KR101343616B1 - Pharmaceutical Compositions for Treating Pancreatic Cancer and Screening Method for Pancreatic Cancer Therapeutic Agent - Google Patents
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Abstract
본 발명은 췌장암 치료용 약제학적 조성물, 이를 이용한 췌장암 진단 및 치료제 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명의 췌장암 치료용 약제학적 조성물은 췌장암 암줄기세포의 억제 또는 사멸을 효과적으로 유도하므로 췌장암에서 항암약물 또는 방사선 내성을 극복하고, 전이를 예방하고 췌장암을 근본적으로 치료할 수 있는 장점이 있다. 또한, 본 발명의 췌장암 치료용 약제학적 조성물은 mRNA를 직접적인 타겟으로 하는 것이 아니라, mRNA 레벨을 조절할 수 있는 miRNA 조절을 통해 질병을 치료하므로 안전하다.The present invention relates to a pharmaceutical composition for treating pancreatic cancer, a method for screening and diagnosing pancreatic cancer using the same.
The pharmaceutical composition for treating pancreatic cancer of the present invention effectively induces inhibition or death of pancreatic cancer stem cells, thereby overcoming anticancer drugs or radiation resistance in pancreatic cancer, preventing metastasis and fundamentally treating pancreatic cancer. In addition, the pharmaceutical composition for treating pancreatic cancer of the present invention is safe because it does not target mRNA directly, but treats disease through miRNA regulation that can regulate mRNA levels.
Description
본 발명은 췌장암 치료용 약제학적 조성물 및 췌장암 치료제 스크리닝 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a pharmaceutical composition for treating pancreatic cancer and a method for screening a pancreatic cancer therapeutic agent.
오랫동안 통설로 여겨져 온 암발생 모델은 클론진화설(clonal evolution)로서, "종양은 정상세포가 돌연변이를 거쳐 비정상적인 딸세포를 낳고, 이 딸세포들 역시 돌연변이를 일으켜 유전적으로 다양한 암세포의 덩어리를 형성한다."는 것이다. 그러나 최근 이 모델을 반박하는 암줄기세포(cancer stem cell 또는 tumor initiating cell)설이 주목을 받고 있다. 암줄기세포설의 요체는 인체를 구성하는 장기에는 각기 고유한 성체 줄기세포가 있어서, 장기가 손상을 받을 때 장기를 재생하고 유지하는 역할을 하듯이, 암 조직에도 일반 장기처럼 암 조직을 유지하는 구실을 하는 암줄기세포가 존재하며, 이것이 암의 최초 시작에 관여할 것으로 추측되고 있을 뿐 아니라, 암 치료 후 줄어든 암세포를 재생하는 데 관여함으로써 암의 재발이나 전이 및 항암치료 내성 유발에 깊은 영향을 미친다는 것이다. 따라서 암을 근본적으로 치료하기 위해서는, 기존의 암 치료와 같이 암 조직의 대부분을 차지하는 일반 암세포만을 표적으로 삼는 것도 중요하지만, 암 조직의 극히 일부만 차지하면서도 암의 발병과 유지, 재발에 핵심 구실을 하는 암줄기세포에 초점을 맞춰야 한다. 최근에, 실제로 유방암, 뇌종양, 전립선암, 간암 및 췌장암 등의 몇몇 악성 종양 내에 암줄기세포의 존재가 보고 및 확인되었다. 췌장관 선암종은 실질적으로 치료-저항성이 있는 대단히 공격적인 악성종양으로 알려져 있다. 따라서, 암줄기세포에 대한 더 많은 이해는 조기 진단을 위한 진단용 마커 개발뿐만 아니라, 화학-방사선 저항성 췌장암을 치료하는 데에도 도움이 될 것이다. A long-established model of cancer development has been clonal evolution, in which "the tumors are mutated by normal cells, resulting in abnormal daughter cells, which also mutate, forming a mass of genetically diverse cancer cells." will be. Recently, however, attention has been drawn to cancer stem cells or tumor initiating cells that refute this model. The main stem of the cancer stem cell theory is that the organs that make up the human body have their own adult stem cells, which play a role in regenerating and maintaining organs when they are damaged. Cancer stem cells, which are believed to be involved in the initial onset of cancer, are also involved in regenerating cancer cells that have diminished after cancer treatment, and have a profound effect on cancer recurrence, metastasis and induction of chemotherapy resistance. will be. Therefore, in order to fundamentally treat cancer, it is important to target only general cancer cells, which occupy most of the cancer tissues as in conventional cancer treatments, but it plays a key role in the development, maintenance, and recurrence of cancers while occupying only a small portion of cancer tissues. Focus on cancer stem cells. Recently, the presence of cancer stem cells in several malignant tumors such as breast cancer, brain tumor, prostate cancer, liver cancer and pancreatic cancer has been reported and confirmed. Pancreatic adenocarcinoma is known as a highly aggressive malignant tumor that is substantially treatment-resistant. Thus, a greater understanding of cancer stem cells will help to develop diagnostic markers for early diagnosis, as well as to treat chemo-radiation-resistant pancreatic cancer.
마이크로 RNA(micro RNA 또는 miRNA)는 발생, 분화, 증식, 보존 및 아폽토시스 등 다양한 생물학적 과정을 조절한다. 마이크로 RNA는 일반적으로 타겟 mRNA를 불안정하게 하거나, 번역을 방해함으로써 타겟 mRNA를 코딩하는 유전자의 발현을 조절한다. 최근 들어, miRNA와 암줄기세포의 관련성에 관한 증거가 보고되었다. let-7, mir-200 및 mir-181을 포함하는 몇몇 miRNA는 다양한 기관의 암줄기세포 내에서 조절기능을 갖는다. 그러나, 췌장암을 포함하는 다른 암 내 miRNA는 아직 보고된 바 없다.
Micro RNA (micro RNA or miRNA) regulates a variety of biological processes, including development, differentiation, proliferation, conservation and apoptosis. MicroRNAs generally regulate the expression of the gene encoding the target mRNA by destabilizing the target mRNA or disrupting translation. Recently, evidence has been reported regarding the relationship between miRNAs and cancer stem cells. Some miRNAs, including let-7, mir-200 and mir-181, have regulatory functions in cancer stem cells of various organs. However, miRNAs in other cancers, including pancreatic cancer, have not been reported yet.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
Numerous papers and patent documents are referenced and cited throughout this specification. The disclosures of the cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety to better understand the state of the art to which the present invention pertains and the content of the present invention.
본 발명자들은 췌장암의 재발을 방지하고 췌장암을 근본적으로 치료하기 위하여 췌장암줄기세포를 타겟으로 하는 신규 암치료제 개발을 위해 예의 연구 노력해 왔다. 그 결과 췌장암줄기세포에서 특이적으로 다르게 발현하는 36가지의 마이크로 RNA를 동정하고 이들의 레벨을 조절하여 췌장암줄기세포를 억제 및 사멸시킬 수 있음을 밝혀냄으로써, 본 발명을 완성하게 되었다. The present inventors have made intensive research efforts to develop novel cancer therapeutics targeting pancreatic cancer stem cells in order to prevent recurrence of pancreatic cancer and to fundamentally treat pancreatic cancer. As a result, the present invention was completed by identifying 36 microRNAs specifically expressed in pancreatic cancer stem cells and controlling their levels to inhibit and kill pancreatic cancer stem cells.
따라서, 본 발명의 목적은 췌장암줄기세포에서 특이적으로 다르게 발현하는 췌장암 치료용 마이크로 RNA를 제공하는 데 있다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a microRNA for the treatment of pancreatic cancer, which is expressed differently in pancreatic cancer stem cells.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 마이크로 RNA를 이용한 췌장암 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for treating pancreatic cancer using the microRNA.
본 발명의 또 다른 목적은 암줄기세포를 가지는 췌장암 진단 마커를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide a method for detecting a pancreatic cancer diagnostic marker having cancer stem cells.
본 발명의 또 다른 목적은 췌장암 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide a method for screening a pancreatic cancer therapeutic agent.
본 발명의 또 다른 목적은 췌장암 치료시 항암치료 내성 극복의 방법을 제공하는 것이다.
It is another object of the present invention to provide a method for overcoming chemotherapy tolerance in the treatment of pancreatic cancer.
본 발명의 또 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 서열목록 제1서열 내지 제22서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 마이크로 RNA 또는 그의 단편의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 췌장암 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
According to an aspect of the present invention, the present invention provides a pharmaceutical composition comprising (a) a pharmaceutically effective amount of a microRNA or a fragment thereof consisting of a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to 22; And (b) provides a pharmaceutical composition for the treatment of pancreatic cancer comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
본 발명자들은 췌장암의 재발을 방지하고 췌장암을 근본적으로 치료하기 위하여 췌장암 암줄기세포를 타겟으로 하는 신규 암치료제 개발을 위해 예의 연구 노력해 왔다. 그 결과 췌장암 암줄기세포에서 특이적으로 다르게 발현하는 36가지의 마이크로 RNA를 동정하고 이들의 레벨을 조절하여 췌장암줄기세포를 억제 및 사멸시킬 수 있음을 밝혀냄으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventors have made diligent research efforts to develop novel cancer therapeutics targeting pancreatic cancer stem cells in order to prevent recurrence of pancreatic cancer and to fundamentally treat pancreatic cancer. As a result, the present invention was completed by identifying 36 kinds of micro RNAs specifically expressed in pancreatic cancer stem cells and controlling their levels to inhibit and kill pancreatic cancer stem cells.
본 발명의 서열목록 제1서열은 마이크로 RNA인 hsa-miR-448, 제2서열은 hsa-miR-154*, 제3서열은 hsa-miR-424, 제4서열은 hsa-miR-155, 제5서열은 hsa-miR-575, 제6서열은 hsa-miR-512-3p, 제7서열은 hsa-miR-29a, 제8서열은 hsa-miR-29b, 제9서열은 hsa-miR-19a, 제10서열은 hsa-miR-106a, 제11서열은 hsa-miR-517b , 제12서열은 hsa-miR-302d , 제13서열은 hsa-miR-645 , 제14서열은 hsa-miR-99a , 제15서열은 hsa-miR-518e, 제16서열은 hsa-miR-125b, 제17서열은 hsa-miR-100, 제18서열은 hsa-miR-599, 제19서열은 hsa-miR-625, 제20서열은 hsa-miR-497, 제21서열은 hsa-miR-15b, 그리고 제22서열은 hsa-miR-195의 뉴클레오타이드 서열이다.The first sequence is hsa-miR-448, the second sequence is hsa-miR-154 *, the third sequence is hsa-miR-424, the fourth sequence is hsa-miR-155, and 5 is hsa-miR-575, 6 is hsa-miR-512-3p, 7 is hsa-miR-29a, 8 is hsa-miR-29b, 9 is hsa-miR-19a , Hsa-miR-106a for the tenth sequence, hsa-miR-517b for the eleventh sequence, hsa-miR-302d for the twelfth sequence, hsa-miR-645 for the thirteenth sequence, and hsa-miR-99a for the fourteenth sequence , Sequence 15 hsa-miR-518e, sequence 16 hsa-miR-125b, sequence 17 hsa-miR-100, sequence 18 hsa-miR-599, sequence 19 hsa-miR-625 , The 20th sequence is hsa-miR-497, the 21st sequence is hsa-miR-15b, and the 22nd sequence is the nucleotide sequence of hsa-miR-195.
상기 서열목록 제1서열 내지 제22서열에 해당하는 마이크로 RNA는 췌장암줄기세포 내에서 특이적으로 발현이 감소하는 특성을 나타내며, 이들 마이크로 RNA를 췌장암줄기세포에 주입하는 경우 췌장암줄기세포의 억제 및 사멸을 유도한다. 즉 본 발명의 췌장암 치료용 조성물은 췌장암줄기세포의 성장억제, 분화억제 또는 사멸을 유도하는 것을 특징으로 한다. 또한, 본 발명의 췌장암 치료용 조성물은 췌장암 줄기세포를 그 타겟으로 하여 췌장암의 근본적 치료를 가능하게 하므로 화학항암요법 내성 극복 또는 방사선 치료 내성극복을 위해 효과적으로 사용될 수 있다.The microRNAs corresponding to the first to twenty-second sequences of the sequence list exhibit specific characteristics of reduced expression in pancreatic cancer stem cells, and when the microRNAs are injected into pancreatic cancer stem cells, the pancreatic cancer stem cells are suppressed and killed. Induce. That is, the composition for treating pancreatic cancer of the present invention is characterized by inducing growth inhibition, differentiation inhibition or death of pancreatic cancer stem cells. In addition, the pancreatic cancer treatment composition of the present invention can be effectively used to overcome chemotherapy resistance or overcome radiotherapy resistance because the pancreatic cancer stem cells to target the pancreatic cancer can be treated fundamentally.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 상기 마이크로 RNA 자체를 포함할 수도 있으나 그의 단편을 포함할 수도 있으며, 상기 마이크로 RNA의 단편은 상기 마이크로 RNA의 종자서열(seed sequence)을 포함하는 폴리뉴클레오타이드인 것을 특징으로한다. In one embodiment, the composition of the present invention may include the microRNA itself, but may include a fragment thereof, wherein the fragment of the microRNA is a polynucleotide comprising a seed sequence of the microRNA. To be characterized.
