KR101346047B1

KR101346047B1 - 다능성 줄기 세포로부터 심근 세포의 분화를 유도하는 방법

Info

Publication number: KR101346047B1
Application number: KR1020127032143A
Authority: KR
Inventors: 유이치 고시미즈; 도모후미 다나카; 가요코 가와시마; 미치노리 가도쿠라
Original assignee: 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤
Priority date: 2006-04-28
Filing date: 2007-04-27
Publication date: 2013-12-31
Also published as: JP5149791B2; JPWO2007126077A1; BRPI0710949A2; US8293529B2; US20090325288A1; EP2014766A1; EP2457994A1; KR20090009267A; RU2433174C2; CN101426902A; KR20120139856A; CA2650685A1; RU2008146991A; AU2007244226B2; EP2014766A4; AU2007244226A1; CN101426902B; WO2007126077A1; IL194970A0; IL194970A

Abstract

본 발명은 줄기 세포로부터 효율적이고 선택적으로 심근 세포를 분화 유도하는 방법을 제공한다. 다능성 줄기 세포로부터 심근 세포를 분화 유도하는 방법은 다능성 줄기 세포를 (i) 분화 유도 개시부터 카노니칼 Wnt 유전자의 발현 상승기의 24 시간 전까지의 기간동안 카노니칼 Wnt 신호 경로의 활성화를 촉진시키는 물질이 포함되지 않은 배양액에서 배양하고, (ii) 카노니칼 Wnt 유전자의 발현 상승기의 24 - 0 시간 전부터 24 - 96 시간의 기간동안 카노니칼 Wnt 신호 경로의 활성화를 촉진시키는 물질이 포함된 배양액에서 배양하는 단계를 포함하는, 다능성 줄기 세포로부터 심근 세포를 분화 유도하는 방법을 제공한다.

Description

다능성 줄기 세포로부터 심근 세포의 분화를 유도하는 방법{METHOD FOR DIFFERENTIATION INDUCTION OF MYOCARDIAL CELL FROM PLURIPOTENT STEM CELL}

본 발명은 ES 세포 등의 다능성 줄기 세포로부터 선택적이고 고효율적으로 심근 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다.

(1) 다능성 줄기 세포를 이용한 심근 세포의 제조

일반적으로, 심근 세포는 출생 전에 자율 박동하면서 활발하게 세포 분열하지만, 출생 직후에 그 분열능이 상실되며, 또한 미분화된 줄기 세포나 전구 세포가 극소수로 거의 존재하지 않고 그 증식능 및 분화능도 매우 낮기 때문에, 심근경색이나 심근염 등의 각종 스트레스에 노출되어 심근 세포가 사멸하게 되면, 상실된 심근 세포는 보충되지 않는 것으로 여겨지고 있다. 그 결과, 잔존하는 심근 세포는 대상성 비대(compensatory hypertrophy)를 통해 심장 기능을 유지하고자 하지만, 각종 스트레스가 계속되어 허용 범위를 넘어서게 되면, 추가적인 심근 세포의 피폐, 사멸로 이어져, 심근 기능이 저하(즉, 심부전)되게 된다.

심부전을 비롯한 여러가지 심장병은 일본에서 사망 원인의 두번째를 차지하고 있으며, 그 예후도 매우 나빠 심장 질환자의 5년 생존율은 약 50%에 불과하다. 그러므로, 치료 효과가 높은 심부전 치료법의 개발은 의료 복지의 크나큰 전진과 의료 경제 개선과 직결되는 것으로 생각된다. 심부전 치료제로 종래에는 심근의 수축력을 증가시키는 디기탈리스(digitalis) 제제나 크산틴(xanthine) 제제 등의 강심제가 사용되었지만, 이들 약제의 장기 투여는 심근 에너지의 과잉 소비로 인해 병의 용태를 악화시키는 것으로 알려져 있다. 또한, 최근에는 교감 신경계나 레닌-안지오텐신계(renin-angiotensin system)의 항진에 의한 과도한 심장 부하를 경감시키는 β 차단제나 ACE 저해제에 의한 치료가 주를 이루고 있지만, 이는 대증적 치료법에 불과하여, 상해를 입은 심장 조직 자체를 회복시키는 것은 아니다. 이에 반해, 심장 이식은 중증 심부전에 대한 근본적인 치료법이지만, 장기 기증자의 부족이나 의료 윤리, 환자의 육체적·경제적 부담의 중압감 등의 문제로 인해 이러한 방법을 일반적인 치료법으로 통용하기는 어렵다.

그 때문에, 쇠약 또는 소실된 심근 세포를 보충적으로 이식하는 방법이 심부전의 치료에 매우 유용할 것으로 생각된다. 실제, 동물 실험에서, 태아로부터 미성숙 심근 세포를 입수하고 이를 성체 심장 조직에 이식하면 이식된 세포가 심근 세포로서 효율적으로 기능한다는 것이 알려져 있다(비특허문헌1 참조). 그러나, 이 방법의 경우 대량의 심근 세포를 입수하기 어렵고, 윤리적 관점에서도 임상 의료에 응용하긴 곤란하다.

그래서, 심근 세포를 미분화한 줄기 세포로부터 분화 유도하고, 이를 이식용 세포로 이용하는 방법이 최근들어 특히 주목을 받고 있다. 현재, 성체 심장 조직에서 심근 세포를 생산할 수 있는 전구 세포 또는 줄기 세포로서 명백하게 동정할 수 있는 세포 집단은 발견되고 있지 않기 때문에, 상기의 방법을 실시하기 위해서는 보다 미분화되고 다양한 분화능을 가지고 있는 다능성 줄기 세포를 사용할 수 있을 것으로 생각된다.

다능성 줄기 세포(pluripotent stem ceI1s)는 시험관내 배양에 의해 미분화 상태를 유지한 채, 거의 영속적 또는 장기간의 세포 증식이 가능하고, 정상적인 핵형(karyotype)을 나타내며, 적당한 조건 하에서는 모두 3가지 배엽(외배엽, 중배엽 및 내배엽)의 계통의 세포로 분화되는 능력을 가지고 있는 세포로 정의된다. 다능성 줄기 세포로는 초기 배아로부터 분리된 배아 줄기세포(embryonic stem cell: ES 세포), 태아기의 원시 생식 세포로부터 분리된 배아성 생식 세포(embryonic germ cell: EG 세포), 출생 직후의 정소로부터 분리된 생식 세포계열 줄기 세포(germline stem cells : GS 세포) 등이 가장 잘 알려져 있다.

특히, ES 세포는 이전부터 시험관내 배양에 의해 심근 세포로부터 분화 유도할 수 있는 것으로 알려져 있다. 초기 연구들은 대부분 마우스 유래의 ES 세포를 이용하여 행해졌다. ES 세포를 단일 세포 상태(효소 처리 등으로 인해 세포끼리 접착되지 않고 각각의 세포가 분산된 상태) 하에서, 백혈병 저해 인자(leukemia inhibitory factor: LIF) 등의 분화 억제 인자를 존재시키지 않은 상태에서 현탁 배양하였을 때, ES 세포는 서로 접착 및 응집하여 배상체(embryoid body: EB)라고 불리는 초기 배아 유사 구조체를 형성한다. 그 후, EB를 부유 상태 또는 접착 상태로 배양하면, 자율 박동성을 가진 심근 세포가 나타나는 것으로 알려져 있다.

전술한 바와 같이 제조된 ES 세포 유래의 심근 세포는 태아 심장 유래의 미성숙 심근 세포와 매우 유사한 형질을 보인다(비특허문헌 2, 3 참조). 또한, 실제 ES 세포 유래의 심근 세포를 성체 심장 조직에 이식한 동물 실험의 예에서, 태아 심근을 이식한 경우와 마찬가지로, 유효성이 매우 높은 것으로 확인되었다(특허문헌 1, 비특허문헌 4 참조).

1995년, 톰슨 등은 최초로 영장류로부터 ES 세포를 수립하였고, 이로써 다능성 줄기 세포에서 유래된 심근 세포를 이용한 심근 재생 치료법의 실용화가 현실성을 띄게 되었다(특허문헌 2, 비특허문헌 5 참조). 계속해서, 이들은 인간 초기 배아로부터 인간 ES 세포주를 분리 및 확립하는 것도 성공하였다(비특허문헌6 참조). 또한, Gearhart 등은 인간 원시 생식 세포로부터 hEG 세포주를 수립하였다(비특허문헌 7, 특허문헌 3 참조).

마우스 ES 세포와 동일하게, 인간 ES 세포를 심근 세포로 분화 유도할 수 있다는 것이, Kehat 등(비특허문헌8 참조) 및 Xu 등(특허문헌4, 비특허문헌9 참조)에 의해 보고되었다. 이들 보고에 의하면, 인간 ES 세포로부터 분화 유도된 심근 세포는 자율 박동능을 가지고 있음은 물론, 미오신 중쇄/경쇄나 α-액티닌, 트로포닌 I 및 심방성 이뇨 펩타이드(atrial natriuretic peptide; ANP) 등의 심근 특이ㅈㄱ 단백질이나, GATA-4이나 Nkx 2.5, MEF-2c 등의 심근 특이적 전사 인자를 발현 및 생산할 뿐만 아니라, 미세해부학적 관찰 및 전기생리학적 분석을 통해 태생기에 미성숙 심근 세포의 형질을 보유하고 있는 것으로 나타나, 재생 의료에서의 이용이 기대되고 있다.

한편, 다능성 줄기 세포로부터 유래된 심근 세포를 세포 이식 치료나 그외 목적으로 사용할 경우의 중요한 문제점은, 종래의 방법에 의해 ES 세포 또는 EG 세포로부터 형성된 EB에서는 심근 세포 외에도 혈구계 세포나, 혈관계 세포, 신경계 세포, 장관계 세포, 뼈·연골 세포 등의 다른 타입의 세포가 혼재하여 발생한다는 것이다. 게다가, 이들이 분화된 세포에서 심근 세포가 차지하는 비율은 그다지 높지 않고, 전체에 약 5 - 20%에 불과하다.

다른 타입의 세포가 혼재하고 있는 가운데 심근 세포만을 선택적으로 선별하는 방법으로는, ES 세포의 유전자에 인위적인 수식을 가하고, 약제 내성 또는 이소성 발현능(ectopic expression)을 부여함으로써, 심근 세포 또는 그의 전구 세포의 형질을 가지고 있는 세포를 회수하는 방법을 들 수 있다. 예를 들면, Field 및 공동 연구자들은, α-미오신 중쇄 프로모터의 제어 하에 네오마이신(G418) 내성 유전자를 발현시킬 수 있는 유전자 카세트를, 마우스 ES 세포에 도입함으로써, 이들 ES 세포가 심근 세포로 분화되어 α형태의 미오신 중쇄 유전자를 발현할 경우에만, G418이 첨가된 배지에서 생존할 수 있는 시스템을 구축하였다(특허문헌 1, 비특허문헌 4 참조). 이러한 방법에 의해 G418 내성 세포로서 선별된 세포는 99% 이상의 확률로 심근 세포인 것으로 확인되었다. 그러나, 이 방법에서는, 심근 세포의 순도는 매우 높아지지만, 최종적으로 얻어지는 심근 세포수가 전체 세포수에 대해 약 몇 퍼센트에 불과하여, 이식 치료에 필요한 심근 세포를 얻는 것은 용이하지 않다.

또, Xu 등은 인간 ES 세포를 5-아자사이티딘으로 처리하면, EB에서 트로포닌 I-양성(심근) 세포가 15%에서 44%로 증가한다는 것을 보고하였다(비특허문헌 9 참조). 그러나, 이러한 방법에서도, 심근 세포가 차지하는 비율은 EB의 50%를 초과하지 않는다. 또한, 탈메틸화제인 5-아자사이티딘은 DNA에 결합된 메틸기를 이탈시킴으로써 유전자의 발현 상태를 변화시키는 약제로서, 약제가 직접 염색체에 작용하기 때문에, 이식용 세포를 제조하는 약제로서는 적당하지 않다.

그외에, ES 세포로부터 심근 세포를 보다 고효율로 발생시키는 방법으로는, 예를 들면, 마우스 ES 세포에서, 레티노익산(비특허문헌 10 참조), 아스코르브산(비특허문헌 11 참조), TGFβ, BMP-2(비특허문헌 12 참조), PDGF(비특허문헌 13 참조), Dynorphin B(비특허문헌 14 참조)의 첨가, 또는 세포내 활성 산소종 (reactive oxygen species ROS)(비특허문헌 15 참조)이나 Ca² ⁺ (비특허문헌 16 참조)을 증가시키는 처리가, 심근 세포의 분화 유도에 촉진적으로 작용한다는 것이 알려져 있지만, 이러한 어떠한 방법으로도 심근 세포 특이적 분화 또는 선택적인 분화 유도는 이루어지지 않았다. 최근, 발명자들을 포함하는 연구 그룹에 의해, ES 세포를 BMP 길항제로 일시적으로 처리하면, 종래 방법에 비해 고효율적이고 선택적으로 심근 세포를 분화 유도할 수 있다는 것이 밝혀졌다(특허문헌 5, 비특허문헌 17).

(2) 심근 세포의 분화·발생 과정에 있어서의 Wnt 단백질의 기능적 역할

분비성 단백질인 Wnt 단백질은 척추동물 뿐만 아니라 선충 또는 곤충 등의 무척추동물에서도 널리 그 존재가 인지된 단백질 패밀리 군으로, 이 유전자 패밀리에는 다수의 분자종이 있는 것으로 알려져 있다 (비특허문헌 18, 19). 예를 들면, 인간이나 마우스에서 현재 밝혀져 있는 것은 19 종(Wnt-1, 2, 2b/13, 3, 3a, 4, 5a, 5b, 6, 7a, 7b, 8a, 8b, 9a, 9b, 10a, 10b, 11, 16)이다. 이들 Wnt 유전자에 의해 코딩되는 Wnt 단백질 군은 그 조직 특이성 측면에서 각각 다르지만, 구조적으로 서로 유사하다.

