2가 암 줄기세포의 미세환경에 중요한 역할을 하고 있으며, 신생혈관형성 치료의 잠재적인 타겟이 될 수 있음을 예측할 수 있다.

고찰

본 발명에서는 암의 최초 시작으로 여겨지며, 신생혈관형성, 재발이나 전이 및 항암치료 내성을 유발하는 것으로 알려진 암 줄기세포(cancer stem cell or tumor initiating cell)에 초점을 맞춰 항암제 내성 종양인 진행성 위암에서 암 줄기세포를 표적으로 한 새로운 치료법을 개발하기 위하여 위암 줄기세포 관련 표지자들을 도출하였다. 위암 세포주로부터 암 줄기세포 특성을 가지는 스피어 세포를 배양하였고, 스피어 세포가 암 줄기세포의 특성을 가지고 있음을 검증하였다. 이들 스피어 세포에서 암 발생 및 줄기세포 특성 유지에 관여하는 Notch, Hedgehog 및 Wnt 시그널 등 잘 알려진 줄기세포 관련 신호체계(T. Reya et al., Nature, 414: 105-111(2001))가 활성화되어 있었으며, 발생초기에 증가하는 것으로 알려져 있으며 줄기세포의 다분화 능력을 나타내는 oct4와 nanog 유전자의 발현이 증가되어 있음을 확인할 수 있었다. 그 외에도 암 줄기세포의 생존 및 유지에 중요한 역할을 하는 PTEN 의 발현도 증가되어 있어 줄기세포 관련 이전의 보고들과 일치되는 결과를 보여주었다(J. Zhou et al., Proc Natl Acad Sci USA, 104:16158-16163, (2007)).

이 결과들을 토대로 위암 세포주로부터 형성된 스피어에서 cDNA 어레이를 통해 위암 줄기세포 관련 표지자(ABCA5, Ero1L, LGR4, LINGO2, LRRN3)들을 선정하였다. 5개의 신규 표지자들은 위암 세포주로부터 형성된 스피어에서 증가되어 있었고, 인체 위암 조직에서 발현을 확인한 결과 초기 암화과정부터 관여하고 있음을 확인할 수 있었다. 그리고 각 표지자 항체에 의해 세포 분리하였을 때, 신규 표지자들을 높게 발현하는 세포에서 암 줄기세포의 특성을 나타내는 신호전달이 활성화되어 있었고, 줄기세포의 자가 재생(self renewal)한 특성을 지니고 있음을 확인할 수 있었다.

ABCA5는 ABC(ATP-binding cassette) 수송단백질 슈퍼패밀리(transporters superfamily)의 멤버로 알려져 있으며, 악성 흑생종(malignant melanoma)에서 증가되어 있는 것으로 보고된 바 있다(I Vet al., Actas Dermosifiliogr. 101(4):341-8(2010)). 또한, 인간 중피종 세포(mesothelioma cell)에서는 다약제 내성과 암세포 생존에 중요한 역할을 하는 ERK1과 ERK2를 억제 시 ABCA5를 비롯한 ABC 유전자들의 발현이 저해되며, 독소루비신(doxorubicin)에 감수성을 가지게 된다고 보고하고 있어(A. Shukla et al., Mol Cancer, 15:314, (2010)) 항암제 내성 종양 치료의 잠재적인 타겟이 될 수 있음을 예측할 수 있다.

2005년 Oncogene에서 D. May et al.은 Ero1L이 인 비트로 상에서 저산소 환경(Hypoxia)에 의해 유도되며, 저산소 종양 미세환경에서 VEGF와 co-induced 된다고 보고한 바 있다(D. May etl al., Oncogne, 24(6):1011-20(2005)). 저산소 환경은 빠르게 성장하는 종양세포가 처하는 일반적인 환경으로 저산소 조건에 의해 유도된 VEGF의 분비가 암조직의 신생혈관형성에 중요한 역할을 함을 고려할 때, Ero1L이 잠재적인 항-신생혈관형성의 타겟이 될 수 있음을 유추해 볼 수 있다.