본 명세서에 사용되는 용어 “종자서열(seed sequence)”은 마이크로 RNA가 타겟을 인식할 때 완전한 상보성을 가지고 결합하는 miRNA 내 일부 영역의 뉴클레오타이드 서열을 의미하며, 이는 miRNA가 타겟에 결합하기 위해 필수적으로 요구되는 부분이다.As used herein, the term “seed sequence” refers to the nucleotide sequence of some region in the miRNA that binds with complete complementarity when the microRNA recognizes the target, which is essential for the miRNA to bind to the target. Is required.
용어, “약제학적 유효량”은 췌장암줄기세포의 성장억제, 분화억제 또는 사멸을 적절히 유도하여 상기 췌장암 치료제의 약리학적 효과를 나타내는 데 필요한 양을 의미한다.The term “pharmaceutical effective amount” means an amount necessary to adequately induce growth inhibition, differentiation inhibition or death of pancreatic cancer stem cells to exhibit the pharmacological effect of the pancreatic cancer therapeutic agent.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical compositions of the present invention are those commonly used in the preparation, such as lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, Calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and the like It doesn't happen. The pharmaceutical composition of the present invention may further contain a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, etc. in addition to the above components. Suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations include, but are not limited to, Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally. In the case of parenteral administration, the composition can be administered by intravenous injection, subcutaneous injection, muscle injection, intraperitoneal injection, transdermal administration, or the like.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001 ㎍/kg-100 mg/kg(체중)이다.The appropriate dosage of the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on factors such as the formulation method, administration method, age, body weight, sex, pathological condition, food, administration time, administration route, excretion rate, . On the other hand, the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is preferably 0.001 μg / kg-100 mg / kg body weight per day.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
The pharmaceutical composition of the present invention may be formulated into a unit dose form by formulating it using a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to a method which can be easily carried out by a person having ordinary skill in the art to which the present invention belongs. Or by intrusion into a multi-dose container. The formulations may be in the form of solutions, suspensions or emulsions in oils or aqueous media, or in the form of excipients, powders, granules, tablets or capsules, and may additionally contain dispersing or stabilizing agents.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 서열목록 제23서열 내지 제36서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 마이크로 RNA에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 단편의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 췌장암 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a pharmaceutical composition comprising (a) a pharmaceutically effective amount of an oligonucleotide or fragment thereof complementary to a microRNA consisting of a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 23-36; And (b) provides a pharmaceutical composition for the treatment of pancreatic cancer comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
본 발명의 서열목록 제23서열 내지 제36서열의 miRNA와 관련있는 췌장암 치료용 약제학적 조성물은 역시 서열목록 제1서열 내지 제22서열의 miRNA와 관련되는 췌장암 치료용 약제학적 조성물과 마찬가지로, 췌장암 암줄기세포에서 특이적으로 다르게 발현하는 miRNA를 조절하여 췌장암 암줄기세포를 억제 또는 사멸시키는 것을 목적으로 하는 것이므로, 이 둘 사이에 공통된 내용은 반복 기재에 따른 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.The pharmaceutical composition for treating pancreatic cancer associated with the miRNAs of SEQ ID NOs 23 to 36 of the present invention is similar to the pharmaceutical composition for treating pancreatic cancer associated with miRNAs of
본 발명의 서열목록 제23서열은 hsa-miR-498, 제24서열은 hsa-miR-551a, 제25서열은 hsa-miR-485-3p, 제26서열은 hsa-miR-373*, 제27서열은 hsa-miR-429, 제28서열은 hsa-miR-630, 제29서열은 hsa-miR-192, 제30서열은 hsa-miR-142-3p, 제31서열은 hsa-miR-549, 제32서열은 hsa-miR-559, 제33서열은 hsa-miR-384, 제34서열은 hsa-miR-641, 제35서열은 hsa-miR-489 그리고 제36서열은 hsa-miR-526b*의 뉴클레오타이드 서열이다. SEQ ID NO: 23 sequence of the present invention is hsa-miR-498, 24 is the hsa-miR-551a, 25 is the hsa-miR-485-3p, 26 is hsa-miR-373 *, 27 Sequence hsa-miR-429, Sequence 28 hsa-miR-630, Sequence 29 hsa-miR-192,
상기 서열목록 제23서열 내지 제36서열에 해당하는 마이크로 RNA는 췌장암 암줄기세포 내에서 특이적으로 발현이 증가하는 특성을 나타낸다. 이들 miRNA를 억제할 수 있는 물질 예컨대 상기 miRNA에 상보적인 올리고뉴클레오타이드로서 상기 miRNA에 특이적으로 혼성화되는 프라이머, 프로브 또는 안타고미어(antagomir)를 췌장암 암줄기세포에 주입하는 경우 췌장암 암줄기세포의 억제 및 사멸을 유도한다. 즉 본 발명의 췌장암 치료용 조성물은 췌장암 암줄기세포의 성장억제, 분화억제 또는 사멸을 유도하는 것을 특징으로 한다. The microRNAs corresponding to SEQ ID NO: 23 to 36 shows a characteristic of increasing expression specifically in pancreatic cancer stem cells. Inhibiting pancreatic cancer stem cells in the case of injecting pancreatic cancer stem cells with a substance capable of inhibiting these miRNAs such as oligonucleotides complementary to the miRNA, such as primers, probes, or antagomirs that hybridize specifically to the miRNAs. Induce. That is, the composition for treating pancreatic cancer of the present invention is characterized by inducing growth inhibition, differentiation inhibition or death of pancreatic cancer stem cells.
본 발명에서 상기 miRNA에 상보적인 올리고뉴클레오타이드, 즉 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 다양한 분자를 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 DNA 또는 RNA 분자이며, 보다 바람직하게는 RNA 분자이다. 선택적으로 , 본 발명에서 이용되는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드(RNA), 디옥시리보뉴클레오타이드(DNA), 2‘-O-변형 올리고뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트-백본 디옥시리보뉴클레오타이드, PNA(peptide nucleic acid) 또는 LNA(locked nucleic acid)이다. 2‘-O-변형 올리고뉴클레오타이드는 바람직하게는 2’-O-알킬 올리고뉴클레오타이드이고, 보다 바람직하게는 2’-O-C1 -3 알킬 올리고뉴클레오타이드이며, 가장 바람직하게는 2’-O-C1 -3 메틸 올리고뉴클레오타이드이다.In the present invention, oligonucleotides complementary to the miRNA, ie antisense oligonucleotides comprise various molecules. Antisense oligonucleotides are DNA or RNA molecules, more preferably RNA molecules. Optionally, the antisense oligonucleotides used in the present invention include ribonucleotides (RNA), deoxyribonucleotides (DNA), 2'-0-modified oligonucleotides, phosphorothioate-backbone deoxyribonucleotides, peptide nucleic acid (PNA) or LNA. (locked nucleic acid). 2'-O- modified oligonucleotides are preferably 2'-O- alkyl oligonucleotide, more preferably 2'-OC 1 -3 and oligo-alkyl nucleotides, most preferably 2'-OC 1 -3-methyl Oligonucleotides.
상술한 바와 같이, 본 발명에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열목록 제23서열 내지 제36서열에 해당하는 마이크로 RNA에 상보적인 서열을 가지는 핵산-기반 억제제를 포함하는 포괄적인 의미를 갖는다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 포함되는 것은, 예를 들어 좁은 의미의 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 안타고미어 및 억제 RNA 분자를 포함한다.As described above, the antisense oligonucleotide in the present invention has a comprehensive meaning including a nucleic acid-based inhibitor having a sequence complementary to the microRNA corresponding to SEQ ID NO: 23-36. Included in the antisense oligonucleotides of the present invention include, for example, antisense oligonucleotides, antagonists and inhibitory RNA molecules in a narrow sense.
용어 “안타고미어는 내성적 miRNA를 사일런싱하기 위해 디자인된 올리고뉴클레오타이드를 의미하며, 분해를 방지하기 위하여 변형된 형태로서 사용될 수 있다. 안타고미어는 단일-가닥 화학적-변형 리보뉴클레오타이드로서 서열목록 제23서열 내지 제36서열에 해당하는 마이크로 RNA에 적어도 부분적으로 바람직하게는 완전하게 상보적인 서열을 갖는다. 안타고미어는 하나 또는 그 이상의 변형 뉴클레오타이드(예컨대, 2'-O-메틸-당 변형)를 포함한다. 어떤 구현예에 따르면, 안타고미어는 변형 뉴클레오타이드만을 포함한다. 안타고미어는 하나 또는 그 이상의 포스포로티오에이트 결합을 포함하며 이에 부분적으로 또는 완전히 포스포로티오에이트 백본을 갖게 된다. 인 비보 운반 및 안정성을 개선하기 위하여, 안타고미어는 그의 3‘-말단에 콜레스테롤 또는 다른 부위를 결합시킬 수 있다. The term “antagonist” refers to oligonucleotides designed for silencing resistant miRNAs and can be used as modified forms to prevent degradation. The antagonists are single-stranded chemically-modified ribonucleotides having at least partially preferably completely complementary sequences to the microRNAs corresponding to SEQ ID NOs: 23-36. Antagonists include one or more modified nucleotides (eg, 2′-O-methyl-sugar modifications). According to certain embodiments, the antagonist comprises only modified nucleotides. Antagonists include one or more phosphorothioate linkages and have a partially or completely phosphorothioate backbone. To improve in vivo transport and stability, antagonists may bind cholesterol or other sites at their 3′-end.
서열목록 제23서열 내지 제36서열에 해당하는 마이크로 RNA 기능의 억제는 전형적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 투여하여 달성될 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드 또는 디옥시리보뉴클레오타이드이다. 바람직하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나의 화학적 변형을 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 하나 또는 그 이상의 LNAs(Locked nucleic acids)를 포함할 수 있다. LNA는 변형 리보뉴클레오타이드로서 리보오스 당 부위의 2‘ 내지 4’ 탄소 사이에 추가적인 브리지를 포함하여 잠금(locked) 형태를 가지게 되며 이에 LNA가 있는 올리고뉴클레오타이드는 개선된 열 안정성을 가지게 된다. 택일적으로, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 PNAs(peptide nucleic acids)를 포함할 수 있으며, 이는 당-포스페이트 백본 대신에 펩타이드-기반 백본을 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 포함할 수 있는 다른 화학적 변형은, 2'-O-알킬(예컨대, 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸), 2'-플루오로 및 4'-티오 변형과 같은 당 변형; 포스포로티오에이트, 모포리노 또는 포스포노카복실레이트 결합과 같은 백본 변형(예컨대, 미국 특허 제6,693,187호 및 제7,067,641호)을 포함한다. Inhibition of micro RNA function corresponding to SEQ ID NO: 23-36 can be achieved by administering a typical antisense oligonucleotide. Antisense oligonucleotides are ribonucleotides or deoxyribonucleotides. Preferably, the antisense oligonucleotides comprise at least one chemical modification. Antisense oligonucleotides may comprise one or more locked nucleic acids (LNAs). LNAs are modified ribonucleotides that have a locked form, including additional bridges between the 2 'to 4' carbons of the ribose sugar moiety, so that the oligonucleotides with LNA have improved thermal stability. Alternatively, antisense oligonucleotides may comprise peptide nucleic acids (PNAs), which include peptide-based backbones instead of sugar-phosphate backbones. Other chemical modifications that antisense oligonucleotides may include include 2'-0-alkyl (eg, 2'-0-methyl, 2'-0-methoxyethyl), 2'-fluoro and 4'-thio modifications. Sugar modifications such as; Backbone modifications such as phosphorothioate, morpholino or phosphonocarboxylate linkages (eg, US Pat. Nos. 6,693,187 and 7,067,641).
서열목록 제23서열 내지 제36서열에 해당하는 마이크로 RNA의 기능을 억제하는 다른 접근 방식은 억제 RNA 분자를 투여하는 것이며, 상기 억제 RNA 분자는 서열목록 제23서열 내지 제36서열에 해당하는 마이크로 RNA의 성숙 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 이러한 억제 RNA 분자는 이중가닥 siRNA(small interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA) 및 라이보자임을 포함한다.Another approach to inhibit the function of the microRNA corresponding to SEQ ID NO: 23 to 36 is to administer the inhibitory RNA molecule, the inhibitory RNA molecule is the micro RNA corresponding to SEQ ID NO: 23 to 36 It includes a sequence complementary to the mature sequence of. Such inhibitory RNA molecules include small interfering RNA (siRNA), short hairpin RNA (shRNA) and ribozymes.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 상기 마이크로 RNA에 상보적인 폴리뉴클레오타이드 자체를 포함할 수도 있으나 그의 단편을 포함할 수도 있으며, 상기 단편은 특히 miRNA의 종자서열(seed sequence)을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 영역에 결합할 수 있는 것이 바람직하다. In one embodiment, the composition of the present invention may comprise a polynucleotide itself which is complementary to the microRNA, but may also comprise a fragment thereof, which fragment particularly comprises a polynucleotide region comprising a seed sequence of miRNA. It is desirable to be able to bind to.
