KR101351181B1 - 단핵식세포계 세포 내에서 ａｇｅ-알부민의 합성 저해 또는 분비 저해에 의한 세포사 유도 저해 방법 - Google Patents

단핵식세포계 세포 내에서 ａｇｅ-알부민의 합성 저해 또는 분비 저해에 의한 세포사 유도 저해 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 단핵식세포계 세포 내에서 ＡＧＥ-알부민의 합성 저해 또는 분비 저해에 의한 세포사 유도 저해 방법, ＡＧＥ-알부민의 합성 저해제 및 이를 포함하는 퇴행성질환 및 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 AGE-알부민은 알츠하이머 모델, 뇌졸중 모델, 파킨슨병 모델, 류마티스 관절염 모델의 인간 미세아교세포 또는 대식세포에서 합성 및 분비되며, AGE-알부민의 합성 및 분비가 산화적 스트레스에 의한 것이고, AGE-알부민이 투여된 일차 인간 신경세포 또는 연골세포 등에서 RAGE의 발현양이 증가되고, 이것은 MAPK 신호전달체계를 활성화시킨 후 Bax의 발현양을 증가시켜 미토콘드리아에서 칼슘의 증가를 유도하고, 최종적으로 세포사를 유도한다. 따라서, 본 발명의 ＡＧＥ-알부민의 합성 저해제는, 알츠하이머병, 뇌졸중, 파킨슨병, 루게릭병, 류마티스 관절염, 당뇨성 망막변성, AIDS, 노화, 폐섬유증 또는 척수손상 등의 퇴행성 질환 및 자가 면역 질환의 진단 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

단핵식세포계 세포 내에서 ＡＧＥ-알부민의 합성 저해 또는 분비 저해에 의한 세포사 유도 저해 방법{Method for inhibiting cell death induction by inhibiting synthesis or secretion of AGE-albumin in mononuclear phagocyte system}
본 발명은 단핵식세포계 세포 내에서 ＡＧＥ-알부민의 합성 저해 또는 분비 저해에 의한 세포사 유도 저해 방법, ＡＧＥ-알부민의 합성 저해제 및 이를 포함하는 퇴행성 질환 및 자가 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 등에 관한 것이다.
최근 연구에 의하면, 다양한 질병의 발병 원인은 근원적으로 세포사멸 신호전달 기구의 비정상적인 기능에 기인한다고 알려져 있다. 세포사멸 조절요법 (apoptosis modulating therapy)은 세포사멸 유도 또는 세포사멸 억제를 통하여 비정상적인 세포의 성장과 사멸을 조절하는 것으로, 세포사멸 조절요법의 목적은 비정상적인 세포의 사멸에 의한 질병의 진행을 차단할 뿐만 아니라 비정상적인 세포를 정상 기능의 세포로 전환시킴으로써 근원적으로 질병을 치료하는데 있다. 따라서, 세포성장-사멸의 가역적 제어기술(cell survival-death reversible controlling technology)은 세포사멸 조절요법 개발을 위한 차세대 핵심 기술이다.
전세계에서 경쟁적으로 개발되고 있는 세포사멸 조절요법은 백혈병을 비롯한 암, 알츠하이머병, 파킨슨병, AIDS 및 노화 현상 등의 각종 노인성 및 퇴행성 질환에 적용할 수 있다. 그러나, 최근 연구 결과에서 대부분 질병의 발병이 궁극적으로 세포사멸 신호전달 기구의 비정상적 기능에 기인한다는 사실이 밝혀짐에 따라 세포사멸 조절요법은 더욱 다양한 영역의 질환 치료에 적용될 수 있는 기반 기술이 되고 있다.
세포사멸 조절요법은 암세포와 같이 조절되지 않은 세포의 병리적 성장을 차단하거나, 알츠하이머병 또는 파킨슨병에서와 같이 정상 세포가 과도한 세포사멸을 일으켜 퇴행성 질환이 발발하는 것을 억제함으로써 질병 치료에 이용될 수 있다. 암과 같은 질병의 경우, 기존의 광범위한 세포괴사(necrosis) 약물요법은 병리 세포를 죽임과 동시에 병리 세포의 세포막이 파괴됨으로써 유출되는 세포 독성을 지닌 효소들(예를 들어, 리소자임)이 주변의 정상 세포에까지 세포 독성을 나타내어 과도한 염증 발현을 필연적으로 수반하게 됨으로 그 부작용이 심각하다. 반면, 세포사멸 조절요법은 병리 세포의 자발적인 사멸을 유도하거나 이러한 세포의 성장을 강하게 억제하기 때문에 암세포의 세포사멸에 의해 유도되는 염증성 부작용을 극복할 수 있다. 그 이유는 세포의 성장이 강력히 억제될 때는 세포 분열능이 정상세포보다 월등한 암세포가 상대적으로 더욱 큰 억제 효과를 보이며, 이러한 효과가 극대화되어 세포사멸이 유도되면 세포 독성을 지닌 세포내의 여러 물질들이 세포사멸 과정 동안 카스파제(caspase)라는 효소들에 의해 대부분 절단되어 그 기능을 상실함과 동시에 이러한 물질이 세포사멸체(apoptotic body)에 싸여 대식세포(macrophage)에 의해 식세포작용(phagocytosis)의 과정을 거치게 된다. 이로 인해, 세포 독성 물질들은 외부로 유출되지 않으며, 주변세포에 대한 독성을 나타내지 않게 된다.
예정된 세포사(programmed cell death; apoptosis)는 능동적인 세포사멸 과정으로 에너지를 필요로 하며, 특징적인 세포 형태를 나타낸다. 세포사멸 신호가 전달되면 세포내에서는 세포사멸을 결정하고, 이를 실행하는 단계로 진행되며 실행 단계에서는 세포가 특징적인 생화학적, 형태학적 변화를 나타낸다. 세포사멸이 진행되면 세포가 수축되면서 접하고 있던 주변세포와 떨어지게 되고 세포막이 기포 모양(blebbing)으로 변하게 되며, 더 나아가 핵이 응축(condensation)되고 핵 내의 DNA가 작은 올리고뉴클레오티드 절편으로 잘려지며 세포사멸체를 형성하게 된다. 이렇게 형성된 세포사멸체가 대식세포에 의해 식세포작용과 같은 일련의 과정을 거치면서 세포사멸이 일어나게 된다. 세포사멸은 복잡한 세포 내의 과정으로 세포사멸에 대한 세포 내에서의 결정은 쉽게 이루어지지 않지만, 일단 결정되면 세포사멸이 제대로 작동하기 위해 여러 하위 단계의 과정들이 진행된다. 대부분의 형태학적 변화는 세포사멸 과정에서 활성화 효소인 아스파라긴산 특이적 시스테인 프로테아제(aspartic acid specific cysteine protease)인 카스파제들에 의해 이루어진다.
한편, 알부민은 다기능 특성을 갖는 가장 풍부한 혈장 단백질로, 간세포에서 주로 합성되며, 간질액(interstitial fluid), 림프액 및 뇌척수액을 포함하는 대부분의 세포외액의 주요한 성분이다. 생체내에서 알부민이 감소되면 간기능 저하 및 영양상태가 불량하게 되므로, 임상학적으로 알부민은 중환자 및 간경변 환자의 혈관허탈(vascular collapse)을 포함하는 위독한 상태에서 광범위하게 사용되고 있다. 또한, 최근에는 알부민이 질병의 중요한 진단 또는 예후 지표인 저분자량 분자에 특이적으로 결합한다고 암시하고 있다. 예를 들어, 알부민은 분자 확산에 의해 혈뇌 장벽을 통해 뇌로 들어가고, 알츠하이머 유발 물질인 아밀로이드베타 1-42(Aβ1-42)에 특이적으로 결합하여 Aβ1-42를 수송하기 때문에 알츠하이머 질병을 암시할 수 있다고 보고되어 있다. 본 발명자들은 알부민이 단핵식세포계 세포의 한 종류인 인간 뇌의 미세아교세포(microglial cell)에서 합성되고, 이러한 알부민의 합성과 세포 밖으로의 분비가 Aβ1-42의 투여에 의해 증가된다는 연구결과를 2008년도 저널에 보고하였다[Ahn S-M, Byun K, Cho K, Kim JY, Yoo JS, et al. (2008) Human Microglial Cells Synthesize Albumin in Brain. PLoS ONE 3(7): e2829].
또한, 최종당화산물(advanced glycation end-product; AGE)은 인체 내에서 끊임없이 발생하는 복합물질로 주로 탄수화물과 유리 아미노산의 반응에 의해 발생하며, 화학적으로 매우 불안정하고 반응성이 강한 물질이기 때문에 신경세포의 사멸을 촉진시키는 분자로 알려져 있다. 또한, 최종당화산물은 노인이나 노화된 동물의 뇌에서 증가되는 것으로 보고되어 있으며, 모든 세포와 생체 분자에 영향을 미쳐 노화 및 노화 관련 만성 질환의 원인이 된다. 즉, 최종당화산물은 혈관 투과성 증가, 산화 질소 방해에 의한 혈관 확장 억제, LDL 산화, 대식세포 또는 내피세포 등에서 여러 종류의 사이토카인 분비, 및 산화 스트레스를 증가시킴으로써, 노화, 알츠하이머병, 신장질환, 당뇨병, 당뇨병성 혈관 합병증, 당뇨병성 망막 이상 및 당뇨병성 신경 이상 등과 같은 성인병들과 관련이 있는 것으로 알려져 있다.
상기한 바와 같이, AGE는 노인이나 노화된 동물의 뇌에서 증가된다고 알려져 있으므로, 신경세포의 사멸을 촉진하여 알츠하이머병 등의 퇴행성 질환에 영향을 미칠 수 있을 것이라고 많은 연구자들에 의해 제안되어 왔다. 그러나, 이러한 연구 결과에도 불구하고 AGE의 주요 합성 기전이나 주로 분비되는 곳에 대해서는 아직까지 규명되지 않고 있다.
따라서, AGE의 주요 합성 기전과 기원에 대해 규명하면 세포사 유도를 저해할 수 있어 다양한 질병의 원인을 찾을 수 있을 것으로 생각된다. 따라서, 다양한 질병의 원인을 규명할 수 있는 AGE의 주요 합성 기전에 대한 연구의 필요성이 요구되고 있다.
본 발명자들은 AGE의 주요 합성 기전에 대해 규명하여 세포사 유도를 저해하는 방법에 대해 연구하던 중, 알츠하이머 모델, 뇌졸중 모델, 파킨슨병 모델, 류마티스 관절염 모델의 인간 미세아교세포 또는 대식세포에서 AGE-알부민이 합성 및 분비되며, AGE-알부민의 합성 및 분비가 산화적 스트레스에 의한 것이고, Aβ1-42로 처리한 랫트의 뇌조직과 알츠하이머 환자의 뇌조직에서 AGE-알부민이 Aβ1-42의 응집을 유도하며, 인간 미세아교세포 또는 대식세포에서 합성 및 분비된 AGE-알부민이 일차 인간 신경세포 또는 연골세포 등에 작용하여 RAGE의 발현양을 증가시키고, 이것은 MAPK 신호전달체계를 활성화시킨 후 Bax의 발현양을 증가시켜 미토콘드리아에서 칼슘의 증가를 유도하고, 최종적으로 세포사를 유도하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 단핵식세포계 세포 내에서 ＡＧＥ-알부민의 합성 저해 또는 분비 저해에 의한 세포사 유도 저해 방법을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 ＡＧＥ-알부민의 합성 저해 활성을 갖는 화합물을 포함하는 ＡＧＥ-알부민의 합성 저해제를 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 ＡＧＥ-알부민의 합성 저해제를 유효성분으로 함유하는 퇴행성 질환 및 자가 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 ＡＧＥ-알부민의 합성 저해제의 치료적 유효량을 개체에게 투여하여 퇴행성 질환 및 자가 면역 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 AGE-알부민은 알츠하이머 모델, 뇌졸중 모델, 파킨슨병 모델, 류마티스 관절염 모델의 인간 미세아교세포 또는 대식세포에서 합성 및 분비되며, AGE-알부민의 합성 및 분비가 산화적 스트레스에 의한 것이고, AGE-알부민이 투여된 일차 인간 신경세포 또는 연골세포 등에서 RAGE의 발현양이 증가되고, 이것은 MAPK 신호전달체계를 활성화시킨 후 Bax의 발현양을 증가시켜 미토콘드리아에서 칼슘의 증가를 유도하고, 최종적으로 세포사를 유도한다. 따라서, 본 발명의 ＡＧＥ-알부민의 합성 저해제는, 알츠하이머병, 뇌졸중, 파킨슨병, 루게릭병, 류마티스 관절염, 당뇨성 망막변성, AIDS, 노화, 폐섬유증 또는 척수손상 등의 퇴행성 질환 및 자가 면역 질환의 진단 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 단핵식세포계 세포 내에서 AGE-알부민의 합성 저해 또는 분비 저해에 의한 단핵식세포계 세포 주변에 있는 세포의 세포사 유도 저해 방법을 간략히 나타낸 모식도이다.
