KR101338318B1 - Method for sorting EpiSC using Oct4-GTP system - Google Patents
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Abstract
본 발명은 착상 후 배반엽상피줄기세포(EpiSC)를 형광활성세포분류기(FACS)를 이용하여 Oct4-GFP 양성 및 Oct4-GFP 음성 착상 후 배반엽상피줄기세포(EpiSC)로 분류하고 개별적으로 배양하는 단계를 포함하는 Oct4-GFP 시스템을 이용한 상배엽 세포의 분리 방법에 관한 것이다.After implantation, blastocyst epithelial stem cells (EpiSC) are classified into Oct4-GFP-positive and Oct4-GFP-negative blastocyst epithelial stem cells (EpiSC) using a fluorescent activated cell sorter (FACS) and cultured individually. It relates to a method for isolating epidermal cells using Oct4-GFP system comprising the step.
Description
본 발명은 착상 후 배반엽상피줄기세포(EpiSC)를 형광활성세포분류기(FACS)를 이용하여 Oct4-GFP 양성 및 Oct4-GFP 음성 착상 후 배반엽상피줄기세포(EpiSC)로 분류하고 개별적으로 배양하는 단계를 포함하는 Oct4-GFP 시스템을 이용한 상배엽 세포의 분리 방법에 관한 것이다.After implantation, blastocyst epithelial stem cells (EpiSC) are classified into Oct4-GFP-positive and Oct4-GFP-negative blastocyst epithelial stem cells (EpiSC) using a fluorescent activated cell sorter (FACS) and cultured individually. It relates to a method for isolating epidermal cells using Oct4-GFP system comprising the step.
일반적으로 네 종류의 다능성 줄기세포를 현재까지 확립되었다: 기형암종으로부터 온 EC(embryonic cancer, 배아 암종) 세포, 내세포괴로부터 온 ES (embryonic stem, 배아 줄기) 세포, 원시 생식세포(primordial germ cells)로부터 온 EG (embryonic germ, 배아 생식) 세포 및 발생하는 상배엽으로부터 온 EpiSCs(epiblast stem cells, 배반엽상피줄기세포)(Lovell-Badge, R. (2007). Many ways to pluripotency. Nat. Biotechnol. 25,1114-1116). In general, four kinds of pluripotent stem cells have been established to date: EC (embryonic cancer) cells from teratocarcinomas, ES (embryonic stem) cells from internal cell masses, primordial germ cells (Embryonic germ (embryonic germ) cells from) and EpiSCs (epiblast stem cells) from developing epidermis (Lovell-Badge, R. (2007) .Many ways to pluripotency.Nat.Biotechnol 25, 1114-1116).
ES, EC, 및 EG 세포들은 테라토마 및 키메라를 용이하게 형성할 수 있다. 그러나 비록 EpiSCs가 용이하게 테라토마를 형성하지만, 그들은 키메라를 거의 형성하지 아니한다(Brons, I.G., Smithers, L.E., Trotter, M.W., Rugg-Gunn, P., Sun, B., Chuva de Sousa Lopes, S.M., Howlett, S.K., Clarkson, A., Ahrlund-Richter, L., Pedersen,R.A., and Vallier, L. (2007). Nature 448, 191-195; Tesar, P.J., Chenoweth, J.G., Brook, F.A., Davies, T.J., Evans, E.P., Mack,D.L., Gardner, R.L., and McKay, R.D. (2007). Nature 448, 196-199). ES, EC, and EG cells can easily form teratomas and chimeras. However, although EpiSCs readily form teratomas, they rarely form chimeras (Brons, IG, Smithers, LE, Trotter, MW, Rugg-Gunn, P., Sun, B., Chuva de Sousa Lopes, SM, Howlett, SK, Clarkson, A., Ahrlund-Richter, L., Pedersen, RA, and Vallier, L. (2007) .Nature 448, 191-195; Tesar, PJ, Chenoweth, JG, Brook, FA, Davies, TJ, Evans, EP, Mack, DL, Gardner, RL, and McKay, RD (2007) .Nature 448, 196-199).
이 특징은 EpiSCs이 다른 종류의 줄기세포와 비교했을 때에 나타나는 유전자 발현 및 후생학적 프로파일의 유사점에도 불구하고 비교적 제한된 다능성을 나타낼 수 있다는 것을 제안한다(Chou, Y.F., Chen, H.H., Eijpe, M., Yabuuchi, A., Chenoweth, J.G., Tesar, P.,Lu, J., McKay, R.D., and Geijsen, N. (2008). Cell 135, 449-461). EpiSCs는 이 제한된 능력을 나타내는 단지 한 세포타입을 나타낸다. 이 제한된 EpiSCs의 능력은 ES세포와 비교하여 기원의 조직 또는 EpiSCs의 다른 배양 환경으로부터 새롭게 기원한 것일 수 있다. This feature suggests that EpiSCs can exhibit relatively limited pluripotency despite similarities in gene expression and epigenetic profiles that appear when compared to other types of stem cells (Chou, YF, Chen, HH, Eijpe, M.). , Yabuuchi, A., Chenoweth, JG, Tesar, P., Lu, J., McKay, RD, and Geijsen, N. (2008) .Cell 135, 449-461). EpiSCs represent only one cell type exhibiting this limited ability. The ability of these limited EpiSCs may be of new origin from tissues of origin or other culture environments of EpiSCs as compared to ES cells.