본 발명에서 규명한 상기 36가지의 miRNA는 췌장암 암줄기세포에서 특이적으로 발현이 감소하거나 또는 증가하는 것으로서, 췌장암 암줄기세포의 특성을 규정짓는 하나의 특징이라 할 것이다. 상기 36가지의 miRNA는 췌장암 암줄기세포 존재를 확인 하는 것뿐만 아니라, 췌장암의 암줄기세포의 진단 및 췌장암의 예후 판단을 위해서도 사용될 수 있다.The 36 miRNAs identified in the present invention, which are specifically reduced or increased in pancreatic cancer stem cells, will be one feature that defines the characteristics of pancreatic cancer stem cells. The 36 miRNAs can be used not only to confirm the presence of pancreatic cancer stem cells, but also to diagnose cancer stem cells of pancreatic cancer and to determine the prognosis of pancreatic cancer.
또한, 췌장암 암줄기세포에서 다르게 발현하는 상기 36가지의 miRNA의 조절은 위에서 상세히 설명한 바와 같이 췌장암 치료에 이용될 수 있다. 특히 어떤 특정 암줄기세포 유전자를 차단하여도 암을 실질적으로 성장 억제를 하기가 쉽지 않은 현실에서, 마이크로 RNA가 여러 분자들을 조절한다는 점을 고려한다면, 췌장암 암줄기세포에서 특이적으로 발현하는 상기 마이크로 RNA를 조절하는 것은 암줄기세포를 공략하기 위한 매우 현실적인 방법일 수 있다. 그 뿐만 아니라, 상기 방법은 항암제 내성 또는 방사선 치료 내성 극복을 위해 사용될 수 있다는 점에서도 그 가치가 크다고 할 것이다.
In addition, the regulation of the 36 miRNAs that are differently expressed in pancreatic cancer stem cells can be used to treat pancreatic cancer as described in detail above. In particular, in the reality that it is not easy to substantially inhibit cancer growth by blocking certain cancer stem cell genes, considering that the micro RNA regulates several molecules, the micro RNA specifically expressed in pancreatic cancer stem cells Regulating can be a very realistic way to target cancer stem cells. In addition, the method is of great value in that it can be used to overcome anticancer drug resistance or radiation therapy resistance.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 암줄기세포를 가지는 췌장암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 인간의 췌장 세포 시료에 있는 서열목록 제1서열 내지 제36서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드의 발현 수준을 측정하는 방법을 통해 암줄기세포로를 가지는 췌장암 진단 마커를 검출하는 방법을 제공한다.According to another aspect of the invention, the present invention provides an expression of a nucleotide selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to 36 in the pancreatic cell sample of human in order to provide information necessary for the diagnosis of pancreatic cancer having cancer stem cells The present invention provides a method for detecting pancreatic cancer diagnostic markers having cancer stem cells through a method of measuring levels.
상기 서열목록 제1서열 내지 제36서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드의 발현 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있으며, 예컨대 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, RNase 보호 분석법(RNase protection assay), 노던블롯팅(Nothern blotting), DNA 칩 등이 있으나 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.As an analytical method for measuring the expression level of a nucleotide selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to 36 can be used in the art, such as RT-PCR, competitive RT-PCR, real-time RT-PCR, RNase protection assay, Northern blotting, DNA chip, etc., but are not necessarily limited thereto.
암줄기세포를 가지는 췌장암 진단 마커를 검출하는 본 발명의 방법은 인간의 췌장 세포 시료로부터 서열목록 제1서열 내지 제36서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드의 발현 수준을 측정하고, 상기 측정된 발현 수준을 정상 대조군 시료의 뉴클레오타이드 발현 수준과 비교하는 방법으로 수행된다. The method of the present invention for detecting pancreatic cancer diagnostic markers having cancer stem cells measures expression levels of nucleotides selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 36 from human pancreatic cell samples, and measures the expression level. The nucleotide expression level of the normal control sample is compared.
상기 인간의 췌장 세포 시료는 바람직하게는 췌장암 세포 시료일 수 있다. 본 발명의 암줄기세포를 가지는 췌장암 진단 마커를 검출하는 방법을 췌장암 환자의 세포 시료를 가지고 수행하는 경우, 시료를 채취한 환자의 췌장암 예후를 판단할 수 있게 된다.The human pancreatic cell sample may preferably be a pancreatic cancer cell sample. When the method for detecting a pancreatic cancer diagnostic marker having cancer stem cells of the present invention is performed with a cell sample of a pancreatic cancer patient, the pancreatic cancer prognosis of the sampled patient can be determined.
상기 정상 대조군 시료란, 암에 걸리지 않은 인간으로부터 채취한 췌장 세포, 암이 없는 정상 췌장 세포, 암줄기세포를 포함하지 않는 것으로 이미 확인된 시료로서, 예컨대 비 점착성 배양 조건 하에서 구를 형성하지 않는 등 암줄기세포를 포함하지 않는 것으로 확인된 췌장암 세포주 시료, 또는 악성이 아닌 것으로 확인된 췌장암 환자의 암 세포 시료 등을 포함하며, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 암줄기세포를 포함하지 않는 것으로 확인된 췌장암 세포주 시료 또는 악성이 아닌 것으로 확인된 췌장암 환자의 암 세포 시료일 수 있다. 상기 정상 대조군 시료 내 서열목록 제1서열 내지 제36서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드의 발현 수준도 상술한 바와 동일한 방법을 사용하여 측정할 수 있다.The normal control sample is a sample already known to contain no pancreatic cells, non-cancerous normal pancreatic cells, or cancer stem cells collected from a non-cancerous human. Examples thereof include those which do not form spheres under non- A cancer cell sample from a pancreatic cancer cell sample that has been confirmed not to contain an oocyte, or a cancer cell sample from a pancreatic cancer patient that has been confirmed not to be malignant, and the like. Preferably a cancer cell sample from a pancreatic cancer cell sample identified as not containing cancer stem cells or a pancreatic cancer patient identified as not malignant. Expression levels of nucleotides selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 36 in the normal control sample can also be measured using the same method as described above.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 발현수준 측정은 상기 뉴클레오타이드에 특이적인 프라이머를 이용하는 역전사효소 중합효소반응법을 이용하여 수행된다. 상기의 역전사효소 중합효소반응은 반응 후 전기영동하여 밴드 패턴과 밴드의 두께를 확인함으로써 상기 뉴클레오타이드의 발현 여부와 정도를 확인 가능하고 이를 대조군과 비교함으로써, 췌장암줄기세포를 간편하게 검출할 수 있다.In one embodiment of the invention, the expression level measurement is performed using a reverse transcriptase polymerase reaction method using a primer specific for the nucleotide. The reverse transcriptase polymerase reaction can confirm the expression and extent of the nucleotides by confirming the band pattern and the thickness of the band by electrophoresis after the reaction, and by comparing this with the control, pancreatic cancer stem cells can be easily detected.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 발현수준 측정은 DNA 칩을 이용하여 수행된다. 상기 DNA 칩은 상기 제1서열 내지 제36서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 또는 그 단편에 해당하는 핵산이 유리 같은 기판에 고밀도로 부착되어 있는 DNA 칩을 이용하는 것으로서, 시료에서 총RNA를 분리하고, 그 말단 또는 내부를 형광 물질로 표지된 cDNA 프로브를 조제하여, DNA 칩에 혼성화시킨 다음 췌장암줄기세포 포함여부를 간단하게 판독할 수 있다. In another embodiment of the present invention, the expression level measurement is performed using a DNA chip. The DNA chip uses a DNA chip in which a nucleic acid corresponding to a nucleotide or a fragment thereof selected from the group consisting of the first to 36th sequences is densely attached to a glass-like substrate, and separates total RNA from a sample. CDNA probe labeled at the end or the inside with a fluorescent material is prepared, hybridized to a DNA chip, and then read simply to include pancreatic cancer stem cells.
상기 검출 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 miRNA 발현량과 암줄기세포 검출 대상인 췌장암 환자에서의 miRNA 발현량을 비교할 수 있으며, 상기 발현량의 유의한 변화 여부를 판단하여 췌장암 환자 시료 내 암줄기세포 포함여부를 진단할 수 있다. Through the detection methods, miRNA expression in a normal control group and miRNA expression in a pancreatic cancer patient to be detected can be compared, and the cancer stem cell in the pancreatic cancer patient is diagnosed by determining whether the expression level is significantly changed. can do.
구체적으로 제1서열 내지 제22서열의 경우, 환자 시료의 상기 뉴클레오타이드 발현 수준이 정상 대조군 시료의 뉴클레오타이드 발현 수준의 70% 미만인 경우 췌장암 암줄기세포를 포함하는 것으로 판단한다. 반면, 제23서열 내지 제36서열의 경우는, 환자 시료의 상기 뉴클레오타이드 발현 수준이 정상 대조군 시료의 뉴클레오타이드 발현 수준의 150% 이상인 경우 췌장암 암줄기세포를 포함하는 것으로 판단한다.
Specifically, in the case of the first to twenty-second sequences, when the nucleotide expression level of the patient sample is less than 70% of the nucleotide expression level of the normal control sample, it is determined to include pancreatic cancer stem cells. On the other hand, in the case of the 23rd to 36th sequences, the nucleotide expression level of the patient sample is determined to include pancreatic cancer stem cells when the nucleotide expression level of the normal control sample is 150% or more.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 제1서열 내지 제22서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드를 발현하는 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 시험물질이 상기 뉴클레오타이드의 발현에 미치는 영향을 분석하는 단계를 포함하며, 상기 시험물질이 상기 뉴클레오타이드의 발현을 증가시키면 암 치료제로 판정하는 췌장암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention comprises the steps of (a) contacting a test substance to a cell expressing a nucleotide selected from the group consisting of the first sequence to the 22nd sequence; And (b) analyzing the effect of the test substance on the expression of the nucleotide, wherein the test substance increases the expression of the nucleotide and provides a screening method for the treatment of pancreatic cancer, which is determined to be a cancer treatment.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 제23서열 내지 제36서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드를 발현하는 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 시험물질이 상기 뉴클레오타이드의 발현에 미치는 영향을 분석하는 단계를 포함하며, 상기 시험물질이 상기 뉴클레오타이드의 발현을 감소시키면 암 치료제로 판정하는 췌장암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.According to another aspect of the invention, the present invention comprises the steps of (a) contacting a test substance to a cell expressing a nucleotide selected from the group consisting of SEQ ID NO: 23 to 36; And (b) analyzing the effect of the test substance on the expression of the nucleotide, wherein the test substance reduces the expression of the nucleotide, and provides a method for screening a pancreatic cancer therapeutic agent that is determined to be a cancer therapeutic agent.
본 발명자들은 상기 제1서열 내지 제22서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드의 경우, 일반 췌장 암세포와 달리 췌장암 암줄기세포 내에서 그 발현이 현저히 감소한다는 사실을 발견하였다. 마이크로 RNA인 상기 뉴클레오타이드 발현의 현저한 감소는 타겟 RNA 발현의 현저한 증가로 이어지게 된다. 일반 췌장 암세포와는 달리 췌장암 암줄기세포 내에서만 타겟 RNA 발현이 특이적으로 현저하게 증가한다는 것은 그것이 코딩하고 있는 단백질이 암줄기세포의 생존에 있어 필수적인 요소임을 지시하며, 이의 발현을 차단하는 물질은 암줄기세포의 성장 억제 및 사멸을 유도함으로써 췌장암의 근본적 치료에 도움이 되는 물질, 즉 췌장암 치료제로 판정된다.The present inventors found that the nucleotides selected from the group consisting of the first to twenty-second sequences significantly reduced their expression in pancreatic cancer stem cells, unlike general pancreatic cancer cells. Significant decreases in the expression of the nucleotides, which are micro RNAs, lead to significant increases in target RNA expression. Unlike general pancreatic cancer cells, the specific remarkable increase in target RNA expression only in pancreatic cancer stem cells indicates that the protein it encodes is essential for the survival of cancer stem cells. It is judged to be a substance that helps in the fundamental treatment of pancreatic cancer, that is, a pancreatic cancer therapeutic agent, by inducing growth inhibition and death.
반면, 상기 제23서열 내지 제36서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드는, 일반 췌장 암세포와 달리 췌장암 암줄기세포 내에서만 그 발현이 특이적으로 현저히 증가하는 뉴클레오타이드로서, 동일한 원리에 의하여 시험물질이 상기 뉴클레오타이드의 발현을 감소시키면 암 치료제로 판정된다.On the other hand, the nucleotide selected from the group consisting of the 23rd to 36th sequence, unlike the general pancreatic cancer cells, nucleotides whose expression is significantly increased only in pancreatic cancer stem cells, the test material is the nucleotide according to the same principle Reducing the expression of is considered a cancer treatment.