도 2는 Aβ1-42 처리 전 또는 후의 인간 미세아교세포 및 랫트의 뇌조직, 정상인 또는 알츠하이머 환자의 뇌조직에서 AGE-알부민의 분포 및 발현 위치를 항체를 이용하여 염색한 후 레이저 공초점 형광현미경으로 관찰한 도이다.
도 3은 Aβ1-42 처리 전 또는 후의 인간 미세아교세포 및 랫트의 뇌조직, 정상인 또는 알츠하이머 환자의 뇌조직에서 측정된 AGE-알부민의 밀도를 나타낸 도이다.
도 4는 알츠하이머 환자의 뇌조직에서 AGE-알부민의 분포 및 발현 위치를 항체를 이용하여 염색한 후 레이저 공초점 형광현미경으로 관찰한 도이다[AGE(적색), 알부민(녹색), 미세아교세포 표지자인 Iba1(푸른색), 성상교세포 표지자인 MBP(푸른색), 희소돌기아교세포 표지자인 Olig2(푸른색), 신경세포 표지자인 NeuroD(푸른색)].
도 5는 인간 미세아교세포에서 AGE-알부민의 합성양을 공-면역침전법으로 확인한 도이다.
도 6은 인간 미세아교세포 내와 배양 배지로 분비된 AGE-알부민의 발현양을 ELISA를 이용하여 확인한 도이다.
도 7은 인간 미세아교세포에서 AGE-알부민의 합성과 분비가 산화적 스트레스에 의한 것인지를 면역 블롯팅 분석을 통해 확인한 도이다.
도 8은 Aβ1-42로 처리한 랫트의 뇌조직과 알츠하이머 환자의 뇌조직의 미세아교세포에서 합성 및 분비된 AGE-알부민이 Aβ1-42의 응집을 유도하는지를 ThT 형광분석법을 이용하여 관찰한 도이다.
도 9는 인간 미세아교세포에 AGE-알부민을 투여한 후 Aβ1-42의 양을 ELISA 분석법을 이용하여 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 인간 미세아교세포에 AGE-알부민을 투여한 후 BACE, ADAM10, APP의 발현 위치와 발현양을 각각 면역염색화학(A)과 면역 블롯팅(B)을 이용하여 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 일차 인간 신경세포에 AGE-알부민을 투여한 후 RAGE, ERK1/2, pERK1/2, p38, pp38, SAPK/JNK, pSAPK/JNK, Bax의 발현 위치를 면역염색화학을 이용하여 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 일차 인간 신경세포에 AGE-알부민을 투여한 후 RAGE, ERK1/2, pERK1/2, p38, pp38, SAPK/JNK, pSAPK/JNK, Bax의 발현양을 면역 블롯팅 방법을 이용하여 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 AGE-알부민을 일차 인간 신경세포에 처리하기 전 또는 후의 세포 용해물을 이용하여 AGE와 RAGE의 상호작용을 확인한 도이다.
도 14는 일차 인간 신경세포에 AGE-알부민을 투여한 후 미토콘드리아에서 칼슘 변화를 레이저 공초점 형광현미경으로 관찰한 도이다.
도 15는 일차 인간 신경세포에 AGE-알부민을 투여한 후 MTT assay를 이용하여 세포생존율을 측정한 도이다.
도 16은 Aβ1-42 처리 전 또는 후의 마우스의 혈액단핵세포에서 AGE-알부민의 분포 및 발현 위치를 항체를 이용하여 염색한 후 레이저 공초점 형광현미경으로 관찰한 도이다.
도 17은 랫트의 뇌에 Aβ1-42 단독으로 또는 Aβ1-42와 sRAGE(Aβ/sRAGE)를 함께 처리하고 72시간 후 랫트의 뇌에 있는 신경세포의 수를 크레실 바이올렛 (cresyl violet)으로 염색한 후 현미경으로 관찰한 도이다.
도 18은 Aβ1-42 단독으로 또는 Aβ1-42와 sRAGE(Aβ/sRAGE)를 함께 처리한 랫트의 뇌조직에서 AGE(적색), 알부민(녹색), 미세아교세포(microglia cell) 표지자인 Iba1(푸른색), 및 AGE-알부민의 분포 및 발현 위치를 항체를 이용하여 염색한 후 레이저 공초점 형광현미경으로 관찰한 결과(A)와 AGE-알부민의 밀도(B)를 나타낸 도이다.
도 19는 Aβ1-42 단독으로 또는 Aβ1-42와 sRAGE(Aβ/sRAGE)를 함께 처리한 랫트의 뇌조직에서 RAGE, NeuN, DAPI, Bax 및 p-SAPK/JNK의 분포 및 발현 위치를 항체를 이용하여 염색한 후 레이저 공초점 형광현미경으로 관찰한 도이다.
도 20은 뇌졸중 환자의 뇌조직에서 AGE-알부민의 분포 및 발현 위치를 항체를 이용하여 염색한 후 레이저 공초점 형광현미경으로 관찰한 도이다.
도 21은 저산소증과 포도당-결핍된 뇌졸중 모델의 인간 미세아교세포에서 저산소증 유발인자(HIF-1α)의 발현을 면역조직화학법(IHC)(A), PCR (B), 면역블롯팅(C)을 수행하여 확인한 도이다.
도 22는 저산소증과 포도당-결핍된 뇌졸중 모델의 인간 미세아교세포에서 HMGB1(high motility group protein B1)의 발현을 면역조직화학법(IHC)(A), PCR(B), 면역블롯팅(C)을 수행하여 확인한 도이다.
도 23은 저산소증과 포도당-결핍된 뇌졸중 모델의 인간 미세아교세포에서 AGE-알부민의 발현양을 면역조직화학법(IHC)(A), 면역블롯팅(B,C) 및 ELISA(D)를 수행하여 확인한 도이다.
도 24는 저산소증과 포도당-결핍된 뇌졸중 모델의 인간 미세아교세포에서 HMGB1의 농도(0, 50, 200, 500, 2000ng/㎖) 변화에 따른 AGE-알부민의 발현양을 면역조직화학법(IHC)(A), ELISA(B) 및 면역블롯팅(C)을 수행하여 확인한 도이다.
도 25는 저산소증과 포도당-결핍된 뇌졸중 모델의 인간 미세아교세포에 HMGB1 저해제인 글리시리진(glycyrrhizic acid)의 농도(0, 50, 200, 500, 2000ng/㎖) 변화에 따른 AGE-알부민의 발현양을 ELISA 및 면역블롯팅을 수행하여 확인한 도이다.
도 26은 저산소증과 포도당-결핍된 뇌졸중 모델의 인간 미세아교세포에서 AGE-알부민의 합성과 분비가 산화적 스트레스에 의한 것인지 면역블롯팅 분석을 수행하여 확인한 도이다.
도 27은 인간의 뇌조직으로부터 얻은 일차 인간 신경세포에 AGE-알부민을 투여한 후 RAGE, ERK1/2, p-ERK1/2, p38, p-p38, SAPK/JNK, p-SAPK/JNK, Bax의 발현양을 면역 블롯팅 방법을 이용하여 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 28은 일차 인간 신경세포에 AGE-알부민을 투여한 후 MTT assay를 이용하여 세포생존율을 측정한 결과(A)와 신경세포사에 대한 sRAGE의 보호 효과(B)를 나타낸 도이다.
도 29는 파킨슨병 환자의 뇌조직에서 AGE-알부민의 분포 및 발현 위치를 항체를 이용하여 염색한 후 레이저 공초점 형광현미경으로 관찰한 도이다.
도 30은 인간 미세아교세포에 파킨슨병 유발물질인 로테논(rotenone) 또는 6-히드록시도파민(6-hydroxydopamine; 6-OHDA)을 처리한 후 α-시누클레인 또는 TNF-α의 발현 정도를 PCR(A,B)과 면역블롯팅 분석(C,D)을 통해 확인한 도이다.
도 31은 인간 미세아교세포에 0~100nM의 로테논을 처리한 후 세포 용해물 및 세포 배양물을 이용하여 AGE-알부민의 합성 및 분비 여부를, ELISA 및 면역블롯팅 분석을 통해 확인한 도이다.
도 32는 인간 미세아교세포에 파킨슨병 유발물질인 로테논을 처리한 후 산화적 스트레스를 가하여 α-시누클레인 또는 AGE-알부민의 발현양을 면역블롯팅 분석을 통해 확인한 도이다.
도 33은 도파민신경세포에 sRAGE를 처리하거나 처리하지 않은 다음, AGE-알부민을 도파민신경세포에 처리하기 전 또는 후의 세포 용해물을 이용하여 RAGE, Bax, SAPK/JNK, pSAPK/JNK, p38, ERK1/2, pERK1/2의 발현양을 면역 블롯팅 분석을 통해 확인한 도이다.
도 34는 마우스의 뇌조직에 PBS, 로테논, 로테논/sRAGE을 처리하고 1주일과 한달 후에 마우스의 뇌조직에 있는 신경세포의 수를 크레실 바이올렛(cresyl violet)으로 염색한 후 현미경으로 관찰한 도이다.
도 35는 마우스의 뇌조직에 PBS, 로테논, 로테논/sRAGE을 처리하고 1주일과 한달 후에 마우스의 뇌조직에 있는 AGE-알부민, RAGE, Bax의 분포 및 발현 위치를 형광면역염색한 후 레이저 공초점 형광현미경으로 관찰한 도이다.
도 36은 인간 대식세포주(U937)에 β2-마이크로글로불린을 처리한 후 세포 용해물 또는 세포 배양물을 이용하여 TNF-α와 IL-1β의 발현 정도와 AGE-알부민의 합성 및 분비 여부를, 면역블롯팅 및 ELISA를 통해 확인한 도이다.
도 37은 연골세포에 AGE-알부민 단독으로 또는 AGE-알부민/sRAGE를 함께 투여한 후 MTT assay를 이용하여 세포생존율을 측정한 도이다.
도 38은 알츠하이머병 모델의 인간 미세아교세포에서 AGE-알부민의 합성을 저해하는 후보물질을 LOPAC 1280종의 화합물로부터 선별하고, 후보물질의 ELISA 측정결과를 나타낸 도이다.
도 39는 파킨슨병 모델의 인간 미세아교세포에서 AGE-알부민의 합성을 저해하는 후보물질을 LOPAC 1280종의 화합물로부터 선별하고, 후보물질의 ELISA 측정결과를 나타낸 도이다.
도 40은 마우스의 뇌조직에 PBS, 로테논, 로테논/세파클러, 로테논/세팔로틴 나트륨을 처리하고 1주일과 한달 후에 마우스의 뇌조직에 있는 신경세포의 수를 크레실 바이올렛(cresyl violet)으로 염색한 후 현미경으로 관찰한 도이다.
도 41은 마우스의 뇌조직에 PBS, 로테논, 로테논/세파클러, 로테논/세팔로틴 나트륨을 처리하고 1주일과 한달 후에 마우스의 뇌조직에 있는 AGE-알부민, RAGE, Bax의 분포 및 발현 위치를 형광면역염색한 후 레이저 공초점 형광현미경으로 관찰한 도이다.
본 발명은 단핵식세포계 세포 내에서 ＡＧＥ(advanced glycation end-product; 최종당화산물)-알부민의 합성 저해 또는 분비 저해에 의한 세포사 유도 저해 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 ＡＧＥ-알부민의 합성 저해 활성을 갖는 화합물을 포함하는 ＡＧＥ-알부민의 합성 저해제를 제공한다.
또한, 본 발명은 ＡＧＥ-알부민의 합성 저해제를 유효성분으로 함유하는 퇴행성 질환 및 자가 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 ＡＧＥ-알부민의 합성 저해제의 치료적 유효량을 개체에게 투여하여 퇴행성 질환 및 자가 면역 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 세포사 유도 저해 방법은, 단핵식세포계 세포 내에서 AGE-알부민의 합성 또는 분비를 저해하여 단핵식세포계 세포 주변에 있는 세포의 세포사 (cell death) 유도를 저해하는 것을 특징으로 한다.