ESCs는 세포의 동질성 군을 나타낸다고 오랫동안 간주되었다. 그러나 Stella(Dppa3) 및 Rex1 (Zfp42) 발현에 기반한 최근 연구는 ESCs는 이종 세포군(Hayashi, K., Lopes, S.M., Tang, F., and Surani, M.A. (2008). Cell Stem Cell 3, 391-401; Toyooka, Y., Shimosato, D., Murakami, K., Takahashi, K., and Niwa, H. (2008). Development 135, 909-918)을 포함한다고 발표하였다. 다른 여러 세포 서브군은 ICM-유사 상태의 세포 및 상배엽- 또는 원시외배엽-유사상태의 것과 사이에 동적 상호교환을 가지는 다른 인 비보 발생 단계를 나타낸다. 유사하게, stage-specific embryonic antigen 1 (SSEA1) 및 platelet endothelial cell adhesion molecule 1 (Pecam1)의 ESC 발현 수준은 ESC 다능성과 상관관계가 있다(Furusawa, T., Ohkoshi, K., Honda, C., Takahashi, S., and Tokunaga, T. (2004). Biol. Reprod. 70, 1452-1457). 또 단속적인(intermittent) Nanog 발현이 독특한 기능적 ESC 표현형과 관련이 있다(Chambers, I., Silva, J., Colby, D., Nichols, J., Nijmeijer, B., Robertson, M.,Vrana, J., Jones, K., Grotewold, L., and Smith, A. (2007). Nature 450, 1230-1234). ESCs have long been considered to represent homogeneous groups of cells. However, recent studies based on Stella (Dppa3) and Rex1 (Zfp42) expression have shown that ESCs are heterogeneous cell populations (Hayashi, K., Lopes, SM, Tang, F., and Surani, MA (2008) .Cell Stem Cell 3, 391- 401; Toyooka, Y., Shimosato, D., Murakami, K., Takahashi, K., and Niwa, H. (2008) .Development 135, 909-918). Several other cell subgroups represent different in vivo developmental stages with dynamic interchange between ICM-like cells and those of epidermal- or primitive ectoderm-like states. Similarly, ESC expression levels of stage-specific embryonic antigen 1 (SSEA1) and platelet endothelial cell adhesion molecule 1 (Pecam1) correlate with ESC pluripotency (Furusawa, T., Ohkoshi, K., Honda, C., Takahashi, S., and Tokunaga, T. (2004) .Biol. Reprod. 70, 1452-1457). Intermittent Nanog expression is also associated with unique functional ESC phenotypes (Chambers, I., Silva, J., Colby, D., Nichols, J., Nijmeijer, B., Robertson, M., Vara, J., Jones, K., Grotewold, L., and Smith, A. (2007) Nature 450, 1230-1234).
따라서 미분화된 ESC 배양은 배아에서 다른 발생 단계에 해당하는 다른 다능성 수준이 세포를 포함한다. 현재까지, EpiSCs는 ESC와 비교하여 그들의 높은 메틸화로 인하여 동종 다능성 세포군을 나타내는 것으로 간주되어 왔다. 이 후성적 프로파일은 감소된 EpiSC 유연성을 야기할 수 있고 따라서 ESCs에서 관찰되는 것과 같은 세포 이종성을 저해한다 (Hayashi, K., Lopes, S.M., Tang, F., and Surani, M.A. (2008). Cell Stem Cell 3, 391-401; Toyooka, Y., Shimosato, D., Murakami, K., Takahashi, K., and Niwa, H. (2008). Development 135, 909-918).
Thus undifferentiated ESC cultures contain cells with different pluripotency levels corresponding to different developmental stages in the embryo. To date, EpiSCs have been considered to exhibit homologous pluripotent cell populations due to their high methylation compared to ESCs. This epigenetic profile can lead to reduced EpiSC flexibility and thus inhibits cell heterogeneity as observed in ESCs (Hayashi, K., Lopes, SM, Tang, F., and Surani, MA (2008). Stem Cell 3, 391-401; Toyooka, Y., Shimosato, D., Murakami, K., Takahashi, K., and Niwa, H. (2008) .Development 135, 909-918).
본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 EpiSCs의 구별되는 다능성 상태를 탐구하는 방법을 제공하는 것이다.The present invention has been made in view of the above necessity, and an object of the present invention is to provide a method for exploring the distinct pluripotency state of EpiSCs.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 착상 후 배반엽상피줄기세포(EpiSC)를 형광활성세포분류기(FACS)를 이용하여 Oct4-GFP 양성 및 Oct4-GFP 음성 착상 후 배반엽상피줄기세포(EpiSC)로 분류하고 개별적으로 배양하는 단계를 포함하는 Oct-4 GFP 시스템을 이용한 상배엽 세포의 분리 방법을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention uses blastocyst epithelial stem cells (EpiSC) after implantation using fluorescence activated cell sorter (FACS) for Oct4-GFP positive and Oct4-GFP negative implantation after blastocyst epithelial stem cells (EpiSC). It provides a method for separating epidermal cells using Oct-4 GFP system comprising the step of classifying and individually culturing.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 Oct4-GFP 양성 착상 후 배반엽상피줄기세포(EpiSC)는 키메라에 기여하고, 상기 Oct4-GFP 음성 착상 후 배반엽상피줄기세포(EpiSC)는 키메라에 기여하지 않는 것을 특징으로 한다.In one embodiment, the Oct4-GFP positive implantation of blastocyst epithelial stem cells (EpiSC) contributes to the chimera, and the Oct4-GFP negative implantation of blastocyst epithelial stem cells (EpiSC) does not contribute to the chimera. It is characterized by not.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 Oct4-GFP 양성 착상 후 배반엽상피줄기세포(EpiSC)는 초기 상배엽 세포에 해당하고, 상기 Oct4-GFP 음성 착상 후 배반엽상피줄기세포(EpiSC)는 후기 상배엽 세포에 해당하는 것을 특징으로 한다.In another embodiment of the present invention, the Oct4-GFP positive implantation after blastocyst epithelial stem cells (EpiSC) corresponds to early epithelial cells, and the Oct4-GFP negative implantation after blastocyst epithelial stem cells (EpiSC) is late Characterized in that corresponds to the epidermal cells.
또한 본 발명은 Oct4-GFP 마커를 유효성분으로 포함하는 착상 후 배반엽상피줄기세포(EpiSC) 분리용 조성물을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a composition for isolation of blastocyst epithelial stem cells (EpiSC) after implantation comprising an Oct4-GFP marker as an active ingredient.
이하 본 발명을 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described.
본 발명에서 본 발명자들은 배양에서 EpiSCs의 동종성을 조사하여 EpiSCs의 구별되는 다능성 상태를 탐구하였다.In the present invention, the inventors examined the homology of EpiSCs in culture to explore the distinct pluripotent state of EpiSCs.