상기 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 동정되는 췌장암 치료제는 암 조직의 대부분을 차지하는 일반 암세포만를 타겟으로 하는 것이 아니라, 암 조직의 극히 일부만 차지하면서도 암의 발병과 유지, 재발에 핵심 구실을 하는 췌장암 암줄기세포를 그 타겟으로 하므로, 췌장암의 근본적인 치료를 가능하게 한다. 특히 어떤 특정 암줄기세포 유전자를 차단하여도 암을 실질적으로 성장 억제를 하기가 쉽지 않은 현실에서, 마이크로 RNA가 여러 분자들을 조절한다는 점을 고려한다면, 췌장암 암줄기세포에서 특이적으로 발현하는 상기 마이크로 RNA를 조절하는 것은 암줄기세포를 공략하기 위한 매우 현실적인 방법이라 할 것이다. 또한, 상기 방법은 항암제 내성 또는 방사선 치료 내성 극복을 위해 사용될 수 있다는 점에서도 그 가치가 크다고 할 것이다.
The pancreatic cancer therapeutic agent identified by the screening method of the present invention does not target only general cancer cells, which occupy most of the cancer tissue, but occupies only a small portion of the cancer tissue, but plays a key role in the development, maintenance, and recurrence of cancer. Since the target of the, it is possible to fundamental treatment of pancreatic cancer. In particular, in the reality that it is not easy to substantially inhibit cancer growth by blocking certain cancer stem cell genes, considering that the micro RNA regulates several molecules, the micro RNA specifically expressed in pancreatic cancer stem cells Regulating is a very realistic way to target cancer stem cells. In addition, the method is of great value in that it can be used for overcoming chemotherapy or radiation therapy resistance.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:The features and advantages of the present invention are summarized as follows:
(ⅰ) 본 발명은 췌장암 치료용 약제학적 조성물, 이를 이용한 췌장암 진단 및 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.(Iii) The present invention provides a pharmaceutical composition for treating pancreatic cancer, and a method for screening and diagnosing pancreatic cancer using the same.
(ⅱ) 본 발명의 췌장암 치료용 약제학적 조성물은 췌장암 암줄기세포의 억제 또는 사멸을 효과적으로 유도하므로 췌장암의 전이를 예방하고 항암치료 내성을 극복하여 췌장암을 근본적으로 치료할 수 있는 장점이 있다.(Ii) Since the pharmaceutical composition for treating pancreatic cancer of the present invention effectively induces suppression or killing of pancreatic cancer stem cells, pancreatic cancer can be prevented from metastasis and the anticancer resistance can be overcome to fundamentally treat pancreatic cancer.
(ⅲ) 또한, 본 발명의 췌장암 치료용 약제학적 조성물은 mRNA를 직접적인 타겟으로 하는 것이 아니라, mRNA 레벨을 조절할 수 있는 miRNA 조절을 통해 질병을 치료하므로 안전하다.
(Iii) In addition, the pharmaceutical composition for treating pancreatic cancer of the present invention is safe because it does not target mRNA directly, but treats the disease through miRNA regulation that can regulate mRNA levels.
도 1은 인간의 정상 세포주 및 췌장암 세포주를 대상으로 구형 형성 실험을 수행한 결과를 나타낸 것이다. 진한 테두리로 표시한 4개의 세포주(Capan-1, Capan-2, HPAC 및 hYGIC6)가 스피어를 형성한 것을 확인 할 수 있다.
도 2는 Capan-1, HPAC 및 hYGIC6의 구 및 부착배양세포 간에 miRNA 발현 패턴 관계를 계급모양 클러스터링을 사용하여 분석한 결과이다. YS는 hYGIC6 sphere, YA는 hYGIC6 adherent, CS는 Capan-1 sphere, CA는 Capan-1 adherent, HS는 HPAC sphere, HA는 HPAC adherent를 나타낸다.
도 3은 표 1의 다르게 발현하는 36개의 miRNA 중 6개의 miRNA를 선정하여, Capan-1, Capan-2, HPAC 및 hYGIC6 세포주에 대하여 qRT-PCR을 수행한 결과이다.
도 4는 다르게 발현된 mRNA와 다르게 발현된 miRNA의 상관관계를 나타내는 교차 상관관계 히트 맵이다. 높은 상관관계는 및 낮은 상관관계는 각각 적색 및 녹색으로 표시하였다.
도 5는 췌장암줄기세포에서 특이적으로 발현량이 감소되는 mir-99a, mir-106a 및 mir-125b의 과발현이 췌장암줄기세포 구 형성능력에 미치는 영향을 분석한 결과이다. scramble은 비교군이고, anti99a는 mir-99a의 antagomir이다.
도 6은 mir-99a, mir-106a 및 mir-125b의 과발현에 의한 췌장암줄기세포의 항암제 민감성 변화를 분석한 결과이다.
도 7은 mir-99a, mir-106a 및 mir-125b의 과발현에 의한 췌장암줄기세포의 방사선 민감성 변화를 분석(MTT 분석)한 결과이다.
도 8은 mir-99a, mir-106a 및 mir-125b의 과발현에 의한 췌장암줄기세포의 방사선 민감성 변화를 분석(콜로니 형성능 분석)한 결과이다.Figure 1 shows the results of the spherical formation experiments on human normal and pancreatic cancer cell line. Four cell lines (Capan-1, Capan-2, HPAC, and hYGIC6) indicated by dark borders can be seen to form a sphere.
Figure 2 shows the results of analyzing the miRNA expression pattern relationship between the sphere and adherent culture cells of Capan-1, HPAC and hYGIC6 using class clustering. YS is hYGIC6 sphere, YA is hYGIC6 adherent, CS is Capan-1 sphere, CA is Capan-1 adherent, HS is HPAC sphere, HA is HPAC adherent.
Figure 3 shows the results of performing qRT-PCR on Capan-1, Capan-2, HPAC and hYGIC6 cell lines by selecting six miRNAs from 36 differently expressed miRNAs in Table 1.
4 is a cross correlation heat map showing the correlation of differently expressed mRNAs with differently expressed miRNAs. High and low correlations are indicated in red and green, respectively.
Figure 5 is the result of analyzing the effect of overexpression of mir-99a, mir-106a and mir-125b overexpressing the pancreatic cancer stem cell specific capacity in the pancreatic cancer stem cells. scramble is the comparison group, and anti99a is the antagomir of mir-99a.
Figure 6 shows the results of analyzing the anticancer drug sensitivity change of pancreatic cancer stem cells by overexpression of mir-99a, mir-106a and mir-125b.
Figure 7 is the result of analyzing the radiation sensitivity change of pancreatic cancer stem cells by overexpression of mir-99a, mir-106a and mir-125b (MTT analysis).
8 is a result of analyzing the change in radiation sensitivity of pancreatic cancer stem cells due to overexpression of mir-99a, mir-106a and mir-125b (colony formation ability analysis).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood that both the foregoing general description and the following detailed description are exemplary and explanatory only and are not to be construed as limiting the scope of the present invention. It will be self-evident.
실시예Example
실험재료 및 방법Materials and Methods
1. 세포 배양1. Cell culture
모든 인간 췌장암 세포주를 ATCC(American Type Culture Collection; Manassas, VA)로부터 구입하고, 성장 배지에서 유지 배양하였다. 즉, AsPC-1 및 BxPC-3 세포는 10% 우태아혈청(FBS; Hyclone, Logan, UT)을 포함하는 RPMI1640(Invitrogen Gibco, Grand Island, NY)에서 배양하였고, Capan-1 및 CFPAC-1 세포는 10% FBS를 포함하는 IMDM(Invitrogen Gibco)에서 배양하였다. Capan-2 세포는 10% FBS를 포함한 맥코이 5a(Invitrogen Gibco)에서, 그리고 MIA PaCa-2 세포는 10% FBS 및 2.5% 마혈청(Hyclone)을 포함하는 DMEM(Invitrogen Gibco)에서 배양하였다. HPAC 세포는 10% FBS를 포함하는 DMEM/햄 F12(D/F12; Invitrogen Gibco)에서, 그리고 PANC-1 세포는 10% FBS를 포함하는 DMEM에서 배양하였다. 인간 췌장관 상피(HPDE) 세포는 밍 사운드 차오 박사로부터 제공받아 0.2 ng/ml EGF 및 30 ㎍/ml BPE(bovine pituitary extract, Invitrogen Gibco)를 포함하는 케라티노사이트 혈청-프리(KSF) 배지에서 배양하였다. All human pancreatic cancer cell lines were purchased from American Type Culture Collection (ATCC) Manassas, VA and were cultured in growth medium. That is, AsPC-1 and BxPC-3 cells were cultured in RPMI1640 (Invitrogen Gibco, Grand Island, NY) containing 10% fetal bovine serum (FBS; Hyclone, Logan, UT), and Capan-1 and CFPAC-1 cells Was incubated in IMDM (Invitrogen Gibco) containing 10% FBS. Capan-2 cells were cultured in McCoy 5a (Invitrogen Gibco) containing 10% FBS and MIA PaCa-2 cells in DMEM (Invitrogen Gibco) containing 10% FBS and 2.5% HPAC cells were cultured in DMEM / Ham F12 (D / F12; Invitrogen Gibco) containing 10% FBS, and PANC-1 cells in DMEM containing 10% FBS. Human pancreatic duct epithelial (HPDE) cells were supplied by Dr. Ming Sound Chao and cultured in keratinocyte serum-free (KSF) medium containing 0.2 ng / ml EGF and 30 μg / ml bovine pituitary extract (Invitrogen Gibco). It was.
SV40-T 항원으로 형질 전환한 인간 정상 췌장관 세포(hYGIC6; unpublished)는 10 % FBS를 포함한 Waymouth MB 752/1(Sigma, St. Louis, MO)에서 배양하였다.
Human normal pancreatic duct cells (hYGIC6; unpublished) transformed with SV40-T antigen were cultured in Waymouth MB 752/1 (Sigma, St. Louis, Mo.) with 10% FBS.
2. 구(sphere) 형성2. Sphere Formation
세포를 트립신 처리하고 단일 세포 현탁액을 현미경을 사용하여 확인하였다. 그 다음 PBS로 세척하고 EGF(10 ng/ml, R&D Systems Inc., Minneapolis, MN), bFGF(10 ng/ml, R&D Systems Inc.), LIF(10 ng/ml, Chemicon, Billerica, MA), 1ITS(insulin transferring selenium, Gibco) 및 0.5% FBS을 보충한 혈청 프리 D/F12 배지에 1000 세포/ml의 비율로 재현탁시켰다. 상기 세포 현탁액을 37℃, 5 % CO2 대기 환경 하에서 6-웰 울트라 로우 클러스터 플레이트(Corning Inc., Corning NY)에 7일 동안 접종하고 수집하였다. 대조군으로는 상기 구 형성 배지와 동일한 배지를 포함하는 배양 접시(Nalgene Nunc Int., Rochester, NY)에 부착시킨 부착성 배양 세포를 사용하였다.
Cells were trypsinized and single cell suspensions were identified using a microscope. Then washed with PBS, EGF (10 ng / ml, R & D Systems Inc., Minneapolis, MN), bFGF (10 ng / ml, R & D Systems Inc.), LIF (10 ng / ml, Chemicon, Billerica, MA), The cells were resuspended at a rate of 1000 cells / ml in serum-free D / F12 medium supplemented with 1ITS (insulin transferring selenium, Gibco) and 0.5% FBS. The cell suspension was inoculated and collected for 7 days in 6-well ultra low cluster plates (Corning Inc., Corning NY) under 37 ° C., 5% CO 2 atmosphere. As a control, adherent culture cells attached to a culture dish (Nalgene Nunc Int., Rochester, NY) containing the same medium as the sphere forming medium were used.
3. cDNA 마이크로어레이3. cDNA Microarray
RNaesy 미니 키트(Qiagen, Valentia, CA)를 사용하여 제조사 지시에 따라 총 RNA를 추출하였다. 총 RNA를 ND-1000 나노드롭 분광기(NanoDrop Technologies, Inc., DE)를 사용하여 정량 분석하고, Agilent 2100 생분석기(Agilent Technologies, Santa Clare, CA)에 의해 RNA 6000 나노 칩(Agilent Technologies)을 사용하여 정성 분석하였다. 마이크로어레이 실험 절차는 제조사 프로토콜에 따라 수행하였다. 디지털 제노믹스(Seoul, Korea)로 cDNA 마이크로어레이 분석을 수행하였다. 간략히 정리하면, 각각의 총 RNA 6 ㎍ 분량을 사용하여 이중사 cDNA를 준비하고, 비오틴-표지(IVT 라벨링 키트; Affymetrix)를 하여 증폭하였다. 상기 표지된 cDNA를 조각내어 Affymetrix GeneChip 인간 지놈 U133 플러스 2.0 고농도 올리고뉴클레오타이드 어레이(Affymatrix, Santa Clara, CA)에 혼성화시켰다. 그 다음 마이크로어레이를 Genechip Fluidics 스테이션 450(Affymetrix)으로 세척하고 Genechip 어레이 스캐너 3000 7G (Affymetrix)를 사용하여 스캔하였다. Affymetrix 발현 Console 소프트웨어 버전 1.1을 사용하여 발현 데이터를 생성시키고, 이를 MAS5 알고리즘 표준화하였다. raw .cel 파일 내 발현 강도 데이터는 MAS5 알고리즘으로 표준화하여 잡음을 감소시켰다. Total RNA was extracted using RNaesy mini kit (Qiagen, Valentia, CA) according to manufacturer's instructions. Total RNA was quantitated using ND-1000 nano drop spectrometer (NanoDrop Technologies, Inc., DE) and RNA 6000 nanochip (Agilent Technologies) was used by Agilent 2100 bioassay (Agilent Technologies, Santa Clare, CA) Respectively. The microarray experiment procedure was performed according to the manufacturer's protocol. CDNA microarray analysis was performed with digital genomes (Seoul, Korea). Briefly, double-stranded cDNA was prepared using 6 쨉 g of each total RNA and amplified by biotin-labeling (IVT labeling kit; Affymetrix). The labeled cDNA was fragmented and hybridized to Affymetrix GeneChip human genome U133 plus 2.0 high concentration oligonucleotide arrays (Affymatrix, Santa Clara, Calif.). Microarrays were then washed with Genechip Fluidics Station 450 (Affymetrix) and scanned using Genechip Array Scanner 3000 7G (Affymetrix). The Affymetrix Expression Console software version 1.1 was used to generate expression data and standardize the MAS5 algorithm. The intensity data in the raw .cel file was standardized by the MAS5 algorithm to reduce noise.