상기 세포사는 크게 괴사(necrosis)와 아폽토시스(apoptosis)로 나뉜다. 괴사는 화상, 타박, 독극물 등의 자극에 의해 일어나는 세포의 죽음으로, 일명 세포의 사고사라고 할 수 있다. 괴사의 경우에는 세포 밖에서 수분이 유입됨으로써 세포가 팽창하여 파괴된다. 종래에는, 세포의 죽음을 모두 괴사라고 생각하였다. 그러나, 최근 30여년 사이에 세포에는 자발적인 죽음을 일으키는 유발인자가 있다는 사실이 알려졌다. 유전자에 제어되는 이와 같은 능동적인 세포의 죽음이 아폽토시스이다. 괴사가 오랜 시간에 걸쳐 무질서하게 일어나는데 반해, 아폽토시스는 단시간에 질서있게 일어난다. 아폽토시스는 세포가 축소되면서 시작된다. 이후 인접하는 세포 사이에 틈새가 생기고, 세포 내에서는 DNA가 규칙적으로 절단되어 단편화 된다. 마지막에 세포 전체도 단편화되어 아폽토시스 소체로 된 후 가까이에 있는 세포에게 먹힘으로써 죽음에 이르게 된다. 아폽토시스는 발생 과정에서 몸의 형태 만들기를 담당하고, 성체에서는 정상적인 세포를 갱신하거나 이상이 생긴 세포를 제거하는 일을 담당하고 있다. 동물의 몸 안에서 일어나는 발생, 분화의 과정에서 유전적인 프로그램에 의해 일어나는 세포사를 예정된 세포사(PCD; programed cell death)라고 한다. 예정된 세포사는 발생의 어느 단계에서 치사 유전자가 움직이기 시작하여 그 세포가 죽은 경우 등이다. 사람의 경우에는 태아의 초기에 손이나 발은 주걱 모양을 하고 있어 발가락이나 손가락 사이가 벌어지지 않고 있다가 후기에 그 사이에 해당하는 부분에 있던 세포가 에정된 세포사 함으로써 손가락이나 발가락의 형태가 생긴다. 퇴행성 질환은 상기 두가지 형태의 세포를 동반한다고 알려져 있다.
상기 단핵식세포계 세포는 아밀로이드베타 1-42(Aβ1-42), HMGB1, 로테논 (rotenone) 또는 6-히드록시도파민(6-hydroxydopamine; 6-OHDA), β2-마이크로글로불린(β2-microglobulin) 등에 의해 활성화되어 있는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 세포사되는 세포는 단핵식세포계 세포 주변에 있는 세포가 바람직하며, 상기 단핵식세포계 세포 주변에 있는 세포는 신경세포, 연골세포, 폐세포 및 간세포 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 AGE-알부민의 합성 저해 또는 분비 저해는 알부민 siRNA, 알부민 항체, AGE 항체, AGE-알부민 항체 및 AGE-알부민 합성 저해제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종을 이용하여 저해될 수 있다.
상기 단핵식세포계 세포의 종류로는 뇌의 미세아교세포, 혈액단핵세포, 폐포대식세포(type Ⅱ pneumocyte, dust cell), 복강대식세포, 염증부위 육아종대식세포, 비장대식세포, 간의 쿠퍼세포, 관절활액막 A 세포(synovial A cell), 혈관외막세포, 림프절내 대식세포, 피부의 랑거한스 세포(Langehans cell) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 단핵식세포계 세포 내에서 AGE-알부민의 합성 저해 또는 분비 저해에 의한 단핵식세포계 세포 주변에 있는 세포의 세포사 유도 저해 방법은 도 1에 간략히 나타내었다.
알츠하이머 모델, 뇌졸중 모델, 파킨슨병 모델, 류마티스 관절염 모델의 인간 미세아교세포, 대식세포, 뇌조직 또는 연골에서 알부민과 AGE가 같은 위치에서 염색되고, 넓게 분포되어 있으며, AGE-알부민의 발현양 및 밀도가 정상인의 뇌조직 또는 연골에서보다 현저히 증가하고, 미세아교세포 표지자인 Iba1도 AGE-알부민과 같은 위치에서 발현되므로, 대부분의 AGE-알부민이 인간 미세아교세포 또는 대식세포에서 합성된다는 것을 예상할 수 있다.
또한, 알츠하이머 모델, 뇌졸중 모델, 파킨슨병 모델, 류마티스 관절염 모델의 인간 미세아교세포 또는 대식세포에 아밀로이드베타 1-42(Aβ1-42), HMGB1, 로테논 또는 6-히드록시도파민, β2-마이크로글로불린을 처리한 경우 AGE-알부민의 발현양이 증가한다. 또한, 알츠하이머 모델, 뇌졸중 모델, 파킨슨병 모델, 류마티스 관절염 모델의 인간 미세아교세포에 과산화수소(H2O2)를 처리한 경우 과산화수소의 농도가 증가할수록 AGE-알부민의 발현양이 증가하고, 인간 미세아교세포에 항산화제인 아스코르빈산을 처리한 경우 AGE-알부민의 발현양이 현저히 감소한다. 또한, 인간 미세아교세포에 산화적 스트레스를 가하면 Aβ1-42가 축적되고, 이로 인해 AGE-알부민의 합성이 증가됨으로, 인간 미세아교세포에서 AGE-알부민의 합성과 분비가 산화적 스트레스에 의한 것임을 알 수 있다.
또한, AGE-알부민은 일차 인간 신경세포 또는 연골세포에 작용하여 RAGE의 발현양을 증가시키고, 이것은 MAPK 신호전달체계를 활성화시킨 후 Bax의 발현양을 증가시켜 미토콘드리아에서 칼슘의 증가를 유도하고, 최종적으로 세포사를 유도한다. 그러나, AGE-알부민과 sRAGE를 함께 투여한 경우 세포사가 감소한다. 따라서, sRAGE가 세포사에 대해 보호 효과를 갖는다는 것을 알 수 있다.
상기한 바와 같이, AGE-알부민은 알츠하이머 모델, 뇌졸중 모델, 파킨슨병 모델, 류마티스 관절염 모델의 인간 미세아교세포 또는 대식세포에서 합성 및 분비되며, AGE-알부민의 합성 및 분비가 산화적 스트레스에 의한 것이고, AGE-알부민이 투여된 일차 인간 신경세포 또는 연골세포 등에서 RAGE의 발현양이 증가되고, 이것은 MAPK 신호전달체계를 활성화시킨 후 Bax의 발현양을 증가시켜 미토콘드리아에서 칼슘의 증가를 유도하고, 최종적으로 세포사를 유도한다.
따라서, 본 발명에서는 알츠하이머 모델, 뇌졸중 모델, 파킨슨병 모델, 류마티스 관절염 모델의 인간 미세아교세포 또는 대식세포에서 AGE-알부민의 합성 저해 활성을 갖는 물질을 LOPAC(sigma) 1280종의 화합물로부터 총 42종의 화합물을 선별하였으며, 이들 화합물의 AGE-알부민의 합성 저해 활성이 대조군과 유사하게 나타남을 확인하였다. 따라서, 상기 선별된 AGE-알부민의 합성 저해제는, 알츠하이머병, 뇌졸중, 파킨슨병, 루게릭병, 류마티스 관절염, 당뇨성 망막변성, AIDS, 노화, 폐섬유증 또는 척수손상 등의 퇴행성 질환 및 자가 면역 질환의 진단 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 AGE-알부민의 합성 저해제와 함께 퇴행성 질환 및 자가 면역 질환의 예방 또는 치료 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로오스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 상기 AGE-알부민의 합성 저해제의 일일 투여량은 약 0.1~10㎎/㎏, 바람직하게는 약 0.5~2㎎/㎏이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 조성물은 퇴행성 질환 및 자가 면역 질환의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명은 AGE-알부민의 합성 저해제를 치료적 유효량으로 개체에게 투여하여 퇴행성 질환 및 자가 면역 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 알츠하이머 환자의 뇌조직에서 AGE-알부민의 분포 및 발현 위치
정상 또는 알츠하이머 모델의 미세아교세포, 정상인 또는 알츠하이머 환자의 뇌조직, 및 정상 또는 알츠하이머 동물모델의 뇌조직에서 AGE-알부민의 분포 및 발현 위치를 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
1. 세포배양
in vitro 연구를 위해, 불멸화 인간 미세아교세포주(immortalized human microglial cell line; HMO6)를 사용하였다. HMO6 세포를 10% 열-불활성화된 FBS (fetal bovine serum, Gibco) 및 20㎎/㎖의 겐타마이신(Sigma-Aldrich)이 첨가된 고농도의 글루코오스를 함유한 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium, Gibco)에서 성장시키고, HMO6 세포를 5% CO2, 37℃로 유지시켰다. 그 다음 HMO6 세포를 0~400nM의 아밀로이드베타 1-42(Aβ1-42, Sigma-Aldrich)로 처리하였다. 추가 분석을 위해 HMO6 세포를 Aβ1-42로 처리한 후 6시간째에 세포를 채취하였다.
2. 면역형광표지법(immunocytochemistry, ICC)
세포를 Lab-Tek Ⅱ chamber slides(Nunc)에서 성장시키고, PBS로 세척한 다음, 메탄올에서 15분 동안 고정시키고 다시 PBS로 세척하였다. 슬라이드 챔버 위에 고정된 세포를 하기와 같은 일차 항체와 함께 각각 4℃에서 밤새도록 배양하였다: 토끼 항-AGE 항체(1:200, Abcam), 마우스 항 인간-알부민 항체(1:200, R&D system), 항-BACE 항체(1:50, Santa Cruz), 항-ADAM10 항체(1:200, R&D system), 항-APP 항체(1:200, Chemicon), 항-RAGE 항체(1:50, Santa Cruz), 또는 항-미토콘드리아 항체(1:50, abcam). 배양 후, 일차 항체를 PBS로 3번 세척하였고, 슬라이드를 하기와 같은 이차 항체 중 하나와 함께 실온에서 1시간 동안 배양하였다: Alexa flour 633 anti-mouse IgG(1:500, Invitrogen), Alexa flour 488 anti-rabbit IgG (1:500, Invitrogen), 또는 Alexa flour 555 anti-goat IgG(1:500, Invitrogen). 이차 항체를 10분 간격으로 PBS로 3번 세척한 후, 커버슬립을 Vectashield mounting medium(Vector Laboratories)을 사용하여 글라스 슬라이드 위에 설치하고, 레이저 공초점 형광현미경(LSM-710, Carl Zeiss)으로 관찰하였다.
3. 면역조직화학(immunohistochemistry, IHC)
정상 또는 알츠하이머 랫트의 뇌조직, 및 정상인 또는 알츠하이머 환자의 뇌조직에서 면역조직화학을 수행하였다[S. M. Ahn et al., PLoS ONE 3, e2829 (2008)]. 정상인 또는 알츠하이머 환자의 뇌조직은 서울대학병원 뇌은행과 니가타 대학병원의 뇌은행으로부터 얻었다. 구체적으로는, 정상 또는 알츠하이머 랫트의 뇌조직, 및 정상인 또는 알츠하이머 환자의 뇌조직을 0.1M 중성 인산염완충용액 내 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 30% 수크로오스 용액에서 밤새도록 냉동보관한 다음, 저온유지장치(cryostat, Leica CM 1900)로 10㎛ 절편을 준비하였다. 파라핀-포매 뇌조직을 4㎛ 두께의 절편으로 절단하고, 자일렌에서 탈파라핀시킨 후, 일련의 등급 에탄올로 재수화하였다. 정상 염소 혈청(10%)을 사용하여 비특이적 단백질 결합을 차단하였다. 조직 절편을 하기 항체들 중 하나와 함께 4℃에서 밤새도록 배양하였다: 토끼 항-AGE 항체(Abcam), 마우스 항-인간 알부민 항체(1:200, R&D System), 염소 항-Iba1 항체(1:500, Abcam), 항-MBP 항체(1:200, Chemicon), 항-Olig2 항체(1:100, R&D System), 항-NeuroD1 항체(1:200, R&D System), 항-BACE 항체(1:50, SantaCruz), 항-ADAM10 항체(1:200, R&D System), 항-APP 항체(1:200, Chemicon), 항-JNK 항체(1:200, Cell Signaling), 항-p-JNK 항체(1:200, Cell Signaling), 및 항-Bax 항체(1:50, SantaCruz). 상기 배양된 조직 절편을 PBS로 3번 세척하고, Alexa flour 633 anti-mouse IgG(1:500, Invitrogen), Alexa flour 488 anti-rabbit IgG(1:500, Invitrogen), 또는 Alexa flour 555 anti-goat IgG (1:500, Invitrogen)와 함께 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 이차 항체를 PBS로 3번 세척한 후, 커버슬립을 Vectashield mounting medium(Vector Laboratories)를 사용하여 글라스 슬라이드 위에 설치하고, 레이저 공초점 형광현미경(LSM-710, Carl Zeiss)으로 관찰하였다. 즉, Aβ1-42 처리 전 또는 후의 미세아교세포 및 랫트의 뇌조직, 정상인 또는 알츠하이머 환자의 뇌조직에서 AGE(적색), 알부민(녹색) 및 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)(푸른색), AGE-알부민을 염색하여 이들의 분포 및 발현 위치를 레이저 공초점 형광현미경으로 관찰하였고, AGE-알부민의 밀도를 측정하였다. 기타 염색 방법은 상기 면역형광표지법(ICC)과 동일하게 하였다.
