KR101346779B1 - 켈로이드의 성장 또는 전이 억제용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 아네일레마 케이삭(Aneilema keisak) 추출물을 유효성분으로 포함하는 켈로이드의 성장 또는 전이 억제용 약학 조성물 및 화장료 조성물을 제공한다. 상기 추출물은 TGF-β 신호전달체계의 신호전달물질인 Smad2의 발현을 억제함으로써, 켈로이드의 성장 및/또는 전이를 효과적으로 억제한다.

Description

켈로이드의 성장 또는 전이 억제용 조성물{Composition for inhibiting growth or metastasis of keloids}
본 발명은 켈로이드의 성장 또는 전이 억제용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 아네일레마 케이삭(Aneilema keisak) 추출물을 유효성분으로 포함하는 켈로이드의 성장 또는 전이 억제용 약학 조성물 및/또는 화장료 조성물에 관한 것이다.
켈로이드(keloids)는 콜라겐의 과도한 분비와 같은 세포외기질(ECM: Extracellular matrix)의 비정상적인 축적에 의해 발생하며, '진피섬유양성종양(benign dermal fibrous tumor)'이라고도 칭해진다. 켈로이드는 일반 흉터와 달리 더 단단하고, 피부면 위로 튀어올라와 있으며, 표면이 붉고, 불규칙한 특징을 가지고 있다.
켈로이드에서 분리해낸 켈로이드 섬유아세포(KFs : Keloid Fibroblasts)는 세포외기질의 생산과 섬유아세포의 과성장을 조절한다는 측면에서, 형질전환성장인자-베타(TGF-β) 의존적인 신호전달체계와 병리학적으로 밀접한 연관성을 가지고 있다(J Biol Chem.1986:261:4337-4345. Plast Reconstr Surg.1996:98:827-833). TGF-β 신호전달체계는 콜라겐 생합성과 켈로이드의 세포성장을 촉진시키며, TGF-β 무효화 항체(neutralizing antibodies)와 Smad2의 RNA 감소를 통한 TGF-β 신호전달체계의 억제는 흉터가 줄어들고 콜라겐의 생합성이 줄어든다(Int J Surg.2007:5:278-285).
그러므로, TGF-β 신호전달체계를 억제하는 물질은 켈로이드의 성장 및/또는 전이를 위한 약학 조성물 또는 기능성 화장료 조성물에 유용하게 적용될 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명자들은 켈로이드의 성장 및/또는 전이 활성을 갖는 천연물 유래의 소재를 개발하기 위하여 다양한 천연물을 대상으로 검색을 수행하였다. 놀랍게도, 본 발명자들은 아네일레마 케이삭(Aneilema keisak) 추출물이 켈로이드 섬유아세포에서 TGF-β 신호전달체계의 신호전달물질인 Smad2 (Receptor regulated smad 2)의 발현을 억제함으로써, 켈로이드의 성장 및/또는 전이를 효과적으로 억제하는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 아네일레마 케이삭(Aneilema keisak) 추출물을 유효성분으로 포함하는 켈로이드의 성장 및/또는 전이 억제용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 아네일레마 케이삭(Aneilema keisak) 추출물을 유효성분으로 포함하는 켈로이드의 성장 및/또는 전이 억제용 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, 아네일레마 케이삭(Aneilema keisak) 추출물을 유효성분으로 포함하는 켈로이드의 성장 또는 전이 억제용 약학 조성물이 제공된다. 본 발명에 따른 약학 조성물에 있어서, 상기 조성물의 제형(dosage form)은 용액, 현탁액, 에멀젼, 연고제, 파스타제, 및 패치로 이루어진 군으로부터 선택된 외용 제형(external dosage form)일 수 있다.
본 발명의 다른 태양에 따라, 아네일레마 케이삭(Aneilema keisak) 추출물을 유효성분으로 포함하는 켈로이드의 성장 또는 전이 억제용 화장료 조성물이 제공된다.