Oct4-GFP 전이유전자의 독특한 발현에 기반하여, 본 발명자들은 EpiSCs가 균일하지 아니하고 다른 두 독특한 세포 서브군(Oct4-GFP 양성 군 및 Oct4-GFP 음성 군)을 포함한다는 것을 발견하였다. 이 두 서브군은 분자적 특성 및 키메라형성을 포함하는 발생 잠재력에서 명확한 차이를 나타내었다. 본 발명자들은 이 두 서브군은 자발적으로 전환된 ES-유사 세포를 나타내지 아니하고 초기 및 후기 단계의 착상 후 배아의 세포와 유사하다. 따라서 이 발견은 EpiSCs의 다능성 능력에서 관찰된 차이(테라토마 대 키메라 형성)는 배양에서 EpiSCs의 두 기능적으로 구별되는 서브군의 존재에 기인한다는 것을 암시한다.Based on the unique expression of the Oct4-GFP transgene, we found that EpiSCs were not uniform and included two other unique cell subgroups (Oct4-GFP positive group and Oct4-GFP negative group). These two subgroups showed clear differences in developmental potential, including molecular properties and chimerism. We note that these two subgroups do not exhibit ES-like cells that spontaneously converted and are similar to cells in embryos after early and late stage implantation. Thus, this finding suggests that the difference observed in the pluripotent capacity of EpiSCs (teratoma versus chimera formation) is due to the presence of two functionally distinct subgroups of EpiSCs in culture.
배아 줄기세포(ESCs)는 적어도 두 군의 갈라지는 다능성을 가지는 세포 군을 포함한다. 본 발명에서 본 발명자들은 착상 후 배반엽상피줄기세포(Epiblast stem cells;EpiSCs)도 Oct4-GFP 마커의 발현에 의하여 구별될 수 있는 두 구별되는 세포 군을 포함한다는 것을 보여준다. 이 두 서브군인 Oct4-GFP 양성 및 음성 EpiSCs는 인 비트로에서 서로 전환될 수 있다. Oct4-GFP 양성 및 음성 EpiSCs는 전체 유전자 발현 패턴,후성적 프로파일 및 Oct4 인헨서 이용에 대해서 ESC와 구별된다.Embryonic stem cells (ESCs) comprise a cell population having at least two groups of divergent pluripotency. In the present invention, the present inventors also found that after implantation, blastocyst epithelial cells (EpiSCs) It is shown that it comprises two distinct cell groups that can be distinguished by the expression of Oct4-GFP markers. These two subgroups, Oct4-GFP positive and negative EpiSCs, can be converted to each other in vitro. Oct4-GFP positive and negative EpiSCs are distinguished from ESCs in terms of overall gene expression pattern, epigenetic profile and Oct4 enhancer use.
Oct4-GFP 음성 세포들은 후기 마우스 상배엽의 세포와 특징을 공유하고 키메라를 형성할 수 없다. 그러나 단지 적은 EpiSC 분획을 나타내는 Oct4-GFP 양성 EpiSCs는 초기 상배엽의 세포와 닮았고, 키메라에 용이하게 기여할 수 있다. Oct4-GFP negative cells share characteristics with the cells of the late mouse epidermal and cannot form chimeras. However, Oct4-GFP positive EpiSCs, which show only a small EpiSC fraction, resemble the cells of the early mesoderm and can easily contribute to chimeras.
본 발명의 결과는 키메라의 기여에 대한 EpiSCs의 희박한 능력은 초기 상배엽을 나타내는 EpiSC 분획의 존재에 기인한다는 것을 암시한다.The results of the present invention suggest that the lean ability of EpiSCs for the contribution of chimeras is due to the presence of the EpiSC fraction representing early epidermis.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
확립된 Established GOF18GOF18 EpiSCsEpiscs 에서 in Oct4Oct4 -- GFPGFP 전이유전자의 동적 발현 Dynamic expression of the transgene
착상후 배아 줄기세포는 Oct4 유전자의 전체 조절 부위의 조절 하에서 GFP 전이유전자를 함유하는 GOF18 (genomic Oct4 절편, 18 kb) 마우스로부터 추출하였다(Yeom, Y.I., Fuhrmann, G., Ovitt, C.E., Brehm, A., Ohbo, K., Gross, M., Hubner,K., and Scholer, H.R. (1996). Development 122, 881-894). 마우스 EpiSCs의 특성은 Oct4 유전자 전사에 대하여 원거리 인헨서보다 근거리 인헨서의 사용을 선호한다(Tesar, P.J., Chenoweth, J.G., Brook, F.A., Davies, T.J., Evans, E.P., Mack,D.L., Gardner, R.L., and McKay, R.D. (2007). Nature 448, 196-199).After implantation, embryonic stem cells were extracted from GOF18 (genomic Oct4 fragment, 18 kb) mice containing a GFP transgene under the control of the entire regulatory region of the Oct4 gene (Yeom, YI, Fuhrmann, G., Ovitt, CE, Brehm, A., Ohbo, K., Gross, M., Hubner, K., and Scholer, HR (1996). Development 122, 881-894). Characterization of mouse EpiSCs favors the use of near-field enhancers over distant enhancers for Oct4 gene transcription (Tesar, PJ, Chenoweth, JG, Brook, FA, Davies, TJ, Evans, EP, Mack, DL, Gardner, RL). and McKay, RD (2007) .Nature 448, 196-199).
따라서 착상 후 상배엽 및 GOF18 마우스로부터 확립된 EpiSC 모두는 이론적으로 Oct4를 발현하고 Oct4-GFP 양성이다. Thus both EpiSCs established from epidermal and GOF18 mice after implantation theoretically express Oct4 and are Oct4-GFP positive.
본 발명자들은 먼저 양 확립된 EpiSCs(도 1a) 및 착상 후 상배엽(도 5e)에서 Oct4-GFP의 발현을 조사하였다. 인 비보 상배엽은 Oct4-GFP 양성인 반면, 단지 낮은 퍼센트의 확립된 GOF18 EpiSCs는 몇 계대 후 Oct4-GFP 발현을 유지하였다(도 1a 및 도 2a; 도 5e 참조).We first examined the expression of Oct4-GFP in both established EpiSCs (FIG. 1A) and postimplantation epidermal (FIG. 5E). In vivo epidermals were Oct4-GFP positive, whereas only a low percentage of established GOF18 EpiSCs maintained Oct4-GFP expression after several passages (FIGS. 1A and 2A; see FIG. 5E).
GOF18 EpiSCs는 독립적으로 유래된 EpiSC 라인의 것과 매우 유사한 전체 유전자 발현 프로파일을 나타내었지만 ESCs의 것과는 차이가 있다(도 1b 및 1c).GOF18 EpiSCs showed an overall gene expression profile very similar to that of independently derived EpiSC lines but differed from that of ESCs (FIGS. 1B and 1C).