Aβ1-42 처리 전 또는 후의 인간 미세아교세포 및 랫트의 뇌조직, 정상인 또는 알츠하이머 환자의 뇌조직에서 AGE-알부민의 분포 및 발현 위치를 항체를 이용하여 염색한 후 레이저 공초점 형광현미경으로 관찰한 결과는 도 2에 나타내었으며, AGE-알부민의 밀도는 도 3에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, Aβ1-42 처리 전 또는 후의 인간 미세아교세포 및 랫트의 뇌조직, 정상인 또는 알츠하이머 환자의 뇌조직에서 알부민(녹색)과 AGE(적색)가 같은 위치에서 염색됨을 확인하였다. 이때, 알부민은 대부분 당화된 알부민이다. 또한, Aβ1-42를 처리한 인간 미세아교세포 및 랫트의 뇌조직(대뇌피질), 알츠하이머 환자의 뇌조직(대뇌피질)에서 알부민과 AGE가 넓게 분포되어 있으며, AGE-알부민의 발현양이 현저히 증가하는 것을 관찰하였다.
또한, 도 3에 나타난 바와 같이, Aβ1-42를 처리한 미세아교세포 및 랫트의 뇌조직, 알츠하이머 환자의 뇌조직에서의 AGE-알부민의 밀도는 Aβ1-42를 처리하지 않은 인간 미세아교세포 및 랫트의 뇌조직, 정상인의 뇌조직에서의 AGE-알부민의 밀도보다 현저히 증가하였으며, 특히 알츠하이머 환자의 뇌조직에서의 AGE-알부민의 밀도는 정상인의 뇌조직에서의 AGE-알부민의 밀도보다 약 3.4배 이상 증가하는 것을 확인하였다.
실시예 2 : 알츠하이머 환자의 뇌조직에서 AGE-알부민의 분포 및 발현 위치의 재확인
AGE-알부민이 Aβ1-42를 처리한 랫트의 뇌조직 및 알츠하이머 환자의 뇌조직에서 증가하는 것을 확인한 후, AGE-알부민의 분포 및 발현 위치를 재확인하기 위하여 알츠하이머 환자의 뇌조직에서 면역조직화학(IHC)을 수행하였다. 즉, 알츠하이머 환자의 뇌조직에서 AGE(적색), 알부민(녹색), 미세아교세포(microglia cell) 표지자인 Iba1(푸른색), 성상교세포(astrocyte cell) 표지자인 MBP(푸른색), 희소돌기아교세포(oligodendrocyte cell) 표지자인 Olig2(푸른색), 신경세포(neuronal cell) 표지자인 NeuroD(푸른색), 및 AGE-알부민을 염색하여 이들의 분포 및 발현 위치를 레이저 공초점 형광현미경으로 관찰하였다.
결과는 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 알츠하이머 환자의 뇌조직에서 미세아교세포 표지자인 Iba1은 AGE-알부민과 같은 위치에서 발현되었으나, 성상교세포 표지자인 MBP, 희소돌기아교세포 표지자인 Olig2, 및 신경세포 표지자인 NeuroD은 AGE-알부민과 같은 위치에서 발현되지 않았다. 따라서, 대부분의 AGE-알부민이 미세아교세포에서 합성된다는 것을 예상할 수 있다.
실시예 3 : 인간 미세아교세포에서 AGE-알부민의 합성 및 분비
인간 미세아교세포에서 AGE-알부민이 합성 및 분비되는지 확인하기 위하여, 공-면역침전법과 ELISA를 이용하여 AGE-알부민의 발현양을 측정하였다.
1. 공-면역침전법
인간 미세아교세포를 0~400nM의 Aβ1-42로 처리한 후 세포 용해물을 이용하여 면역블롯팅 분석을 수행하였다. 구체적으로는, 세포 용해물을 1M Tris(pH 7.5), 5M NaCl, 10% NP-40, 10% 데옥시콜레이트 및 프로테아제 저해제 칵테일 (Calbiochem)을 함유하는 RIPA(radioimmunoprecipitation assay) 완충용액으로 준비하였다. 세포 용해물(1㎎ 단백질)을 500㎖의 PBS에서 5㎎의 항-AGE(Abcam)-결합된 세파로오스 비드와 함께 4℃에서 밤새도록 배양하였다. 세파로오스 비드를 5분 동안 14,000rpm에서 원심분리하여 침전시키고, 50mM Tris-Cl 및 500mM NaCl(pH 8.0)을 함유한 세척 완충용액 1㎖로 3번 세척하였다. IgG-결합된 항원-항체 복합체를 4~12% 폴리아크릴아미드 겔(Invitrogen)로 분리하고, 항-알부민 항체(1:1000, abcam)로 면역블롯팅 분석을 수행하였다.
결과는 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 인간 미세아교세포에서 Aβ1-42의 농도가 증가할수록 AGE-알부민의 발현양이 증가하였다.
2. 세포내와 배양 배지로 분비된 AGE-알부민의 발현양(ELISA)
이미 합성된 알부민을 알부민 항체로 제거한 후, 세포내와 배양 배지로 분비된 AGE-알부민의 발현양을 ELISA를 이용하여 측정하였다. 구체적으로는, 인간 미세아교세포를 0~400nM의 Aβ1-42로 처리한 후, 세포 용해물(0.5㎎ 단백질) 및 배양 배지(0.1㎎ 단백질)를 이용하여 측정하였다. AGE-알부민의 양은 토끼 항-AGE 항체 (1:1000, Abcam) 및 마우스 항-인간 알부민 항체(1:800, Abcam)로 측정하였다. HRP 결합된 항-마우스 이차 항체(1:1000, Vector Laboratories)를 각 웰에 첨가하였다. 각 웰에 TMB(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘)를 가하여 발색시키고, 같은 부피의 2M H2SO4로 정지시켰다. 그 다음 ELISA 플레이트 리더(VERSA Max, Molecular Devices)를 이용하여 450㎚에서 흡광도를 측정하였다.
결과는 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, Aβ1-42를 처리한 인간 미세아교세포의 세포 용해물에서 AGE-알부민의 양은 Aβ1-42를 처리하지 않은 인간 미세아교세포의 세포 용해물에서 보다 현저히 증가하였다. 그러나, 세포 용해물에 알부민 항체를 반응시킨 경우 AGE-알부민의 양이 감소하였고, 세포 용해물에 알부민 항체와 Aβ1-42를 동시에 처리한 경우는 AGE-알부민의 양이 정상보다 증가하는 것을 관찰하였다.
상기 결과에 의해, AGE-알부민은 인간 미세아교세포에서 합성 및 분비된다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4 : 인간 미세아교세포에서 산화적 스트레스에 의해 AGE-알부민의 합성과 분비 증가
Aβ1-42는 오랜 기간 동안 산화적 스트레스에 의해 축척되는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 실험에서는 인간 미세아교세포에서 AGE-알부민의 합성과 분비가 산화적 스트레스에 의한 것인지 확인하기 위하여, 인간 미세아교세포에 산화적 스트레스 유도물질인 0~1000μM의 과산화수소(H2O2)를 처리한 후 세포 용해물을 이용하여 면역블롯팅 분석을 수행하였다. 또한, 인간 미세아교세포에 항산화제를 처리하여 AGE-알부민의 발현양이 감소하는지를 면역블롯팅 분석을 통해 확인하였다.
결과는 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, 인간 미세아교세포에 과산화수소(H2O2)를 처리한 경우 과산화수소의 농도가 증가할수록 AGE-알부민의 발현양이 증가하였다. 또한, 인간 미세아교세포에 항산화제인 아스코르빈산을 처리한 경우 AGE-알부민의 발현양이 현저히 감소하였으며, Aβ1-42와 아스코르빈산을 동시에 처리한 경우에도 AGE-알부민의 발현양이 감소하였다.
상기 결과에 의해, 인간 미세아교세포에 산화적 스트레스를 가하면 Aβ1-42가 축적되고, 이로 인해 AGE-알부민의 합성이 증가됨으로, 인간 미세아교세포에서 AGE-알부민의 합성과 분비가 산화적 스트레스에 의한 것임을 확인할 수 있었다.
실시예 5 : 알츠하이머 모델의 미세아교세포에서 합성 및 분비된 AGE-알부민의 Aβ1-42 응집 유도 (ThT 형광분석법)
알부민은 아밀로이드베타 1-42(Aβ1-42)의 중합체 형성을 방지하는 것으로 보고되어 있으며, 뇌척수액으로부터 분리된 아밀로이드 억제제 활성의 60%를 보이고 있는 것으로 알려져 있다. 하지만 현재까지 알츠하이머 모델의 미세아교세포에서 합성 및 분비된 AGE-알부민의 아밀로이드 플라크(plaque)에 대한 양성적인 관계에 대해서는 보고되어 있지 않다. 따라서, 본 실험에서는 ThT(thioflavin T) 분석법을 이용하여 알츠하이머 모델의 미세아교세포에서 합성 및 분비된 AGE-알부민과 Aβ1-42의 응집(aggregation)의 상호작용을 관찰하였다.
구체적으로는, Aβ1-42로 처리한 랫트의 뇌조직과 알츠하이머 환자의 뇌조직에 알부민 또는 AGE-알부민을 각각 10mM씩 가하고 37℃에서 2.5시간 동안 일정하게 흔들면서 Perkin-Elmer 형광분광 광도계(LS-55)를 이용하여 ThT 형광을 483㎚(450㎚ 여기)에서 측정하였다. 알부민 또는 AGE-알부민을 처리한 세포의 형광값은 DMSO-처리된 음성대조군으로 표준화하였으며, 상대 형광 백분율로 나타내었다.
결과는 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타난 바와 같이, Aβ1-42로 처리한 랫트의 뇌조직과 알츠하이머 환자의 뇌조직에서 AGE-알부민과 아밀로이드 플라크가 같은 위치에 존재하는 것을 관찰하였고(A), 미세아교세포에 알부민을 투여하였을 때보다 AGE-알부민을 투여하였을 때 Aβ1-42의 응집이 현저히 증가하는 것을 관찰하였다(B). 따라서, Aβ1-42로 처리한 랫트의 뇌조직과 알츠하이머 환자의 뇌조직에서 AGE-알부민이 Aβ1-42의 응집을 유도한다는 것을 알 수 있다.
실시예 6 : AGE-알부민이 인간 미세아교세포에서 Aβ1-42의 합성 유도
AGE-알부민이 인간 미세아교세포에서 Aβ1-42의 합성을 유도하는지 확인하기 위하여, 인간 미세아교세포에 AGE-알부민을 투여한 후 Aβ1-42의 양을 ELISA 분석법을 이용하여 측정하였고, BACE, ADAM10, APP의 발현 위치와 발현양을 면역염색화학과 면역 블롯팅을 이용하여 관찰하였다.
인간 미세아교세포에 AGE-알부민을 투여한 후 Aβ1-42의 양을 ELISA 분석법을 이용하여 측정한 결과는 도 9에 나타내었고, 인간 미세아교세포에 AGE-알부민을 투여한 후 BACE, ADAM10, APP의 발현 위치와 발현양을 각각 면역염색화학(A)과 면역 블롯팅(B)을 이용하여 관찰한 결과는 도 10에 나타내었다.
도 9에 나타난 바와 같이, 인간 미세아교세포에 AGE-알부민을 투여하였을 때 Aβ1-42의 양이 증가하였다.
또한, 도 10에 나타난 바와 같이, 인간 미세아교세포에 AGE-알부민을 투여하였을 때 BACE의 발현양은 증가하였으나, ADAM10과 APP의 발현양은 유사하게 나타났다.
상기 결과에 의해, AGE-알부민은 인간 미세아교세포에서 Aβ1-42의 합성을 유도한다는 것을 알 수 있다.