본 발명에 따른 약학 조성물 또는 화장료 조성물에 있어서, 상기 추출물은 아네일레마 케이삭(Aneilema keisak)을 C1∼C4 알코올 또는 C1∼C4 알코올과 물의 혼합용매로 추출하는 것을 포함하는 추출방법에 의해 얻어질 수 있다. 상기 추출은 아네일레마 케이삭(Aneilema keisak)의 전초(aerial part)를 건조하고, 얻어진 건조된 전초를 C1∼C4 알코올 또는 C1∼C4 알코올과 물의 혼합용매로 추출, 바람직하게는 초음파 추출함으로써 수행될 수 있다.
본 발명에 의해, 아네일레마 케이삭(Aneilema keisak) 추출물이 켈로이드 섬유아세포에서 TGF-β 신호전달체계의 신호전달물질인 Smad2 (Receptor regulated smad 2)의 발현을 억제함으로써, 켈로이드의 성장 및/또는 전이를 효과적으로 억제억제하는 것이 밝혀졌다. 따라서, 아네일레마 케이삭(Aneilema keisak) 추출물은 켈로이드의 성장 또는 전이 억제용 약학 조성물 또는 화장료 조성물에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 인간 켈로이드 섬유아세포(hKFs)에서의 아네일레마 케이삭(Aneilema keisak) 추출물의 영향을 평가한 결과를 나타낸다.
도 1의 A는 인간 진피 섬유아세포(hDFs) 및 인간 켈로이드 섬유아세포(hKFs)를 분주하여 24시간 동안 세 가지 다른 조건에서 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였을 때, 세포의 성장속도를 측정한 결과이다. 도 1의 A에서 대조군(Cont)는 10% FBS 및 0.1% 젠타마이신이 보충된 DMEM 배지에서 배양한 것을 나타내고, SD는 0.1% FBS 및 0.1% 젠타마이신이 보충된 DMEM 배지에서 배양한 것을 나타내고, SD+TGF는 0.1% FBS, 10 ng/ml TGF-β 리간드 및 0.1% 젠타마이신이 보충된 DMEM 배지에서 배양한 것을 나타낸다.
도 1의 B는 TGF-β 리간드를 처리하여 신호전달체계를 활성화시킨 hKFs에 다양한 천연물 추출물을 처리하였을 때, Smad4의 핵안으로 전좌를 면역형광법(Immunofluorescence)으로 분석한 결과이다.
도 1의 C는 TGF-β리간드를 처리하여 신호전달체계를 활성화시킨 hKFs에 아네일레마 케이삭(Aneilema keisak) 추출물을 처리하였을 때, 세포내 Smad2의 단백질 발현량을 면역블롯팅 방법으로 분석한 결과이다.
도 1의 D는 TGF-β리간드를 처리하였을 때 화학요법제인 블레오마이신(BLM; Bleomycin)과 아네일레마 케이삭(Aneilema keisak) 추출물을 각각 처리하였을 때의 Smad2의 단백질양과 활성화된 형태인 Smad2의 인산화된 단백질양을 면역 블롯팅 방법으로 분석한 결과이다.
도 2 는 hKFs에 아네일레마 케이삭(Aneilema keisak) 추출물을 처리하였을 때, 병리학적 반응을 평가한 결과를 나타낸다.
도 2의 A는 같은 수(1 x 104 cells)의 hKFs를 분주한 후, 아네일레마 케이삭(Aneilema keisak) 추출물을 처리하였을 때, 1일, 2일, 3일, 4일 후에 세포의 수를 측정한 결과이다.
도 2의 B는 아네일레마 케이삭(Aneilema keisak) 추출물을 농도별로 처리한 hKFs 세포에 대하여 유세포분석기로 세포주기를 분석한 결과이다.
도 2의 C는 아네일레마 케이삭(Aneilema keisak) 추출물을 농도별로 처리하였을 때, Col3A1의 mRNA의 양을 측정한 결과이다.
도 2의 D는 90%의 밀도로 동일하게 분주된 hKFs 세포를 멸균된 팁을 이용하여 메카니컬하게 긁어 아네일레마 케이삭(Aneilema keisak) 추출물을 농도별로 처리하여 세포 전이(migration)를 측정한 결과이다.