Oct4 단백질 수준은 ESCs 및 EpiSCs와 유사하였지만, Sox2 및 Nanog 단백질 수준은 EpiSCs에서 더 낮았다(도 1d 및 1e).Oct4 protein levels were similar to ESCs and EpiSCs, but Sox2 and Nanog protein levels were lower in EpiSCs (FIGS. 1D and 1E).
따라서 Oct4-GFP 전이유전자의 발현은 GOF18 EpiSCs에서 내생적 Oct4 유전자의 것에 해당하는 것으로 나타나지 않았고, 이것은 인 비보 상배엽의 인비트로 배양 조건에 적용에 기인되는 것으로 예측하게 하였다. Thus, expression of Oct4-GFP transgene did not appear to correspond to that of the endogenous Oct4 gene in GOF18 EpiSCs, which was predicted to be due to application in vitro culture conditions of in vivo complement germline.
Oct4-GFP 전이유전자의 불활성화는 유전자 및 단백질 수준에서 내생적 Oct4 로커스에는 영향을 미치지 않지만 GFP 전이유전자에 영향을 미칠 수 있는 인 비트로 배양 변화에서 일어나는 후성적 변화를 일으킬 수 있다. 그러나, 약 0.5%의 GOF18 EpiSCs는 일련의 계대 후 Oct4-GFP 양성을 보유하였다(도 2a)Inactivation of the Oct4-GFP transgene does not affect the endogenous Oct4 locus at the gene and protein levels, but can cause epigenetic changes that occur in in vitro culture changes that may affect the GFP transgene. However, about 0.5% of GOF18 EpiSCs retained Oct4-GFP positive after a series of passages (FIG. 2A).
다음으로 본 발명자들은 EpiSCs의 이 Oct4-GFP 양성 군의 특성을 조사하였다. 이를 위하여, 본 발명자들은 형광-활성 세포 분류기(FACS)에 의하여 Oct4-GFP 양성 및 음성 세포를 분류하고 그들을 분리하여 배양하였다. 흥미롭게도, FACS 분류 48시간 후, Oct4-GFP 양성 세포가 GFP 발현의 손실을 시작하였다. 반면에, 일부 Oct4-GFP 음성 세포는 GFP 발현을 얻기 시작하였다(도 2b). 배양 1 주일 후, 각 배양에서 Oct4-GFP 양성 세포의 퍼센트는 모계 미분류된(parental nonsorted) EpiSCs의 것과 유사하였다.Next, the inventors examined the properties of this Oct4-GFP positive group of EpiSCs. To this end, we sorted Oct4-GFP positive and negative cells by fluorescence-activated cell sorter (FACS) and isolated them and cultured them. Interestingly, 48 hours after FACS sorting, Oct4-GFP positive cells started to lose GFP expression. On the other hand, some Oct4-GFP negative cells started to get GFP expression (FIG. 2B). After one week of culture, the percentage of Oct4-GFP positive cells in each culture was similar to that of parental nonsorted EpiSCs.
Oct4-GFP 음성 EpiSCs는 작은 비율의 Oct4-GFP 양성 EpiSCs을 야기하고( 약 0.2% Oct4-GFP 양성), 반면 대부분의 Oct4-GFP 양성 EpiSCs는 Oct4-GFP 음성 EpiSCs로 전환된다(약 0.5% Oct4-GFP 양성) (도 2c).Oct4-GFP negative EpiSCs cause a small percentage of Oct4-GFP positive EpiSCs (about 0.2% Oct4-GFP positive), while most Oct4-GFP positive EpiSCs are converted to Oct4-GFP negative EpiSCs (about 0.5% Oct4- GFP positive) (FIG. 2C).
이 전환을 더 잘 이해하기 위하여, 본 발명자들은 클론 어세이를 수행하였다(도 2d). 본 발명자들은 그 후 96웰 플레이트에서 FACS sorted 단일 Oct4-GFP 양성 및 음성 세포(Oct4-GFP 음성 EpiSCs를 가지는 10 X 96-웰 플레이트 및 Oct4-GFP 양성 EpiSCs를 가지는 5 X 96-웰 플레이트). 960 Oct4-GFP 음성 EpiSCs 중 58개 및 480 Oct4-GFP 양성 EpiSCs 중 30개가 배양 1주일 후 생존하였다. 배양 1주 후, 5 Oct4-GFP 음성 클론 라인이 Oct4-GFP 전이유전자의 부분적인 재활성화를 나타내었다. 유사하게 12 Oct4-GFP 양성 싱글 세포주가 부분적 또는 전체적으로 Oct4-GFP 발현을 상실하였다(도 2d). To better understand this conversion, we performed a clone assay (FIG. 2D). We then followed FACS sorted single Oct4-GFP positive and negative cells (10 × 96-well plates with Oct4-GFP negative EpiSCs and 5 × 96-well plates with Oct4-GFP positive EpiSCs) in 96 well plates. 58 of 960 Oct4-GFP negative EpiSCs and 30 of 480 Oct4-GFP positive EpiSCs survived one week after culture. After 1 week of culture, the 5 Oct4-GFP negative clone line showed partial reactivation of Oct4-GFP transgene. Similarly, 12 Oct4-GFP positive single cell lines partially or totally lost Oct4-GFP expression (FIG. 2D).
이 결과들은 Oct4-GFP 양성 및 음성 EpiSCs 모두는 배양에서 Oct4-GFP 양성 및 음성 EpiSCs 사이에 동적 평형상태를 야기하는 상호전환능력을 가진다는 것을 나타낸다.These results indicate that both Oct4-GFP positive and negative EpiSCs have the interconversion capacity causing dynamic equilibrium between Oct4-GFP positive and negative EpiSCs in culture.