실시예 7 : 일차 인간 신경세포에서 AGE-알부민에 의한 신경세포사 유도
스트레스에 의해 활성화된 MAPK(Mitogen-Activated Protein Kinase)가 신경세포사를 유도한다고 보고되어 있다. 따라서, 본 실험에서는 일차 인간 신경세포에서 AGE-알부민이 직접적으로 MAPK 신호전달체계를 활성화시키고, Bax의 발현양을 증가시키는지 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
1. 일차 인간 신경세포 배양(primary human neuronal cell culture)
일차 인간 신경세포는 사람의 뇌 조직으로부터 얻었다. 뇌조직 수집과 사용은 서울대학교 의과대학 윤리심의위원회(Ethics Committee of the Seoul National University College of Medicine, Seoul, Korea)에 의해 승인받았다. 인간 두뇌 피질의 작은 조각을 0.25% 트립신과 40㎎/㎖ DNase I을 함유하는 인산염완충용액 (PBS)에서 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 분리 배양된 세포를 5% FBS, 5% HS (horse serum), 20㎎/㎖의 겐타마이신 및 2.5㎎/㎖의 암포테리신 B가 첨가된 DMEM (배양배지)에 현탁시키고, 10㎝ 배양접시에 1×106 cells/㎖ (10㎖)로 플레이트한 다음, 5% CO2/95% 대기 하의 배양기에서 37℃로 유지하였다. in vitro 배양 2~3주 후, 배양접시에 떠있는 부유세포를 수집하고, 면역형광표지법용 Lab-Tek Ⅱ Chamber Slide System(2×104 cells/wells, Nunc)으로 세포를 다시 플레이팅하여 미세아교세포-풍부 세포를 준비하였다. 남아있는 신경세포는 AGE-알부민으로 처리한 후 아폽토시스-관련 특성을 위해 사용하였다.
2. 면역조직화학과 면역 블롯팅
AGE-알부민을 일차 인간 신경세포에 처리하기 전 또는 후의 세포 용해물을 이용하여 RAGE, ERK1/2, pERK1/2, p38, pp38, SAPK/JNK, pSAPK/JNK, Bax의 발현 위치와 발현양을 면역조직화학과 면역 블롯팅 방법을 이용하여 관찰하였다.
일차 인간 신경세포에 AGE-알부민을 투여한 후 RAGE, ERK1/2, pERK1/2, p38, pp38, SAPK/JNK, pSAPK/JNK, Bax의 발현 위치와 발현양을 각각 면역염색화학과 면역 블롯팅 방법을 이용하여 관찰한 결과는 각각 도 11 도 12에 나타내었다.
도 11 및 도 12에 나타난 바와 같이, AGE-알부민을 투여한 일차 인간 신경세포에서 RAGE가 증가하였으며, pERK1/2를 제외한 ERK1/2, p38, pp38, SAPK/JNK, pSAPK/JNK가 증가하여 MAPK가 활성화되는 것을 관찰하였을 뿐만 아니라 세포사멸 유발(pro-apoptotic) 단백질인 Bax의 발현양이 증가하는 것을 관찰하였다.
3. 일차 인간 신경세포에서 AGE와 RAGE의 상호작용 : PLA(proximity ligation assay)
AGE-알부민을 일차 인간 신경세포에 처리하기 전 또는 후의 세포 용해물을 이용하여 AGE와 RAGE의 상호작용을 확인하기 위하여, 일차 인간 신경세포와 뇌조직에서 PLA를 수행하여 AGE와 RAGE의 상호작용의 정도를 시각화하였다.
구체적으로는, 표적 조직을 차가운 PBS로 세척하고, 마우스 항 인간-알부민 항체(1:200, R&D system), 토끼 항-Aβ 항체(1:100, Chemicon), 또는 항-RAGE 항체 (1:200, Santa Cruz)와 함께 4℃에서 밤새도록 배양하였다. PLA 및 Hoechst 염색을 Duolink Detection Kit(O-link Bioscience)를 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 수행하였다. 조직 표본을 Vectashield mounting media(Vector Laboratories)에 고정시키고, 공초점 현미경(LSM 710)을 이용하여 분석하였다. 세포 당 in-situ PLA 신호 수는 반자동 영상 분석 프로그램 BlobFinderV3.0을 이용하여 세었다.
AGE-알부민을 일차 인간 신경세포에 처리하기 전 또는 후의 세포 용해물을 이용하여 AGE와 RAGE의 상호작용을 확인한 결과는 도 13에 나타내었다.
도 13에 나타난 바와 같이, AGE-알부민을 투여한 일차 인간 신경세포에서 AGE와 RAGE의 상호작용이 증가하는 것을 확인하였다.
4. 세포 내 칼슘 변화 측정
일차 인간 신경세포를 Lab-Tek Ⅱ glass slide chambers(Nunc)에서 성장시켰다. 세포 배양 2일 후, 세포를 4μM의 Fluo-3 염료(Invitrogen)로 염색한 후 37℃에서 40분 동안 배양하였다. 배양 후, 슬라이드 챔버에 100ng/㎖의 AGE-알부민 (AGE-ALB)을 조심스럽게 가하고 실시간 이미징을 통해 20분 동안 세포 내 칼슘의 변화를 레이저 공초점 형광현미경(LSM 710, Carl Zeiss)으로 관찰하였다.
결과는 도 14에 나타내었다.
도 14에 나타난 바와 같이, 일차 인간 신경세포에 AGE-알부민을 투여한 후 미토콘드리아에서 칼슘이 증가하는 것을 확인하였다.
5. 세포생존율(MTT assay) 측정
AGE-알부민을 투여한 일차 인간 신경세포에서 Bax의 발현양의 증가가 미토콘드리아의 칼슘을 증가시키고, 궁극적으로 AGE-알부민이 세포사를 유도하는지 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
일차 인간 신경세포를 96-웰 배양 플레이트에 웰당 2×103 세포로 접종하였다. 80% 융합(confluence)에 도달한 후, 일차 인간 신경세포를 여러 농도(0, 0.01, 0.1, 1, 10, 20㎍/㎖)의 AGE-알부민 또는 여러 농도(0, 0.5, 1, 5, 10㎎/㎖)의 알부민으로 처리하였다. 처리 24시간 후, 세포를 PBS로 세척한 다음, 세포생존율을 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] assay를 이용하여 측정하였다. 각 웰의 흡광도는 96-웰 플레이트 리더(VERSA Max, Molecular Devices)를 이용하여 540㎚에서 측정하였다.
결과는 도 15에 나타내었다.
도 15에 나타난 바와 같이, 일차 인간 신경세포에 AGE-알부민을 처리한 경우 AGE-알부민의 농도가 증가할수록 세포생존율이 감소하여 세포사가 유도됨을 확인하였다. 반면, 일차 인간 신경세포에 알부민을 처리한 경우 알부민의 농도에 상관없이 세포생존율이 거의 변화가 없어 세포사가 유도되지 않음을 확인하였다.
상기 결과에 의하여, AGE-알부민은 일차 인간 신경세포에 작용하여 RAGE의 발현양을 증가시키고, 이것은 MAPK 신호전달체계를 활성화시킨 후 Bax의 발현양을 증가시켜 미토콘드리아에서 칼슘의 증가를 유도하고, 최종적으로 세포사를 유도함을 알 수 있다.
실시예 8 : 마우스의 혈액단핵세포에서 AGE-알부민의 분포 및 발현 위치
마우스의 혈액단핵세포에서 AGE-알부민의 분포 및 발현 위치를 확인하기 위하여, Aβ1-42 처리 전 또는 후의 마우스의 혈액단핵세포에서 알부민(녹색), AGE(적색) 및 DAPI(푸른색), AGE-알부민을 염색하여 이들의 분포 및 발현 위치를 레이저 공초점 형광현미경으로 관찰하였다.
결과는 도 16에 나타내었다.
도 16에 나타난 바와 같이, Aβ1-42 처리 전 또는 후의 마우스의 혈액단핵세포에서 알부민(녹색)과 AGE(적색)가 같은 위치에서 염색됨을 확인하였다. 또한, Aβ1-42를 처리한 마우스의 혈액단핵세포에서 알부민과 AGE가 넓게 분포되어 있으며, AGE-알부민의 발현양이 Aβ1-42 처리 전의 마우스의 혈액단핵세포에서보다 증가하는 것을 관찰하였다.
실시예 9 : Aβ1-42 매개된 신경세포사에 대한 수용성 RAGE(sRAGE)의 보호 효과 : in vivo 실험
Aβ1-42 매개된 신경세포사에 대한 수용성 RAGE(sRAGE)의 보호 효과를 확인하기 위하여, 랫트의 뇌조직에 Aβ1-42 단독으로 또는 Aβ1-42와 sRAGE(Aβ/sRAGE)를 함께 주입한 후 in vivo 실험을 수행하였다.
1. 동물모델
실험동물로 체중 230~350g의 Sprague-Dawley 랫트를 사용하였다. 랫트를 12시간 명암 주기로 유지시켰으며, 식량과 물을 자유로이 섭취시켰고, 적어도 사용하기 일주일 전에 순응시켰다. 모든 동물 실험은 실험동물사용관리위원회(IACUC; Institutional Animal Care and Use Committees)에 의해 승인되고 인도적으로 수행되었다.
실험동물을 수술 전에 케타민(0.75 ㎎/㎏ 체중)과 럼푼(0.2　㎎/㎏ 체중)으로 마취시켰다. in vivo 처리를 위해, PBS, sRAGE를 400μM의 농도로 멸균수에 용해시키고, 사용할 때까지 4℃로 유지하였다. 랫트의 뇌를 뇌심부고정장치(stereotaxic instrument)를 이용하여 고정한 후, 두피 피부의 중앙을 절개하였다. 두개골 브레그마(bregma)에서 생물학적 전기 드릴로 구멍을 뚫고(뒤쪽으로, 8.3㎜; 측면으로, 5.4㎜), 표적 면적(깊이, 4.5㎜)에 도달할 때까지 5-㎕ 해밀톤 주사기의 바늘(30 게이지)을 수직으로 하강시켰다. 5㎕의 200μM Aβ1-42, 5㎕의 200μM Aβ1-42/sRAGE 또는 5㎕의 인산염완충용액(PBS)을 자동미세주입기(automatic microinjector)로 분당 1㎕의 속도로 랫트의 내후각뇌피질(entorhinal cortex, EC)에 천천히 주입하였다. 그 다음, 주사기를 천천히 제거하고 수술 창상(surgical wounds)을 상처봉합용 클립으로 봉합하고 항생제로 국소 처리하였다.
대부분의 랫트는 주사 후 3일 동안 회복되었다. 완전히 회복한 후, 모든 랫트를 동일한 방법으로 다시 마취시키고, 18℃에서 100~200㎖의 헤파린이 첨가된 증류수(heparinized saline)로 심장을 통해 관류하고, 이어서 0.1M 소듐 포스페이트 완충용액(pH 7.4) 내 4% 파라포름알데히드-리신 페리오데이트(paraformaldehyde-lysine periodate)의 400㎖로 관류시켰다. 뇌를 제거하고 동일한 고정액에 넣은 다음 4℃에서 4시간 동안 고정하고, 20% 수크로오스를 함유하는 차가운 0.1M 인산염완충용액(PBS)으로 옮겼다. 뇌를 동결박편제작기(freezing microtome)로 10㎛ 두께로 횡단면을 절개하고, 사용할 때까지 -80℃에서 저장하였다.
2. 랫트의 뇌조직에 있는 신경세포의 수
랫트의 뇌조직에 Aβ1-42 단독으로 또는 Aβ1-42와 sRAGE(Aβ/sRAGE)를 함께 처리하고 72시간 후 랫트의 뇌조직에 있는 신경세포의 수를 크레실 바이올렛 (cresyl violet)으로 염색한 후 현미경으로 관찰하였다.
결과는 도 17에 나타내었다.
도 17에 나타난 바와 같이, 랫트의 뇌조직에 Aβ1-42와 sRAGE(Aβ/sRAGE)를 함께 처리한 경우 Aβ1-42를 단독으로 처리하였을 때보다 신경세포의 수가 급증하였다.
3. 랫트의 뇌조직에서 AGE-알부민의 분포 및 발현 위치
Aβ1-42 단독으로 또는 Aβ1-42와 sRAGE(Aβ/sRAGE)를 함께 처리한 랫트의 뇌조직에서 AGE-알부민의 분포 및 발현 위치를 확인하기 위하여, 랫트의 뇌조직에서 AGE(적색), 알부민(녹색), 미세아교세포(microglia cell) 표지자인 Iba1(푸른색), 및 AGE-알부민을 염색하여 면역조직화학(IHC)을 수행하였다. 그 다음, 이들의 분포 및 발현 위치를 레이저 공초점 형광현미경으로 관찰하고, AGE-알부민의 밀도를 측정하였다.
결과는 도 18에 나타내었다.
도 18에 나타난 바와 같이, AGE, 알부민, 미세아교세포 표지자인 Iba1, 및 AGE-알부민의 발현양은 Aβ1-42를 단독으로 주입한 랫트의 뇌조직에서 증가하였으나, Aβ1-42와 sRAGE(Aβ/sRAGE)를 함께 주입한 랫트의 뇌조직에서는 감소하였다. 또한, Aβ1-42를 단독으로 주입한 랫트의 뇌조직에서의 AGE-알부민의 밀도는 Aβ1-42와 sRAGE(Aβ/sRAGE)를 함께 주입한 랫트의 뇌조직에서보다 현저히 증가하였다.