적어도 하나의 샘플 군 내 50%가 넘는 샘플에서, MAS5 탐지 콜에 의할 때 프레즌트 콜이 아닌 프로브 세트는 걸러내었다. 두 그룹 간에 다르게 발현하는 유전자를 결정하기 위하여 MASS 발현 값에 대하여 짝지은 t-테스트를 수행하였다. p-값이 0.05 미만인 유전자를 추출하고 1.5배가 넘는 차이를 보이는 유전자를 고려하였다. 0.01 미만의 p-값을 중요하게 고려하고 affy-패키지 2.8(Biodonductor)을 사용하여 모더레이트 t-통계를 계산하였다. 그 다음 affymatrix 프로브 ID를 Unigene ID로 변환하였다. 모든 개별적인 칩 분석은 독립적인 총 RNA 샘플에 대하여 2회 반복 수행하였다.
In over 50% of samples in at least one sample group, probe sets other than the presence call were filtered out by MAS5 detection call. Paired t-tests were performed on MASS expression values to determine genes that expressed differently between the two groups. Genes with p-values less than 0.05 were extracted and considered genes with more than 1.5-fold differences. Moderate t-statistics were calculated using affy-package 2.8 (Biodonductor) with significant p-values less than 0.01. The affymatrix probe ID was then converted to Unigene ID. All individual chip analyzes were performed twice for independent total RNA samples.
4. miRNA 칩 분석4. miRNA chip analysis
제조사 지시에 따라 mirVana miRNA 분리 키트(Ambion, Austin, TX)를 사용하여 총 RNA를 추출하였다. 총 RNA를 ND-1000 나노드롭(NanoDrop Technologies, Inc., DE)을 사용하여 정량 분석하고, 아질런트 2100 생분석기(Agilent Technologies) 및 RNA 6000 나노 칩(Agilent Technologies)을 사용하여 정성 분석하였다. miRNA 마이크로어레이 실험은 제조사 프로토콜에 따라 수행하였고, 디지털 지노믹스(Seoul)를 사용하여 miRNA 마이크로어레이 결과를 분석하였다. 즉, 37℃에서 30분 동안 각각의 총 RNA 샘플 100 ng 분량을 송아지 장 포스파타제(GE Healthcare, Piscataway, NJ)로 처리하고, 100℃에서 5분간 열 블록 하에 100% DMSO(Sigma)로 변성시키고, 그 다음 RNA가 재 어닐링 되는 것을 방지하기 위하여 얼음 수조 내로 이전시켰다. 그 다음 T4 RNA 리가아제(GE Healthcare)를 사용하여 16℃에서 2시간 동안 반응시켜 RNA 샘플을 pCp-Cy3로 표지하였다. 상기 표지된 샘플을 Agilent 인간 8X15K miRNA 마이크로어레이(Agilent Technologies)에 혼성화시켰다. 혼성화는 SureHyb 챔버(Agilent Technologies) 내 55℃에서 24시간 동안 수행하였다. 그 다음 마이크로어레이를 세척하고 Agilent 마이크로어레이 스캐너(G2505B; Agilent Technologies)를 사용하여 스캔하였다. 상기 스캔한 이미지는 www. Agilent.com/chem/feprotocols 사이트에서 miRNA 발현 분석을 위해 제공되는 프로토콜에 따라 Feature 추출 소프트웨어 9.5.3(www.agilent.com/chem/fe)을 사용하여 분석하였다. 전체 유전자 군에 대한 프로브 중요도에 적용되는 T-테스트 p-값을 가지고 0.01 미만부터 0.01까지의 세트 측정의 데이터 변형을 사용하여 평준화를 수행하였다. 독립적인 총 RNA 샘플에 대하여 모든 개별적 칩 분석을 2회 반복 수행하였다.
Total RNA was extracted using mirVana miRNA isolation kit (Ambion, Austin, TX) according to the manufacturer's instructions. Total RNA was quantitated using ND-1000 nanodrops (NanoDrop Technologies, Inc., DE) and qualitatively analyzed using an Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies) and RNA 6000 nanochips (Agilent Technologies). miRNA microarray experiments were performed according to the manufacturer's protocol and the miRNA microarray results were analyzed using Digital Genomics (Seoul). That is, 100 ng portions of each total RNA sample for 30 minutes at 37 ° C. were treated with calf intestinal phosphatase (GE Healthcare, Piscataway, NJ), denatured with 100% DMSO (Sigma) under heat block at 100 ° C. for 5 minutes, RNA was then transferred into an ice bath to prevent re-annealing. RNA samples were then labeled with pCp-Cy3 by reaction using T4 RNA ligase (GE Healthcare) for 2 hours at 16 ° C. The labeled samples were hybridized to Agilent human 8 × 15K miRNA microarrays (Agilent Technologies). Hybridization was performed for 24 hours at 55 ° C. in a SureHyb chamber (Agilent Technologies). The microarray was then washed and scanned using an Agilent microarray scanner (G2505B; Agilent Technologies). The scanned image is www. The analysis was performed using Feature extraction software 9.5.3 (www.agilent.com/chem/fe) according to the protocol provided for miRNA expression analysis at Agilent.com/chem/feprotocols. Leveling was performed using data modifications of set measurements from less than 0.01 to 0.01 with T-test p-values applied to probe importance for the entire gene group. All individual chip analyzes were performed twice for independent total RNA samples.
5. 정량적 5. Quantitative RTRT -- PCRPCR
TaqMan 역전사 키트(Applied Biosystems, Foster City, CA), TaqMan miRNA 분석기(Applied Biosystems) 및 TaqMan 유전자 발현 마스터 믹스를 사용하여 제조사 프로토콜에 따라 역전사 및 정량적 역전사 PCR(qRT-PCR)를 수행하였다. qRT-PCR는 ABI 프리즘 7300 시퀀스 탐지 시스템(Applied Biosystems)을 사용하여 수행하였고, 성숙한 miRNA 및 U6 snRNA는 Ambion로부터 구입하였다. PCR 증폭 프로그램은 95℃ 10분간의 개시단계와 95℃ 30초, 56℃ 30초 및 72℃ 15초로 이루어지는 PCR 40 사이클 단계로 구성되었다. 표준 곡선을 구하고 타겟 유전자 miRNA의 상대적인 양을 U6 snRNA에 대하여 평준화하였다. 샘플 내 상대적인 miRNA의 양은 비교 Ct 방법(△Ct구-△Ct부착배양세포=△△Ct; 상대량=2-△△ Ct)을 사용하여 계산하였고, 배수변화값(fold change)으로 전환시켰다. 모든 qRT-PCR은 독립적인 총 RNA 샘플에 대하여 3회 반복 수행하였다. Reverse transcription and quantitative reverse transcription PCR (qRT-PCR) were performed using the TaqMan reverse transcription kit (Applied Biosystems, Foster City, Calif.), TaqMan miRNA analyzer (Applied Biosystems) and TaqMan gene expression master mix according to the manufacturer's protocol. qRT-PCR was performed using ABI Prism 7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems), and mature miRNA and U6 snRNA were purchased from Ambion. The PCR amplification program consisted of a PCR amplification program consisting of a 95 ° C. 10 minute initiation step and a 95 ° C. 30 sec, 56 ° C. 30 sec, and 72 ° C. 15 sec. Standard curves were obtained and the relative amounts of target gene miRNAs were leveled against U6 snRNAs. Method sample relative amount of the miRNA compared Ct (△ Ct old - △ Ct attached culture cells = △△ Ct; relative amount = 2 - △△ Ct) was calculated by using, was converted to a multiple change value (fold change). All qRT-PCRs were repeated three times for independent total RNA samples.
6. 6. miRNAmiRNA 및 And mRNAmRNA 의 상관관계 Correlation of
문헌 [1]에 의해 기재된 분석 방법에 따라 miRNA 및 mRNA 어레이 데이터를 표준화하고 선형 모델을 사용하여 실험적 효과를 보정하였다. The miRNA and mRNA array data were normalized according to the analytical method described by [1] and a linear model was used to correct experimental effects.
각각의 miRNA 및 mRNA 로그-발현 동태는 선형 모델과 일치하였는데, 여기에서 각각의 실험 군에 대한 부가적 효과는 최소 좌승법을 사용하여 산정하였다. 본 발명자들은 복제된 실험 데이터로부터 miRNA 및 mRNA 발현의 상관관계를 바르게 산정하기 위하여 CORREP 도서관의 cor 기능을 사용하였고, 통계적 소프트웨어 R 내 gplots 도서관(http://www.r-project.org)의 heatmap.2 기능을 사용하여 히트 맵(heat map)을 작성하였다.
Each miRNA and mRNA log-expression kinetics were in agreement with a linear model, where additional effects for each experimental group were estimated using the least squares method. We used the cor function of the CORREP library to correctly correlate miRNA and mRNA expression from replicated experimental data, and we used the heatmap of the gplots library (http://www.r-project.org) in statistical software R. A heat map was created using the .2 function.
실험결과Experiment result
1. 췌장암 세포주 내 구(1. Pancreatic cancer cell line spheresphere ) 형성) formation
인간의 정상 췌장 세포주인 HPDE 및 hYGIC6와 함께, AsPC-1, BxPC-3, Capan-1, Capan-2, CFPAC-1, MIA PaCa-2, HPAC 및 PANC-1을 포함하는 다양한 인간 췌장암 세포주를 대상으로 구형 형성 실험을 수행하여, 상기 세포주들의 구 형성 능력을 평가하였다. 그 결과 Capan-1, Capan-2, HPAC 및 hYGIC6는 인 비트로에서 재생 가능한 구를 형성하였다(도 1). AsPC-1 및 HPDE는 단일 세포로서 남아있었고, 다른 세포주들은 뭉친 모양의 세포 다발을 형성하였다. 상기 형성된 구와 부착된 상태로 배양된 세포를 비교하기 위하여, 구를 형성한 상기 4개의 세포주 중 Capan-1, HPAC 및 hYGIC6를 대상으로 추가 분석을 수행하였다.
Various human pancreatic cancer cell lines including AsPC-1, BxPC-3, Capan-1, Capan-2, CFPAC-1, MIA PaCa-2, HPAC and PANC-1, together with human normal pancreatic cell lines HPDE and hYGIC6 Spherical formation experiments were performed on the subjects to evaluate the cell formation ability of the cell lines. As a result, Capan-1, Capan-2, HPAC and hYGIC6 formed spheres reproducible in vitro (FIG. 1). AsPC-1 and HPDE remained as single cells and the other cell lines formed a cluster of cell clusters. In order to compare the cells cultured in the attached state with the formed spheres, further analysis was performed on Capan-1, HPAC and hYGIC6 among the four cell lines which formed the spheres.
2. 전체적인 2. whole mRNAmRNA 발현 프로파일 Expression profile
Capan-1, HPAC 및 hYGIC6 세포의 구 및 부착배양세포 내 다르게 발현되는 유전자를 분석하기 위하여 칩 분석법을 수행하였다. 유전자 발현 프로파일을 분석하기 위하여, 본 발명자들은 Affymetrix GeneChip HG U133을 사용하였다. 상기 구를 부착배양세포와 비교한 결과 Capan-1 내 2066 유전자, HPAC 내 1684 유전자 및 hYGIC6 내 3832 유전자가 각각 다르게 발현됨을 확인하였고(p<0.05) 유전자 프로브는 단일 유전자 ID로 변환시켰다.
Chip analysis was performed to analyze differently expressed genes in sphere and adherent culture cells of Capan-1, HPAC and hYGIC6 cells. To analyze gene expression profiles, we used Affymetrix GeneChip HG U133. Comparing the spheres with adherent culture cells, the 2066 gene in Capan-1, the 1684 gene in HPAC, and the 3832 gene in hYGIC6 were differently expressed (p <0.05), and the gene probe was converted into a single gene ID.