도 2의 E는 hKFs 세포에 에탄올(CON, 대조군), 블레오마이신(BLM) 10 ㎍/ml, 및 아네일레마 케이삭(Aneilema keisak) 추출물 10, 20, 40 ㎍/ml을 처리하여, 면역형광법을 이용헌 gamma-H2AX foci의 생성 유무의 확인을 통하여, DNA 손상을 야기하는지 확인한 결과이다.
본 발명은 아네일레마 케이삭(Aneilema keisak) 추출물을 유효성분으로 포함하는 켈로이드의 성장 또는 전이 억제용 약학 조성물이 제공한다.
본 발명은 또한 아네일레마 케이삭(Aneilema keisak) 추출물을 유효성분으로 포함하는 켈로이드의 성장 또는 전이 억제용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 약학 조성물 또는 화장료 조성물에 있어서, 상기 추출물은 아네일레마 케이삭(Aneilema keisak)을 C1∼C4 알코올 또는 C1∼C4 알코올과 물의 혼합용매로 추출하는 것을 포함하는 추출방법에 의해 얻어질 수 있다. 바람직하게는, 상기 추출은 아네일레마 케이삭(Aneilema keisak)의 전초(aerial part)를 건조하고, 얻어진 건조된 전초를 C1∼C4 알코올 또는 C1∼C4 알코올과 물의 혼합용매로 추출함으로써 수행될 수 있다.
상기 추출용매의 사용량은 크게 제한되는 것은 아니며, 예를 들어 아네일레마 케이삭(Aneilema keisak)의 전초 건조물 1 중량에 대하여 약 1 내지 10배 부피, 바람직하게는 약 1 내지 5배 부피의 비율로 사용될 수 있다. 또한, 상기 추출은 약 1.5 시간 내지 48 시간, 바람직하게는 약 2 시간 내지 24 시간 동안, 냉침 추출, 열수 추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출 등의 추출방법으로 수행될 수 있다. 바람직하게는 상기 추출은 실온(약 25 ℃)에서 초음파 추출법에 의해 수행될 수 있으며, 또한 상기 추출과정은 단회 또는 복수회 수행할 수 있고, 바람직하게는 약 3회 정도 반복 수행할 수 있다. 얻어진 추출액은 필요에 따라 통상의 방법, 예를 들어 약 30 내지 70℃에서, 감압 농축하거나 감압 건조함으로써, 액상 또는 분말 형태로 추출물을 얻을 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있으며, 통상의 방법에 따라 다양한 제형으로 제제화될 수 있다. 바람직하게는 본 발명에 따른 약학 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 연고제, 파스타제, 및 패치로 이루어진 군으로부터 선택된 외용 제형(external dosage form)으로 제제화될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오즈, 메틸 셀룰로오즈, 미결정 셀룰로오즈, 히드록시프로필셀룰로오스, 저치환도히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메칠셀룰로오즈2910, 폴리에틸렌글리콜 6000, 폴리비닐 피롤리돈, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트 등을 포함한다. 또한, 충진제, 증량제, 습윤제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 포함한다. 비경구용 제제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 에멀젼, 좌제 등을 포함하며, 비수성 용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르류 등을 포함한다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 함유되는 아네일레마 케이삭(Aneilema keisak) 추출물의 투여량은 겔로이드를 갖는 환자의 상태, 질병의 정도, 제제 형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 상기 아네일레마 케이삭(Aneilema keisak) 추출물은 1일 0.1 ∼ 100 mg, 바람직하게는 1 ∼ 10 mg의 용량으로 켈로이드 부위에 국소투여될 수 있다. 따라서, 본 발명의 약학 조성물은 0.1 ∼ 10 mg/day, 바람직하게는 1 ∼ 10 mg/day의 용량으로 국소투여되기에 적합한 함량의 아네일레마 케이삭(Aneilema keisak) 추출물을 함유할 수 있다. 각각의 단위 투여 형태는 하루에 한번 또는 수회 나누어 투여하는데 적합하도록 제제화될 수 있다.