4. 랫트의 뇌조직에서 RAGE, NeuN, DAPI, Bax 및 p-SAPK/JNK의 분포 및 발현 위치
랫트의 뇌조직에서 Aβ1-42가 신경세포사를 유도하고 sRAGE가 RAGE-매개된 신경세포사를 보호하는지 확인하기 위하여, Aβ1-42 단독으로 또는 Aβ1-42와 sRAGE(Aβ/sRAGE)를 함께 처리한 랫트의 뇌조직에서 RAGE, NeuN, DAPI, Bax 및 p-SAPK/JNK를 염색하여 면역조직화학(IHC)을 수행하였다. 그 다음, 이들의 분포 및 발현 위치를 레이저 공초점 형광현미경으로 관찰하였다.
결과는 도 19에 나타내었다.
도 19에 나타난 바와 같이, RAGE, NeuN, DAPI, Bax 및 p-SAPK/JNK의 발현양은 Aβ1-42를 단독으로 주입한 랫트의 뇌조직에서 증가하였으나, Aβ1-42와 sRAGE(Aβ/sRAGE)를 함께 주입한 랫트의 뇌조직에서는 감소하였다. 따라서, Aβ1-42가 신경세포사를 유도하고, sRAGE가 RAGE-매개된 신경세포사를 보호한다는 것을 알 수 있다.
실시예 10 : 뇌졸중 환자의 뇌조직에서 AGE-알부민의 분포 및 발현 위치
뇌졸중 환자의 뇌조직에서 AGE-알부민의 분포 및 발현 위치를 확인하기 위하여, 뇌졸중 환자의 뇌조직에 AGE, 알부민 및 AGE-알부민을 염색하여 면역조직화학 (IHC) 실험을 수행하고, 이들의 분포 및 발현 위치를 레이저 공초점 형광현미경으로 관찰하였다.
결과는 도 20에 나타내었다.
도 20에 나타난 바와 같이, 뇌졸중 환자의 뇌조직에서 알부민(녹색)과 AGE (적색)가 같은 위치에서 염색되고 넓게 분포되어 있으며, AGE-알부민이 넓게 분포되어 있는 것을 관찰하였다.
실시예 11 : 뇌졸중 모델의 인간 미세아교세포에서 저산소증 유발인자(HIF-1α)와 HMGB1(high motility group protein B1)의 발현
뇌졸중 모델의 인간 미세아교세포에서 저산소증 유발인자(HIF-1α)와 HMGB1의 발현 정도를 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
1. 세포배양 및 뇌졸중 세포 모델의 제작
인간 미세아교세포주는 DMEM 배지(Gibco, 10% 소혈청(Gibco), 0.1% 겐타마이신(Gibco), 고농도의 포도당)를 이용하여 5% CO2가 포함되어 있는 37℃ 배양기에서 배양하였다. 뇌졸중 세포 모델을 만들기 위하여, 준비된 미세아교세포주를 포도당이 없는 DMEM 배지로 교환한 후, 저산소 상태(5% CO2와 95% N2)를 만들어주는 챔버 (Billups-Rothenberg, Del Mar, CA)에서 1시간 동안 배양한 다음 세포들을 추출하여 실험에 사용하였다.
2. 뇌졸중 모델의 인간 미세아교세포에서 저산소증 유발인자(HIF-1α)와 HMGB1의 발현 확인
저산소증과 포도당-결핍된 뇌졸중 모델의 인간 미세아교세포에서 저산소증 유발인자(HIF-1α)와 HMGB1의 발현을 확인하기 위하여, 면역조직화학법(IHC), PCR, 면역블롯팅을 수행하였다.
저산소증과 포도당-결핍된 뇌졸중 모델의 인간 미세아교세포에서 저산소증 유발인자(HIF-1α)와 HMGB1의 발현 정도는 각각 도 21 및 도 22에 나타내었다.
도 21 및 도 22에 나타난 바와 같이, 저산소증과 포도당-결핍된 뇌졸중 모델의 인간 미세아교세포에서 저산소증 유발인자(HIF-1α)와 HMGB1의 발현이 증가하는 것을 확인하였다.
실시예 12 : 뇌졸중 모델의 인간 미세아교세포에서 AGE-알부민의 합성 및 분비
1. 뇌졸중 모델의 인간 미세아교세포에서 AGE-알부민의 발현양 측정
저산소증과 포도당-결핍된 뇌졸중 모델의 인간 미세아교세포에서 AGE-알부민이 합성 및 분비되는지 확인하기 위하여, 면역조직화학법(IHC), 면역블롯팅 및 ELISA를 이용하여 AGE-알부민의 발현양을 측정하였다.
결과는 도 23에 나타내었다.
도 23에 나타난 바와 같이, 저산소증과 포도당-결핍된 뇌졸중 모델의 인간 미세아교세포에서 AGE-알부민의 발현양이 현저히 증가하였다.
2. 뇌졸중 모델의 인간 미세아교세포에서 HMGB1의 농도 변화에 따른 세포내와 배양 배지로 분비된 AGE-알부민의 발현양
뇌졸중 시에 가장 많이 뇌에서 분비되어 미세아교세포를 흥분시킨다고 알려진 HMGB1를 뇌졸중 모델의 인간 미세아교세포에 처리하였을 때, 뇌졸중 모델의 인간 미세아교세포에서 HMGB1의 농도(0, 50, 200, 500, 2000ng/㎖) 변화에 따른 AGE-알부민의 합성 및 분비 여부를 확인하기 위하여, 면역조직화학법(IHC), ELISA 및 면역블롯팅을 이용하여 AGE-알부민의 발현양을 측정하였다.
결과는 도 24에 나타내었다.
도 24에 나타난 바와 같이, 저산소증과 포도당-결핍된 뇌졸중 모델의 인간 미세아교세포에서 HMGB1의 농도가 증가할수록 AGE-알부민의 발현양이 현저히 증가하였다.
3. 뇌졸중 모델의 인간 미세아교세포에서 HMGB1 저해제의 농도 변화에 따른 세포내와 배양 배지로 분비된 AGE-알부민의 발현양
뇌졸중 모델의 인간 미세아교세포에 HMGB1 저해제인 글리시리진 (glycyrrhizic acid)을 농도별(0, 50, 200, 500, 2000ng/㎖)로 처리한 다음, ELISA 및 면역블롯팅을 이용하여 AGE-알부민의 발현양을 측정하였다.
결과는 도 25에 나타내었다.
도 25에 나타난 바와 같이, 저산소증과 포도당-결핍된 뇌졸중 모델의 인간 미세아교세포에서 HMGB1 저해제의 농도가 증가할수록 AGE-알부민의 발현양이 현저히 감소하였다.
실시예 13 : 뇌졸중 모델의 인간 미세아교세포에서 산화적 스트레스에 의해 AGE-알부민의 합성과 분비 증가
뇌졸중 모델의 인간 미세아교세포에서 AGE-알부민의 합성과 분비가 산화적 스트레스에 의한 것인지 확인하기 위하여, 뇌졸중 모델의 인간 미세아교세포에 산화적 스트레스 유도물질인 0~1000μM의 과산화수소(H2O2)를 처리한 후 세포 용해물을 이용하여 면역블롯팅 분석을 수행하였다. 또한, 뇌졸중 모델의 인간 미세아교세포에 항산화제인 아스코르빈산을 처리하여 AGE-알부민의 발현양이 감소하는지 면역블롯팅 분석을 통해 확인하였다.
결과는 도 26에 나타내었다.
도 26에 나타난 바와 같이, 뇌졸중 모델의 인간 미세아교세포에 과산화수소 (H2O2)를 처리한 경우 과산화수소의 농도가 증가할수록 AGE-알부민의 발현양이 증가하였다. 반면, 뇌졸중 모델의 인간 미세아교세포에 항산화제인 아스코르빈산을 처리한 경우 저산소증과 포도당-결핍에 상관없이 AGE-알부민의 발현양이 현저히 감소하였다.
실시예 14 : 일차 인간 신경세포에서 AGE-알부민에 의한 신경세포사 유도
일차 인간 신경세포에서 AGE-알부민이 신경세포사를 유도하는지 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
1. 일차 인간 신경세포 배양(primary human neuronal cell culture)
일차 인간 신경세포는 DMEM 배지(Gibco, 10% 소혈청(Gibco), 0.1% 겐타마이신(Gibco), 고농도의 포도당)를 이용하여 5% CO2가 포함되어 있는 37℃ 배양기에서 배양하였다. 배양된 세포에 AGE-알부민(sigma, 10㎍/㎖)을 24시간 동안 처리한 후 하기 실험에 사용하였다.
2. 면역조직화학과 면역 블롯팅
인간의 뇌조직으로부터 얻은 일차 인간 신경세포에서 AGE-알부민이 직접적으로 MAPK 신호전달체계를 활성화시키고, Bax의 발현양을 증가시키는지 확인하기 위하여, AGE-알부민을 일차 인간 신경세포에 처리하기 전 또는 후의 세포 용해물을 이용하여 RAGE, ERK1/2, p-ERK1/2, p38, p-p38, SAPK/JNK, p-SAPK/JNK, Bax의 발현양을 면역 블롯팅 방법을 이용하여 관찰하였다.
결과는 도 27에 나타내었다.
도 27에 나타난 바와 같이, AGE-알부민을 투여한 일차 인간 신경세포에서 RAGE가 증가하였으며, p-ERK1/2, p38, p-p38을 제외한 SAPK/JNK, p-SAPK/JNK가 증가하여 MAPK가 활성화되는 것을 관찰하였을 뿐만 아니라 세포사멸 유발(pro-apoptotic) 단백질인 Bax의 발현양이 증가하는 것을 관찰하였다.
3. 세포생존율(MTT assay) 측정 및 신경세포사에 대한 수용성 RAGE(sRAGE)의 보호 효과
AGE-알부민을 투여한 일차 인간 신경세포에서 Bax의 발현양의 증가가 신경세포사를 유도하는지 확인하기 위하여, 일차 인간 신경세포를 96-웰 배양 플레이트에 웰당 2×103 세포로 접종하였다. 80% 융합(confluence)에 도달한 후, 일차 인간 신경세포를 여러 농도(0, 0.1, 1, 10, 50㎍/㎖)의 AGE-알부민으로 처리하였다. 처리 24시간 후, 세포를 PBS로 세척한 다음, 세포생존율을 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] assay를 이용하여 540㎚에서 흡광도를 측정하였다.
또한, 신경세포사에 대한 수용성 RAGE(sRAGE)의 보호 효과를 확인하기 위하여, 인간 미세아교세포에 sRAGE 단독, AGE-알부민 단독, 또는 sRAGE/AGE-알부민을 함께 처리한 후 540㎚에서 흡광도를 측정하였다.
결과는 도 28에 나타내었다.
도 28에 나타난 바와 같이, 일차 인간 신경세포에 AGE-알부민을 처리한 경우 AGE-알부민의 농도가 증가할수록 세포생존율이 감소하여 세포사가 유도됨을 확인하였으며(A), 일차 인간 신경세포에 sRAGE와 AGE-알부민을 동시에 처리한 경우 세포생존율이 증가하여 세포사가 감소됨을 확인하였다(B). 따라서, sRAGE가 신경세포사에 대해 보호 효과를 갖는다는 것을 알 수 있다.
실시예 15 : 파킨슨병 환자의 뇌조직에서 AGE-알부민의 분포 및 발현 위치
파킨슨병 환자의 뇌조직에서 AGE-알부민의 분포 및 발현 위치를 확인하기 위하여, AGE, 알부민, 미세아교세포 표지자인 Iba1 및 AGE-알부민을 염색하여 면역조직화학(IHC) 실험을 수행하고, 이들의 분포 및 발현 위치를 레이저 공초점 형광현미경으로 관찰하였다.
결과는 도 29에 나타내었다.
도 29에 나타난 바와 같이, 파킨슨병 환자의 뇌조직에서 알부민(녹색)과 AGE (적색)가 같은 위치에서 염색되고 넓게 분포되어 있으며, 미세아교세포 표지자인 Iba1도 AGE-알부민과 같은 위치에서 염색되고 넓게 분포되어 있는 것을 관찰하였다.