Oct4Oct4 -- GFPGFP 양성 및 음성 Positive and negative EpiSCsEpiscs 는 독특한 유전자 발현 프로파일을 가짐Has a unique gene expression profile
다음으로 본 발명자들은 Oct4-GFP 양성 및 음성 서브군이 분자적 수준에서 다른지를 조사하였다. 양 FACS-분류된 서브군의 전체 유전자 발현 프로파일은 마이크로 어레이 분석에 의하여 결정하였다. Oct4-GFP 음성 EpiSCs의 전체 유전자 발현 프로파일(전체 GOF18 EpiSC 배양의 99%를 나타냄)은 모계 비분류된 GOF18 EpiSCs의 것과 매치되었다(도 3a). 또한 Oct4-GFP 양성 분획의 전체 발현 프로파일은 음성 분획의 프로파일과 매우 유사하였으나 ESC 조절 전사체의 것과는 많이 달랐다 (도 3a 및 3b).Next we examined whether the Oct4-GFP positive and negative subgroups differed at the molecular level. The overall gene expression profile of both FACS-classified subgroups was determined by micro array analysis. The overall gene expression profile of Oct4-GFP negative EpiSCs (indicating 99% of the total GOF18 EpiSC culture) matched that of the maternal unclassified GOF18 EpiSCs (FIG. 3A). In addition, the overall expression profile of the Oct4-GFP positive fraction was very similar to that of the negative fraction, but was very different from that of the ESC regulatory transcripts (FIGS. 3A and 3B).
Fgf5 및 Brachyury (T)와 같은 EpiSC 마커들이 GFP 음성 EpiSCs에 비교하여 양성 서브군에서 다운조절되었다. 전체적으로 이들 발견들은 Oct4-GFP 양성 세포는 본질적으로는 여전히 EpiSCs이지만 그들은 일부 특징적인 마커 유전자의 발현에 의하여 더 풍부한 EpiSC 서브군과 차이가 있다는 것을 나타낸다.EpiSC markers such as Fgf5 and Brachyury (T) were downregulated in the positive subgroup compared to GFP negative EpiSCs. Overall these findings indicate that Oct4-GFP positive cells are still EpiSCs in nature but they differ from the richer EpiSC subgroup by expression of some characteristic marker genes.
본 발명자들은 Oct4-GFP 양성 EpiSCs가 ES-유사 상태로 전환되었던 EpiSCs를 나타낼 가능성을 더욱 배제하려 하였다. 계통도 클러스터링에 의하여 나타난 것과 같이, Oct4-GFP 양성 뿐아니라 Oct4-GFP 음성 EpiSCs는 ESCs는 명확하게 다르고, 독립적인 EpiSC 라인을 가지고 클러스터되었다(도 3c 및 3d). The inventors further tried to rule out the possibility that Oct4-GFP positive EpiSCs exhibited EpiSCs that had been converted to an ES-like state. As shown by phylogenetic clustering, Oct4-GFP positive as well as Oct4-GFP negative EpiSCs were clustered with distinct EpiSCs with distinct ESCs and independent EpiSC lines (FIGS. 3C and 3D).
따라서 Oct4-GFP 양성 EpiSC 서브군은 ES-유사 상태로 자발적으로 전환되는 EpiSC 세포군을 나타내지 않는다.Thus the Oct4-GFP positive EpiSC subgroup does not represent an EpiSC cell population that spontaneously converts to an ES-like state.
Oct4Oct4 -- GFPGFP 양성 및 음성 Positive and negative EpiSCsEpiscs 사이에 Between 후성적Post-sexual 차이 Difference
다음 본 발명자들은 Oct4-GFP 양성 및 음성 EpiSCs 사이에 유전자 발현의 차이의 적어도 일부가 차별적인 후성적 변경을 일으킬 수 있는지를 조사하였다(도 3a).We then investigated whether at least some of the differences in gene expression between Oct4-GFP positive and negative EpiSCs can cause differential epigenetic alterations (FIG. 3A).
이를 위해서, 본 발명자들은 Oct4-GFP 양성 및 음성 EpiSCs 모두에서 내생적 및 전이유전자 Oct4 부위의 DNA 메틸화 상태를 조사하였다. 유전자 발현 프로파일 데이터(도 3a)와 일치하게, 내생적 Oct4의 프로모터 부위는 양 서브군에서 완전하게 비메틸화되었다(도 3e). 그러나, Oct4-GFP 전이유전자 프로모터는 Oct4-GFP 양성 EpiSCs에서는 일부메틸화되었으나 Oct4-GFP 음성 EpiSCs에서는 매우 많이 메틸화되었다(도 3E). 이들 데이터는 EpiSC 배양에서 동적 Oct4-GFP 변동을 조절하는 기작이 Oct4-GFP 양성 및 음성 EpiSCs 내 Oct4-GFP 프로모터의 DNA 메틸화 상태의 차이와 관련이 있다는 것을 나타낸다.To this end, we investigated the DNA methylation status of endogenous and transgene Oct4 sites in both Oct4-GFP positive and negative EpiSCs. Consistent with gene expression profile data (FIG. 3A), the promoter region of endogenous Oct4 was completely unmethylated in both subgroups (FIG. 3E). However, Oct4-GFP transgene promoter was partially methylated in Oct4-GFP positive EpiSCs but very much methylated in Oct4-GFP negative EpiSCs (FIG. 3E). These data indicate that the mechanism that regulates dynamic Oct4-GFP fluctuations in EpiSC culture is associated with differences in DNA methylation status of Oct4-GFP promoters in Oct4-GFP positive and negative EpiSCs.
다음 본 발명자들은 Oct4-GFP 양성 세포들이 초기PGCs를 나타낼 수 있는지를 조사하였다. 이를 위해서, 본 발명자들은 ESCs, Oct4-GFP 양성 및 음성 EpiSCs,PGCs, 및 마우스 배아 섬유아세포(MEFs)에서 생식 세포 마커 Stella (Dppa3), Vasa, 및 Fragilis(Iftm3)의 프로모터 부위를 조사하였다. 예상한 것과 같이, 조사된 모든 프로모터 부위는 MEFs에서 완전하게 메틸화되었으나 PGCs에서는 완전하게 비메틸화되었다.We then investigated whether Oct4-GFP positive cells can exhibit early PGCs. To this end, we investigated the promoter sites of germ cell markers Stella (Dppa3), Vasa, and Fragilis (Iftm3) in ESCs, Oct4-GFP positive and negative EpiSCs, PGCs, and mouse embryo fibroblasts (MEFs). As expected, all promoter sites examined were completely methylated in MEFs but completely unmethylated in PGCs.