본 발명에 따른 화장료 조성물은 화장료 조성물 분야에서 통상적으로 사용되는 방법에 따라 다양한 형태로 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 화장료 조성물은 크림, 팩, 로션, 에센스, 화장수, 파운데이션 및 메이크업 베이스 등의 통상의 화장료 조성물 형태일 수 있으며, 상기 화장료 조성물은 화장료 분야에서 통상적으로 사용되는 담체 또는 첨가제와 함께 통상의 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 아네일레마 케이삭(Aneilema keisak) 추출물의 함량은 예를 들어 단위 화장료 당 0.001 내지 20 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 15중량%, 가장 바람직하게는 0.1 내지 10 중량%의 범위일 수 있다. 물론, 상기 함량은 원하는 켈로이드의 성장 또는 전이 억제 정도 등에 따라 상이할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 추출물의 제조
아네일레마 케이삭(Aneilema keisak)의 전초를 채취하여 약 7일 동안 건조하였다. 건조된 전초 279.7 g에 무수 메탄올 700 ml을 가하고, 초음파 추출을 2 시간 동안 수행하였다. 상기 초음파 추출 과정을 2회 추가로 수행하였다. 얻어진 추출액을 감압하에서 건조하여 추출물 23.24 g의 추출물을 얻었다.
시험예. 항-켈로이드 활성 평가
1. 재료 및 시험방법
(1) 시약
1차 항체인 항-smad4(cat# SC-7966), 항-β-액틴(cat# SC-47778), 항-알파-튜불린(cat# SC-8035) 항체는 Santa cruz Biotechnology, Inc(Santa cruz, CA, USA)로부터 구입하였다. 항-절단된(cleaved) PARP(cat#9546), 항-인산화된(phosphorylated) Rb(pRb, ser807/811: cat#9308), 항-인산화된 Akt(pAkt, ser473: cat#4060X), 항-인산화된 H2AX(pH2AX, ser139: cat#9718), 항-인산화된 Smad2(pSmad2, ser465/467: cat#3101), 항-Smad2(cat#3103) 항체는 Cell Signaling Technology(Danvers, MA, USA)로부터 구입하였다. 2차 항체인 퍼옥시다아제가 결합된 항-마우스, 항-토끼 항체는 Jackson Immuno Research Laboratories(West Grove, PA, USA)로부터 구입하였다. 2차 항체인 Alexa 594가 결합된 항-마우스 IgG 는 Molecular Probes(Eugene, OR, USA)로부터 구입하였다. Cy2가 결합된 항-토끼 IgG는 Jackson Immuno Research Laboratories(West Grove, PA, USA)로부터 구입하였다. 블레오마이신(BLM: Bleomycin, cat#203408)은 Calbiochem (San Diego, CA, USA)으로부터 구입하였다.
(2) 세포 배양
강북삼성병원(IRB#KBC-10126)으로부터 기부받은 환자의 피부 시료에서 인간 진피 섬유아세포(hDF)와 인간 켈로이드 섬유아세포(hKFs)를 얻었다. 즉, 인간 진피 피부를 0.25% 디스파아제(Dipase)(Gibco)로 4℃에서 16시간 동안 처리하여 분리하였다. 섬유아세포를 포함하는 진피 피부를 조각낸 뒤, 100 U/ml페니실린, 100 ㎍/ml의 스트렙토마이신 및 10% 소태아혈청(fetal bovine serum)(FBS)이 보충된 둘베코 변형 이글즈 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium)(DMEM)로 구성된 배지가 들어있는 플라스크에 외식(explant)하였다. 각 세포군을 콘플루언스(confluence) 전까지 유지한 뒤, 트립신으로 처리하였다. 2∼3회의 계대를 거친 세포를 시험에 이용하였다. 얻어진 인간 진피 섬유아세포와 켈로이드 섬유아세포를 10% 소태아혈청(FBS)과 0.1% 젠타마이신(gentamycin)(Chemicon)이 보충된 DMEM 배지에서, 37℃, 5% CO2 조건하에서 유지하였다.