Wnt 단백질이 리간드로서 세포내 신호 전달 시스템에 기여하는 경우, 이것은 세포막 상에 존재하는 7회 막 관통형의 프리즐드(Frizzled; 이하, Fzd라 함) 패밀리 수용체에 결합한다. Fzd 수용체의 하류에서 작용하는 다수의 경로가 있지만, 가장 주요한 경로로는 글리코겐 합성 효소 키나제(glycogen synthase kinase: GSK)-3β을 통한 β-카테닌의 인산화 억제를 들 수 있다. Wnt 신호가 존재하지 않을 경우, β-카테닌은 APC(Adenomatous polyposis coli) 단백질 상에서 액신(Axin)에 의해 GSK-3β와 함께 보족(補足)되어, GSK-3β에 의해 신속하게 인산화된다. 인산화된 β-카테닌은 유비퀴틴화되고 프로테아좀에서 분해된다.

한편, Wnt 단백질이 Fzd 수용체에 결합하면, 세포내 인자인 Dishevelled가 활성화되어 GSK-3β이 포획되고, 그로 인해 β-카테닌은 인산화되지 않고 세포질내에서 유리 형태로 잔존하고 동시에 핵내로 이동한다. 핵내로 이동된 β-카테닌은 핵내에 존재하는 림프구 활성화 인자-1/T 세포 인자(lymphoid enhancer factor-1/T cell factor; 이하, LEF-1/TCF)와 결합하여 전사 활성화 복합체를 형성하고, 표적 유전자의 전사를 유도한다. 이러한 β-카테닌의 축적과 핵내 이동을 수반하는 신호 전달 경로를 "고전적" Wnt 경로 또는 카노니칼(canonical) Wnt 신호 경로라고 하며, 해당 경로를 활성화시킬 수 있는 Wnt-1, Wnt-3a, Wnt-8a 등의 패밀리 분자 종을 카노니칼 Wnt라 한다. 카노니칼 Wnt 신호 경로의 활성화가 각종 GSK-3β 저해제 처리에 의해 유도된다는 것은 공지된 것이다.

Wnt 리간드는 Fzd 수용체를 통해서 β-카테닌 경로 이외의 신호 전달 경로도 활성화시키는 것으로 알려져 있으며, MAP 키나제의 일종인 JNK(Jun N-terminal kinase)를 활성화시키는 평면 세포 극성(Planar cell polarity: PCP) 경로나, 삼량체형 G 단백질의 활성화와 후속적인 포스포리파제(Phospholipase) C의 활성화를 통해서 세포내 Ca² ⁺ 농도를 상승시키고 단백질 키나제 C를 활성화시키는 Ca² ⁺ 경로를 들 수 있다(비특허문헌 19, 20). 이들 경로는 카노니칼 Wnt 신호 경로에 대하여 "비고전적인" Wnt 경로 또는 비-카노니칼(non-canonical) Wnt 신호 경로라고 한다. Wnt-4이나 Wnt-11이 해당 경로를 활성화시킬 수 있는 Wnt 패밀리 분자인 것이 보고되고 있어, 이들 Wnt 리간드는 카노니칼 Wnt 신호 경로에 대해 억제적으로 작용한다.

여전히, Wnt 단백질의 분자 종들 중에는, 작용하는 세포 종이나 그 분화 단계, 해당 세포에서 발현되는 Fzd 수용체의 차이에 따라, 카노니칼 경로 및 비-카노니칼 경로 양자를 활성화시킬 수 있는 것도 있다. 예를 들면, Wnt-5a는 제노푸스 라비스(Xenopus laevis) 배아에서 2차 축 형성이나 유선 상피 세포의 암화 등의 일반적인 검정 시스템에서 비-카노니칼 Wnt로서 작용하는 것으로 알려져 있지만, 한편으로는 ES 세포에 대해서는 β-카테닌의 안정화 및 그것의 전사 활성을 유도하는, 즉 카노니칼 Wnt 신호 경로를 활성화시키는 것으로 보고되고 있다(비특허문헌 21).

Wnt 단백질은 여러가지 세포·조직이나 암의 발생·증식·분화 과정에 있어서, 각종 다양한 생물학적 기능에 관여하는 것으로 알려져 있다. 심근 세포는 발생 초기 단계에서 측판 중배엽의 일부로부터 발생되며, 그 후, 세포 분열을 반복하면서 증식하여 심장을 형성해간다. 이 과정에서 Wnt 시그널의 유무가 중요한 역할을 담당한다는 것은 몇가지 사례들에서 명확하게 나타났다. 예를 들면, 조류나 제노푸스 라비스의 발생 초기 단계에서, 카노니칼 Wnt 신호 경로를 활성화시키는 Wnt-3a나 Wnt-8a 유전자의 이소적 및/또는 강제적 발현은 심장의 형성을 현저하게 저해하였다(비특허문헌 22, 23).

한편, Wnt-3a나 Wnt-8a와 결합하여 신호 전달을 저해하는 작용을 가진 Frzb 또는 Dkk-1 등의 소위 Wnt 길항제가 심장 형성을 촉진하는 것으로부터, 카노니칼 Wnt 신호가 심근 발생에 대해 저해적으로 작용한다는 것이 시사되었다.

이와는 반대로, 카노니칼 Wnt 신호를 길항하는 비-카노니칼 Wnt 시그널 경로의 활성화는 심근 세포의 발생·분화를 촉진적으로 유도하는 것으로 알려져 있다. Pandur 등(비특허문헌 24)은, 카노니칼 경로를 활성화시키지 않고 비-카노니칼 경로를 활성화시키는 Wnt-11이 제노푸스 라비스의 심장 발생에 필수적인 인자임을 밝혔다. 그 후, 마우스 ES 세포(비특허문헌 25) 및 인간의 혈관 내피 전구 세포(비특허문헌 26)의 심근 분화 유도 시스템에서도 Wnt-11의 촉진 효과가 동일하게 확인되었다. 또, 비-카노니칼 Wnt 신호 경로의 활성화와 관련하여, 혀 조직으로부터 심근 세포를 분화 유도할 수 있는 것으로 알려져 있다(특허문헌6).

한편, 상기의 사례와는 달리, 카노니칼 Wnt 신호 경로의 활성화가 배아성 암종 세포(embryonic carcinoma cell: EC 세포)의 심근 분화를 촉진시킨다는 것이 공지되었다. EC 세포의 일종인 P19 세포의 서브라인인 P19CL6 세포는 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide: DMSO)의 자극 하에서 심근 세포로 분화되는 성질을 가지고 있으며, Wnt-3a나 Wnt-8을 배지에 첨가하면, β-카테닌의 안정화에 따라 심근 세포로의 분화가 촉진되었다(비특허문헌 27). 또, 이 시스템에서, Wnt 단백질을 첨가하는 시기는 분화 유도 직후로부터 4일 동안이 충분한 것으로 확인되었다(비특허문헌 28).

P19 세포주는 심근 세포 및 신경 세포로 분화 유도할 수 있다는 점에서 일부 ES 세포와 유사한 형질을 가진다. P19 세포주는 ES 세포와 같은 다양한 분화능이나 키메라형을 형성할 수 있는 능력을 가지고 있지 않으며, 또한, 세포 표면 마커나 발현 유전자 등에 있어 ES 세포와 큰 차이가 있다. 다시 말해, P19 세포주는 어떤 종류의 실험에서는 ES 세포의 모델 시스템으로서 사용될 수도 있지만, 반드시 ES 세포와 동일한 형질을 가진다고하기는 어려우며, 본 실험 시스템에서 확인된 사실을 그대로 ES 세포 등의 다능성 줄기 세포의 심근 분화 유도 시스템에 직접 외삽(外揷)할 수 있는지는, 과학적 근거를 토대로 예측하기는 어렵다.

최근, 마우스 ES 세포를 이용한 실험 시스템에서, 카노니칼 Wnt인 Wnt-3a 단백질을 분화 유도 시작일 부터 3일간 첨가함으로써, ES 세포의 심근 분화가 촉진된다는 것이 보고되었다(Naito A et al., 28th Annual Meeting of the Molecular Biology Society of Japan, 2005.12.7 to 2005.12.10, Hakata, Japan; 비특허문헌 30). 그러나, 본 발명자들이 수행한 유사한 검토에서는, 유의적인 분화 촉진 효과는 인지되지 않았으며(실시예 2), 또한, 다른 연구 그룹에서도 마우스 ES 세포에 Wnt-3a를 처리하더라도 특별히 유의적인 심근 분화 유도 효과가 초래되지 않거나(비특허문헌 25), 저해 효과가 있다(비특허문헌 29)는 보고가 행해지고 있다. 다시 말해, 카노니칼 Wnt 신호 경로의 활성화가 ES 세포를 비롯한 다능성 줄기 세포의 심근 분화에 미치는 효과는 명확하지 않으며, 심근 분화를 유도하기 위한 최적의 배양 방법이 확립되어 있다고할 수 없는 상황이다.

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본 발명의 과제는 카노니칼 Wnt 신호 경로를 활성화함으로써, 미분화된 다능성 줄기 세포로부터 고효율적이고 선택적으로 심근 세포를 분화 유도하는 방법;상기 방법에 의해 얻어지는 심근 세포; 및, 상기 세포를 심장병을 타겟으로 한 세포 이식, 주입, 그 밖의 치료에 이용하는 방법 등을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 심근 세포를 제조하는 줄기 세포원으로서 다능성 줄기 세포, 특히 가장 통상적으로 사용되는 세포인 ES 세포를 이용하고, 심근 세포 또는 그 전구 세포로의 분화 유도 조건에 대해서 여러가지 검토를 거듭한 결과, 배양시기가 있는 일정 기간동안, 배지에 카노니칼 Wnt 신호 경로의 활성화를 촉진하는 물질(이하, Wnt 신호 활성화 물질)을 첨가함으로써, 박동능을 가진 심근 세포로 인지되는 세포가, 통상적인 방법에 비해 훨씬 더 선택적으로 효율적으로 생산됨을 확인하여, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명에 이용할 수 있는 다능성 줄기 세포로는 마우스, 원숭이, 인간 등의 포유류 유래의 ES 세포, EG 세포, GS 세포 뿐 아니라 ES 세포와 유사한 형질을 가진 모든 다능성 줄기 세포를 들 수 있다. 이 경우, ES 세포와 유사한 형질은 ES 세포에 특이적인 표면(항원) 마커의 존재나 ES 세포 특이적인 유전자의 발현, 또는 테라토마(teratoma) 또는 키메라 마우스 형성 기능 등의, ES 세포에 특이적인 세포 생물학적 성질로 정의할 수 있다.

본 발명에서, 카노니칼 Wnt 신호 경로의 활성화를 촉진시키는 물질의 구체예로는 각종 카노니칼 Wnt 단백질이나, GSK-3β 저해제, 그 밖의 카노니칼 Wnt 신호 경로를 활성화할 수 있는 저분자 화합물 등을 들 수 있다. 또, 카노니칼 Wnt 신호 경로를 활성화할 수 있는 유전자, 예를 들면 각종 카노니칼 Wnt 유전자나, β-카테닌 유전자, 또는 그 N-말단이 결손되거나 GSK-3β에 의한 인산화 부위가 비인산화 아미노산으로 치환된 β-카테닌 유전자의 활성형 변이체 등도 사용가능하다.

본 발명에 있어서, 카노니칼 Wnt 단백질은 Wnt 패밀리 단백질군에 속하며, Fzd 패밀리 수용체에 결합하여 GSK-3β에 의한 β-카테닌의 인산화를 억제함으로써 β-카테닌의 안정화 및 이의 전사 활성능을 촉진시키는 물질로서 정의된다. 본 발명에 바람직한 카노니칼 Wnt 단백질로서는, 예를 들면, Wnt-1, Wnt-3a, Wnt-5a 또는 Wnt-8a 등을 들 수 있으며, 해DAN 단백질질과 아미노산 서열이 80%이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 상동하며 β-카테닌 활성화능을 가진 것도 해당된다.

본 발명은 ES 세포 등의 다능성 줄기 세포를 Wnt 신호 활성화 물질로 일시적으로 자극하는 것을 일 특징으로 하며, 자극 방법은 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는, 카노니칼 Wnt 단백질, 예를 들면, 정제한 카노니칼 Wnt 유전자를 발현되게 하여 수득한 재조합 단백질(이하, 재조합 Wnt 단백질)을 포함하는 배지에서 배양하는 방법을 들 수 있다. 사용되는 카노니칼 Wnt 단백질 및 이를 코딩하는 유전자는 다능성 줄기 세포가 유래된 종과 동종의 동물로부터 유래되는 것이 바람직하지만, 다른 종의 동물로부터 유래된 것도 사용할 수 있다. 재조합 Wnt 단백질을 이용할 경우, 구배지를 무균적으로 제거한 후, 0.l ng/mL - 500 ng/mL, 바람직하게는 1 ng/mL - 200 ng/mL, 보다 바람직하게는 10 ng/mL - 100 ng/mL의 농도의 재조합 Wnt 단백질이 함유된 배지에서 배양한다.

본 발명에 따른 GSK-3β 저해제는 GSK-3β 단백질의 키나제 활성(예를 들면 β-카테닌에 대한 인산화 능력)을 저해하는 물질로 정의되며, 이미 수십 종 이상이 알려져 있으며, 그 구체예로는, 인디루빈(indirubin) 유도체인 BIO (이명, GSK-3β 저해제 IX; 6-브로모인디루빈 3'-옥심), 말레이미드 유도체인 SB216763 (3-(2,4-디클로로페닐)-4-(1-메틸-lH-인돌-3-일)-lH-피롤-2,5-디온), 페닐-α-브로모메틸케톤 화합물인 GSK-3β 저해제 VII(4-디브로모아세토페논), 세포막 투과성의 인산화된 펩타이드인 L803-mts(이명, GSK-3β 펩타이드 저해제; Myr-N-GKEAPPAPPQSpP-NH₂)등 을 들 수 있다. 이들 화합물은 Calbiochem사나 Biomol사 등에서 시판하고 있어, 용이하게 사용할 수 있지만, 특별히 이들로 한정되진 않는다.