반면, 생식세포 마커 유전자들은 ESCs 또는 PGCs가 아니라 MEF와 유사하게 Oct4-GFP 음성 및 양성 EpiSCs에서 완전하게 메틸화되었다(도 3f). 결국, 모계 미분류된 EpiSCs는 Oct4-GFP 음성 EpiSCs와 동일한 메틸화 패턴을 나타내었다(데이터 도시 안함). 이들 데이터는 Oct4-GFP 양성 세포가 ES 유사도 아니고 PGC-유사도 아닌 전체적으로 EpiSC 성질을 가진다는 것을 더욱 지지한다.In contrast, germ cell marker genes were completely methylated in Oct4-GFP negative and positive EpiSCs similar to MEF but not ESCs or PGCs (FIG. 3F). Eventually, maternal unclassified EpiSCs showed the same methylation pattern as Oct4-GFP negative EpiSCs (data not shown). These data further support that Oct4-GFP positive cells have EpiSC properties as a whole, which are neither ES-like nor PGC-like.
반면, Dppa5 프로모터의 메틸화 패턴은 Oct4-GFP 양성 EpiSCs 및 ESCs와 유사하였다 (도 3f). 이것은 Oct4-GFP 음성 EpiSCs와 비교하여 Oct4-GFP 양성 EpiSCs에서 증가된 Dppa5 발현을 나타내는 유전자 발현 프로파일 데이터와 일치한다(도 3a).In contrast, the methylation pattern of the Dppa5 promoter was similar to Oct4-GFP positive EpiSCs and ESCs (FIG. 3F). This is consistent with gene expression profile data showing increased Dppa5 expression in Oct4-GFP positive EpiSCs compared to Oct4-GFP negative EpiSCs (FIG. 3A).
이 데이터는 Oct4-GFP 양성 세포가 Oct4-GFP 음성 세포와 일부 ESC 마커 유전자들의 발현에서 차이가 있다는 것을 제안한다.이들 데이터는 EpiSCs의 Oct4-GFP 양성 및 음성 서브군 사이에 동적인 상호교환이 DNA 메틸화 의존적인 기작에 의하여 조절된다는 것을 더욱 암시한다.These data suggest that Oct4-GFP positive cells differ in the expression of Oct4-GFP negative cells and some ESC marker genes. These data indicate that the dynamic interchange between Oct4-GFP positive and negative subgroups of EpiSCs is DNA. Further suggests that it is regulated by methylation dependent mechanisms.
Oct4Oct4 -- GFPGFP 양성 및 음성 Positive and negative EpiSCsEpiscs 는 독특한 Is unique ESCESC 전환률을Conversion rate 나타냄 Indicates
다음, 본 발명자들은 이들 두 EpiSC 군이 기능면에서 다른지를 조사하였다. Oct4-GFP 양성 세포가 일부 ESC 마커의 업레귤레이션을 나타내었기 때문에, 본 발명자들은 Oct4-GFP 양성 EpiSCs가 Oct4-GFP 음성 EpiSCs 보다 더 용이하게 전환될 것이다고 예측하였다. 2i 조건 하에서, alkaline phosphatase에 대한 양성 콜로니 염색 수에 의하여 결정된 것과 같이, Oct4-GFP 양성 EpiSCs의 전환 효율은 Oct4-GFP 음성 EpiSCs의 것과 비교하여 더 높았다(도 4a 및 4b). 특히, Oct4-GFP 양성 EpiSCs의 전환은 EpiSC 배지가 아니라 단지 2i+LIF의 존재하에서만 관찰되었고 본 발명자들은 또한 전형적인 ESC 배지(LIF 만)에서 전환된 ES 유사 세포를 얻었다. 따라서 비록 Oct4-GFP 양성 세포가 ES 유사 세포를 나타내지 않지만, 그들은 Oct4-GFP 음성 EpiSCs 보다 실질적으로 더 높은 효율로 전환될 수 있다.Next, the inventors examined whether these two EpiSC groups differed in function. Since Oct4-GFP positive cells showed upregulation of some ESC markers, we predicted that Oct4-GFP positive EpiSCs would be more easily converted than Oct4-GFP negative EpiSCs. Under 2i conditions, the conversion efficiency of Oct4-GFP positive EpiSCs was higher compared to that of Oct4-GFP negative EpiSCs, as determined by the number of positive colony staining for alkaline phosphatase (FIGS. 4A and 4B). In particular, the conversion of Oct4-GFP positive EpiSCs was observed only in the presence of 2i + LIF, not EpiSC medium and we also obtained ES-like cells converted in typical ESC medium (LIF only). Thus, although Oct4-GFP positive cells do not exhibit ES-like cells, they can be converted to substantially higher efficiency than Oct4-GFP negative EpiSCs.
최종적으로, Oct4-GFP 양성 EpiSCs가 ES-유사 세포로 실질적으로 자발적으로 전환되는 가능성을 명확하게 배제하기 위하여, 본 발명자들은 Oct4-GFP 양성 EpiSCs로부터 전환된 ES 유사 세포에서 Stella,Fragilis, Vasa, 및 Dppa5의 프로모터 메틸화 패턴을 조사하였다. 도 4c에 나타낸 것과 같이, 그 전환된 ES-유사 세포는 ES와 같이 그러나 그들이 유래된 Oct4-GFP 양성 EpiSCs와 비교하여 명확하게 다른 Stella 프로모터의 DNA 메틸화 패턴을 나타낸다(도 3f). 또한, 그 전환된 ES-유사 세포는 ESC와 같이 생식 세포 마커 Fragilis, Vasa, 및 Dppa5의 감소된 DNA 프로모터 메틸화를 나타내지만, Oct4-GFP 양성 EpiSCs는 이들 생식 세포 마커 유전자의 과메틸화를 나타내었다(도 4c 및 도 3f).Finally, in order to explicitly exclude the possibility of Oct4-GFP positive EpiSCs being substantially spontaneously converted to ES-like cells, we have identified Stella, Fragilis, Vasa, and in ES-like cells converted from Oct4-GFP positive EpiSCs. The promoter methylation pattern of Dppa5 was investigated. As shown in FIG. 4C, the converted ES-like cells exhibit DNA methylation patterns of Stella promoters that are clearly different, as compared to Oct4-GFP positive EpiSCs from which they were derived (FIG. 3F). In addition, the converted ES-like cells exhibited reduced DNA promoter methylation of germline markers Fragilis, Vasa, and Dppa5 like ESCs, while Oct4-GFP positive EpiSCs showed hypermethylation of these germline marker genes ( 4c and 3f).