실시예 16 : 파킨슨병 모델의 인간 미세아교세포에서 α-시누클레인(α-synuclein) 또는 TNF-α의 발현
파킨슨병 모델의 인간 미세아교세포에서 α-시누클레인(α-synuclein) 또는 TNF-α의 발현 정도를 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
1. 세포배양 및 파킨슨병 세포 모델의 제작
인간 미세아교세포주는 DMEM 배지(Gibco, 10% 소혈청(Gibco), 0.1% 겐타마이신(Gibco), 고농도의 포도당)를 이용하여 5% CO2가 포함되어 있는 37℃ 배양기에서 배양하였다. 파킨슨병 세포 모델을 만들기 위하여, 준비된 미세아교세포주에 파킨슨병 유발물질인 로테논(rotenone; Sigma, 1nM)을 10일 또는 6-히드록시도파민(6-hydroxydopamine; 6-OHDA)을 24시간 동안 처리한 후 세포들을 추출하여 실험에 사용하였다.
2. 파킨슨병 모델의 인간 미세아교세포에서 α-시누클레인(α-synuclein) 또는 TNF-α의 발현 확인
파킨슨병 환자의 뇌조직에서 α-시누클레인 또는 TNF-α이 높은 수준으로 존재한다고 알려져 있다. 따라서, 인간 미세아교세포에 파킨슨병 유발물질인 로테논 (rotenone) 또는 6-히드록시도파민(6-hydroxydopamine; 6-OHDA)을 처리한 후 α-시누클레인 또는 TNF-α의 발현 정도를 PCR과 면역블롯팅 분석을 통해 확인하였다.
결과는 도 30에 나타내었다.
도 30에 나타난 바와 같이, 인간 미세아교세포에 파킨슨병 유발물질인 로테논 또는 6-히드록시도파민을 처리한 후 α-시누클레인 또는 TNF-α의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 따라서, 인간 미세아교세포가 활성화됨을 알 수 있다.
실시예 17 : 파킨슨병 모델의 인간 미세아교세포에서 AGE-알부민의 합성 및 분비
인간 미세아교세포에 0~100nM의 로테논을 처리한 후 세포 용해물 및 세포 배양물을 이용하여 AGE-알부민의 합성 및 분비 여부를, ELISA 및 면역블롯팅 분석을 통해 확인하였다.
결과는 도 31에 나타내었다.
도 31에 나타난 바와 같이, 인간 미세아교세포에 1nM의 로테논을 처리하였을 때 AGE-알부민의 합성 및 분비가 증가하는 것을 확인하였다.
실시예 18 : 파킨슨병 모델의 인간 미세아교세포에서 산화적 스트레스에 의해 α-시누클레인 또는 AGE-알부민의 합성과 분비 증가
파킨슨병 모델의 인간 미세아교세포에서 α-시누클레인 또는 AGE-알부민의 합성과 분비가 산화적 스트레스에 의한 것인지 확인하기 위하여, 인간 미세아교세포에 파킨슨병 유발물질인 로테논을 처리한 다음 산화적 스트레스 유도물질인 0~1000μM의 과산화수소(H2O2)를 처리한 후 세포 용해물을 이용하여 면역블롯팅 분석을 수행하였다. 또한, 인간 미세아교세포에 파킨슨병 유발물질인 로테논을 처리한 다음 α-시누클레인 저해제인 사이토칼라신 D(cytochalasin D) 또는 항산화제인 아스코르빈산을 처리하여 α-시누클레인 또는 AGE-알부민의 발현양이 감소하는지 면역블롯팅 분석을 통해 확인하였다.
결과는 도 32에 나타내었다.
도 32에 나타난 바와 같이, 인간 미세아교세포에 로테논을 처리한 다음 과산화수소(H2O2)를 처리한 경우 과산화수소의 농도가 증가할수록 α-시누클레인과 AGE-알부민의 발현양이 증가하였다. 반면, 인간 미세아교세포에 로테논을 처리한 다음 α-시누클레인 저해제인 사이토칼라신 D 또는 항산화제인 아스코르빈산을 처리한 경우 α-시누클레인과 AGE-알부민의 발현양이 현저히 감소하였다.
실시예 19 : 도파민신경세포에서 AGE-알부민에 의한 신경세포사 유도
도파민신경세포에서 AGE-알부민이 신경세포사를 유도하는지 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
1. 도파민신경세포 배양(dopamine neuronal cell culture)
도파민신경세포는 DMEM 배지(Gibco, 10% 소혈청(Gibco), 0.1% 겐타마이신 (Gibco), 고농도의 포도당)를 이용하여 5% CO2가 포함되어 있는 37℃ 배양기에서 배양하였다. 배양된 세포에 AGE-알부민(sigma, 10㎍/㎖)을 24시간 동안 처리한 후 하기 실험에 사용하였다.
2. 면역조직화학과 면역 블롯팅
인간의 뇌조직으로부터 얻은 도파민신경세포에서 AGE-알부민이 직접적으로 MAPK 신호전달체계를 활성화시키고, Bax의 발현양을 증가시키는지 확인하기 위하여, 도파민신경세포에 sRAGE를 처리하거나 처리하지 않은 다음, AGE-알부민을 도파민신경세포에 처리하기 전 또는 후의 세포 용해물을 이용하여 RAGE, Bax, SAPK/JNK, pSAPK/JNK, p38, ERK1/2, pERK1/2의 발현양을 면역 블롯팅 방법을 이용하여 관찰하였다. 또한, 신경세포사에 대한 수용성 RAGE(sRAGE)의 보호 효과를 확인하기 위하여, 540㎚에서 흡광도를 측정하였다.
결과는 도 33에 나타내었다.
도 33에 나타난 바와 같이, 도파민신경세포에 sRAGE를 처리하지 않고 AGE-알부민을 투여한 경우 RAGE가 증가하였으며, p-ERK1/2, p38, p-p38을 제외한 SAPK/JNK, pSAPK/JNK가 증가하여 MAPK가 활성화되는 것을 관찰하였을 뿐만 아니라 세포사멸 유발(pro-apoptotic) 단백질인 Bax의 발현양이 증가하는 것을 관찰하였다. 또한, 도파민신경세포에 sRAGE를 처리한 다음 AGE-알부민을 투여한 경우 RAGE, SAPK/JNK, pSAPK/JNK, Bax의 발현양은 대조군과 유사하게 나타났다. 따라서, sRAGE가 신경세포사에 대해 보호 효과를 갖는다는 것을 알 수 있다.
실시예 20 : 로테논-매개된 신경세포사에 대한 수용성 RAGE(sRAGE)의 보호 효과 : in vivo 실험
로테논-매개된 신경세포사에 대한 수용성 RAGE(sRAGE)의 보호 효과를 확인하기 위하여, 마우스의 뇌조직에 로테논 단독 또는 로테논/sRAGE을 주입한 후 in vivo 실험을 수행하였다.
1. 동물모델
실험동물로 체중 20~25g의 CBL57/bL6 마우스를 사용하였다. 마우스를 12시간 명암 주기로 유지시켰으며, 식량과 물을 자유로이 섭취시켰고, 적어도 사용하기 일주일 전에 순응시켰다. 모든 동물 실험은 실험동물사용관리위원회(IACUC; Institutional Animal Care and Use Committees)에 의해 승인되고 인도적으로 수행되었다.
로테논을 마우스에 한달 동안 경구 투여하여 마우스에 파킨슨병을 유발시켜 파킨슨병 동물 모델을 제작하였다. 파킨슨병 동물 모델을 수술 전에 케타민(0.75 ㎎/㎏ 체중)과 럼푼(0.2　㎎/㎏ 체중)으로 마취시켰다. in vivo 처리를 위해, 인산염 완충용액(PBS), sRAGE(10ng/㎕)를 1mM의 농도로 멸균수에 용해시키고, 사용할 때까지 4℃로 유지하였다. 파킨슨병 동물 모델의 뇌를 뇌심부고정장치(stereotaxic instrument)를 이용하여 고정한 후, 두피 피부의 중앙을 절개하였다. 두개골 브레그마(bregma)에서 생물학적 전기 드릴로 구멍을 뚫고 (뒤쪽으로, 0.3㎜; 측면으로, 2㎜), 표적 면적(깊이, 2.5㎜)에 도달할 때까지 10-㎕ 해밀톤 주사기의 바늘(26 게이지)을 수직으로 하강시켰다. 3㎕의 sRAGE을 자동미세주입기로 분당 1㎕의 속도로 파킨슨병 동물 모델의 내후각뇌피질(entorhinal cortex, EC)에 천천히 주입하였다. 그 다음, 주사기를 천천히 제거하고 수술 창상(surgical wounds)을 상처봉합용 클립으로 봉합하고 항생제로 국소 처리하였다. 양성대조군으로는 정상 마우스의 내후각뇌피질에 PBS를 주입하였다.
대부분의 마우스는 sRAGE의 주사 후 1주일과 한달 동안 사육하였다. 사육 동안에도 로테논은 계속 경구투여하였다. 사육 후, 모든 마우스를 동일한 방법으로 다시 마취시키고, 18℃에서 100~200㎖의 헤파린이 첨가된 증류수(heparinized saline)로 심장을 통해 관류하고, 이어서 0.1M 소듐 포스페이트 완충용액(pH 7.4) 내 4% 파라포름알데히드-리신 페리오데이트(paraformaldehyde-lysine periodate)의 400㎖로 관류시켰다. 뇌를 제거하고 동일한 고정액에 넣은 다음 4℃에서 4시간 동안 고정하고, 20% 수크로오스를 함유하는 차가운 0.1M 인산염완충용액(PBS)으로 옮겼다. 뇌를 동결박편제작기(freezing microtome)로 10㎛ 두께로 횡단면을 절개하고, 사용할 때까지 -80℃에서 저장하였다.
2. 마우스의 뇌조직에 있는 신경세포의 수
마우스의 뇌조직에 PBS, 로테논, 로테논/sRAGE을 처리하고 1주일과 한달 후에 마우스의 뇌조직에 있는 신경세포의 수를 크레실 바이올렛(cresyl violet)으로 염색한 후 현미경으로 관찰하였다.
결과는 도 34에 나타내었다.
도 34에 나타난 바와 같이, 마우스의 뇌조직에 로테논을 처리한 경우 로테논을 처리하지 않은 경우에 비해 세포사가 많이 일어나는 것을 확인하였다. 또한, 마우스의 뇌조직에 로테논/sRAGE을 처리한 경우 세포사가 회복되는 것을 관찰하였으며, PBS로 처리하였을 때보다 신경세포의 수가 급증하였다. 특히, sRAGE을 주입한 부분(오른쪽 화살표)이 주입하지 않은 부분(왼쪽 화살표)보다 더 많이 회복되는 것을 확인하였으며, 흑색질(substantia nigra) 부분이 더 많이 회복되었다.
3. 마우스의 뇌조직에서 AGE-알부민의 분포 및 발현 위치
마우스의 뇌조직에 PBS, 로테논, 로테논/sRAGE을 처리하고 1주일과 한달 후에 마우스의 뇌조직에 있는 AGE-알부민, RAGE, Bax의 분포 및 발현 위치를 형광면역염색한 후 레이저 공초점 형광현미경으로 관찰하였다.
결과는 도 35에 나타내었다.
도 35에 나타난 바와 같이, AGE, 알부민, 미세아교세포 표지자인 Iba1, AGE-알부민, RAGE, Bax의 발현양은 로테논을 경구투여한 마우스의 뇌조직에서 증가하였으나, 로테논/sRAGE를 주입한 랫트의 뇌조직에서는 감소함을 확인하였다.
실시예 21 : 류마티스 관절염 모델의 대식세포에서 AGE-알부민의 합성 및 분비
β2-마이크로글로불린(β2-microglobulin)은 류마티스 관절염 환자의 연골에서 풍부하다고 알려져 있다. 그러나, 연골에서 β2-마이크로글로불린의 정확한 역할과 숙주 대식세포 또는 연골세포와의 관련성은 아직까지 밝혀지지 않았다. 따라서, 본 실험에서는 β2-마이크로글로불린이 대식세포의 활성과 대식세포 내에서 TNF-α와 IL-1β의 합성을 유도하는지에 대해서 실험을 수행하였다.
1. 세포배양 및 관절염 세포 모델의 제작
인간 림프종에서 채취한 대식세포주(U937)는 RPMI 1640 배지(Thermo, 10% 소혈청(Gibco), 0.1% 겐타마이신(Gibco), 고농도의 포도당)를 이용하여 5% CO2가 포함되어 있는 37℃ 배양기에서 배양하였다. 관절염 세포 모델을 만들기 위하여, 준비된 인간 대식세포주(U937)에 β2-마이크로글로불린(Sigma, 50㎍/㎖)을 24시간 동안 처리한 후 세포들을 추출하여 실험에 사용하였다.