이들 GSK-3β 저해제를 이용할 경우, 화합물의 특성 차이에 따라 최적 농도는 크게 달라진다. 따라서, 사용하는 화합물의 종류에 따라 최적 농도를 바꿀 필요가 있다. 예를 들면, BIO나 SB216763은 바람직하게는 1O nmol/L - 1 μmol/L, 보다 바람직하게는 50 nmol/L - 200 nmol/L의 농도로 GSK-3β 저해제를 함유하는 배지로 교환하여 계속 배양한다. GSK-3β 저해제 VII의 첨가 농도는 바람직하게는 2 μmol/L - 100 μmol/L이고, 보다 바람직하게는 5 μmol/L - 20 μmol/L이다. L803-mts의 첨가 농도는 바람직하게는 5 μmol/L - 500 μmol/L, 보다 바람직하게는 20 μmol/L - 200 μmol/L, 더욱 바람직하게는 25 μmol/L - 200 μmol/L이다.

또, 본 발명의 실시에 이용하는 약제는, GSK-3β 저해제 이외에도, 카노니칼 Wnt 신호 경로의 활성화를 촉진시키는 저분자 물질(이하, Wnt 작용제)일 수 있으며, 바람직한 예로는 아미노피리미딘 유도체인 (2-아미노-4-[3,4-(메틸렌디옥시)벤질-아미노]-6-(3-메톡시페닐)-피리미딘; Calbiochem사)(Liu et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 44:1987, 2005)을 들 수 있다. 그러한 Wnt 작용제를 이용할 경우, 1 nmol/L - 1000 nmoI/L, 바람직하게는 10 nmol/L - 500 nmol/L, 보다 바람직하게는 50 nmol/L - 200 nmol/L의 농도로 Wnt 작용제가 함유된 배지로 교체하여, 계속 배양한다.

Wnt 신호 활성화 물질을 처리하는 시기는 본 발명의 실시에 이용하는 다능성 줄기 세포의 분화 유도 과정에서의 각종 카노니칼 Wnt 유전자의 발현 패턴을 지표로서 결정할 수 있다. 구체적으로는, 다능성 줄기 세포를 통상적인 방법에 기초로하여 분화 유도하고, 경시적으로 회수한 샘플로부터 mRNA를 추출하여 각종 카노니칼 Wnt 유전자의 발현량을 RT-PCR 법 등의 일반적인 방법으로 조사한 다음, 분화 유도 후에 카노니칼 Wnt 유전자의 발현량이 분화 유도 전의 미분화된 다능성 줄기 세포 보다 유의하게 상승한 시점을 "Wnt 유전자의 발현 상승기"로 한다. 분석에 대상이 되는 카노니칼 Wnt 유전자는 한 종류일 수도 있지만, 바람직하게는 2종 이상, 더욱 바람직하게는 3종 이상이 바람직하다.

본 발명의 실시에 있어서, 다능성 줄기 세포는 심근 분화를 유도하기 위한 배양을 개시한 직후부터 상기 방법에 의해 결정된 Wnt 유전자의 발현 상승기의 24 시간 전까지의 기간동안 Wnt 신호 활성화 물질을 포함하지 않는 배지에서 배양한다. 또, 다능성 줄기 세포는 상기 방법에 의해 결정된 Wnt 유전자의 발현 상승기의 24 시간 전 - 0 시간 전, 바람직하게는 24 시간 전의 시점부터, 바람직하게는 24 시간 - 96 시간, 보다 바람직하게는 48 시간 - 72 시간동안, Wnt 신호 활성화 물질이 포함된 배지에서 배양한다. 한편, Wnt 신호 활성화 물질을 처리하는 기간은 이용하는 세포가 유래된 동물 종, 이용하는 세포주, 이용하는 Wnt 신호 활성화 물질의 종류 등의 조건 차이에 따라, 최적 기간(시간)을 변경하여 이용할 수 있다.

상기의 방법에 의해, ES 세포를 비롯한 다능성 줄기 세포로부터 분화 유도된 심근 세포는 추가적으로 공지된 방법에 의한 세포 회수, 분리, 정제법을 이용하여, 고순도의 심근 세포를 효율적으로 다량 수득할 수 있다. 이렇게 수득되는 심근 세포를 이하, 본 발명에 의해 제조된 심근 세포라 한다.

본 발명에 의해 제조된 심근 세포는 심근 세포의 형태학적, 생리학적 및/또는 면역학적 특징을 나타내는 세포이다. 생리학적 및/또는 면역학적 특징은 특별히 이들로 한정되진 않지만, 본 발명에 의해 제조된 심근 세포가 심근 세포로서 인지되는, 심근 세포에 특이적인 1개 또는 그 이상의 마커를 발현할 수 있다.

또, 본 발명에 의해 제조된 심근 세포는 심근 세포의 발생, 분화 유도, 재생, 생존 등을 촉진하는 신규 인자 또는 가능성 있는 화학요법제를 동정하기 위한 스크리닝 방법에 이용할 수 있다.

추가적으로, 본 발명에 의해 제조된 심근 세포는 심장 질환 상태에 있는 심장의 치료 방법에 이용할 수 있다.

즉, 이들로 한정되진 않지만, 본 발명은하기 사항에 관한 것이다.

(1) 다능성 줄기 세포로부터 심근 세포를 분화 유도하는 방법으로서,

다능성 줄기 세포를

i) 분화 유도 개시 시점부터 카노니칼 Wnt 유전자의 발현 상승기의 24 시간 전까지의 기간동안, 카노니칼 Wnt 신호 경로의 활성화를 촉진시키는 물질이 포함되지 않은 배양액에서 배양하고;

그 후 ii) 카노니칼 Wnt 유전자의 발현 상승기의 24 - 0 시간 전부터 24 - 96 시간의 기간 동안, 카노니칼 Wnt 신호 경로의 활성화를 촉진시키는 물질이 포함된 배양액에서 배양하는 것을 포함하는, 다능성 줄기 세포로부터 심근 세포를 분화 유도하는 방법.

(2) 다능성 줄기 세포를 카노니칼 Wnt 유전자의 발현 상승기의 24 시간 전부터, 카노니칼 Wnt 시그널 경로의 활성화를 촉진시키는 물질이 포함된 배양액에서 배양하는, (1)에 기재된 방법.

(3) 다능성 줄기 세포를 카노니칼 Wnt 신호 경로의 활성화를 촉진시키는 물질이 포함된 배양액에서 배양하는 기간이 48 - 72 시간인, (1) 또는 (2)에 기재된 방법.

(4) 카노니칼 Wnt 신호 경로의 활성화를 촉진시키는 물질이 카노니칼 Wnt 단백질, GS K3β 저해제, Wnt 작용제로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질인, (1) - (3) 중 어느 한항에 기재된 방법.

(5) 카노니칼 Wnt 신호 경로의 활성화를 촉진시키는 물질이 카노니칼 Wnt 단백질인, (4)에 기재된 방법.

(6) 카노니칼 Wnt 단백질이 Wnt-1, Wnt-3a 및 Wnt-5a로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 Wnt 단백질인, (5)에 기재된 방법.

(7) 카노니칼 Wnt 단백질의 배양액 중의 농도가 0.l ng/mL - 500 ng/mL인, (5) 또는 (6)에 기재된 방법.

(8) 카노니칼 Wnt 신호 경로의 활성화를 촉진시키는 물질이 GSK3β 저해제인, (4)에 기재된 방법.

(9) GSK3β 저해제가 GSK3β 저해제 VII, L803-mts, SB216763, 및 GSK3β 저해제 IX(BIO)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 저해제인, (8)에 기재된 방법.

(1O) GSK3β 저해제의 배양액 중의 농도가, GSK3β 저해제 VII의 경우 2 μmol/L - 100 μmol/L, L803-mts의 경우 5 μmol/L - 500 μmol/L, SB216763의 경우 10 nmol/L - 1 μmol/L 또는, GSK3β 저해제 IX(BIO)의 경우 10 nmol/L - 1 μmol/L인, (8) 또는 (9)에 기재된 방법.

(11) 카노니칼 Wnt 신호 경로의 활성화를 촉진시키는 물질이 Wnt 작용제인, (4)에 기재된 방법.

(12) Wnt 작용제가 아미노피리미딘 유도체인, (11)에 기재된 방법.

(13) Wnt 작용제의 배양액 중의 농도가 1 nmol/L - 100O nmol/L인, (11) 또는 (12)에 기재된 방법.

(14) 다능성 줄기 세포가 배아 줄기세포, 배아 생식 세포 또는 생식 세포계열 줄기 세포인, (1) - (13)에 기재된 방법.

(15) 다능성 줄기 세포가 배아 줄기 세포인, (14)에 기재된 방법.

(16) 다능성 줄기 세포가 인간 유래인, (14) 또는 (15)에 기재된 방법.

본 발명에 따른 방법을 이용함으로써, ES 세포 등의 다능성 줄기 세포로부터 심근 전구 세포 및 심근 세포를 매우 효율적이고 선택적으로 생산할 수 있다. 본 발명에 따른 방법에 의해 제조되는 심근(전구) 세포는 심장 질환 치료에 유효한 약제의 탐색·개발에 이용할 수 있으며, 심각한 심장 질환에 대한 심근 이식 치료에 적용할 수 있다.

도 1A는 ES 세포의 분화 유도하는 동안에 Wnt 유전자 등의 발현 변동을 나타낸다. 도에 기재된 기호의 의미는 이하와 같다. ○: 무처리군, ●: 코르딘 (Chordin) 처리군, ▲: 단(DAN) 처리군. 세로 축은 내부 표준으로서 사용한 GAPDH 유전자의 발현량에 대한 해당 Wnt 유전자 발현량의 상대비이다. 또, ※는 해당 Wnt 유전자의 발현량이 분화 유도 전의 미분화된 ES 세포에서 보다 유의적으로 상승한 시점이다.
도 1B는 ES 세포의 분화 유도하는 동안에 Wnt 유전자 등의 발현 변동을 나타낸다. 도에 기재된 기호의 의미는 이하와 같다. ○: 무처리군, ●: 코르딘 처리군, ▲: 단(DAN) 처리군. 세로 축은 내부 표준으로서 사용한 GAPDH 유전자의 발현량에 대한 해당 Wnt 유전자 발현량의 상대비이다. 또, ※는 해당 Wnt 유전자의 발현량이 분화 유도 전의 미분화된 ES 세포에서 보다 유의적으로 상승한 시점이다.
도 1C는 ES 세포의 분화 유도하는 동안에 Wnt 유전자 등의 발현 변동을 나타낸다. 도에 기재된 기호의 의미는 이하와 같다. ○: 무처리군, ●: 코르딘 처리군, 좋다 ▲: 단(DAN) 처리군. 세로 축은 내부 표준으로서 사용한 GAPDH 유전자의 발현량에 대한 해당 Wnt 유전자 발현량의 상대비이다. 또, ※는 해당 Wnt 유전자의 발현량이 분화 유도 전의 미분화된 ES 세포에서 보다 유의적으로 상승한 시점이다.
도 2A는 배양액에 재조합 Wnt 단백질의 첨가 시기의 차이에 의한 박동성 EB의 출현에 미치는 영향을 나타낸다.
도 2B는 배양액에 재조합 Wnt 단백질의 첨가 시기의 차이에 의한 박동성 EB의 출현에 미치는 영향을 나타낸다.
도 3A는 ES 세포의 분화 유도에 의해 출현한 박동성 EB에서의 심근 세포 특이적 마커 유전자의 발현을 나타낸다. 세로 축은 무처리군(None)의 유전자 발현량을 1로 하였을 때의 상대비이다.
도 3B는 ES 세포의 분화 유도에 의해 출현한 박동성 EB에서의 심근 세포 특이적 마커 유전자의 발현을 나타낸다. 세로 축은 무처리군(None)의 유전자 발현량을 1로 하였을 때의 상대비이다.
도 3C]는 ES 세포의 분화 유도에 의해 출현한 박동성 EB에서의 심근 세포 특이적 마커 유전자의 발현을 나타낸다. 세로 축은 무처리군(None)의 유전자 발현량을 1로 하였을 때의 상대비이다.
도 3D는 ES 세포의 분화 유도에 의해 출현한 박동성 EB에서의 심근 세포 특이적 마커 유전자의 발현을 나타낸다. 세로 축은 무처리군(None)의 유전자 발현량을 1로 하였을 때의 상대비이다.
도 4는 ES 세포의 분화 유도에 의해 출현한 박동성 EB에서의 심근 세포 특이적 마커 단백질의 면역조직화학적 염색을 나타낸다.
도 5A는 GSK3β 저해제의 박동성 EB의 출현에 미치는 효과를 나타낸다.
도 5B는 GSK3β 저해제의 박동성 EB의 출현에 미치는 효과를 나타낸다.
도 5C는 GSK3β 저해제의 박동성 EB의 출현에 미치는 효과를 나타낸다.
도 5D는 GSK3β 저해제의 박동성 EB의 출현에 미치는 효과를 나타낸다.
도 5E는 GSK3β 저해제의 박동성 EB의 출현에 미치는 효과를 나타낸다.
도 6은 코먼 마모셋(common marmoset)(원숭이) ES 세포의 분화 유도 과정에 있어서의 Wnt-3 유전자의 발현 변동을 나타낸다.
도 7은 cmES 세포의 분화 유도에 의해 출현한 박동성 EB에서의 심근 세포 특이적 마커 유전자의 발현을 나타낸다.
도 8은 cmES 세포의 분화 유도에 의해 출현한 박동성 EB에서의 심근 세포 특이적 마커 단백질의 면역조직화학적 염색을 나타낸다.

이하 본 발명의 상기 효과나 다른 이점 및 특징을 포함한, 발명을 실시하기 위한 형태를 설명한다.