따라서, Oct4-GFP 양성 EpiSCs 및 전환된 ES-유사 세포의 독특한 DNA메틸화 패턴은 Oct4-GFP 양성 EpiSC 서브군이 EpiSC 배양에서 ES-유사 상태로 자발적으로 전환된 EpiSCs를 나타내는 것을 명백하게 제외하게 한다.Thus, the unique DNA methylation pattern of Oct4-GFP positive EpiSCs and converted ES-like cells explicitly excludes that Oct4-GFP positive EpiSC subgroups exhibit EpiSCs that spontaneously converted to ES-like states in EpiSC culture.
Oct4Oct4 -- GFPGFP 양성 및 음성 Positive and negative EpiSCsEpiscs 는 다른 발생 단계의 Of different occurrence stages PregastrulationPregastrulation 상배엽을Epidermis 나타냄 Indicates
Oct4-GFP 양성 및 Oct4-GFP 음성 EpiSCs는 일부 ESC 마커 유전자의 차별적인 발현(도 3a), 구별되는 Dppa5 메틸화 패턴 (도 3f), 및 독특한 ESC 전환 효율(도 4a 및 4b)은 나타낸다. 흥미롭게도,Oct4-GFP 음성 EpiSCs에 비하여 양성에서 덜 메틸화된 Dppa5(도 3f)는 E 6.5가 아니라 E5.5 상배엽에서 발현된다. Oct4-GFP positive and Oct4-GFP negative EpiSCs show differential expression of some ESC marker genes (FIG. 3A), distinct Dppa5 methylation patterns (FIG. 3F), and unique ESC conversion efficiencies (FIGS. 4A and 4B). Interestingly, Dppa5 (FIG. 3F), which is less methylated in positive compared to Oct4-GFP negative EpiSCs, is expressed in E5.5 epidermis rather than E 6.5.
이들 관찰들은 다른 Oct4-GFP 전이유전자 발현을 가지는 세포가 다른 발생 단계의 인 비보 상배엽에 실질적으로 해당하는지를 조사하게 하였다. 이를 위해, 본 발명자들은 GOF18 마우스로부터 분리된 E5.5 및 E6.5 인 비보 상배엽의 유전자 프로파일을 비교하였다. 그러한 초기 단계로부터 온 상배엽은 아주 제한된 수의 세포만을 가지므로, 전체 유전자 프로파일 과정은 많은 도전을 주었다. 또한, Oct4-GFP 양성 EpiSCs는 마이크로어레이 유전자 분석에 기반한 모계 EpiSCs와 매우 유사하기 때문에(도 3c), 본 발명자들은 Oct4-GFP 양성 및 음성 EpiSCs에서 차별적으로 발현되는 특정 유전자를 비교하였다. These observations led to the investigation of whether cells with different Oct4-GFP transgene expressions correspond substantially to in vivo complementary germline at different stages of development. To this end, we compared the gene profiles of the E. coli in vivo complementary embryos isolated from GOF18 mice. Since the epidermis from such early stages has only a very limited number of cells, the entire gene profiling process presents a number of challenges. In addition, since Oct4-GFP positive EpiSCs are very similar to maternal EpiSCs based on microarray gene analysis (FIG. 3C), we compared specific genes differentially expressed in Oct4-GFP positive and negative EpiSCs.
이를 위해서, E5.5 및 E6.5 후배엽 모두로부터 온 Oct4-GFP 양성 세포를 분류하고 실시간 PCR을 수행하였다. Oct4-GFP 양성 및 음성 EpiSCs에서 차별적으로 발현되는 Rex1 (Zfp42),Esrrb, Fbxo15, Klf2, Klf4, Klf5, Stella, Dppa4, Dppa5, Dnmt3l,Piwil2, Fragilis, 및 T와 같은유전자들(도 3a)을 분석을 위해서 선택하였다. 마이크로어레이 데이터와 일치하게, 대부분의 ESC 마커들이 Oct4-GFP 음성 EpiSCs 및 E6.5와 비교하여 Oct4-GFP 양성 및 E5.5 상배엽에서 각각 높이 발현되었다(도 5a 및 5b). 한편,Fragilis 및 T는 Oct4-GFP 양성 EpiSCs 및 E5.5와 비교하여 Oct4-GFP 음성 및 E6.5 상배엽에서 각각 높이 발현되었다(도 5a 및 5b).To this end, Oct4-GFP positive cells from both E5.5 and E6.5 mesoderm were sorted and real time PCR was performed. Genes such as Rex1 (Zfp42), Esrrb, Fbxo15, Klf2, Klf4, Klf5, Stella, Dppa4, Dppa5, Dnmt3l, Piwil2, Fragilis, and T differentially expressed in Oct4-GFP positive and negative EpiSCs (Figure 3a) Selected for analysis. Consistent with the microarray data, most of the ESC markers were expressed high in Oct4-GFP positive and E5.5 epidermis, respectively, compared to Oct4-GFP negative EpiSCs and E6.5 (FIGS. 5A and 5B). On the other hand, Fragilis and T were expressed high in Oct4-GFP negative and E6.5 epidermis, respectively, compared to Oct4-GFP positive EpiSCs and E5.5 (FIGS. 5A and 5B).
따라서, Oct4-GFP 양성 및 음성 EpiSCs의 발현 패턴은 각각 E5.5 및 E6.5 상배엽과 상관관계가 있다.Thus, expression patterns of Oct4-GFP positive and negative EpiSCs correlate with E5.5 and E6.5 epidermis, respectively.
다음, 본 발명자들은 다른 단계의 인 비보 상배엽과 EpiSC 서브군 사이의 관련성을 결정하기 위하여 컴퓨터 분석을 사용하였다. 실시간 RQ 값으로 게산된 히트 맵은 매우 유사한 상관성을 보여준다(도 5c). 루시퍼레이트 어세이를 사용하여, 본 발명자들은 Oct4-GFP 양성 및 음성 EpiSCs에서 Oct4 인헨서 이용/활성을 비교하였다. 대조군으로, 본 발명자들은 Oct4-GFP 양성 EpiSCs으로부터 전환된 ES-유사 세포를 사용하였다.Next, we used computer analysis to determine the association between the different stages of in vivo germline and EpiSC subgroups. Heat maps calculated with real-time RQ values show very similar correlations (FIG. 5C). Using luciferate assays, we compared Oct4 enhancer utilization / activity in Oct4-GFP positive and negative EpiSCs. As a control, we used ES-like cells converted from Oct4-GFP positive EpiSCs.