(3) RNA 분리와 정량적인 실시간 PCR(Real-time PCR) 분석
제조사의 지시서에 따라, Trizol 시약(Invitrogen)을 사용하여 세포로부터 총 RNA를 추출한 후, DNase I 처리를 하였다. 클로로포름을 첨가하여 Trizol을 제거하고, 이소프로판올을 이용하여 mRNA를 침전시켰다. 침전된 mRNA를 75% 에탄올로 세척하였다. 260nm∼280nm에서 UV 스펙트로미터(spectrometer)를 이용하여 광밀도를 측정하여 RNA의 양과 순도를 결정하였고, 아가로즈 겔 전기영동을 하여 RNA의 완전성(integrity)을 확인하였다. 사용된 유전자 특이적 프라이머는 다음 표 1과 같다. GAPDH를 하우스키핑 유전자((housekeeping gene)로 사용하였다.
유전자 서열번호 서열
Smad2
 1 정방향 5'-AAACCCTTACCACTATCAGA-3'
2 역방향 5'-TTTGATTCAACTGTTGGTCA-3'
Col1A2
 3 정방향 5'-GGTGGTGGTTATGACTTTGG-3'
4 역방향 5'-TCTGGGTGGCTGAGTCTCAA-3'
Col3A1
 5 정방향 5'-GCTCTGCTTCATCCCACTATTA-3'
6 역방향 5'-AACATTCTCCAAATGGAATT-3'
GAPDH
 7 정방향 5'-AAGGGTCATCATCTCTGCCC-3'
8 역방향 5'-GTGATGGCATGGACTGTGGT-3'
모든 증폭과정은 1 × SYBR supermix의 최종 농축물, 500 nmol/l의 유전자 특이 프라이머, 및 2㎕의 주형을 함유하는 최종 반응 혼합물(20㎕)에서 다음 조건하에서 수행되었다: 초기의 변성은 95℃에서 5분, 그 후부터는 95℃에서 45초간, 58℃에서 45초간, 72℃에서 45초간의 45 사이클, 그리고 마지막 신장은 72℃에서 5분간 수행하였다. 증폭을 한 후, 소프트웨어 패키지(Light cycler480II Roche)를 이용하여 각 반응의 기준치와 역치를 결정하였다. PCR의 유효함을 확인하기 위하여, 증폭 산물을 2% 아가로즈 겔로 분리하였고, 에티디움 브로마이드(ethidium bromide)로 염색하여 시각화하였다.
(4) 면역블롯팅(Immunoblotting)
세포를 차가운 인산완충식염수(PBS)로 2회 세척하고, 조직 용해 버퍼(tissue lysis buffer) 300 ㎕에 용해시킨 뒤 14,000 rpm으로 10분간 원심분리하였다. 약 20㎍의 총 단백질을 SDS-PAGE로 분리하였다. 단백질을 PVDF 막으로 전이시킨 뒤, 0.1% 트윈-20 함유 트리스 완충식염수(Tris-buffered saline, TBS-T) 중의 5%의 탈지분유로 1시간 동안 블로킹시켰다. 1% BSA 용액을 포함하는 TBS 중에서 일차 항체와 함께 상온 1시간 또는 4℃에서 16시간 동안 배양하였다. 막을 TBS-T 용액으로 세척하고, HRP와 결합된 이차 항체(0.1㎍/ml; Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA)로 45분 동안 반응시켰다. 면역 반응은 ECL 검출 시스템(enhanced chemiliminescence detection system) (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)을 이용하여 검출하였다.
(5) 면역형광법(Immunofluorescence)
둥근모양 유리 커버슬립(coverslip)(#1, VWR) 상에 자란 세포를 4% 파라포름알데히드로 8분간 고정한 뒤, 0.1% 트리톤 X-100 함유 PBS로 2분간 침투시켰다. 고정된 세포를 블로킹시키기 위하여 3% BSA를 포함하는 TBS에서 1시간 동안 추가 배양한 후, 특정 1차 항체로 1시간 배양시켰다. 세포를 TBS-T 용액으로 3번 세척한 후, Cy2-결합 항-토끼 2차 항체(Jacson ImmunoResearch Laboratories)와 함께 45분 배양하였다. 세포 DNA를 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI, PBS중의 0.2 ㎍/ml)로 대조 염색하였다.