LRRN3(Neuronal leucine rich repeat protein 3)은 LRR 슈퍼패밀리에 속한다고 보고되어 있으나, 암과의 연관성은 거의 보고된 바 없으며, 2002년 JBC에서는 c-Ha-ras 형질전환 랫트 종양으로부터 분리된 랫트 NLRR-3의 발현은 주로 Ras-MAPK 신호체계를 통해 주로 조절되며, 이를 더 활성화시킨다고 보고하고 있다(K. Fukamachi et al., J. Biol . Chem. 277(46):43549-52(2002)).

LGR4는 LGR 패밀리 중 하나로 GPCR48(G protein-coupled receptor 48)이라고도 불리우며, 다양한 생리적인 기능을 한다고 알려져 있다. 2006년 Cancer research에서는 LGR4가 대장암 세포주의 침윤과 전이에 중요한 역할을 한다고 보고한 바 있으며(Y. Gao et al., Cancer Res, 66(24):11623-31(2006)), LGR 패밀리 중 가장 잘 알려진 LGR5는 최근 대장암 줄기세포 마커로 보고되었다(H. Takahashi et al., Ann Surg Oncol., 18(4):1166-74(2011)). 2011년 EMBO report에서는 LGR4 역시 장에서 wnt 신호체계의 허용 요인(permissive factor)이며, 장암 치료의 잠재적인 타겟이라고 보고하였다(RC Mustata et al., EMBO Rep., 2011). 본 발명에서 도출한 LGR4의 경우, 줄기세포의 특성을 지니고 있으며 위암의 초기 암화과정부터 관여하고 있음을 보여주었다. 또한 LGR4를 높게 발현하는 세포가 종양 형성 가능성을 가지고 있음을 NOD-SCID 이식을 통해 확인할 수 있었으며, LGR4가 위암 줄기세포 관련 마커로써 위암의 치료용 타겟이 될 수 있음을 알 수 있었다.

LINGO2는 LRR 유전자 패밀리의 멤버로 마우스 배형성(embryogenesis) 중 초기 마우스 배아에서 발현하는 것으로 알려져 있으며, 2009년 Gene Expression Pattern에서 LINGO 패밀리가 RAS/MAPK 신호전달, PI3K 신호전달을 비롯한 다양한 신호 전달과정을 활성화시키는 Trk 수용체의 도메인 구조에서 발견되었다고 보고된 바 있다(S. Homma et al., Gene Expr Patterns, 9(1):1-26(2009)). 그리고 파킨슨병 관련되어 있다는 보고는 있으나(YW Wu et al., Hum Genet(2011)), 암에 대해서는 보고된 바 없다. 그러나 본 발명의 결과에서, LINGO2가 종양형성 가능성 및 신혈관형성과 연관성을 나타내어, 잠재적인 항-신생혈관형성의 타겟 가능성을 예측할 수 있었다.

현재 위암 줄기세포 관련 연구는 전 세계적으로 초기 단계라고 할 수 있으며, 2011년 ME Han et al.은 기존에 유방암, 췌장암 등 다양한 암에서 암 줄기세포 타겟으로 밝혀진 CD44 및 EpCAM를 이용하여 세포를 분리하였으며 CD44+/EpCAM+ 부분모집단(subpopulation)에 위암 줄기세포가 모여있고, 이들 부분모집단이 5-FU, 독소루비신과 같은 항암제에 더 높은 저항성을 갖는다는 결과를 보여 주었다. 또한 암 스피어를 암 줄기세포 연구의 이상적인 모델 시스템으로 보고하였다(ME Han et al., Cell . Mol . Life Sci., (2011)).

따라서, 현재까지는 기존의 잘 알려진 암 줄기세포 마커들에 대한 보고가 전부이며, 위와 같은 보고들과 본 발명의 다양한 실험들을 토대로 5개의 신규 표지자들이 위암 줄기세포 특성을 이용한 위암의 진단 마커 및 항암제 내성 위암 치료의 유용한 타겟이 될 수 있을 것이라 판단된다.

참고문헌

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2. BB Zhou et al. Tumour-initiating cells: challenges and opportunities for anticancer drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery: 8, 806-823, 2009.