본 발명의 실시에 있어서, 분자 생물학이나 재조합 DNA 기술 등의 유전공학적 방법 및 일반적인 세포 생물학 방법 및 종래 기술에 대해서, 실시자는, 특별한 언급이 없는 한, 해당 분야의 표준적인 서적을 참조할 수 있다. 이러한 서적으로는, 예를 들면, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition”(Sambrook & Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001); “Current Protocols in Molecular biology”(Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, 1987); “Methods in Enzymology series”(Academic Press); “PCR Protocols: Methods in Molecular Biology”(Bartlett & Striling, eds., Humana Press, 2003); “Animal Cell Culture: A Practical Approach, Third Edition”(Masters, ed., Oxford University Press, 2000); 및 “Antibodies: A Laboratory Manual”(Harlow et al. & Lane, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1987) 등을 들 수 있다. 또, 본 명세서에 참조되는 세포 배양, 세포 생물학 실험용 시약 및 키트류는 Sigma사나 Aldrich사, Invitrogen/GIBCO사, Clontech사, Stratagene사 등의 시판 업자에게서 입수가능하다.

또, 다능성 줄기 세포를 이용한 세포 배양, 및 발생·세포 생물학 실험의 일반적 방법은, 실시자는, 해당 분야의 표준적인 서적을 참조할 수 있다. 이러한 문헌으로는 “Guide to Techniques in Mouse Development” (Wasserman et al., eds., Academic Press, 1993); “Embryonic Stem Cell Differentiation in vitro” (M.V. Wiles, Meth. Enzymol. 225:900, 1993); “Manipulating the Mouse Embryo: A laboratory manual” (Hogan et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994); 및 “Embryonic Stem Cells” (Turksen ed., Humana Press, 2002)이 포함된다. 본 명세서에 참조되는 세포 배양, 발생·세포 생물학 실험용 시약 및 키트류는 Invitrogen/GIBCO사나 Sigma사 등의 시판 업자에게서 입수가능하다.

마우스나 인간의 다능성 줄기 세포의 제조, 계승, 보존 방법에 대해서는, 이미 표준적인 프로토콜이 확립되어 있어, 실시자는 전술한 참고서적에 덧붙여 복수의 참고 문헌 등을 참조함으로써, 이들의 다능성 줄기 세포를 사용할 수 있다. 그러한 문헌으로 하기 문헌을 들 수 있다: Matsui et al., Cell 70:841, 1992; Thomson et al., 미국 특허 5,843,780; Thomson et al., Science 282:114, 1998; Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998; Shamblott et al., 미국 특허 6,090,622; Reubinoff et al., Nat. Biotech. 18:399, 2000; 및 국제 공개공보 WO00/27995. 또, 다른 동물 종으로, 예를 들면 원숭이(Thomson et al., U.S. Patent No. 5,843,780; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 7844, 1996)이나 랫(Iannaccone et al., Dev. Biol. 163:288, 1994; Loring et al., International Publication No. WO99/27076), 조류(Pain et al., Development 122:2339, 1996; U.S. Patent No. 5,340,740; U.S. Patent No.　5,656,479), 돼지(Wheeler et al., Reprod. Fertil. Dev. 6:563, 1994; Shim et al., Biol. Reprod. 57:1089, 1997) 등에서 ES 세포 또는 ES 세포-유사 세포(ES cell-like cell)의 수립 방법이 알려져 있어, 각 기재된 방법을 따라 본 발명에 이용할 수 있는 ES 세포를 제조 및 사용할 수 있다.

본 공개에서, “심근 세포”란, 향후 기능적인 심근 세포가 될 수 있는 능력을 가진 심근 전구 세포, 태아형 심근 세포, 성체형 심근 세포 등의 모든 분화 단계의 세포를 포함하며, 하기 한가지 이상, 바람직하게는 다수의 방법에 의해, 적어도 하나 이상, 바람직하게는 복수 개의 마커나 기준을 확인할 수 있는 세포로 정의된다.

심근 세포에 특이적인 여러가지 마커의 발현은 종래의 생화학적 또는 면역화학적 방법에 의해 검출된다. 그 방법은 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는, 면역조직화학적 염색법이나 면역전기영동법의 같은 면역화학적 방법이 사용된다. 이러한 방법에서, 심근 전구 세포 또는 심근 세포에 결합하는 마커 특이적 다클론성 항체 또는 단일 클론 항체를 사용할 수 있다. 각각의 특이적 마커를 표적으로 하는 항체는 시판되고 있으므로, 용이하게 사용할 수 있다. 심근 전구 세포 또는 심근 세포에 특이적인 마커로는, 예를 들면, 미오신 중쇄/경쇄, α-액티닌, 트로포닌 I, ANP, GATA-4, Nkx 2.5, MEF-2c 등을 들 수 있다.

또는, 심근 전구 세포 또는 심근 세포 특이적 마커의 발현은, 특별히 그 방법이 한정되지 않지만, 역전사 효소 매개성 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)이나 혼성화 분석 등의, 임의의 마커 단백질을 코딩하는 mRNA를 증폭, 검출, 분석하기 위한 종래에 통상적으로 사용되는 분자 생물학적 방법에 의해 확인할 수 있다. 심근 전구 세포 또는 심근 세포에 특이적인 마커(예를 들면, 미오신 중쇄/경쇄, α-액티닌, 트로포닌 I, ANP, GATA-4, Nkx 2.5, MEF-2c) 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 공지된 것이며, National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 유전자 은행(GenBank)과 같은 공공 데이터베이스를 통해 이용가능하므로, 프라이머 또는 프로브로서 사용하기 위해 필요한 마커 특이적 서열을 용이하게 결정할 수 있다.

또한, 다능성 세포의 심근 세포로의 분화를 확인하기 위해, 생리학적 기준도 추가적으로 사용된다. 다시 말해, 다능성 세포 유래의 세포가 자율적 박동성을 가지는지, 또는 각종 이온 채널을 발현하고 있어 전기생리적 자극에 반응할 수 있는 지 등도, 유용한 지표가 된다.

본 발명의 방법은, 임의의 포유 동물 유래의 다능성 줄기 세포에도 적용할 수 있다. 예를 들면, 마우스, 소, 염소, 개, 고양이, 마모셋, 붉은털 원숭이, 인간 유래의 다능성 줄기 세포에 대하여 사용할 수 있지만, 이들 동물 종 유래의 다능성 줄기 세포만으로 한정되지 않는다. 예를 들면, 본 발명에 이용할 수 있는 다능성 줄기 세포로 이미 배양 세포로서 널리 사용되고 있는 마우스, 원숭이, 인간 등의 포유류 유래의 ES 세포를 들 수 있다.

마우스 유래 ES 세포의 구체예로는, EB3 세포, E14 세포, D3 세포, CCE 세포, R1 세포, 129SV 세포, J1 세포 등을 들 수 있다. 본 발명에 따른 마우스 유래 ES 세포는, 예컨대 American Type Culture Collection (ATCC), Chemicon사, 또는 Cell & Molecular Technologies사 등으로부터 입수할 수 있다.

원숭이 유래 ES 세포는, 붉은털 원숭이(rhesus monkey: Macaca mulatta)(Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844, 1995), 시노몰구스(cynomolgus monkeys: Macaca fascicularis)(Suemori et al., Dev. Dyn. 222:273, 2001), 코먼 마모셋(common marmoset: Callithrix jacchus)(Sasaki et al., Stem Cells. 23:1304, 2005)으로부터의 수립이 보고되어 있어, 사용가능하다. 예를 들면, 마모셋 ES 세포는 재단법인 실험 동물 중앙 연구소에서도 입수할 수 있다.

인간 유래 ES 세포는 현재 전세계에서 수십 종 이상이 수립되어 있으며, 예를 들면, 미국 국립 위생 연구소의 리스트(http://stemcells.nih.gov /registry/ index.asp)에 다수의 세포주가 등록되어 있어 사용할 수 있을 뿐만 아니라 Cellartis사, ES Cell International사, Wisconsin Alumni Research Foundation 등으로부터 구입할 수도 있다. 또, 일본의 경우, 국립 대학법인 교토 대학 재생 의과학 연구소 부속 줄기 세포 의학 연구 센터에서도 입수할 수 있다(Suemori et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 345:926, 2006).

게다가, 소(Mitalipova et al., Cloning 3:59, 2001), 조류(Petitte et al., Mech. Dev. 121:1159, 2004), 제브라 피시(Fishman, Science 294:1290, 2001)에서도 ES 세포의 수립이 보고되었다.

일반적으로 ES 세포는 초기 단계의 배아를 배양함으로써 수립되지만, 체세포의 핵을 핵 이식한 초기 배아로부터도 ES 세포를 제조할 수 있다(Munsie et al., Curr. Biol. 10:989, 2000; Wakayama et al., Science 292:740, 2001; Hwang et al., Science 303:1669, 2004). 또, 단위 발생 배아로부터 배반포기(blastocyst stage)와 동등한 단계까지 발생시켜, ES 세포를 제조하는 시도(미국 특허 02/168763; Vrana K et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:11911-6)나, ES 세포와 체세포를 융합시켜 체세포핵의 유전 정보를 가진 ES 세포를 만드는 방법도 보고되어 있다(국제 공개 WO00/49137; Tada et al., Curr. Biol. 11:1553, 2001). 본 발명에 사용되는 ES 세포는 이러한 방법에 의해 제조된 ES 세포 또는 ES 세포의 염색체 유전자를 유전공학적 방법에 의해 변형시킨 것도 포함한다.

또, 본 발명에 따른 방법에 이용가능한 다능성 줄기 세포는 ES 세포로만 한정되지 않으며, 포유류의 성체 장기나 조직의 세포, 골수 세포, 혈액 세포, 또는 배아나 태아의 세포 등에서 유래되는, ES 세포와 유사한 형질을 가지는, 모든 다능성 줄기 세포를 포함한다. 이 경우, ES 세포와 유사한 형질은 ES 세포에 특이적인 표면(항원) 마커의 존재, ES 세포 특이적인 유전자의 발현, 또는 테라토마(teratoma) 또는 키메라 마우스를 형성하는 능력 등의 ES 세포에 특이적인 세포생물학적 성질을 가지는 것으로 정의할 수 있다. 그 구체예로는, 원시 생식 세포로부터 제조된 EG 세포, 정소의 생식 세포로부터 제조된 GS 세포, 및 섬유아세포 등의 체세포로부터 특수한 유전자조작에 의해 제조된 유도된 다능성 줄기 세포(induced pluripotent stem cell:iPS 세포)등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, ES 세포 등의 다능성 줄기 세포로부터 심근 세포를 제조하는 배양 방법은 심근 세포의 분화 유도에 적합한 방법이면 모두 이용할 수 있으며, 예를 들면, 부유(suspension) 배양법, 현적(hanging drop) 배양법, 공급자 세포와의 공배양법, 선회 배양법(gyratory culture), 연질 한천 배양법, 마이크로-담체 배양법 등을 들 수 있다. 구체적인 방법의 예로는, 단일 세포 상태(효소 분해 등에 의해 세포끼리 접착되지 않은 각각의 세포가 액체상으로 분산된 상태)의 ES 세포를, 바람직하게는 배지에 1 × 10³ - 1 × 10⁵ 세포/mL의 세포 밀도가 되게 현탁하고, 그 액적 10 - 100 μL을 배양 플레이트의 상위 디쉬에 부착시켜서 현적 배양으로 하는 방법을 들 수 있다. 또, 상기 세포 현탁액을 시판되는 세포집괴(스페로이드) 형성용 96웰 배양 플레이트(예를 들면, Sumilon Celltight Spheroid; Sumitomo Bakelite Co., Ltd., Japan), 세포 비접착성의 배양 플레이트 (예를 들면, Coaster ultra-저접착 플레이트; Corning사), 또는 무처리 폴리스티렌제 플레이트에 파종할 수 있다. 그 후, ES 세포를 포함하는 현탁액을, 37℃, 5%의 이산화탄소를 통기한 CO₂ 조건 하에서 배양함으로써, EB이 형성되고, 그 중에서 심근 세포 등의 분화 유도가 일어난다.

본 발명에 있어서, 카노니칼 Wnt 신호 경로의 활성화는 β-카테닌이 GSK-3β에 의해 인산화되지 않고 세포질내 및/또는 핵내에서 안정적인 상태로 존재, 및/또는 핵내에서 LEF-1/TCF와 결합하여 전사 활성화 복합체를 형성하여, 표적 유전자의 전사 유도 활성능을 가지고 있는 상태를 의미한다. 카노니칼 Wnt 신호 경로의 활성화 여부를 조사하는 방법은 특별히 이로 한정되진 않지만, β-카테닌 특이항체를 이용한 면역조직 염색이나 웨스턴 블로팅 분석 등에 의해, 세포질내 및/또는 핵내 β-카테닌 함량을 측정하는 방법을 사용할 수 있다. 또, 비인산화된 β-카테닌, 즉 활성형 β-카테닌을 특이적으로 인지하는 단일 클론 항체도 시판되고 있어, 특히 유용한다. 또한, LEF-1/TCF 결합 서열의 하류에 리포터 유전자가 연결되어 있고, 해당 리포터 유전자 산물의 생산능을 지표로 하는 리포터 분석도 유효하다. 이러한 방법에 사용되는 LEF-1/TCF 결합 서열 및 리포터 유전자를 포함하는 플라스미드는 Upstate사에서 상품명 TOPflash에서 구입할 수 있다.

Wnt 신호 활성화 물질의 구체적인 예로는 각종 카노니칼 Wnt 단백질, GSK-3β 저해제 및 Wnt 작용제 등을 들 수 있다. 또, 카노니칼 Wnt 신호 경로를 활성화시킬 수 있는 유전자, 예를 들면 각종 카노니칼 Wnt 유전자나, β-카테닌 유전자, 또는 그 N-말단을 결손시키거나, GSK-3β에 의한 인산화된 부위를 비인산화 아미노산으로 치환한 β-카테닌 유전자 활성형 변이체 등도 사용가능하다. 아울러, 다른 방법으로는, 카노니칼 Wnt 신호 경로를 억제 제어하는 액신(Axin) 또는 APC 등의 유전자의 발현을 특이적 안티센스 DNA나 리보자임, RNA 간섭용 안티센스RNA, 저분자 화합물 등에 의해 억제 또는 정지시키는 방법도 이용할 수 있다. 이들 분자를 코딩하는 유전자의 염기 서열은 NCBI 등의 공적인 DNA 데이터베이스로부터 이용할 수 있으므로, 당업자는 해당 유전자의 cDNA나 siRNA, 안티센스 DNA를 취득, 제조, 사용하는 것이 가능하다.