(6) 유세포 분석법 (FACs analysis)
대조군인 에탄올과 실시에 1에서 얻어진 아네일레마 케이삭(Aneilema keisak) 추출물을 함유한 배양 배지에서 각각 키운 세포를 트립신을 사용하여 배양플레이트에서 떼어내 PBS로 2회 세척한 뒤, -20℃에 보관해 두었던 70% 에탄올 3ml을 이용하여 4℃에서 16시간 동안 세포를 고정하였다. 고정된 세포는 100 ㎍/mL의 RNase A (Invitrogen)를 포함한 PBS에 30분 동안 반응시킨 후, 50 ㎍/mL의 프로피이움 아이오다이드(propidium iodide, Sigma)를 포함한 PBS에 다시 30분 동안 반응시켰다. DNA 함량측정은 유세포 분석기(FACScanAnalyzer, BD Biosciences)를 사용하였고, 결과의 분석은 Sync Wizard Model, ModFit LT software package (BD Biosciences)를 사용하였다. 제1휴지기(G1 phase), DNA합성기(S phase), 그리고 제2휴지기/세포분열기(G2/M phase)의 퍼센트를 확인하기 위해 G1/S기로 세포주기를 정지시켜놓은 세포로부터 2N과 4N 피크를 설정하였다.
(7) 세포전이시험(Migration assay)
세포를 90% 밀도로 분주한 후 마이크로파이펫 팁(micropipette tip)으로 동일 양을 긁어낸 후 PBS로 2회 세척한 뒤, 대조군인 에탄올과 실시에 1에서 얻어진 아네일레마 케이삭(Aneilema keisak) 추출물을 각각 포함하고 있는 세포 배양 배지 중에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후 세포의 전이 정도를 사진으로 찍은 후 Image Pro. 프로그램을 사용하여 분석하였다.
(8) 통계분석(Statistical analysis)
그래픽 데이터는 평균±표준편차(meas±S.D)로 나타내었다. 세 그룹간 그리고 그룹간의 통계학적 유의성은 one way ANOVA와 Bonferroni post-test, Student t-test 로 분석하였다. 유의성은 p<0.05(*), p<0.01(**) 일 때로 가정하였다. 통계학적 분석은 SAS 통계분석 v.9.13으로 분석하였다.
2. 결과 및 고찰
인간 진피 섬유아세포(hDFs) 및 인간 켈로이드 섬유아세포(hKFs)를 분주하여 24시간 동안 세 가지 다른 조건에서 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였을 때, 세포의 성장속도를 측정하였다. 즉, 첫번째 조건(Cont): 10% FBS를 포함하는 배지를 사용하여 배양(정상적 세포주기 상태). 두번째 조건(SD): 0.1% FBS를 포함하는 배지를 사용하여 배양(휴지기 세포주기로 모인 상태). 세번째 조건(SD+TGF-β: 0.1% FBS 및 10 ng/ml의 TGF-β 리간드를 포함한 배지를 사용하여 배양. hDFs와 hKFs는 모두 세포를 휴지기로 유도하기 위하여 실행한 0.1% 소태아혈청을 포함한 배양 배지에서 세포의 성장이 억제되었다. 그러나 TGF-β 리간드를 넣어준 휴지기 유도상황에서는 hKFs의 성장억제가 반전되는 것을 확인하였다(도 1의 A). TGF-β 신호전달체계는 세포외기질(ECM: Extracellular matrix) 구성물질인 엘라스틴, 피브로넥틴, 콜라겐 타입 I, III의 생합성을 촉진시키는 것이 보고되어 있다(Int J Mol Med. 2009: 24: 283-293). 따라서, TGF-β 신호전달체계는 ECM 구성물질의 비정상적인 축적에 의해 발생하는 켈로이드의 성장 억제제 개발을 위한 표적으로서 기능할 수 있다.