3. 전체적인 3. whole miRNAmiRNA 발현 프로파일 Expression profile
miRNA 발현 프로파일을 분석하기 위하여, 본 발명자들은 Agilent 멀티플렉스 마이크로어레이-베이스 플랫폼을 사용하였다. 칩 상의 470개 인간 miRNA 중에서, 본 발명자들은 프레즌트 콜 유전자 프로브를 선별하여 총 210 프로브를 남기었고 이를 가지고 교차-상관관계 분석을 추가적으로 수행하였다. 수개의 miRNA들이 부착배양세포 내 발현 형태와 다른 발현 형태를 나타내었는데, Capan-1, HPAC 및 hYGIC6의 모든 세포주에서 mir-106a, mir-19a, mir-29a를 포함하는 14개의 miRNA가 다르게 발현됨을 확인 할 수 있었다. 또한, Capan1 및 HPAC 암세포주에서 mir-99a, mir-100, mir-125b을 포함하는 22개의 miRNA가 또 다른 발현 형태를 나타내었다(도 2a). 상기 구 형성 세포 내에서 다르게 발현된 총 36개의 miRNA를 하기 표 1에 정리하였다. To analyze miRNA expression profiles, we used an Agilent multiplex microarray-base platform. Among the 470 human miRNAs on the chip, we screened the present call gene probes, leaving a total of 210 probes, with which we further performed cross-correlation analysis. Several miRNAs showed different expressions from those in adherent culture cells, indicating that 14 miRNAs, including mir-106a, mir-19a and mir-29a, were expressed differently in all cell lines of Capan-1, HPAC and hYGIC6. Could confirm. In addition, 22 miRNAs including mir-99a, mir-100, mir-125b in Capan1 and HPAC cancer cell lines showed another expression form (FIG. 2A). A total of 36 miRNAs expressed differently in the sphere forming cells are summarized in Table 1 below.
상기 표에서, 암줄기세포에서 발현이 더 적게 되는 것을 서열번호 1번-22번으로, 더 많이 되는 것을 23번-36번으로 배치하였다.
In the table, less expression in cancer stem cells was arranged in SEQ ID NOs: 1-22, and more in 23-36.
Capan-1, HPAC 및 hYGIC6의 구 및 부착배양세포 간에 miRNA 발현 패턴 관계를 계급모양 클러스터링을 사용하여 분석하였다(도 2b). 상기 클러스터링 결과에 기초할 때, 암 세포주들의 구 또는 부착배양세포 내 miRNA의 전체 발현 패턴은 정상 세포주의 발현 패턴보다 더 근접한 양상을 나타내었다. 또한, 다르게 발현하는 miRNA의 패턴은 클러스터링 결과, 다른 세포 주의 구 또는 부착배양세포보다는, 동일한 세포 주 내에서 더 근접한 양상을 나타내었다. The relationship of miRNA expression pattern between sphere and adherent culture cells of Capan-1, HPAC and hYGIC6 was analyzed using rank clustering (FIG. 2B). Based on the clustering results, the overall expression pattern of miRNA in sphere or adherent culture cells of cancer cell lines showed a closer pattern than that of normal cell lines. In addition, the pattern of differently expressed miRNAs showed a closer pattern in the same cell line, as a result of clustering, than spheres or adherent cells of other cell lines.
4. 4. qRTqRT -- PCRPCR
mir-106a, mir-19a, mir-29a, mir-99a, mir-100 및 mir-125b를 포함하는 선별된 miRNA에 대한 qRT-PCR 분석을 추가적으로 수행하여, 다르게 발현하는지 여부를 확인하였다. qRT-PCR에 사용한 각각의 miRNA 프로브를 하기 표 2에 정리하였다. qRT-PCR analysis was further performed on selected miRNAs including mir-106a, mir-19a, mir-29a, mir-99a, mir-100 and mir-125b to determine whether they were expressed differently. Each miRNA probe used for qRT-PCR is summarized in Table 2 below.
Capan-1, Capan-2, HPAC 및 hYGIC6 세포주에 대하여 구형성세포 및 부착배양세포 내 상기 선별된 6개의 miRNA를 발현을 비교분석하였다. 칩 분석 결과 Capan-1, HPAC 및 hYGIC의 구형성 세포 내에서 하향 조절되는 것으로 확인되어 선별된 상기 6개의 miRNA는, qRT-PCR 결과 Capan-2 구형성세포를 포함한 모든 세포주에 대해서도 하향 조절되는 것이 확인되어 상기 칩 데이터와 일치하는 결과를 나타내었다(도 3).
The expression of the six selected miRNAs in globular and adherent culture cells was compared for Capan-1, Capan-2, HPAC and hYGIC6 cell lines. As a result of chip analysis, the six miRNAs identified as being down-regulated in spherical cells of Capan-1, HPAC and hYGIC were down-regulated in all cell lines including Capan-2 spherical cells as a result of qRT-PCR. The result is consistent with the chip data (Fig. 3).
5. 교차-상관관계5. Cross-correlation
본 발명자들은 다르게 발현된 mRNA와 다르게 발현된 miRNA의 관계를 통찰하기 위하여, 선형 모델을 사용하여 교차-상관관계 분석을 수행하였다. 다르게 발현되는 mRNA 중에, 258개의 줄기세포 관련 mRNA 및 210개의 프레즌트 콜 miRNA를 대상으로 하여 추가적 분석을 수행하였다. 첫째, hYGIC6 부착배양세포의 2중 데이터의 평균값을 분석하고 각각에 대하여 Log2(샘플/점착성 hYGIC6 평균) 값을 분석하기 위하여, hYGIC6를 대조군으로 설정하였다. 그 다음 바이오컨덕터의 CORREP 모듈을 사용하여 상관관계를 계산하였다. 페어와이즈 상관관계를 계산한 miRNA 및 mRNA 각각의 로그 발현 동태와 선형 모델이 일치하는 결과, 본 발명자들은 Pearson 상관관계 계수로 색을 입힌 교차 상관관계 히트 맵을 작성하였다(도 4). mRNA와 관련있는 전체 줄기세포는 3개 군으로 분류되었고, miRNA는 각각 6개 군으로 분류되었다. 예를 들어, 분류 2 mRNA는 분류 3,5 miRNA와 높은 상관관계를 보이고 분류 1,2 miRNA와는 낮은 상관관계를 보였다. 높은 상관관계는 및 낮은 상관관계는 각각 적색 및 녹색으로 표시하였다.
We performed cross-correlation analysis using a linear model to gain insight into the relationship between differently expressed mRNAs and differently expressed miRNAs. Among the differently expressed mRNAs, further analysis was performed on 258 stem cell related mRNAs and 210 present call miRNAs. First, hYGIC6 was set as a control in order to analyze the mean value of the double data of hYGIC6 adherent cells and to analyze the Log2 (sample / adhesive hYGIC6 mean) value for each. Correlation was then calculated using Bioconductor's CORREP module. As a result of the agreement between the linear expression model and the log expression kinetics of each of the miRNAs and mRNAs for which the pairwise correlation was calculated, the inventors generated a cross correlation heat map colored by the Pearson correlation coefficient (FIG. 4). Total stem cells related to mRNA were classified into three groups, and miRNAs were divided into six groups. For example,
6. 6. 췌장암줄기세포의Pancreatic cancer stem cells 억제 또는 사멸 유도 Inhibit or induce death
췌장암줄기세포에서 특이적으로 발현량이 낮은 22개의 miRNA, 즉 서열목록 제1서열 내지 제22서열의 miRNA 중 임의로 3 가지 miRNA를 선택하여 이를 각각 췌장암 암줄기세포에 인위적으로 과발현 하여 a) 구형성 실험을 통한 췌장암 암줄기세포의 구형성능력 저하, b) 항암제-방사선 처리 후 IC50 값 도출을 통해 항암제 저항성 감소 및 방사선 처리 후 MTT assay를 통한 방사선 정항성을 지닌 세포수의 감소, 그리고 세포 생장속도 측정을 통해 성장의 억제를 유도함을 확인할 수 있었다.22 miRNAs with low specific expression levels in pancreatic cancer stem cells, i.e., randomly select three miRNAs from the miRNAs in SEQ ID NOs: 1 to 22, and artificially overexpress them in pancreatic cancer stem cells, respectively. Decreased globular capacity of pancreatic cancer stem cells through the treatment, b) anti-cancer drug resistance through anti-cancer drug-derived treatment, IC 50 value reduction, decrease in the number of cells with radio-regularity through MTT assay, and cell growth rate measurement after radiation treatment. It was confirmed that the induction of growth through.
(a) 구형성 실험을 통한 췌장암 암줄기세포의 구형성능력 저하의 분석(a) Analysis of spheroid deterioration of pancreatic cancer stem cells through spheroid experiment
췌장암줄기세포에서 특이적으로 발현량이 감소되는 miRNA, mir-99a, mir-106a 및 mir-125b의 과발현을 유도하도 구 형성능력을 살펴본 결과 구 형성등력의 저하를 관찰하였다. miRNA의 과발현을 유도하기 위해 염기서열에 해당하는 각각의 siRNA(제놀루션, 한국)를 합성 제작하여 60mm 세포 배양접시(Nalgene Nunc Int.)에 배양하는 HPAC 세포에 20nM의 농도로 16ul의 Lipofectamin RNAiMAX(Invitrogen)와 섞은 후 주입하였다. miRNA의 과발현이 유도된 HPAC 세포주는 37℃, 5 % CO2 대기 환경 하에서 8시간 배양한 후 세포를 트립신 처리하고 구형성 실험을 위해 EGF(10 ng/ml, R&D Systems Inc.), bFGF(10 ng/ml, R&D Systems Inc.), LIF(10 ng/ml, Chemicon), 1ITS(insulin transferring selenium, Gibco) 및 0.5% FBS을 보충한 혈청 프리 D/F12(Invitrogen Gibco) 배지에 2000 세포/웰의 비율로 재현탁시켰다. 상기 세포 현탁액을 37℃, 5 % CO2 대기 환경 하에서 6-웰 울트라 로우 클러스터 플레이트(Corning Inc.)에 7일 동안 접종하고 수집하여서 각각의 miRNA 발현에 따르는 구형성 개수를 현미경 아래에서 세었다. 구형성능력의 변화가 siRNA에 의한것임을 확인하기 위해 사용화된 스크램블 siRNA(또는 scramble, 제놀루션)과 mir-99a의 antagomir로 작용하는 2’-O-C1 -3 메틸 올리고뉴클레오타이드 mir-99a(또는 anti99a,제놀루션)를 합성제작하여 동일한 조건에서 병행 실험하였다. In the pancreatic cancer stem cells, we found that the bulb formation ability was induced even when overexpression of miRNA, mir-99a, mir-106a, and mir-125b, which decreased the expression level, was observed. In order to induce overexpression of miRNA, each siRNA (genolation, Korea) corresponding to the nucleotide sequence was synthesized and manufactured in HPAC cells incubated in a 60 mm cell dish (Nalgene Nunc Int.) at a concentration of 20 nM of Lipofectamin RNAiMAX (20 μM). Invitrogen) and then injected. HPAC cell lines induced by overexpression of miRNAs were cultured for 8 hours at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere, followed by trypsin treatment and EGF (10 ng / ml, R & D Systems Inc.), bFGF (10). 2000 cells / well in serum free D / F12 (Invitrogen Gibco) medium supplemented with ng / ml, R & D Systems Inc.), LIF (10 ng / ml, Chemicon), 1ITS (insulin transferring selenium, Gibco) and 0.5% FBS Resuspend in proportions. The cell suspension at 37 ° C., 5% CO 2 The spherical number following each miRNA expression was counted under the microscope by inoculation and collection for 6 days in 6-well ultra row cluster plates (Corning Inc.) under an atmospheric environment. The change in sphere-forming ability is used to confirm that by siRNA screen scrambled siRNA (or scramble, jenol convolution) and 2'-OC 1 which acts as a antagomir of mir-99a -3-methyl oligo nucleotide mir-99a (or anti99a , Genol) was synthesized and tested in parallel under the same conditions.
도 5에 기재된 바와 같이, 2000개의 세포를 분주하여 7일 후 구 형성능력을 살펴본 결과, mir-99a, mir-106a 및 mir-125b 각각의 과발현을 통해 58.33± 2.08개의 구가 42± 4.24개, 48.67± 2.72개 및 27.67± 2.08개로 저하되었다.As shown in FIG. 5, after dispensing 2000 cells and examining sphere formation capacity after 7 days, 58.33 ± 2.08 spheres were 42 ± 4.24 cells through overexpression of mir-99a, mir-106a and mir-125b, respectively. 48.67 ± 2.72 and 27.67 ± 2.08.
따라서, 췌장암줄기세포-특이적으로 발현량이 감소되는 것으로 본 발명에서 발굴된 miRNA, 특히 mir-99a, mir-106a 및 mir-125b의 과발현을 통해 췌장암줄기세포에 대한 항종양 효과를 나타낼 수 있음을 알 수 있다.
Therefore, the pancreatic cancer stem cell-specific expression level is reduced by the overexpression of miRNAs, especially mir-99a, mir-106a and mir-125b, which have been discovered in the present invention, may exhibit antitumor effect on pancreatic cancer stem cells. Able to know.