본 발명에서 이용할 수 있는 카노니칼 Wnt 단백질은 Wnt 패밀리 단백질에 속하며, Fzd 패밀리 수용체에 결합하여 GSK-3β에 의한 β-카테닌의 인산화를 억제시킴으로써 β-카테닌의 안정화 및 전사 활성능을 촉진시키는 물질로서 정의된다. 본 발명에 따른 바람직한 카노니칼 Wnt 단백질로는, 예를 들면, Wnt-1(서열번호 1), Wnt-3a (서열번호 2), Wnt-5a (서열번호 3), Wnt-8a(서열번호 4) 등을 들 수 있으며, 추가적으로 해DAN 단백질질과 아미노산 서열이 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상 상동하며 β-카테닌 활성화 능력을 가진 것을 들 수 있다.

본 발명은 ES 세포 등의 다능성 줄기 세포를 Wnt 신호 활성화 물질로 일시적으로 자극하는 일 특정에 관한 것으로, 자극 방법은 특별히 이로 한정되진 않지만, 바람직하게는, 카노니칼 Wnt 단백질, 예를 들면, 재조합 Wnt 단백질을 배지에 첨가하여 배양하는 방법을 들 수 있다. 그 밖에도, 동일한 효과를 나타내는 방법이면 모두 이용할 수 있으며, 예를 들면, 생체 조직으로부터 추출, 정제한 카노니칼 Wnt 단백질을 첨가하여 배양하는 방법, 카노니칼 Wnt 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 벡터를 다능성 줄기 세포 자신에게 도입하는 방법, 해당 발현 벡터를 지지 세포에 도입하고, 그 도입 세포를 공배양 세포로 이용하는 방법, 또는 그 도입 세포의 배양 상청 등의 세포 생산물을 이용하는 방법 등을 들 수 있다. 본 발명에 따른 방법은 모두 카노니칼 Wnt 단백질을 배지에 첨가하는 실시예로서 포함된다.

본 발명의 실시에 사용되는 카노니칼 Wnt 단백질 및 그것을 코딩하는 유전자는 다능성 줄기 세포가 유래하는 종과 동종의 동물 유래가 바람직하지만, 다른 종의 동물로부터 유래된 것을 사용할 수도 있다. 예를 들면, 본 발명에 있어서, 마우스 ES 세포나 원숭이 ES 세포를 사용할 경우, 인간 WNT-1 단백질을 사용할 수 있으며, 재조합 Wnt 단백질로는 마우스 유래의 Wnt-3a나 Wnt-5a, 인간 유래의 WNT-7A가 R&D Systems사에서, 인간 유래의 WNT-1은 Peprotech사에서 시판되고 있어, 용이하게 사용할 수 있다. 이러한 재조합 단백질을 이용할 경우, 구배지를 무균적으로 제거한 후, 0.1 ng/mL - 500 ng/mL, 바람직하게는 1 ng/mL - 200 ng/mL, 보다 바람직하게는 10 ng/mL - 100 ng /mL의 농도로 Wnt 단백질을 함유하는 배지에서 배양을 계속한다.

목적한 Wnt 단백질을 자체 제조할 경우, Wnt 단백질은 팔미트산 수식되지 않은 한 생물학적 활성을 나타내지 않는 것으로 알려져 있기 때문에, 해당 유전자의 발현 벡터를 L세포 등의 동물 유래 세포에 도입 및 발현시키고, 그 배양 상청액에 분비되는 재조합 단백질을 정제하여야 하며, 그 구체적인 방법은 이미 공지되어 있다(Willert et al., Nature 423:448, 2003; Kishida et al., Mol. Cell. Biol. 24:4487; http://www.stanford.edu/~rnusse/ wntwindow.html).

이들 인자를 코딩하는 유전자의 염기 서열은 NCBI 등의 공적인 DNA 데이타베이스에서 이용할 수 있어, 당업자는 해당 유전자의 cDNA를 취득·사용할 수 있다. 예를 들면, Wnt-3a나 Wnt-8a 유전자는 이미 인간이나 마우스에서 동정되어 있어, 인간의 WNT-3A (서열번호 5), 마우스의 Wnt-3a (서열번호 2), 인간의 WN T-8A (서열번호 6), 마우스의 Wnt-8a (서열번호 4)의 염기 서열은, 각각 액세스 번호: NM-033131, NM-009522, NM-031933, NM-009290로 등록되어 있다.

본 발명에 따른 GSK-3β 저해제는 GSK-3β 단백질의 키나제 활성, 예를 들면 β-카테닌에 대한 인산화 능력을 저해하는 물질로서 정의되며, 이미 수십 종 이상이 공지되어 있다(Martinez et al., Med. Res. Rev. 22:373, 2002; Meijer L et al., Trends Pharmacol. Sci. 25:471, 2004). 그 구체예로는, 리튬, 발프로산; 벤즈아제피논(benzazepinone) 패밀리의 켄파울론(Kenpaullone; 9-브로모-7,12-디하이드로인돌로[3,2-d][1]벤즈아제핀-6(5H)-온)이나, 알스테르파울론(Alsterpaullone; 9-니트로-7,12-디하이드로인돌로[3,2-d][1]벤즈아제핀-6(5H)-온); 인디루빈 유도체인 5-클로로-인디루빈, 인디루빈-3'-모노옥심이나 BIO(이명, GSK-3β 저해제 IX; 6-브로모인디루빈-3'-옥심); 말레이미드 유도체인 SB216763 (3-(2,4-디클로로페닐)-4-(1-메틸-1H-인돌-3-일)-1H-피롤-2,5-디온)이나 SB415286 (3-[(3-클로로-4-하이드록시페닐)아미노]-4-(2-니트로페닐)-lH-피롤-2,5-디온); 티아디아졸리디논(TDZD: thiadiazolidinone) 유사체인 TDZD-8(이명, GSK-3β 저해제 I: 4-벤질-2-메틸-1,2,4-티아디아졸리딘-3,5-디온)이나 OTDZT(이명, GSK-3β 저해제 III; 2,4-디벤질-5-옥소티아디아졸리딘-3-디온); 페닐-α-브로모메틸케톤 화합물인 GSK-3β 저해제 VII(4-디브로모아세토페논); 세포막 투과성의 인산화된 펩타이드인 L803-mts(이명, GSK-3β 펩타이드 저해제; Myr-N-GKEAPPAPPQSpP-NH₂) 등을 들 수 있다. 이들 화합물은 Calbiochem사나 Biomol사 등에서 시판되고 있어 용이하게 사용가능하지만, 특별히 이들로 한정되지 않는다.

이들 GSK-3β 저해제를 이용할 경우, 화합물의 특성 차이에 따라 최적 농도가 달라진다. 따라서, 사용하는 화합물의 종류에 따라 최적 농도를 바꾸어야 하며, 해당 농도로 GSK-3β 저해제를 포함하고 있는 배지에서 배양한다.

예를 들면, BIO나 SB216763의 경우, 바람직하게는 10 nmol/L - 1 μmol/L, 보다 바람직하게는 50 nmol/L - 200 nmol/L의 농도로 포함하고 있는 배지에서 배양한다. GSK-3β 저해제 VI1의 경우, 바람직하게는 2 μmol/L - 100 μmol/L, 보다 바람직하게는 5 μmol/L - 20 μmol/L이다. 또, L803-mts의 경우, 바람직하게는 5 μmol/L - 500 μmol/L, 보다 바람직하게는 20 μmol/L - 200 μmol/L, 더욱 바람직하게는 25 μmol/L - 200 μmol/L이다.

본 발명의 실시에 이용되는 약제는 GSK-3β 저해제 이외에도, 카노니칼 Wnt 신호 경로의 활성화를 촉진시키는 저분자 물질(Wnt 작용제), 예를 들면, 유기 또는 무기 화합물이나 펩타이드 단편 등일 수도 있다. 바람직한 예로, 아미노피리미딘 유도체(2-아미노-4-[3,4-(메틸렌디옥시)벤질-아미노]-6-(3-메톡시페닐)피리미딘; Calbiochem사)(Liu et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 44:1987, 2005)를 들 수 있다. 상기 Wnt 작용제를 이용할 경우, 1 nmol/L - 1000 nmol/L, 바람직하게는 10 nmol/L - 500 nmol/L, 보다 바람직하게는 50 nmol/L - 200 nmol/L의 농도로 Wnt 작용제를 포함하고 있는 배지에서 배양한다.

다능성 줄기 세포에 Wnt 신호 활성화 물질을 작용시키는 시기의 결정은, 본 발명의 실시에 있어 매우 중요한 요건이다. 다시 말해, 부적절한 시기에 Wnt 신호 활성화 물질을 작용시켰을 경우, 다능성 줄기 세포의 심근 분화능에 대해 촉진 효과를 나타내지 않을 뿐만 아니라, 오히려 억제 효과를 나타낼 수도 있다. 예를 들면, 다능성 줄기 세포를 분화 유도한 직후부터 Wnt 신호 활성화 물질을 배양액에 첨가한 상태에서 약 1주일 배양하는 경우, 배양액에 아무 것도 첨가하지 않는 군(무처리군) 보다 심근 분화능이 낮을 수 있다.

Wnt 시그널 활성화 물질을 작용시키는 시기를 결정할 때, 본 발명의 실시에 이용하는 다능성 줄기 세포의 분화 유도 과정에서 각종 카노니칼 Wnt 유전자의 발현 패턴을 지표화할 수 있다. 구체적으로, 다능성 줄기 세포를 통상적인 방법을 기초로 분화 유도하고, 경시적으로 회수한 샘플로부터 mRNA를 추출하여 각종 카노니칼 Wnt 유전자의 발현량을 RT-PCR 방법 등의 일반적인 방법으로 조사할 수 있다. 샘플의 회수는, 분화 유도를 위한 배양을 개시한 후 (박동성) 심근 세포의 출현을 인정될 때까지의 기간 동안, 예를 들면, 마우스 ES 세포, 원숭이 ES 세포 및 인간 ES 세포의 경우는 약 6 - 14일간, 바람직하게는 24 시간마다, 보다 바람직하게는 12 시간마다 실시한다. 분석 대상이되는 카노니칼 Wnt 유전자는 1종일 수 있지만, 바람직하게는 2종 이상, 더욱 바람직하게는 3종 이상이 바람직하다.

ES 세포 등의 다능성 줄기 세포에서, 각종 카노니칼 Wnt 유전자의 발현은 미분화 상태나 분화 유도 직후에 일반적으로 낮게, 분화 유도 후 수일 경과시 급격하게 향상된다(실시예 1). 이렇게, 분화 유도 후 카노니칼 Wnt 유전자의 발현량이 분화 유도 전의 미분화된 다능성 줄기 세포 보다 유의하게 상승한 시점을 “Wnt 유전자의 발현 상승기”로 한다. 유의한 발현 상승은 일반적으로 사용되는 Student's t-테스트 등의 통계적 검정(위험율: 5%)에 의해 판단할 수 있다. 이 때, 판단의 기준이 되는 위험율은 바람직하게는 5%, 보다 바람직하게는 1%이다. 또, 계측한 카노니칼 Wnt 유전자의 발현이 분화 유도 후 수 일간에 급격하게 상승하고, 그 후 수 일이내에 그 발현이 소실될 경우, 즉, 카노니칼 Wnt 유전자가 단기간에만 발현 상승을 보일 경우, 최대 발현량을 보이는 시점을 Wnt 유전자의 발현 상승기로 할 수 있다.

다능성 줄기 세포를 분화 유도하기 2, 3일 전부터 및/또는 분화 유도 직후에, BMP 길항제가 포함된 배지에서 배양하면, 유의적으로 그 심근 분화능이 높아진다는 것이 공지되어 있다(WO2005/033298; Yuasa et al., Nat. Biotechnol. 23:607, 2005). 이 경우, 상기의 각종 카노니칼 Wnt 유전자의 발현 상승이 확인되었다. 이러한 결과는, 본 발명에서 카노니칼 Wnt 유전자의 발현 상승기를 결정할 때 유용하고, 발현 상승기를 결정할 때는 BMP 길항제가 포함된 배지에서 배양하는 것이 바람직하다. BMP 길항제로는, BMP 분자(예를 들면, BMP-2, BMP-4, BMP-7 등)에 결합하여 BMP 신호 전달을 억제하는 물질을 의미하며, 노긴(Noggin), 코르딘(Chordin) 또는 단(DAN) 등을 들 수 있으며, 배지 첨가에 이용할 수 있는 이들 물질들은 예를 들면 R&D systems사에서 구입할 수 있다.