본 발명자들은 상기한 TGF-β 신호전달체계에 대한 저해 활성을 갖는 물질을 찾기 위하여 다양한 종류의 천연물 추출물을 대상으로 시험을 수행하였다. 10 ng/ml의 농도로 TGF-β 리간드를 처리하여 신호전달체계를 활성화시킨 hKFs에, 다양한 종류의 천연물 추출물을 같은 농도(20 ㎍/ml, 에탄올에 용해시킴)로 처리하여 hKFs에서의 TGF-β 신호전달체계의 활성도를 측정하였다. TGF-β 신호전달체계는 Smad2/Smad3 단백질의 인산화를 통해 신호전달 매개체인 Smad4와 결합하여 핵안으로 전좌되어 다양한 유전자의 전사를 조절한다(Nature 2003: 425: 577-584). TGF-β 신호전달체계의 활성도에 미치는 영향을 평가하기 위하여 Smad4의 핵안으로의 전좌(translocation)를 면역형광법(Immunofluorescence)으로 평가한 결과, 시험에 사용된 추출물 a 내지 추출물 f 중 추출물 c만이 Smad4의 핵안으로의 전좌를 유의성 있게 억제하였으며(도 1의 B), 이러한 추출물에 의한 TGF-β 신호전달체계의 억제는 Smad2 단백질 발현의 억제에 기인한 것임이 면역블롯팅을 통해 밝혀졌다(도 1의 C). 상기 추출물 c를 확인한 결과, 아네일레마 케이삭(Aneilema keisak) 추출물로 밝혀졌다.
또한, TGF-β 리간드 존재하에서, 켈로이드 치료를 위한 화학요법제인 블레오마이신(BLM; Bleomycin)과 아네일레마 케이삭(Aneilema keisak) 추출물을 각각 에탄올에 용해시켜 처리하였을 때, Smad2의 단백질양과 활성화된 형태인 Smad2의 인산화된 단백질양을 면역 블롯팅 방법으로 분석한 결과는 도 1의 D와 같다. 도 1의 D의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 아네일레마 케이삭(Aneilema keisak) 추출물은 Smad2의 단백질양과 인산화된 Smad2의 단백질양을 모두 억제하는 반면에, 블레오마이신(BLM: bleomycin)은 Smad2의 단백질양과 인산화된 Smad2의 단백질양에 영향을 끼치지 않았다. 따라서, 아네일레마 케이삭(Aneilema keisak) 추출물은 화학요법제인 블레오마이신과 상이한 작용기전에 의해 켈로이드 치료활성을 가짐을 알 수 있다.
실시예 1에서 제조한 아네일레마 케이삭(Aneilema keisak) 추출물은 hKFs의 증식을 억제하고 제2 휴지기로 세포주기를 정지시켰으며, 세포노화 정도를 증가시켰다(도 2의 A 및 B). 즉, hKFs를 1 x 104 cells로 분주한 후, 실시예 1에서 제조한 추출물을 에탄올에 용해시켜 처리하고(대조군은 에탄올만 처리), 1일, 2일, 3일, 4일 후에 세포의 수를 분석하였을 때 hKFs의 성장속도가 농도 의존적으로 감소하였다(도 2의 A). 또한, 실시예 1에서 제조한 추출물을 에탄올에 용해시켜 각각 0, 10, 20, 40 ㎍/mL의 농도로 처리한 hKFs 세포에 대하여 유세포분석기로 세포주기를 분석한 결과, 제2휴지기/세포분열기를 나타내는 4N 피크가 증가하였다(도 2의 B, 상위패널). 또한, 세포노화를 측정하기 위하여 베타-갈락토시데이즈 염색(β-galactosidase staining)을 수행한 결과, 아네일레마 케이삭(Aneilema keisak) 추출물을 처리한 hKFs 가 대조군에 비해 세포노화가 증가함을 알 수 있다 (도 2의 B, 하위패널).