(b) 항암제 처리 후 MTT 분석을 통한 IC50 값 도출을 통해 항암제 저항성 세포수의 감소 관찰(b) Decreased number of anticancer drug resistant cells by deriving IC 50 values through MTT assay after anticancer drug treatment
mir-99a, mir-106a 및 mir-125b의 과발현을 통해 항암제(Gemcitabine) 저항성을 관찰하였다. miRNA의 과발현을 유도하기 위해 염기서열에 해당하는 각각의 siRNA(제놀루션)를 60mm 세포 배양접시(Nalgene Nunc Int.)에 D/F12(Invitrogen Gibco)로배양된 HPAC 세포에 20nM의 농도로 16ul의 Lipofectamin RNAiMAX(Invitrogen)와 섞은 후 주입하였다. miRNA의 과발현이 유도된 HPAC 세포주는 37℃, 5 % CO2 대기 환경 하에서 8시간 배양한 후 세포를 트립신 처리 후 D/F12(Invitrogen Gibco) 배양액에 2.5x105세포/ml 농도로 현탁하여 96-웰 배양접시에 100ul씩 분주하고 37℃, 5 % CO2 대기 환경 하에서 24시간 배양한 후 GEMZAR(Gemcitabine, Eli Lilly and Co., Indianapolis IN.)를 최종농도가 0부터 200nM사이가 되도록 2배의 농도를 100ul씩 각 웰에 처리를 하였다. 약물 처리 72시간 배양액을 제거하고 PBS로 세포를 세척한 후 PBS에 녹인 5mg/ml농도의 MTT(3-[4,5-dimethyl thiazo-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma)시약 1ml과 D/F12 배양액 9ml을 섞어서 100ul씩 96-웰에 각각 넣어주고 4시간 37℃, 5 % CO2 대기 환경 하에서 배양하였다. 그 후 배양액을 제거하고 dimethyl sulphoxide(또는 DMSO, Sigma)를 100ul/웰 첨가하여 VersaMax™ 마이크로 플레이트 리더(Associated of Cape Code Inc., East Falmouth, MA) 기기로 570nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 살아있는 세포의 수는 (세포생존률(%)=약을 처리한 세포의 흡광도570파장/약을 처리하지 않은 세포의 흡광도570파장) 공식을 이용하여 산출하였고 절반의 세포가 생존하는 약의 농도(IC50)를 계산하였다. 변화가 siRNA에 의한것임을 확인하기 위해 사용화된 스크램블 siRNA(또는 scramble)와 mir-99a antagomir(또는 anti99)를 이용하여 동일한 조건에서 병행 실험하였다.Gemcitabine resistance was observed through overexpression of mir-99a, mir-106a and mir-125b. In order to induce overexpression of miRNA, each siRNA (genolation) corresponding to the nucleotide sequence was transferred to a 60 mm cell culture dish (Nalgene Nunc Int.) at 16 n of HPAC cells cultured with D / F12 (Invitrogen Gibco) at a concentration of 20 nM. Lipofectamin RNAiMAX (Invitrogen) was mixed with and then injected. HPAC cell line induced miRNA overexpression at 37 ° C., 5% CO 2 After 8 hours of incubation in the atmosphere, cells were trypsin-treated and suspended in D / F12 (Invitrogen Gibco) culture at a concentration of 2.5x10 5 cells / ml, and 100ul was dispensed in a 96-well culture dish at 37 ° C and 5% CO 2. After 24 hours of incubation in an air environment, GEMZAR (Gemcitabine, Eli Lilly and Co., Indianapolis IN.) Was treated with 100ul each well twice the concentration so that the final concentration was between 0 and 200nM. Drug treatment 72 hours after removing the culture medium and washing the cells with PBS, MTT (3- [4,5-dimethyl thiazo-2-yl] -2,5-diphenyltetrazolium bromide (Sigma) reagent at a concentration of 5 mg / ml dissolved in PBS Mix 1ml and 9ml of D / F12 culture solution and add 100ul each to 96-well, and 4 hours 37 ℃, 5% CO 2 Incubated under atmospheric environment. Subsequently, the culture medium was removed, and 100 ul / well of dimethyl sulphoxide (or DMSO, Sigma) was added, and the absorbance was measured at 570 nm using a VersaMax ™ microplate reader (Associated of Cape Code Inc., East Falmouth, Mass.). The number of living cells (cell survival rate (%) = Absorbance 570 wavelength of not treated with absorbance 570 Wavelength / drug treated with approximately cells) was calculated using the formula drug concentration in which the half cell viability (IC 50 ) was calculated. The scrambled siRNA (or scramble) and mir-99a antagomir (or anti99) were used in parallel experiments to confirm that the change was caused by siRNA.
실험 결과, 항암제에의 IC50 값이 111.71 nM에서 mir-99a의 발현을 통해 98.91 nM, mir-106a의 발현을 통해 92.19 nM, mir-125b의 발현을 통해 85.71 nM로 각각 감소하였다(참조: 도 6 및 표 3). Experiment result, IC 50 to anticancer agent The value decreased to 98.91 nM through the expression of mir-99a at 111.71 nM and to 92.19 nM through the expression of mir-106a and 85.71 nM through the expression of mir-125b (see FIG. 6 and Table 3).
따라서, 췌장암줄기세포-특이적으로 발현량이 감소되는 것으로 본 발명에서 발굴된 miRNA, 특히 mir-99a, mir-106a 및 mir-125b의 과발현을 통해 췌장암의 항암제 민감성(sensitivity)을 증가시킬 수 있음을 알 수 있다.Therefore, the pancreatic cancer stem cell-specific expression level is reduced by the overexpression of miRNAs, especially mir-99a, mir-106a and mir-125b, which have been discovered in the present invention, may increase anticancer sensitivity of pancreatic cancer. Able to know.
(c) 방사선 처리 후 MTT 분석을 통한 방사선 저항성을 지닌 세포수의 감소(c) Reduction of radiation resistant cell number through MTT assay after radiation treatment
miRNA의 과발현을 유도하기 위해 염기서열에 해당하는 각각의 siRNA(제놀루션)를 60mm 세포 배양접시(Nalgene Nunc Int.)에 D/F12(Invitrogen Gibco)로 배양된 HPAC 세포에 20nM의 농도로 16ul의 Lipofectamin RNAiMAX(Invitrogen)와 섞은 후 주입하였다. miRNA의 과발현이 유도된 HPAC 세포주는 37℃, 5 % CO2 대기 환경 하에서 8시간 배양한 후 세포를 트립신 처리 후 D/F12 배양액에 2.5x103세포/ml 농도로 현탁하여 감마이레이데이터 감마셀 3000엘란(MDS Nordio Inc., ON, Canada) 기계를 이용하여 감마선을 각각 0 Gy, 2 Gy, 4 Gy 및 6 Gy로 처리한 후 96-웰 배양접시에 100ul씩 분주하고 37℃, 5 % CO2 대기 환경 하에서 10일간 배양하였다. 배양액을 제거하고 PBS로 세포를 세척한 후 PBS에 녹인 5mg/ml농도의 MTT(3-[4,5-dimethyl thiazo-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma)시약 1ml과 D/F12 배양액 9ml을 섞어서 100ul씩 96-웰에 각각 넣어주고 4시간 37℃, 5 % CO2 대기 환경 하에서 배양하였다. 그 후 배양액을 제거하고 dimethyl sulphoxide(또는 DMSO, Sigma)를 100ul/웰 첨가하여 VersaMax™ 마이크로 플레이트 리더(Associated of Cape Code Inc.) 기기로 570nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 살아있는 세포의 수는 (세포생존률(%)=약을 처리한 세포의 흡광도5 70파장/약을 처리하지 않은 세포의 흡광도570파장) 공식을 이용하여 산출한 값을 백분율로 계산하였다. 변화가 siRNA에 의한것임을 확인하기 위해 사용화된 스크램블 siRNA(또는 scramble)와 mir-99a antagomir(또는 anti99)를 이용하여 동일한 조건에서 병행 실험하였다.In order to induce overexpression of miRNA, each siRNA (genolation) corresponding to the nucleotide sequence was transferred to a 60 mm cell culture dish (Nalgene Nunc Int.) at 16 n at a concentration of 20 nM in HPAC cells cultured with D / F12 (Invitrogen Gibco). Lipofectamin RNAiMAX (Invitrogen) was mixed with and then injected. HPAC cell line induced miRNA overexpression at 37 ° C., 5% CO 2 After 8 hours of incubation in an air environment, the cells were trypsin-treated and suspended in D / F12 culture at a concentration of 2.5x10 3 cells / ml, using gamma ray data gamma cell 3000 Elan (MDS Nordio Inc., ON, Canada) machine. Were treated with 0 Gy, 2 Gy, 4 Gy and 6 Gy, respectively, and then dispensed 100ul in a 96-well culture dish, 37 ° C., 5% CO 2 The cells were incubated for 10 days under an atmospheric environment. After removing the culture medium and washing the cells with PBS, 1 ml of 5 mg / ml MTT (3- [4,5-dimethyl thiazo-2-yl] -2,5-diphenyltetrazolium bromide (Sigma) reagent dissolved in PBS and D /
표 4 및 도 7에서 확인할 수 있듯이, mir-99a, mir-106a, mir-125b를 과발현시킨 경우에 2Gy 처리 후 세포의 생존률이 각각 5.19%, 3.32% 및 14.5%가 감소하였고, 4Gy 처리 후 세포의 수가 각각 9.14%, 8,28%, 2.6% 가 감소하였다. As can be seen in Table 4 and FIG. 7, when over-expressing mir-99a, mir-106a and mir-125b, cell survival after 2Gy treatment decreased by 5.19%, 3.32% and 14.5%, respectively, and after 4Gy treatment. The numbers of were decreased by 9.14%, 8,28% and 2.6%, respectively.
따라서, 췌장암줄기세포-특이적으로 발현량이 감소되는 것으로 본 발명에서 발굴된 miRNA, 특히 mir-99a, mir-106a 및 mir-125b의 과발현을 통해 췌장암의 방산선 민감성(sensitivity)을 증가시킬 수 있음을 알 수 있다.Therefore, pancreatic cancer stem cell-specific expression levels can be reduced by overexpression of miRNAs, particularly mir-99a, mir-106a and mir-125b, which are discovered in the present invention, to increase the radiation sensitivity of pancreatic cancer. It can be seen.
(d) 방사선 처리 후 콜로니 형성능력으로 보는 방사선 저항성 세포수의 감소(d) Reduction of the number of radiation resistant cells in terms of colony forming ability after radiation treatment
감마선을 각각 0 Gy, 2 Gy, 4 Gy 및 6 Gy로 처리한 세포의 생존수를 확인하기 위해 1000개의 세포를 소프트-아가에 분주하여 살아있는 세포가 형성하는 콜로니의 수를 확인했다. 소프트-아가를 이용한 세포 배양은 6웰 배양 접시에 4%의 아가(Invitrogen Gibco)를 D/F12(Invitrogen Gibco)에 녹인 층과 3%의 아가와 1000개의 세포를 D/F12에 녹인 층을 차례로 분주 한 후 그 위에 3ml의 D/F12를 첨가하여 10일간 37℃, 5 % CO2 대기 환경 하에서 배양하였다. 10일 후 크리스탈 바이올렛(Invitrogen)시약을 100배 희석하여 각 웰에 1ml씩 넣어 형성된 콜로니를 염색한 후 형성된 콜로니의 개수를 현미경으로 확인하였다.
To determine the viability of cells treated with gamma rays at 0 Gy, 2 Gy, 4 Gy and 6 Gy, respectively, 1000 cells were dispensed into soft-agar to determine the number of colonies that live cells form. Cell culture using soft-agar was performed by dissolving 4% agar (Invitrogen Gibco) in D / F12 (Invitrogen Gibco) in a 6-well culture dish, followed by 3% agar and 1000 cells in D / F12. After dispensing, 3 ml of D / F12 was added thereto, followed by 10 days at 37 ° C., 5% CO 2 Incubated under atmospheric environment. After 10 days, the crystal violet (Invitrogen) reagent was diluted 100-fold and stained with 1 ml of each formed colonies, and the number of colonies formed was checked under a microscope.
표 5 및 도 8에서 확인할 수 있듯이, 아무것도 처리하지 않은 세포에서 콜로니의 형성능력은 mir-99a, mir-106a, mir-125b를 과발현시킨 경우 각각 12.2%, -6.12% 및 22.4% 감소하였고 2 Gy 처리 후 세포의 수가 각각 40.92%, 49.93% 및 31.79% 감소하였다.As can be seen from Table 5 and Figure 8, the colony formation ability in the cells treated with nothing decreased 12.2%, -6.12% and 22.4% respectively when mir-99a, mir-106a, mir-125b overexpressed 2 Gy After treatment the number of cells decreased by 40.92%, 49.93% and 31.79%, respectively.
따라서, 췌장암줄기세포-특이적으로 발현량이 감소되는 것으로 본 발명에서 발굴된 miRNA, 특히 mir-99a, mir-106a 및 mir-125b의 과발현을 통해 췌장암의 방산선 민감성(sensitivity)을 증가시킬 수 있음을 알 수 있다.Therefore, pancreatic cancer stem cell-specific expression levels can be reduced by overexpression of miRNAs, particularly mir-99a, mir-106a and mir-125b, which are discovered in the present invention, to increase the radiation sensitivity of pancreatic cancer. It can be seen.