본 발명에서, 다능성 줄기 세포는 심근 분화 유도를 위한 배양을 개시한 직후부터, 상기 방법에 의해 결정된 Wnt 유전자의 발현 상승기의 24 시간 전까지의 기간 동안, Wnt 신호 활성화 물질이 포함되지 않은 배지에서 배양한다. 이어서, 상기 방법에 의해 결정된 Wnt 유전자의 발현 상승기의 24 - 0 시간 전, 바람직하게는 24 시간 전부터, 24 - 96 시간, 바람직하게는 48 - 72 시간의 기간동안, Wnt 신호 활성화 물질이 포함된 배지에서 배양한다. 예를 들면, 마우스 ES 세포의 일예로 해당 세포의 심근 분화 유도를 위해 배양한 경우, 대표적인 카노니칼 Wnt 유전자인 Wnt-3, Wnt-3a 또는 Wnt-8a의 발현은 미분화시나 분화 유도 직후에는 매우 낮지만, 분화 유도 후 72 시간째부터 96 시간까지 강한 발현을 나타낸다(실시예 1). 그러므로, 해당 세포를 본 발명의 방법으로 사용할 경우, 카노니칼 Wnt 유전자의 발현 상승기는 분화 유도한 지 72 시간 후이며, 분화 유도 개시부터 48 시간째까지 Wnt 신호 활성화 물질이 포함되지 않은 배지에서 배양한다. 그 후, 해당 세포는 분화 유도 개시한 지 48 시간째부터, Wnt 신호 활성화 물질이 포함된 배지에서 24 시간 - 96 시간, 바람직하게는 48 시간 - 72 시간동안 배양한다. 한편, Wnt 신호 활성화 물질을 작용시키는 기간(시간)은 이용되는 세포가 유래된 동물 종, 이용되는 세포주, 이용되는 Wnt 신호 활성화 물질의 종류 등의 조건의 차이에 따라, 적절하게 최적 기간(시간)을 설정하며, 해당 기간(시간)은 상기의 Wnt 신호 활성화 물질을 작용시키는 시기를 결정하는 방법에 의해 얻어진 카노니칼 Wnt 유전자의 발현 상승기에 근거하여 설정할 수 있다. 예를 들면, 원숭이(코먼 마모셋) ES 세포의 경우, Wnt-3 유전자의 발현은 분화 유도 후 72 - 120 시간에 걸쳐서 강하고(실시예 5), 인간 ES 세포의 경우에는 Wnt-3a 유전자는 분화 유도 후 72 시간 전후를 피크 발현을 나타낸다(Beqqali et al., Stem Cells 24:1956, 2006).

전술한 방법에 의해, ES 세포를 비롯한 다능성 줄기 세포로부터 분화 유도된 심근 세포는 계속적으로 공지된 방법에 의한 세포 회수, 분리, 정제 방법을 이용함으로써, 고순도의 심근 세포(본 발명에 의해 제조된 심근 세포)을 효율적이고 다량으로 얻을 수 있다.

심근 세포의 정제 방법은, 공지된 세포 분리 정제 방법이면 모두 이용할 수 있지만, 구체적인 예로는 유세포 측정기, 자석 비드 또는 패닝(panning) 방법 등의 항원-항체 반응에 준한 방법(“Monoclonal Antibodies: principles and practice, Third Edition”(Acad. Press, 1993); “Antibody Engineering: A Practical Approach”(IRL Press at Oxford University Press, 1996), 자당 또는 퍼콜(Percoll) 등의 담체를 이용한 밀도 구배 원심에 의한 세포 분획법을 들 수 있다. 또, 다른 심근 세포 선별법으로는, 시초가 되는 ES 세포 등의 다능성 줄기 세포의 유전자에 미리 인위적인 수식을 행하고, 약제 내성 또는 이소성 단백질의 발현능을 부여함으로써, 심근 세포의 형질을 가진 세포를 회수하는 방법을 들 수 있다. 예를 들면, Field 및 공동 연구자들은 α-미오신 중쇄 프로모터의 제어하에 네오마이신(G418) 내성 유전자를 발현시킬 수 있는 유전자 카세트를 마우스 ES 세포에 도입함으로써, ES 세포가 심근 세포로 분화되고, 그에 따라 α-미오신 중쇄 유전자가 발현되었을 때만 G418이 첨가된 배지에서 생존할 수 있는 시스템을 구축하였고, 이러한 방법에 의해 G418 내성 세포로서 선별된 세포는 99% 이상이 심근 세포인 것으로 확인되었다(미국 특허 제 6,015,671호; Klug et al., J. Clin. Invest. 98: 216, 1996). 또 다른 예로, 심근 세포가 다른 세포에 비해 미토콘드리아 함량이 높은 점을 이용하여, 미토콘드리아 선택적 형광 색소나 미토콘드리아 막 전위 감수성 시약을 하여 미토콘드리아를 다수 포함하는 세포 집단, 즉 심근 세포를 특이적으로 회수하는 방법(WO 2006/022377)도 유효하다. 또 다른 예로, 심근 세포의 특이적인 대사 특성을 이용하여, 저당 조건 하에 락트산이나 아스파라긴산 등의 아미노산을 첨가함으로써, 심근 세포를 특이적으로 정제하는 방법도 바람직하다(일본 특허 출원 2006-23770).

본 발명에 의해 제조된 심근 세포는 각종 생리 활성 물질(예를 들면, 약품)이나 기능 미확인된 신규 유전자 산물 등의 약리 평가 및 활성 평가에 유용하다. 예를 들면, ES 세포 등의 다능성 줄기 세포에서 심근 세포로의 분화 제어와 관련있는 물질이나 약제, 또는 심근 세포의 기능 조절에 관한 물질이나 약제, 또한 심근 세포에 대하여 독성이나 장해를 나타내는 물질이나 약제의 스크리닝에 이용할 수 있다. 특히, 인간 심근 세포를 이용한 스크리닝 방법은 대부분 존재하지 않으므로, 본 발명에 의해 제조된 심근 세포는 이러한 스크리닝 방법을 실시하는데 유용한 세포원이 된다. 새로운 구현예로, 본 발명에서 제조된 심근 세포를 포함하는 평가 키트도 상기 스크리닝에 유용한다.

스크리닝에 제공되는 피시험물질은 배양 시스템에 첨가할 수 있는 것이면 임의 종류일 수 있으며, 예를 들면, 저분자 화합물, 고분자 화합물, 유기 화합물, 무기 화합물, 단백질, 펩타이드, 유전자, 바이러스, 세포, 세포 배양액, 미생물 배양액 등을 들 수 있다. 유전자를 효율적으로 배양 시스템에 도입하는 방법은 레트로바이러스, 아데노바이러스 등의 바이러스 벡터를 이용하여 배양 시스템에 첨가하는 방법, 또는 리포솜 등의 인공적 구조물에 넣어 밀봉하여 배양 시스템에 첨가하는 방법 등을 들 수 있다.

피시험물질의 평가는 ES 세포 등의 다능성 줄기 세포로부터 심근 세포로의 분화 유도 효율이나, 심근 세포 기능의 질적 또는 양적인 변화를 측정함으로써 행할 수 있다. 예를 들면, 피시험물질의 심근 분화 유도 효율은, 본 발명에 기재된 방법으로 배양하는 다능성 줄기 세포를, 배양 개시 후 5 - 15일째, 바람직하게는 7 - 12일째의 시점에, 심근 세포에 특이적인 여러가지 마커의 발현을, 생화학적 또는 면역화학적 방법으로 검출함으로써 측정할 수 있다. 생화학적 또는 면역화학적 방법은 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 면역조직화학적 염색법이나 면역전기영동법과 같은 면역화학적 방법을 이용할 수 있다. 이러한 방법에서는 심근 세포에 결합하는 마커 특이적 다클론성 항체 또는 단일 클론 항체를 사용할 수 있다. 각각의 특이적 마커를 표적으로 하는 항체는 시판되고 있어, 용이하게 사용할 수 있다. 심근 세포에 특이적인 마커로는, 예컨대, 미오신 중쇄/경쇄, α-액티닌, 트로포닌 I, ANP, GAT A-4, Nkx 2.5, MEF-2c 등을 들 수 있다.

또, 피시험물질을 평가하는 지표로서의 심근 세포 기능으로는, 심근 세포의 생존성을 일예로서 들 수 있다. 구체적으로는, 본 발명에 기재된 방법에 의해 제조된 심근 세포를, 적절한 세포 밀도가 되도록 배양 플레이트에 파종하고, 혈청이 포함되지 않은 배지에서 배양하여 세포사(세포자살)를 유도할 수 있지만, 이 때 적당량의 피시험물질을 배지에 첨가하여 심근 세포의 생존율 또는 사망율을 측정할 수 있다. 심근 세포의 생존율 또는 사망율의 측정 방법은 트립판 블루 등의 색소의 편입/결합을 지표로 한 육안 관찰에 의해 수행할 수 있으며, 탈수소효소의 활성(환원 활성)을 지표로 한 방법, 또는 세포자살 세포에 특이적인 카스파제 활성이나 아넥신 V의 발현을 지표로 한 방법을 이용할 수도 있다. 이러한 메커니즘을 이용하는 키트는 Sigma사, Clontech사, Promega사 등 다수의 제조사에서 각 메커니즘을 이용한 키트로 시판되고 있어, 용이하게 사용할 수 있다.

이러한 스크리닝 방법에 의해 수득되는 물질이나 약제는 심근 세포의 분화 유도 작용이나 기능 조절 작용을 가지므로, 예를 들면 심근경색, 허혈성 심장 질환, 울혈성 심부전, 비대성 심근증, 확장성 심근증, 심근염, 만성 심부전 등의 심장 질환 예방제 또는 치료제로서 이용할 수 있다. 이들 화합물은 신규 화합물일 수도 있으며, 공지된 화합물일 수도 있다.

또, 본 발명에 의해 제조된 심근 세포는 심근 재생제 또는 심장 질환 치료제로서 이용할 수 있다. 심장 질환으로는 심근경색, 허혈성 심장 질환, 울혈성 심부전, 비대성 심근증, 확장성 심근증, 심근염, 만성 심부전 등을 들 수 있다. 심근 재생제 또는 심장 질환 치료제로 이용하는 경우, 본 발명에 의해 제조된 심근 세포를 고순도로 포함할 수 있으며, 세포를 배지 등의 수성 담체에 부유시키거나, 세포를 생체분해성 기질 등의 지지체에 포매하거나, 또는 단층 또는 다층의 심근 세포 시드(Shimizu et al., Circ. Res. 90:e40, 2002)에 가공하는 등, 어떠한 임의 형태일 수도 있다.

상기 치료제를 장해 부위에 전달하는 방법으로는 개흉하여 주사기로 직접 심장에 주입하는 방법, 심장의 일부를 외과적으로 절개해서 이식하는 방법, 또한 도뇨관을 이용한 경혈관적 방법에 의해 이식하는 방법 등(Murry et al., Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 67:519, 2002; Menasche, Ann. Thorac. Surg. 75:S20, 2003; Dowell et al., Cardiovasc. Res. 58:336, 2003)을 들 수 있지만, 특별히 이들로 한정되진 않는다. 이러한 방법에 의해, 태아 심장으로부터 회수한 심근 세포를 심장 상해가 있는 동물의 심장에 이식하는 경우, 특히 치료 효과가 우수한 것으로 보고되고 있다(Menasche, Ann. Thorac. Surg. 75:S20, 2003; Reffelmann et al., Heart Fail. Rev. 8:201, 2003). ES 세포 유래의 심근 세포는 태아 심장 유래의 심근 세포와 매우 유사한 형질을 가진다(Maltsev et al., Mech. Dev. 44:41, 1993; Circ. Res. 75:233, 1994; Doevendans et al., J. Mol. Cell. Cardiol. 32:839, 2000). 또, 실제로 ES 세포 유래의 심근 세포를 성체 심장에 이식한 동물 실험예에서, 태아 심근을 이식한 예와 일관되게, 생존성이 매우 높은 것으로 확인되었다(Klug et al., J. Clin. Invest. 98:216, 1996; Laflamme et al., Am. J. Pathol. 167:663). 따라서, 심근 세포의 피폐 및 탈락으로 인한 상기 심장 질환에서, 본 발명에 기재된 방법에 의해 제조한 심근 세포를 병에 걸린 심장 조직에 보충 이식함으로써, 심장 기능의 개선을 촉진시킬 수 있을 것으로 기대할 수 있다.

[ 실시예 ]

실시예를 제시하여 본 발명을 구체적으로 설명한다.

실시예 1: ES 세포의 분화 유도 과정에서의 각종 Wnt 유전자의 발현 양식 검토(1)

마우스 ES 세포의 분화 유도 과정에서 각종 Wnt 유전자의 발현을 검토하였다. 마우스 ES 세포는, 20% 소 태아 혈청, 2 mmol/L L-글루타민 및 0.1 mmoI/L 2-머캅토에탄올을 포함하는 Knockout-DMEM(Invitrogen사) 배지(이하, ESM이라 함)에 1000 U/mL의 LIF(ESGRO; Chemicon사)을 첨가한 것을 이용하여, “Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual” (Hogan et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994) 및 “Embryonic Stem Cells: Methods and Protocols” (Turksen ed., Humana Press, 2002) 등에 기재된 방법에 따라, 미분화된 형질을 유지하면서 계대배양(subculture)한 것을 실험에 제공하였다. 이 조건으로 계대배양한 ES 세포를, 이하, 통상의 배양 조건 하에서 계대배양한 ES 세포로 한다. 또, 이하의 실험에는 마우스 ES 세포로 D3 세포, R1 세포 및 129SV 세포(Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.에서 구입)을 이용했지만, 대개 ES 세포주의 차이에 의한 실험 결과 차이는 나타나지 않았다. 이하, 특별한 언급이 없는 한, D3 세포주를 이용한 실험 데이터를 나타낸다. 한편, 실시예 1-4의 실험에서는 마우스 ES 세포를 이용해서 실험을 행하였다.

통상의 배양 조건 하에서 계대배양한 ES 세포를 인산완충액(phosphate-buffered saline; PBS)에서 2회 세정한 후, 1 mmoI/L EDTA를 포함하는 0.25% 트립신 용액으로 처리하여 단일 세포 상태로 만든 다음, ESM에 현탁하였다. 이하, 특별히 명시하지 않는 한, ES 세포를 플레이트에서 탈착한 후 분화 유도나 그 밖의 실험에 사용할 때에는, 상기 조건을 이용하였다.

ES 세포로부터 심근 세포나 신경 세포 등으로의 분화를 유도하기 위한 배양은, 통상적인 방법을 기초로 하여 하기와 같이 수행하였다. ES 세포를 LIF-무첨가 배지에 현탁하고, 현탁액을 시판되는 세포 집괴(spheroid) 형성용 96웰 배양 플레이트(Sumilon Celltight Spheroid; Sumitomo Bakelite Co., Ltd., Japan)에 1웰 마다 500 세포/50 μL씩 파종하였다. 본 실험 조건에서, 부유 배양 직후부터 ES 세포가 응집되어 EB의 형성이 인지되었고, 부유 응집 배양(분화 유도)한지 약 7 - 8일째부터 일부 EB에서 자율 박동성이 관찰되기 시작하였는데, 이는 EB 중 적어도 일부의 세포가 심근 세포로 분화 유도됨을 나타낸다.