ECM 구성물질 중 콜라겐 타입 I과 III의 과도한 축적에 의해 야기되는 섬유화(fibrosis)는 켈로이드 섬유아세포의 세포증식을 촉진시켜 세포전이를 촉진하며, 이 섬유화는 TGF-β 신호전달체계에 의해 증가된다고 알려져 있다(Biochem J 1987:247:597-604, FASEB J.2004:18:816-827). 실시예 1에서 얻어진 추출물을 에탄올에 용해시켜 농도별도 처리한 후, 실시간 PCR(real-time PCR)을 수행한 결과, 콜라겐 타입 III 단백질을 코딩하는 Col3A1의 mRNA의 양이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 2의 C). 또한 90%의 밀도로 동일하게 분주된 hKFs 세포를 멸균된 팁을 이용하여 메카니컬하게 긁어 실시예 1에서 얻어진 아네일레마 케이삭(Aneilema keisak) 추출물을 에탄올에 용해시켜 농도별로 처리하였을 때, 세포 전이(migration)가 농도 의존적으로 감소하였다(도 2의 D).
블레오마이신, 마이토마이신 C, 5-플루오로우라실, 독소루비신 등의 화학치료제들은 DNA 손상을 야기하여 g-H2AX nuclear foci를 형성하는 것으로 알려져 있다(Cancer Res.2010:70:4112-4122). 그러나, hKFs 세포에 에탄올(CON, 대조군), 블레오마이신(BLM) 10 ㎍/ml, 및 실시예 1에서 제조한 추출물 10, 20, 40 ㎍/ml을 에탄올에 용해시켜 처리하여, 면역형광법을 통해 DNA손상을 나타내는 지표중 하나인 인산화된 H2AX 와 DAPI로 핵을 염색한 결과, 추출물을 처리한 세포에서는 DNA 손상의 흔적이 관찰되지 않았다(도 2의 E).
따라서, 아네일레마 케이삭(Aneilema keisak) 추출물은 인간 켈로이드 섬유아세포에서 세포의 과다 성장, 콜라겐의 분비, 및 세포 전이를 효과적으로 억제함으로써, 켈로이드의 성장 및 전이를 억제하기 위한 약학 조성물 및/또는 기능성 화장료로서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다. 특히, 상기 추출물은 켈로이드 화학치료제로 쓰이는 블레오마이신과는 달리 DNA 손상을 야기하지 않으므로, 우수한 안정성을 가짐을 알 수 있다.
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Claims (9)

  1. 아네일레마 케이삭(Aneilema keisak) 추출물을 유효성분으로 포함하는 켈로이드의 성장 또는 전이 억제용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조성물의 제형이 용액, 현탁액, 에멀젼, 연고제, 파스타제, 및 패치로 이루어진 군으로부터 선택된 외용 제형인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 추출물이 아네일레마 케이삭(Aneilema keisak)을 C1∼C4 알코올 또는 C1∼C4 알코올과 물의 혼합용매로 추출하는 것을 포함하는 추출방법에 의해 얻어진 것임을 특징으로 하는 약학 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 추출이 아네일레마 케이삭(Aneilema keisak)의 전초(aerial part)를 건조하고, 얻어진 건조된 전초를 C1∼C4 알코올 또는 C1∼C4 알코올과 물의 혼합용매로 추출함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  5. 제3항에 있어서, 상기 추출이 초음파 추출에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  6. 아네일레마 케이삭(Aneilema keisak) 추출물을 유효성분으로 포함하는 켈로이드의 성장 또는 전이 억제용 화장료 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 추출물이 아네일레마 케이삭(Aneilema keisak)을 C1∼C4 알코올 또는 C1∼C4 알코올과 물의 혼합용매로 추출하는 것을 포함하는 추출방법에 의해 얻어진 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 추출이 아네일레마 케이삭(Aneilema keisak)의 전초(aerial part)를 건조하고, 얻어진 건조된 전초를 C1∼C4 알코올 또는 C1∼C4 알코올과 물의 혼합용매로 추출함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 상기 추출이 초음파 추출에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
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