2. 류마티스 관절염 모델의 대식세포에서 TNF-α, IL-1β, AGE-알부민의 발현 확인
인간 대식세포주(U937)에 β2-마이크로글로불린(0㎍, 12.5㎍, 25㎍, 50㎍)을 처리한 후 세포 용해물 또는 세포 배양물을 이용하여 TNF-α와 IL-1β의 발현 정도와 AGE-알부민의 합성 및 분비 여부를, 면역블롯팅 및 ELISA를 통해 확인하였다.
결과는 도 36에 나타내었다.
도 36에 나타난 바와 같이, 인간 대식세포주(U937)에 β2-마이크로글로불린을 처리한 후 TNF-α, IL-1β 및 AGE-알부민의 발현이 증가하였으며, β2-마이크로글로불린의 농도가 증가할수록 세포밖으로 분비되는 AGE-알부민의 양이 증가하는 것을 확인하였다.
실시예 22 : 연골세포에서 AGE-알부민에 의한 연골세포사 유도
연골세포에서 AGE-알부민이 연골세포사를 유도하는지 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
1. 연골세포 배양(chondrocyte cell culture)
인간 연골세포는 연골세포 성장배지(Promo cell)와 연골세포 성장배지 supplementMix(Promo cell)를 혼합한 배지를 사용하여 5% CO2가 포함되어 있는 37℃ 배양기에서 배양하였다.
2. 세포생존율(MTT assay) 측정
배양된 연골세포를 96-웰 배양 플레이트에 웰당 2×103 세포로 접종하였다. 80% 융합(confluence)에 도달한 후, 배양된 연골세포를 AGE-알부민(sigma, 10㎍/㎖)으로 처리하였다. 처리 24시간 후, 세포를 PBS로 세척한 다음, MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] assay를 이용하여 540㎚에서 흡광도를 측정하였다.
결과는 도 37에 나타내었다.
도 37에 나타난 바와 같이, 연골세포에 AGE-알부민을 처리한 후 연골세포 수가 감소하였다. 그러나, 연골세포에 sRAGE와 AGE-알부민을 동시에 처리한 경우 연골세포 수가 대조군과 유사하게 나타났다. 따라서, sRAGE가 연골세포사에 대해 보호 효과를 갖는다는 것을 알 수 있다.
실시예 23 : AGE-알부민 합성 저해제의 후보물질 선별
인간 미세아교세포에서 AGE-알부민의 합성을 저해하는 물질을 발굴하기 위하여, LOPAC(sigma)으로부터 후보물질을 선별하는 실험을 하기와 같이 수행하였다.
1. 알츠하이머병 모델의 인간 미세아교세포에서 AGE-알부민의 합성 저해제의 선별
인간 미세아교세포를 96-웰 플레이트에 1×104 /200㎕의 농도로 분주하고 24시간 동안 배양시켰다. 플레이트에 배양된 세포에 Aβ1-42(sigma)를 2μM로 6시간 동안 처리한 후, LOPAC(sigma)에 포함되어 있는 1280종의 화합물(5μM)을 24시간 동안 처리하였다. 배양이 끝난 세포들을 100% 메탄올로 고정시킨 후, AGE-알부민 항체(1:10000, abcam)를 이용하여 반응시켰다. 그 다음, 퍼옥시다제가 포함되어 있는 이차 항체(1:5000, Vector)와 반응을 시킨 후 TMB(sigma)로 발색시키고, ELISA 리더로 450㎚에서 흡광도를 측정하였다. 그리고, AGE-알부민의 합성을 저해하는 후보물질을 선별하였다.
알츠하이머병 모델의 인간 미세아교세포에서 AGE-알부민의 합성을 저해하는 후보물질은 LOPAC 1280종의 화합물 중에서 총 42종의 화합물이 선별되었으며, 선별된 후보물질은 하기 표 1에 나타내었고, 후보물질의 ELISA 측정결과는 도 38에 나타내었다.
Figure 112011031578583-pat00001
도 38에 나타난 바와 같이, 알츠하이머병 모델의 인간 미세아교세포에서 후보물질의 AGE-알부민의 합성 저해 활성이 대조군과 유사하게 나타남을 확인하였다.
2. 파킨슨병 모델의 인간 미세아교세포에서 AGE-알부민의 합성 저해제의 선별
인간 미세아교세포를 96-웰 플레이트에 1×104 /200㎕의 농도로 분주하고 24시간 동안 배양시켰다. 플레이트에 배양된 세포에, 로테논(sigma, 1nM)을 10일 동안 처리한 도파민신경세포에서 추출한 배지를 24시간 동안 처리한 후, LOPAC (sigma)에 포함되어 있는 1280종의 화합물(5μM)을 24시간 동안 처리하였다. 배양이 끝난 세포들을 100% 메탄올로 고정시킨 후, AGE-알부민 항체(1:10000, abcam)를 이용하여 반응시켰다. 그 다음, 퍼옥시다제가 포함되어 있는 이차 항체(1:5000, Vector)와 반응을 시킨 후 TMB(sigma)로 발색시키고, ELISA 리더로 450㎚에서 흡광도를 측정하였다. 그리고, AGE-알부민의 합성을 저해하는 후보물질을 선별하였다.
파킨슨병 모델의 인간 미세아교세포에서 AGE-알부민의 합성을 저해하는 후보물질은 LOPAC 1280종의 화합물 중에서 총 9종의 화합물이 선별되었으며, 선별된 후보물질은 하기 표 2에 나타내었고, 후보물질의 ELISA 측정결과는 도 39에 나타내었다.
Figure 112011031578583-pat00002
도 39에 나타난 바와 같이, 파킨슨병 모델의 인간 미세아교세포에서 후보물질의 AGE-알부민의 합성 저해 활성이 대조군과 유사하게 나타남을 확인하였다.
실시예 24 : AGE-알부민의 합성 저해제가 로테논-매개된 신경세포사에 미치는 영향
AGE-알부민의 합성 저해제가 로테논-매개된 신경세포사에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 마우스의 뇌조직에 상기 실시예 23에서 선별된 AGE-알부민의 합성 저해제 중 C-20(세파클러), C-21(세팔로틴 나트륨)을 주입한 후 실시예 20과 동일하게 실험을 수행하여, 마우스의 뇌조직에 있는 신경세포의 수와 AGE-알부민, RAGE, Bax의 분포 및 발현 위치를 관찰하였다.
마우스의 뇌조직에 PBS, 로테논, 로테논/세파클러, 로테논/세팔로틴 나트륨을 처리하고 1주일과 한달 후에 마우스의 뇌조직에 있는 신경세포의 수를 크레실 바이올렛(cresyl violet)으로 염색한 후 현미경으로 관찰한 결과는 도 40에 나타내었고, 마우스의 뇌조직에 PBS, 로테논, 로테논/세파클러, 로테논/세팔로틴 나트륨을 처리하고 1주일과 한달 후에 마우스의 뇌조직에 있는 AGE-알부민, RAGE, Bax의 분포 및 발현 위치를 형광면역염색한 후 레이저 공초점 형광현미경으로 관찰한 결과는 도 41에 나타내었다.
결과는 도 40에 나타내었다.
도 40에 나타난 바와 같이, 마우스의 뇌조직에 로테논을 처리한 경우 로테논을 처리하지 않은 경우에 비해 세포사가 많이 일어나는 것을 확인하였다. 또한, 마우스의 뇌조직에 로테논/세파클러, 로테논/세팔로틴 나트륨을 처리한 경우 세포사가 회복되는 것을 관찰하였으며, PBS로 처리하였을 때보다 신경세포의 수가 급증하였다. 특히, 세파클러, 세팔로틴 나트륨을 주입한 부분(오른쪽 화살표)이 주입하지 않은 부분(왼쪽 화살표)보다 더 많이 회복되는 것을 확인하였으며, 흑색질 (substantia nigra) 부분이 더 많이 회복되었다. 또한, 세팔로틴 나트륨이 세파클러보다 효율이 더 좋음을 확인하였다.
또한 도 41에 나타난 바와 같이, AGE, 알부민, 미세아교세포 표지자인 Iba1, AGE-알부민, RAGE, Bax의 발현양은 로테논을 경구투여한 마우스의 뇌조직에서 증가하였으나, 로테논/세파클러, 로테논/세팔로틴 나트륨을 주입한 랫트의 뇌조직에서는 감소함을 확인하였다.
하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다.
제제예 1 : 산제의 제조
AGE-알부민의 합성 저해제 0.1 g
유당 1.5 g
탈크 0.5 g
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
제제예 2 : 정제의 제조
AGE-알부민의 합성 저해제 0.1 g
락토오스 7.9 g
결정성 셀룰로오스 1.5 g
마그네슘 스테아레이트 0.5 g
상기의 성분들을 혼합한 후 직타법(direct tableting method)으로 정제를 제조하였다.
제제예 3 : 캡슐제의 제조
AGE-알부민의 합성 저해제 0.1 g
옥수수전분 5 g
카르복시 셀룰로오스 4.9 g
상기의 성분들을 혼합하여 분말을 제조한 후, 상기 분말을 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라 경질 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
제제예 4 : 주사제의 제조
AGE-알부민의 합성 저해제 0.02~0.2 g
주사용 멸균 증류수 적량
pH 조절제 적량
안정화제 적량
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플 당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조하였다.
제제예 5 : 액제의 제조
AGE-알부민의 합성 저해제 0.1 g
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고, 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합하였다. 그 다음 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충전하고 멸균시켜 액제를 제조하였다.

Claims (10)

  1. ＡＧＥ(advanced glycation end-product; 최종당화산물)-알부민의 합성 저해 활성을 갖는 파록세틴 하이드로클로라이드 헤미하이드레이트(C-11)를 포함하는 ＡＧＥ-알부민의 합성 저해제.
  2. 제1항에 있어서, ＡＧＥ-알부민의 합성 저해 활성을 갖는 하기 C-1 내지 C-10 및 C-12 내지 C-42의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 화합물을 추가로 포함하는 ＡＧＥ-알부민의 합성 저해제.
    Figure 112013056397918-pat00045

  3. 제1항에 있어서, C-12, C-17 내지 C-21, C-26 및 C-27로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 화합물을 추가로 포함하는 AGE-알부민의 합성 저해제.
  4. 제 1항 또는 제2항의 ＡＧＥ-알부민의 합성 저해제를 유효성분으로 함유하는 알츠하이머병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 .
  5. 제1항 또는 제3항의 AGE-알부민의 합성 저해제를 유효성분으로 함유하는 파킨슨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 단핵식세포계 세포 내에서 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 ＡＧＥ(advanced glycation end-product; 최종당화산물)-알부민의 합성 저해제에 의해, 단핵식세포계 세포 주변에 있는 세포의 세포사(cell death) 유도를 인비트로에서 저해하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 단핵식세포계 세포 주변에 있는 세포는 신경세포, 연골세포, 폐세포 및 간세포로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포사 유도를 인비트로에서 저해하는 방법.
  8. 제 6항에 있어서, 상기 단핵식세포계 세포는 뇌의 미세아교세포, 혈액단핵세포, 폐포대식세포(type Ⅱ pneumocyte, dust cell), 복강대식세포, 염증부위 육아종대식세포, 비장대식세포, 간의 쿠퍼세포, 관절활액막 A 세포(synovial A cell), 혈관외막세포, 림프절내 대식세포, 및 피부의 랑거한스 세포(Langehans cell)로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는, 세포사 유도를 인비트로에서 저해하는 방법.
  9. (a) 분리된 단핵식세포계 세포에 아밀로이드 베타 1-42, HMGB1, 로테논 또는 6-히드록시도파민, 베타2-마이크로글로불린 중 하나 이상을 처리하는 단계;
    (b) 상기 단핵식세포계 세포에 후보 화합물을 처리하거나(실험군) 또는 처리하지 않고(대조군) 배양하는 단계; 및
    (c) 배양된 실험군 또는 대조군 단핵식세포계 세포의 파쇄물 또는 배양액에 존재하는 AGE-알부민의 농도를 측정하는 단계; 및
    (d) 실험군의 AGE-알부민 농도가 대조군에서 측정된 것보다 유의하게 낮을 경우, 상기 화합물을 AGE-알부민의 합성 또는 분비 저해제로 판정하는 단계를 포함하는, AGE-알부민 합성 저해제를 스크리닝하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 단핵식세포계 세포는 뇌의 미세아교세포, 혈액단핵세포, 폐포대식세포(type Ⅱ pneumocyte, dust cell), 복강대식세포, 염증부위 육아종대식세포, 비장대식세포, 간의 쿠퍼세포, 관절활액막 A 세포(synovial A cell), 혈관외막세포, 림프절내 대식세포, 및 피부의 랑거한스 세포(Langehans cell)로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는, AGE-알부민 합성 저해제를 스크리닝하는 방법.


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논문1;BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS *

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