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이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (11)

1. 다음의 단계를 포함하는 위암 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법:
   (a) 서열목록 제1서열의 단백질, 서열목록 제3서열의 단백질, 서열목록 제5서열의 단백질, 서열목록 제7서열의 단백질 및 서열목록 제9서열의 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질 또는 서열목록 제2서열의 폴리뉴클레오타이드, 서열목록 제4서열의 폴리뉴클레오타이드, 서열목록 제6서열의 폴리뉴클레오타이드, 서열목록 제8서열의 폴리뉴클레오타이드 및 서열목록 제10서열의 폴리뉴클레오타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포 또는 조직에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; 및
   (b) 상기 단계 (a)에서의 상기 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드의 발현량을 측정하는 단계로서, 상기 시료가 상기 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드의 발현을 감소시키는 경우에는 상기 시료는 위암의 예방 또는 치료용 물질로 판정된다.
   
2. 다음의 단계를 포함하는 위암 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법:
   (a) 서열목록 제1서열의 단백질, 서열목록 제3서열의 단백질, 서열목록 제5서열의 단백질, 서열목록 제7서열의 단백질 및 서열목록 제9서열의 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질을 준비하는 단계;
   (b) 상기 단백질에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; 및
   (c) 상기 시료가 상기 단백질에 결합하는지 여부 또는 상기 시료가 상기 단백질의 기능을 억제하는지 여부를 분석하는 단계; 상기 시료가 상기 단백질에 결합하거나 또는 단백질의 기능을 억제하면 위암의 예방 또는 치료용 물질로 판정된다.
   
3. 다음의 단계를 포함하는 암 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법:
   (a) 서열목록 제3서열의 단백질 또는 서열목록 제4서열의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포 또는 조직에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; 및
   (b) 상기 단계 (a)에서의 상기 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드의 발현량을 측정하는 단계로서, 상기 시료가 상기 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드의 발현을 감소시키는 경우에는 상기 시료는 암의 예방 또는 치료용 물질로 판정된다.
   
4. 다음의 단계를 포함하는 암 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법:
   (a) 서열목록 제3서열의 단백질을 준비하는 단계;
   (b) 상기 단백질에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; 및
   (c) 상기 시료가 상기 단백질에 결합하는 지 여부 또는 상기 시료가 상기 단백질의 기능을 억제하는 지 여부를 분석하는 단계; 상기 시료가 상기 단백질에 결합하거나 또는 단백질의 기능을 억제하면 암의 예방 또는 치료용 물질로 판정된다.
   
5. 제 3 항에 있어서, 상기 단백질은 세포 표면, 바이러스 표면 또는 분리된 형태(isolated form)로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
6. 서열목록 제1서열의 단백질, 서열목록 제3서열의 단백질, 서열목록 제5서열의 단백질, 서열목록 제7서열의 단백질 및 서열목록 제9서열의 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질에 특이적으로 결합하는 결합제 또는 서열목록 제2서열의 폴리뉴클레오타이드, 서열목록 제4서열의 폴리뉴클레오타이드, 서열목록 제6서열의폴리뉴클레오타이드, 서열목록 제8서열의 폴리뉴클레오타이드 및 서열목록 제10서열의 폴리뉴클레오타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 위암 암 줄기세포 검출용 키트.
   
7. 서열목록 제3서열의 단백질에 특이적으로 결합하는 결합제 또는 서열목록 제4서열의 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 암 줄기세포 검출용 키트.
   
8. 서열목록 제1서열의 단백질, 서열목록 제3서열의 단백질, 서열목록 제5서열의 단백질, 서열목록 제7서열의 단백질 및 서열목록 제9서열의 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질에 특이적으로 결합하는 결합제 또는 서열목록 제2서열의 폴리뉴클레오타이드, 서열목록 제4서열의 폴리뉴클레오타이드, 서열목록 제6서열의폴리뉴클레오타이드, 서열목록 제8서열의 폴리뉴클레오타이드 및 서열목록 제10서열의 폴리뉴클레오타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 위암 진단 또는 예후 분석용 키트.
   
9. 서열목록 제3서열의 단백질에 특이적으로 결합하는 결합제 또는 서열목록 제4서열의 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 암 진단 또는 예후 분석용 키트.
   
10. 제 6 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키트는 면역분석(immunoassay)용 키트인 것을 특징으로 하는 키트.
    
11. 제 6 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키트는 유전자 증폭 또는 마이크로어레이용 키트인 것을 특징으로 하는 키트.

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