추가논의Further discussion
췌장관 선암종은 치료-저항성을 가진 대단히 공격적인 악성종양으로 알려져 있다. 화학치료 저항성 췌장암 극복을 위한 연구에 있어서, 암줄기세포에 내재된 관련 메카니즘이 필요하지만, 췌장암 암줄기세포에 접근하기 위해 사용가능한 정보는 거의 없는 실정이다. 본 발명자들은 췌장암 암줄기세포 내 다르게 발현되는 독특한 miRNA 세트를 동정하였고, 더 나아가 이들 miRNA 레벨을 조절함으로써 췌장암 암줄기세포의 억제 또는 사멸을 유도할 수 있음을 밝혀내었다. 또한 본 발명자들은 더 나아가 miRNA 및 mRNA 발현 동태 간 상관관계를 분석하였다. Pancreatic adenocarcinoma is known as a highly aggressive malignant tumor with treatment-resistance. In the study for overcoming chemotherapy resistant pancreatic cancer, related mechanisms inherent in cancer stem cells are required, but little information is available for accessing pancreatic cancer stem cells. The inventors have identified a unique set of miRNAs that are differentially expressed in pancreatic cancer stem cells, and further found that by controlling these miRNA levels, they can induce inhibition or killing of pancreatic cancer stem cells. We also further analyzed the correlation between miRNA and mRNA expression kinetics.
기존 보고에 따르면, 정상 세포 및 암 세포 모두 비 부착 배양 조건 하에서 구를 형성할 수 있다는 것은 자가-증식(self renewal) 능력을 갖는 세포라는 것을 의미한다[3-4]. 본 발명자들은 Capan-1, Capan-2 및 HPAC을 포함하는 3개의 암세포주 및 정상세포주 hYGIC6가 구를 형성함을 관찰하였고, 이러한 기법을 사용하여, 암줄기세포를 밀집시켰다. 이러한 구는 인 비트로에서 구 형성 능력 또는 자가-증식 능력을 상실하지 않고 수회 분열하였다. 다르게 발현하는 miRNA를 분석하기 위하여, 본 발명자들은 3가지 세포주 Capan-1, HPAC 및 hYGIC6를 가지고 실험을 수행하였고, miRNA 칩을 이용하여 전체 miRNA 발현을 분석하였다. miRNA 세포주 클러스터링 결과(도 2)에 근거할 때, 구 또는 부착형태 보다는 동일한 세포 주 내에서 더 근접함이 관찰되었는데, 이는 암줄기세포 생물학과 관련된 적은 수의 miRNA와 관련이 있다. 칩 분석 결과 모든 구 형성 세포에서 14개의 다르게 발현되는 miRNA가 관찰되었다(표 1). 이러한 14개의 miRNA는 암세포 및 정상세포주 모두에서 구 형성에 관계하는 것으로 여겨진다. 추가적으로, 22개의 miRNA가 Capan1 및 HPAC 내에서 다른 발현을 보였으나, hYGIC6 내에서는 거의 차이를 나타내지 않았다(표 1). 이러한 miRNA는 암세포주 및 정상세포주를 차별할 수 있다.Previous reports indicate that both normal and cancer cells can form spheres under non-adherent culture conditions, meaning that the cells have self renewal capacity [3-4]. The inventors observed that three cancer cell lines, including Capan-1, Capan-2 and HPAC, and the normal cell line hYGIC6 form a sphere, and using this technique, the cancer stem cells were concentrated. This sphere formation is old in vitro ability or self-cleavage were several times without loss of proliferative capacity. To analyze differently expressed miRNAs, we performed experiments with three cell lines Capan-1, HPAC and hYGIC6, and analyzed the total miRNA expression using miRNA chips. Based on miRNA cell line clustering results (FIG. 2), closer proximity was observed within the same cell line than sphere or adherence, which is associated with a small number of miRNAs involved in cancer stem cell biology. Chip analysis revealed 14 differently expressed miRNAs in all globular cells (Table 1). These 14 miRNAs are believed to be involved in sphere formation in both cancer cells and normal cell lines. In addition, 22 miRNAs showed different expression in Capan1 and HPAC, but little difference in hYGIC6 (Table 1). Such miRNAs can differentiate between cancer cell lines and normal cell lines.
본 발명자들은 선형 모델을 채택하고, 상호작용할 것으로 예상되는 miRNA 및 관련 mRNA에 대한 교차-상관관계 클러스터링을 분석하였다. 문헌[1]에 따르면 이러한 상관관계 기법은 mRNA와 각각의 miRNA 발현 레벨과의 상관관계를 분석하고, mRNA 및 miRNA 사이의 관련성을 분석하는데 도움을 준다. 구 및 부착 배양된 세포 내 발현 패턴에 근거하여 다르게 발현하는 miRNA의 6개 군을 동정하였다. 줄기세포군과 교차-상관관계를 갖는 개별 군은 mRNA와 양성적으로 또는 음성적으로 관련될 수 있는데, 이는 독특한 규칙을 갖는 것으로 여겨질 수 있다. 예를 들어 제 5군의 miRNA는 제2군 mRNA 각각에 매우 양성적으로 관련된다. 직접적인 타겟을 확인하기 위하여 PicTar(http://pictar.mdc-berlin.de/)와 TargetScan(http://www.targetscan.org/)[6]을 사용하여 타켓 예측을 컴퓨터 처리하고 제 5군 miRNA타켓으로 기대되는 제2군 mRNA를 확인하고 이를 하기 표 6 및 표 7에 정리하였다. 표 6은 각각의 miRNA의 타겟으로 예측되는 mRNA를 코딩하는 유전자를 GenBank 접근번호로 정리한 것이고, 표 7는 상기 GenBank 접근번호가 나타내는 유전자를 구체적으로 표시하여 정리 한 것이다. We adopted a linear model and analyzed cross-correlation clustering for miRNAs and related mRNAs expected to interact. According to [1], this correlation technique helps to analyze the correlation between mRNA and each miRNA expression level and to analyze the relationship between mRNA and miRNA. Six groups of differently expressed miRNAs were identified based on sphere and adherent cultured expression patterns in cells. Individual groups that cross-correlate with stem cell populations may be positively or negatively associated with mRNA, which may be considered to have unique rules. For example,
short basic domain, secreted, (semaphorin) 3ASema domain, immunoglobulin domain (Ig),
short basic domain, secreted, (semaphorin) 3A
(simian sarcoma viral (v-sis) oncogene homolog)Platelet-derived growth factor beta polypeptide
(simian sarcoma viral (v-sis) oncogene homolog)
(TIR) domainSingle immunoglobulin and toll-
(TIR) domain
상관관계가 높게 나타나는 제5군의 miRNA와 제2군의 mRNA의 경우, 암세포 전사인자 KLF4는 mir-7, mir-135b, mir-148a, mir-148b, mir-200b, mir-200c, 및 mir-375의 잠재적인 타겟이고 Notch 경로 전사인자 Hes-1은 mir-96및 mir-182의 잠재적인 타겟이다. TGF bet BMP 신호관련 유전자들로 INHBB(beta B)은 mir-106b, mir-148a, mir-148b의, PDGFB(platelet-derived growth factor beta polypeptide)는 let-7g, mir-98의, 그리고 TGFBR3( transforming growth factor, beta receptorIII)는 mir-206의 각각에 잠재적 타겟이다. 그러나, 제 5군의 몇몇 miRNA는 제2군의 몇몇 mRNA를 직접적으로 타겟하지 않으며, 제 5군의 miRNA는 제 2군 이외의 다른 mRNA에 타겟하여 전사를 조절 할 수 있을 것으로 예측된다. 제 2군의 mRNA 또한 다른 다른군의 miRNA에 의해서도 직접적으로 타겟받을 것으로 예측된다. 단 miRNA가 제한된 전사 관련성, 즉 전체 mRNA전사 중 3분의 1 만이 miRNA 발현에 의해 조절되기 때문에 일부 mRNA들의 전사 조절이 miRNA의 발현 변화에 의해 조절되는것으로 예측할 수 있다.[6]
In the case of the high correlation between the fifth group of miRNAs and the second group of mRNAs, cancer cell transcription factors KLF4 are mir-7, mir-135b, mir-148a, mir-148b, mir-200b, mir-200c, and mir. Potential target of -375 and Notch pathway transcription factor Hes-1 is a potential target of mir-96 and mir-182. TGF bet BMP signaling-related genes include INHBB (beta B) for mir-106b, mir-148a, mir-148b, and platelet-derived growth factor beta polypeptide (PDGFB) for let-7g, mir-98, and TGFBR3. transforming growth factor, beta receptor III), is a potential target for each of mir-206. However, it is expected that some miRNAs in the fifth group will not directly target some mRNAs in the second group, and miRNAs in the fifth group will be able to target transcription other than the second group. The second group of mRNAs is also expected to be directly targeted by other groups of miRNAs. However, because miRNAs have limited transcriptional relevance, that is, only one third of the total mRNA transcription is regulated by miRNA expression, it can be predicted that transcription regulation of some mRNAs is regulated by changes in miRNA expression.
결론적으로, 본 발명자들은 구(sphere) 형성 기법을 사용하여 췌장 암줄기세포 특이적 miRNA를 동정하였고, 다르게 발현되는 miRNA의 전체 유전자 발현을 획득하였다. 더 나아가, 본 발명자들은 이들 miRNA 레벨을 조절함으로써 췌장암 암줄기세포의 억제 또는 사멸을 유도할 수 있음을 세포 실험을 통해 밝혀내었다. 즉 췌장암 암줄기세포에서 특이적으로 발현량이 낮은 22개의 miRNA의 경우는 이를 췌장암 암줄기세포에 투여하여 췌장암 암줄기세포의 억제 또는 사멸을 유도할 수 있음을 밝혀내었으며, 췌장암 암줄기세포에서 특이적으로 발현량이 높은 14개의 miRNA의 경우는 그의 안타고미어 등을 투여하여 췌장암 암줄기세포의 억제 또는 사멸을 유도할 수 있음을 밝혀내었다. 또한 본 발명자들은 다르게 발현되는 miRNA와 암줄기세포 관련 mRNA과의 교차-상관관계를 분석하였다. 그 결과로서 얻어진 miRNA 및 mRNA의 군 또는 분류는 암줄기세포의 후성적 조절에 있어서 가능한 역할을 제안한다. 그 뿐만 아니라, 암 생물학과의 관계에 대한 이해는 암줄기세포 특이적 화학요법에도 응용될 수 있다.
In conclusion, the present inventors identified pancreatic cancer stem cell specific miRNA using sphere formation technique and obtained total gene expression of differently expressed miRNA. Furthermore, the inventors have found out through cell experiments that the regulation of these miRNA levels can induce inhibition or killing of pancreatic cancer stem cells. In other words, it was found that 22 miRNAs with low specific expression levels in pancreatic cancer stem cells could be administered to pancreatic cancer stem cells to induce inhibition or death of pancreatic cancer stem cells. It was found that 14 high miRNAs can be inhibited or killed by pancreatic cancer stem cells by administering their antagonists and the like. The present inventors also analyzed the cross-correlation between differently expressed miRNAs and mRNAs related to cancer stem cells. The resulting groups or classes of miRNAs and mRNAs suggest possible roles in the epigenetic regulation of cancer stem cells. In addition, an understanding of the relationship with cancer biology can be applied to cancer stem cell specific chemotherapy.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the same is by way of illustration and example only and is not to be construed as limiting the scope of the present invention. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
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Claims (11)
(a) a pharmaceutically effective amount of a microRNA or a fragment thereof consisting of a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 10, 14, and 16; And (b) a pharmaceutically acceptable carrier.
The pharmaceutical composition of claim 1, wherein the pancreatic cancer treatment composition induces growth inhibition, differentiation inhibition or death of pancreatic cancer stem cells.
According to claim 1, wherein the composition for treating pancreatic cancer is a pharmaceutical composition, characterized in that administered to patients with chemotherapy-resistant or radiation-resistant.
The pharmaceutical composition of claim 1, wherein the fragment of the microRNA is a polynucleotide comprising a seed sequence of the microRNA.
Cancer line through measuring the expression level of nucleotides selected from the group consisting of SEQ ID NO: 10, 14 and 16 in the pancreatic cell sample of human A method for detecting pancreatic cancer diagnostic markers having stromal cells.
(a) 서열목록 제10서열, 제14서열 및 제16서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드를 발현하는 생체 외(外) 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 시험물질이 상기 뉴클레오타이드의 발현에 미치는 영향을 분석하는 단계로서, 상기 시험물질이 상기 뉴클레오타이드의 발현을 증가시키면 췌장암 치료제로 판정된다.
Screening methods for treating pancreatic cancer comprising the following steps:
(a) contacting a test substance with an ex vivo cell expressing a nucleotide selected from the group consisting of SEQ ID NO: 10, 14, and 16; And
(b) analyzing the effect of the test substance on the expression of the nucleotide, wherein the test substance increases the expression of the nucleotide and is determined as a pancreatic cancer therapeutic agent.
The method of claim 8, wherein the pancreatic cancer therapeutic agent induces growth inhibition, differentiation inhibition or death of pancreatic cancer stem cells.
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