이 때, 일부 실험군에는 분화 유도하기 3일 전부터 분화 유도한 직후에 시판되는 재조합 코르딘 단백질 또는 DAN 단백질(15 ng/mL, 둘다 R&D systems에서 구입)을 배지에 첨가하였다. 이렇게 ES 세포를 BMP 길항제에 일시적으로 처리하면, 심근 분화능이 현저하게 높아지는 것은 공지된 사실이다(WO2005-033298; Yuasa et al., Nat. Biotechnol. 23:607, 2005). 이하, 코르딘 단백질이나 DAN 단백질 등의 BMP 길항제를 배지에 첨가해 ES 세포에 작용시키는 것을 “BMP 길항제 처리”라고 한다.

이렇게 해서 제조한 EB를 주기적으로 회수하고, RNeasy mini kit (Qiagen)를 이용하여 전체 RNA를 준비한 다음, DNase를 처리하였다. DNase 처리한 전체 RNA(1 μg)로부터 SuperScript^TM First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen)을 이용해서 cDNA를 합성하였다. 유전자의 발현 분석은 ABI PRISM 7700 (PE Applied Biosystems)에 의해, Lux 프라이머를 이용한 실시간 중합효소 연쇄반응( real-time polymerase chain reaction; PCR) 정량 시스템에 의해, 각종유전자의 발현량을 조사하였다. 실시간 PCR 정량 반응은, 상기 cDNA를 주형으로 Platinum Quantitative PCR SuperMix-UDG (Invitrogen)을 이용해서 첨부된 설명서 에 기재된 방법을 따라 행하였다.

각종 Wnt 유전자 등을 검출하기 위한 Lux 프라이머는 프라이머 설계용 소프트(D-LUX^TM Designer; Invitrogen)를 이용하여 여러가지 유전자의 염기 서열 정보를 기초로 설계하였다. 각종 Wnt 유전자의 각 전사 산물 검출에 이용한 Lux 프라이머의 염기 서열은 하기와 같다.

Wnt-3

(정방향) 5'-CAACAGTAGCAAGGAGCATGGACTGTTG-3'(서열번호 7)

(역방향) 5'-GGCTGGGTCCAGGTCGTTTA-3'(서열번호 8)

Wnt-3a

(정방향) 5'-GACAAACCGGGAGTCAGCCTTTGTC-3'(서열번호 9)

(역방향) 5'-TGCTGCACCCACAGATAGCA-3'(서열번호 10)

Wnt-8a

(역방향) 5'-GTACATGCGCTCTGCTGCCATCATGTAC-3'(서열번호 11)

(정방향) 5'-GACTCGTCACAGCCGCAGTT-3'(서열번호 12)

상기의 방법에 기초해 수행한 실험예 1을 도 1에 나타낸다. ES 세포의 분화 유도한지 24 시간(1일째)부터 168 시간(7일째)까지의 기간동안 Wnt 유전자의 발현을 조사한 결과, Wnt-3, Wnt-3a 및 Wnt-8a 유전자의 유의한 발현 상승이 인지되었다. 이들 Wnt 유전자는 분화 유도 후 72 시간부터 96 시간 사이에 강한 피크 발현을 보였으며, 이 후 120 시간째 부터 현저하게 저하되었다. 따라서, 해당 ES 세포에서의 Wnt 유전자의 발현 상승기를 분화 유도후 72 시간으로 판단할 수 있다.

코르딘 단백질 또는 DAN 단백질 등의 BMP 길항제를 처리한 군에서는 무처리군과 동일하게 분화 유도 후 72 시간에 강한 Wnt 유전자 발현 상승이 나타났으며, 그 발현량은 무처리군 보다 유의적으로 높았다. 이렇게, BMP 길항제 처리는 ES 세포의 분화 과정 동안에 Wnt 유전자의 발현 상승 시기를 보다 명확하게 판단할 수 있는 방법임을 시사한다.

실시예 2: 재조합 Wnt 단백질 처리에 의한 ES 세포 유래 심근 세포의 출현 증강 효과 (1)

ES 세포의 분화 유도 초기 단계에서, 심근 세포의 출현 이전에 각종 Wnt 유전자의 일시적인 발현 상승이 관찰되었기에, 이 시기의 ES 세포에 재조합 Wnt 단백질을 처리하여 심근 분화 유도 효과를 검토하였다. ES 세포의 분화 유도는 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였지만, 일부 실험군은 시판되는 재조합 WNT-1단백질(Peprotech), Wnt-3a 단백질(R&D systems) 또는 Wnt-5a 단백질(R&D systems)이 포함된 배지에서 배양하였다. 이하, WNT-1 등의 카노니칼 Wnt의 재조합 단백질을 배지에 첨가해 ES 세포에 작용시키는 것을 “Wnt 처리”라고 한다.

ES 세포로부터 심근 세포의 분화 및 발생을 유용한 지표로 하여, 자율 박동성을 보이는 EB의 출현율을 주기적으로 조사하였다. 무처리군에서는, 부유 응집 배양후 13일째에 박동성 EB의 출현율은 약 20%였지만, 분화 유도 후 48 시간 - 96 시간의 48 시간(2일간) 동안 Wnt 처리한 군(Wnt⁴⁸ ^{- 96 시간}) 및 48 시간 - 12O 시간의 72 시간(3일간) 동안 Wnt 처리한 군(Wnt⁴⁸ ^{- 120 시간})에서는 유의적으로 높은 비율의 EB에서 박동성을 확인할 수 있었다(도 2A, B). 그 효과는 BMP 길항제 처리(도에서 코르딘 군)에 필적할 만큼 높았다.

한편, 분화 유도 후의 일차 48, 72, 96, 또는 120 시간(2, 3, 4 또는 5일간) Wnt 처리한 군(각각 Wnt ^{~ 48h}, Wnt ^{~ 72h}, Wnt ^{~ 96h}, Wnt ^{~ 120h})이나 분화 유도 후 12O 시간 또는 144 시간(5일 또는 6일) 이후에 Wnt 처리한 군(Wnt ^120h~, Wnt ^144h~) 등에서는, 박동능을 가진 EB은 무처리군과 동일한 수준으로만 나타났다. 또, 무처리군 등의 박동성 EB의 비율이 낮은 군의 EB에서는, 박동하는 부분의 영역은 EB의 일부에 한정되어 있었지만, Wnt⁴⁸ ^{- 96h} 군이나 Wnt⁴⁸ ^{- 120h} 군의 EB에서는 코르딘 처리한 EB와 동일하게 EB 표면 층 전역에서 박동을 관찰할 수 있었다. 다시 말해, 해당 ES 세포를 분화 유도 직후부터 Wnt 유전자의 발현 상승이 인지되는 시기(분화 유도 개시 후 72 시간째)의 24 시간 전까지의 기간동안 Wnt 단백질이 포함된 배지에서 배양하면, 유의한 심근 분화 유도 효과는 나타나지 않았다.

반면, 해당 ES 세포를 Wnt 유전자의 발현 상승이 인지되는 시기(분화 유도 개시 후 72 시간째)의 24 시간 전부터 48 시간동안(2일간) 또는 72 시간(3일간), 재조합 Wnt 단백질이 포함된 배지에서 배양하면, 현저한 심근 분화능 촉진 효과가 나타났다.

이상의 결과로부터, Wnt 처리는 ES 세포의 심근 분화를 현저하게 유도하지만, 그 효과는 분화 유도 과정에서 지극히 한정된 기간에서만 나타나는 것으로 확인되었다. 이하의 실험에서는, 특별히 명시하지 않는 한, “Wnt 처리”는 분화 유도 개시 후 48 시간 - 96 시간까지의 48 시간(2일간), 또는 분화 유도 개시 후 48 시간 - 120 시간까지의 72 시간(3일간) 동안 Wnt 처리를 행한 것을 의미한다.

“Wnt 처리”에 있어서, 재조합 Wnt 단백질의 첨가 농도의 차이가, 심근 분화 유도에 끼치는 영향에 대해서 검토한 바, 예를 들면 Wnt-3a, Wnt-5a, WNT-1을 이용했을 경우，거의 동일한 농도 의존성이 나타났으며, 1 ng/mL - l00 ng/mL 농도로 재조합 단백질 첨가에 의해 무처리군보다 유의적으로 높은 박동성 EB의 출현율이 수득할 수 있었다. 특히 10 ng/mL - 50 ng/mL 농도로 Wnt 단백질을 첨가할 경우, 지극히 양호한 박동성 EB가 나타났다.

실시예 3: Wnt 처리에 의해 분화 유도한 ES 세포 유래 심근 세포의 형질

실시예 2에 나타낸 바와 같이, Wnt 처리에 의해 ES 세포로부터 제조한 EB의 박동성이 유의적으로 향상되었지만, 박동성 EB에서 박동성 세포가 심근 세포인 것을 확인하기 위해, 각종 심근 특이적 마커 분자의 유전자 발현 및 단백질 생산을 검토하였다. 실시예 2와 동일한 방법으로 ES 세포의 분화를 유도하고, 분화 유도 후 10일째에 EB을 회수하여 cDNA를 준비하였다. 실시간 PCR 정량 반응은 TaqMan 프로브 방법으로 행하였다. 즉, 상기 cDNA(1 μL)을 주형으로 하고, TaqMan Universal PCR Master Mix (PE Applied Biosystems)을 이용해서 첨부된 설명서에 기재된 방법을 따라 행하였다. 여러가지 유전자를 검출하기 위한 TaqMan프로브는, 프라이머 설계용 소프트웨어(ABI PRI SM Primer Express)를 이용하고, 여러가지 유전자의 염기 서열 정보를 기초로 설계하였다. GATA-4, Nkx-2.5, MLC-2a, MLC-2v 및 GAPDH의 각 전사 산물의 검출에 이용한 프라이머 및 TaqMan 프로브의 염기 서열은 이하와 같다.

GATA-4

(정방향) 5'-ACGGAAGCCCAAGAACCTGA-3'(서열번호 13),

(역방향) 5'-CATTGCTGGAGTTACCGCTG-3'(서열번호 14),

(TaqMan probe) 5'-TAAATCTAA GACGCCAGCAGGTCCTGCTG-3'(서열번호 15);

Nkx-2.5

(정방향) 5'-TGACCCAGCCAAAGACCCT-3'(서열번호 16),

(역방향) 5'-CCATCCGTCTCGGCTTTGT-3'(서열번호 17),

(TaqMan probe) 5'-CGGATAAAAAAGA GCTGTGCGCGC-3'(서열번호　18);

MLC-2a

(정방향) 5'-CCAGGCAGACAAGTTCTCTCCT-3'(서열번호 19),

(역방향) 5'-CTTGTAGTCAATGTTGCCGGC-3'(서열번호 20),

(TaqMan probe) 5'-CAACTGTTTGCGCTGACACCCATGGA-3'(서열번호　21);

MLC-2v

(정방향) 5'-GCAGAGAGGTTCTCCAAAGAGG-3'(서열번호 22),

(역방향) 5'-AAGATTGCCGGTAACGTCAGG-3'(서열번호 23),

(TaqMan probe) 5'-ATCGACCAGATGTTCGCAGCCTTTCC-3'(서열번호　24)

GAPDH

(정방향) 5'-TGCACCACCAACTGCTTAG-3'(서열번호 25),

(역방향) 5'-GGATGCAGGGATGATGTTC-3'(서열번호 26),

(TaqMan 프로브) 5'-CAGAAGACTGTG GATGGCCCCTC-3'(서열번호 27)

분화 유도 1O일째의 Wnt 처리군(Wnt⁴⁸ ^{- 120h}군) EB에서, 대표적인 심근 세포 마커로서 알려지는 GATA-4, Nkx-2.5, MLC-2a, MLC-2v (도 3), αMHC, βMHC 등의 유전자가 무처리군에 비해 유의적으로 강하게 발현되는 것으로 확인되었다.

반면, 박동성 EB의 출현율이 낮은 Wnt ^{~ 48h}, Wnt ^{~ 120h} 및 Wnt 1^{44h ~} 군에서는, 무처리군과 동일한 수준의 발현량을 보였으며, 박동성 EB의 출현율과 각종 심근 마커 유전자의 발현량은 거의 동일한 경향을 나타내었다.

이후, Wnt 처리군 EB에서 발생한 박동성 세포가 심근 세포 특이적 마커 단백질을 생산하고 있는 지를 면역조직화학적 염색법으로 확인하였다. 분화 유도한지 10일째의 Wnt 처리군(Wnt ^{48 - 120h} 군) EB를 동결 절편 제조용 포매제(OCT Compound, Sakura Finetek USA Inc.)로 신선하게 포매하고, 액체 질소로 동결시켜 제조한 동결 표본을 얇게 썬(6 μm) 후, 슬라이드 글라스에 유착시켰다. 이 동결 절편은 일차 항체로서 항-근절 미오신(sarcomeric myosin) 항체((MF20; American Type Culture Collection), 항-GATA-4 항체(C-20; Santa Cruz), 또는 항-Nkx-2.5항체(N-19; Santa Cruz)와 반응시킨 후, 계속해서 호스래디쉬 페록시다제-표지된 2차 항체(Bio-RAD)와 반응시키고, 마지막으로 ACE(3-아미노-9-에틸카르바졸) 기질 용액(Nichirei Corporation, Japan)으로 발색 반응을 행한 후, 광학 현미경하에서 관찰하였다.

결과를 도 4에 나타낸다. 무처리군에서는 심근 세포에 특이적인 마커 단백질인 근절 미오신(도에서 MHC), Nkx-2.5 또는 GATA-4에 양성인 세포가 EB 중 극히 일부에서만 관찰되었지만, Wnt 처리군에서는 BMP 길항제(DAN) 처리군과 마찬가지로 EB를 구성하고 있는 세포의 대부분에서 양성으로 나타나, 심근 세포 집괴(cardiospheres)를 형성하고 있음을 확인할 수 있었다. 이상의 결과로부터, Wnt 처리에 의해 분화 유도된 ES 세포 유래의 박동성 세포가 심근 세포인 것이 실증되었기에, 본 발명의 방법이 EB에서 심근 세포의 분화 및 발생을 강하게 촉진시키는 방법이라는 것이 명확해졌다.

실시예 4: 베타- 카테닌 활성화제에 의한 ES 세포 유래 심근 세포의 출현 증강 효과

상기 카노니칼 Wnt 단백질의 처리가 세포내에서 GSK3β의 작용을 저해함으로써, β-카테닌의 안정화 및 전사 활성능을 촉진시킨다는 것은 공지된 것이다. 여기에서, β-카테닌의 안정화 및 전사 활성능을 촉진시키는 각종 약제 처리가 Wnt 처리와 같이 ES 세포의 심근 분화 유도 효과를 나타내는 지를 확인하였다. β-카테닌의 안정화 및 전사 활성능을 촉진시키는 약제로는, 시판되는 GSK3β 저해제인 BIO(Calbiochem사), GSK3β 저해제 VII(Calbiochem사), 세포막 투과성 GSK3β 펩타이드 저해제(L803-mts; Calbiochem사), SB216763(Biomo1사) 및 GSK3β 저해를 거치지 않고 β-카테닌의 전사 활성능을 촉진시키는 Wnt 작용제(Calbiochem사), 5종을 이용하였다. ES 세포의 분화 유도는 상기 실시예들과 동일하게 실시하고, 상기 화합물은 재조합 Wnt 단백질처럼 분화 유도 후 48 시간부터 120 시간(3 - 5일째)까지의 기간동안 처리하고, 상기 화합물이 포함된 배지에서 배양하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 상기 화합물의 첨가군은 최적 농도에서 재조합 Wnt 단백질 처리군과 동일하거나 또는 그 이상의 강한 심근 분화 유도 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다. 실시예 3과 동일한 방법으로, 이들 화합물로 처리한 EB에서의 심근 마커 유전자 및 심근 마커 단백질의 발현을 검토한 결과, 재조합 Wnt 단백질 처리군에서와 같이, 무처리군에 비해 유의적으로 높은 유전자 및 단백질 발현 상승 효과가 확인되었다.

실시예 5: ES 세포의 분화 유도 과정에서의 Wnt 유전자의 발현 양식 검토(2)

원숭이 일종인 코먼 마모셋 유래의 ES 세포(이하, cmES 세포라 함)를 이용하여, 분화 과정에서의 Wnt 유전자 발현을 검토하였다. cmES 세포의 배양시, 20% Knockout Serum Replacement (Invitrogen), 0.1 mmol/L MEM 비필수 아미노산 용액, 1 mmol/L L-글루타민, 0.1 mmol/L 2-머캅토에탄올이 포함된 Knockout-DMEM medium (Invitrogen)(이하, cmES 배지라 함)에 10 ng/mL 재조합 LIF(alomone labs사) 및 10 ng/mL 재조합 염기성 섬유아세포 증식 인자(Invitrogen사)를 첨가한 배지를 이용하였고, 공급자 세포로는 미리 파종한 미토마이신 처리한 일차 마우스 배아 섬유아세포 상에서 미분화 형질을 유지시키면서 계대배양한 것을 실험에 제공하였다.

cmES 세포를 분화 유도하기 위한 배양은 통상적인 방법에 따라 하기와 같이 행하였다. cm ES 세포를 PBS에서 세정한 후, 시판되는 영장류 ES 세포용 세포박리액(ReproCELL사)으로 37℃에서 5분간 처리하고, cmES 세포의 세포 덩어리를 포함하는 세포 현탁액을 회수하였다. 그 다음에, 공급자 세포와 cmES 세포를 분리하기 위해서, 세포 현탁액을 구경 100μm의 메쉬로 여과하고, 통과 세포 분획을 구경 40μm의 메쉬로 여과시켜, 비통과 분획을 회수하였다. 아울러, 이 cmES 세포 덩어리를 포함하는 비통과 분획을, 세포접착성이 높은 시판되는 배양 플레이트(Primaria; Becton Dickinson)에 파종하여 30분간 배양한 후, 플레이트에 접착되지 않고 배지 중에 부유하는 세포 덩어리를 회수하였다. 이렇게 해서 얻어진 cmES 세포 덩어리는 cmES 배지를 넣은 시판되는 세포 비접착성 배양 플레이트(HydroCell; CellSeed)에 세포 덩어리끼리 서로 접촉 및 접착되지 않는 상태로 배양하여 EB을 형성시켜, 분화 유도를 행하였다.

이렇게 제조한 EB를 을 주기적으로 회수하고, RNeasy mini kit (Qiagen)으로 전체 RNA를 준비하였다. 계속해서, 역전사 효소를 이용해서 cDNA를 합성한 후, PCR에 의해 코먼 마모셋 Wnt-3 유전자(cmWnt-3) 및 내인성 컨트롤로서 βActin(cmbActin)의 발현을 검출하였다. 검출에 이용한 프라이머는 이하와 같다.

cmWnt-3

(정방향) 5'-GAGGTGAAGACCTGCTGGTGGGC-3'(서열번호 28)

(역방향) 5'-GTTGGGCTCACAAAAGTTGG-3'(서열번호 29)

cmbActin

(정방향) 5'-TCCTGACCCTGAAGTACCCC-3'(서열번호 30)

(역방향) 5'-GTGGTGGTGAAGCTGTAGCC-3'(서열번호 31)

전술한 방법에 기초하여 수행한 실험예 중 하나를 도 6에 나타낸다. cmES 세포의 분화 유도한지 24 시간(1일째)부터 168 시간(7일째)까지의 발현을 조사한 결과, Wnt-3 유전자는, 분화 유도한 후 72 시간째부터 120 시간까지의 기간동안 강한 피크 발현이 나타났으며, 그 후 발현은 소실되었다(도 6). 그러므로, 해당 ES 세포의 경우, Wnt-3 유전자의 발현 상승기를 분화 유도한 후 72 시간으로 판단할 수 있었으며, 마우스 ES 세포와 거의 동일한 결과가 얻어졌다.

실시예 6: 재조합 Wnt 단백질 처리에 의한 ES 세포 유래 심근 세포의 출현 증강 효과(2)

cmES 세포를 이용하여 재조합 Wnt 단백질 처리 효과를 검토하였다. 실시예 5의 방법과 동일하게 cmES 세포의 배양 및 분화 유도를 행하였다. 이 때, 일부 실험군은 분화 유도 후 48 시간 - 120 시간까지의 72 시간(3일간) 동안 시판되는 재조합 WNT-1 단백질(PeproTech사), Wnt-3a 단백질(R&D systems사) 또는 WNT-7A 단백질(R&D s ystems사)이 포함된 배지에서 배양하였다.

cmES 세포로부터의 심근 세포의 분화 및 발생을 확인하기 위해, EB의 자율 박동능 관찰과 각종 심근 특이적 마커 1분자의 유전자 및 단백질 발현을 검토하였다. 무처리군의 경우, 10% 이하의 EB에서, 분화 유도 후 2주일 전후에 EB의 일부의 영역에서 박동이 인지되었지만, 이에 반해 Wnt 처리군에서는, 분화 유도 후 1O일째를 전후하여 자율 박동이 시작되었고, 분화 유도 후 16일째에는 거의 반수가 EB 박동성을 나타내었다.

또, 발현 유전자의 분석을 위해, 분화 유도 후 10일째에 EB를 회수하여 실시예 5의 방법과 동일하게 각종 마커 유전자의 발현을 검출하였다. 코먼 마모셋의 Nestin, ANP, MLC-2a, MLC-2v의 각 전사 산물(이하, cmNestin, cmANP, cmMLC-2a, cmMLC-2v라 함)의 검출에 이용한 프라이머는 이하와 같다.

cmNestin

(정방향) 5'-GCCCTGACCACTCCAGTTTA-3'(서열번호 32),

(역방향) 5'-GGAGTCCTGGATTTCCTTCC-3'(서열번호 33)

cmANP

(정방향) 5'-GAACCAGAGGGGAGAGACAGA-3'(서열번호 34),

(역방향) 5'-CCCTCAGCTTGCTTTTTAGGAG-3'(서열번호 35)

cmMLC-2a

(정방향) 5'-GAGGAGAATGGCCAGCAGGAA-3'(서열번호 36),

(역방향) 5'-GCGAACATCTGCTCCACCTCA-3'(서열번호 37)

cmMLC-2v

(정방향) 5'-AGGAGGCCTTCACTATCATGG-3'(서열번호 38),

(역방향) 5'-GTGATGATGTGCACCAGGTTC-3'(서열번호 39)

분화 유도후 10일째 Wnt-3a 처리군 EB에서는 대표적인 심근 세포 마커인 c mANP, cmMLC-2a, cmML C-2v 유전자의 발현이 무처리군보다도 유의적으로 강하게 확인되었다(도 7). Wnt-1 처리군 EB에서도 동일한 결과가 얻어졌다.

한편, 신경 마커로서 알려져 있는 cmNestin의 발현은 Wnt 처리군에서 명백한 발현 감소가 인지되었다.

계속해서, Wnt 처리군 EB에서 발생되는 박동성 세포가 특이적 마커 단백질을 생산하고 있는 심근 세포인지를 실시예 2와 동일하게 면역조직화학적 염색 방법으로 확인하였다. 분화 유도 16일째의 Wnt 처리군(Wnt-3a, WNT-1) EB로 제조한 동결 절편을 일차 항체로서 항-근절 미오신 항체, 항-GATA-4 항체 또는 항-Nkx-2.5 항체를 반응시키고, 발색 반응을 행한 후, 광학현미경하에서 관찰하였다.

그 결과, 무처리군에서는 심근 세포에 특이적인 마커 단백질인 근절 미오신이나 GATA-4의 양성 세포가 EB 중에서 극히 일부에서만 관찰되었고, Nkx-2.5 양성 세포는 대부분 관찰되지 않았지만, 반면 Wnt-3a나 WNT-1로 처리한 군에서는 EB를 구성하고 있는 세포의 대부분에서 양성인 것으로 확인할 수 있었다(도 8). WNT-7A 처리군 EB에서도 동일한 결과가 나타났다.

이상의 결과로부터, Wnt 처리는 설치류의 ES 세포 뿐만 아니라 영장류의 ES 세포에 대해서도 분명한 심근로의 분화 유도를 촉진시킬 수 있음이 명확해졌다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

다능성 줄기 세포로부터 심근 세포를 분화 유도하는 방법으로서,
다능성 줄기 세포를
i) 분화 유도 개시 시점부터 카노니칼 Wnt 유전자의 발현 상승기의 24 시간 전까지의 기간 동안, 카노니칼 Wnt 신호 경로의 활성화를 촉진시키는 물질이 포함되지 않은 배양액에서 배양하는 단계; 및
ii) 카노니칼 Wnt 유전자의 발현 상승기의 24 - 0 시간 전부터 24 - 96 시간의 기간 동안, 카노니칼 Wnt 신호 경로의 활성화를 촉진시키는 물질이 포함된 배양액에서 배양하는 단계
를 포함하며,
상기 카노니칼 Wnt 신호 경로의 활성화를 촉진시키는 물질이 카노니칼 Wnt 단백질, GSK3β 저해제, 및 Wnt 작용제로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 다능성 줄기 세포를 카노니칼 Wnt 유전자의 발현 상승기의 24 시간 전부터 카노니칼 Wnt 신호 경로의 활성화를 촉진시키는 물질이 포함된 배양액에서 배양하는, 방법.
제1항에 있어서,
상기 다능성 줄기 세포를 카노니칼 Wnt 신호 경로의 활성화를 촉진시키는 물질이 포함된 배양액에서 배양하는 기간이 48 - 72 시간인, 방법.
삭제
제1항에 있어서,
상기 카노니칼 Wnt 신호 경로의 활성화를 촉진시키는 물질이 카노니칼 Wnt 단백질인, 방법.
제5항에 있어서,
상기 카노니칼 Wnt 단백질이 Wnt-1, Wnt-3a 및 Wnt-5a로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 Wnt 단백질인, 방법.
제5항에 있어서,
상기 카노니칼 Wnt 단백질의 배양액 중의 농도가 0.1 ng/mL - 500 ng/mL인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 카노니칼 Wnt 신호 경로의 활성화를 촉진시키는 물질이 GSK3β 저해제인, 방법.
제8항에 있어서,
상기 GSK3β 저해제가 GSK3β 저해제 VII, L803-mts, SB216763 및 GSK3β 저해제 IX(BIO)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 저해제인, 방법.
제9항에 있어서,
상기 GSK3β 저해제의 배양액 중의 농도가, GSK3β 저해제 VII는 2 μmol/L - 100 μmol/L, L803-mts는 5 μmol/L - 500 μmol/L, SB216763은 10 nmol/L - 1 μmol/L 또는 GSK3β 저해제 IX(BIO)는 10 nmol/L - 1 μmol/L인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 카노니칼 Wnt 신호 경로의 활성화를 촉진시키는 물질이 Wnt 작용제인, 방법.
제11항에 있어서,
상기 Wnt 작용제가 아미노피리미딘 유도체인, 방법.
제11항에 있어서,
상기 Wnt 작용제의 배양액 중의 농도가 1 nmol/L - 100O nmol/L인, 방법.
제1항 내지 제3항 및 제5항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 다능성 줄기 세포가 배아 줄기 세포, 배아 생식 세포 또는 생식 세포 계열 줄기 세포(germline stem cell)인, 방법.
제14항에 있어서,
다능성 줄기 세포가 배아 줄기 세포인, 방법.
제15항에 있어서,
다능성 줄기 세포가 인간으로부터 유래된 것인, 방법.