Oct4-GFP 음성 EpiSCs는 PE를 특이적으로 사용하였고, 그 전환된 ES-유사세포는 강한 DE 활성을 나타내었다(도 5d).Oct4-GFP negative EpiSCs specifically used PE, and the converted ES-like cells showed strong DE activity (FIG. 5D).
흥미롭게도, Oct4-GFP 양성 EpiSCs는 PE를 더 잘 이용하지만, 그들은 일부 DE 활성을 나타낸다(도 5d). Oct4-GFP 양성 EpiSCs에서 이 예측되지 않은 DE 활성은 초기 단계 인 비보 상배엽에서 인헨서 활성을 분석하게 하였다. 본 발명자들은 GOF18 (DE 및 PE를 함유) 및 GOF18DPE 마우스로부터 인 비보 상배엽(E5.5, E6.6, 및 E7.5)을 분리하였다. E5.5, E6.6, 및 E7.5에 대하여 GOF18DPE 마우스로부터 인 비보 상배엽은 GFP 양성이다(도 5e). 그러나 인 비보 GOF18DPE 상배엽(E5.5 및 E6.5)도 GFP 양성이었지만 GFP 발현이 GOF18 마우스의 것과 비교하여 매우 약하였다(즉 GFP 신호가 과노출 없이는 거의 검출되지 아니함). GFP 강도는 E6.5에서 점차적으로 감소되었다(도 5e). 이 관찰은 초기 단계의 상배엽은 PE 활성과 함께 여전하게 잔류 DE 활성을 보유한다는 것을 암시한다. 따라서, 착상의 시간 주위로 널리 받아들여지는 인헨서 스위치(E4.5)는 예상보다 늦게 일어나는 것으로 나타난다.Interestingly, Oct4-GFP positive EpiSCs better use PE, but they show some DE activity (FIG. 5D). This unanticipated DE activity in Oct4-GFP positive EpiSCs led to the analysis of enhancer activity in the early stages of the complementary germ layers. We isolated in vivo superior germ layers (E5.5, E6.6, and E7.5) from GOF18 (containing DE and PE) and GOF18DPE mice. In vivo autogenous from GOF18DPE mice for E5.5, E6.6, and E7.5 are GFP positive (FIG. 5E). However, the in vivo GOF18DPE upper germ layers (E5.5 and E6.5) were also GFP positive, but GFP expression was very weak compared to that of GOF18 mice (ie, GFP signals were hardly detected without overexposure). GFP intensity gradually decreased at E6.5 (FIG. 5E). This observation suggests that the early germ layers still retain residual DE activity with PE activity. Thus, the enhancer switch E4.5, widely accepted around the time of implantation, appears to occur later than expected.
따라서, Oct4-GFP 양성 EpiSCs에서 관찰되는 DE활성은 초기 단계의 상배엽에서 Oct4 인헨서 이용과 상관관계를 가진다(도 5d 및 5e).Thus, DE activity observed in Oct4-GFP positive EpiSCs correlates with Oct4 enhancer use in early stage mesoderm (FIGS. 5D and 5E).
실시간 PCR 데이터와 결합하여 인헨서 이용 어세이는 Oct4-GFP 양성 EpiSCs가 초기 발생 단계의 상배엽에 해당되는 반면 Oct4-GFP 음성 EpiSCs는 후기 단게의 상배엽과 상당하게 유사하다는 것을 제안한다.Enhancer use assays in combination with real-time PCR data suggest that Oct4-GFP positive EpiSCs correspond to the early developmental epidermis, while Oct4-GFP negative EpiSCs are significantly similar to the later stages.
Oct4Oct4 -- GFPGFP 양성 positivity EpiSCsEpiscs 는 The 키메라에Chimera 기여할 수 있음 Can contribute
초기 및 후기 단계 인 비보 상배엽 사이와 같이 Oct4-GFP 양성 및 음성 EpiSCs 사이에 기능적 차이가 있는지를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 이들 두 세포군이 키메라에 기여할 수 있는지를 조사하였다. 배반포로 Oct4-GFP 양성 EpiSCs의 주사는 단지 약 10%의 배아가 ICM 통합(integration)을 나타내었다(도 6a). In order to investigate whether there is a functional difference between Oct4-GFP positive and negative EpiSCs, such as between the early and late stages of the complementary germ layers, we examined whether these two cell groups could contribute to the chimera. Injection of Oct4-GFP positive EpiSCs into blastocysts showed only 10% embryos showing ICM integration (FIG. 6A).
놀랍게도, 이들 배아의 전달을 수반하여, 코트-칼라 키메리즘 뿐 아니라 생식선 기여도 보여진다(도 6b 및 6c). 재구축된 배아에서 Oct4-GFP 음성 EpiSCs의 운명을 쫓기 위해서 본 발명자들은 먼저 Td-tomato lentivirus로 GOF18 EpiSCs를 감염시켰다. 다음 본 발명자들은 새로운 Td-tomato GOF18 EpiSC 라인을 확립하였다(Epi-Red) (도 6d). Tomato 양성/Oct4-GFP 음성 세포를 FACS 분류하고 배반포로 주사하였으나 ICM 통합은 관찰되지 않았다(도 6e). 따라서, Oct4-GFP 음성 EpiSCs(배양에서 약 99%의 EpiSCs를 차지함)는 Oct4-GFP 양성 EpiSCs과 다르게 발생능이 없다.Surprisingly, along with the delivery of these embryos, not only coat-color chimerism but also germline contributions are shown (FIGS. 6B and 6C). In order to chase the fate of Oct4-GFP negative EpiSCs in reconstructed embryos, we first infected GOF18 EpiSCs with Td-tomato lentivirus. We then established a new Td-tomato GOF18 EpiSC line (Epi-Red) (FIG. 6D). Tomato positive / Oct4-GFP negative cells were FACS sorted and injected into blastocysts but no ICM integration was observed (FIG. 6E). Thus, Oct4-GFP negative EpiSCs (which occupy about 99% of EpiSCs in culture) are unlikely to develop unlike Oct4-GFP positive EpiSCs.
이것과 함께, 본 발명의 데이터는 Oct4-GFP 양성 EpiSCs는 초기 단계 상배엽 (E5.5)의 세포를 나타내는 반면, Oct4-GFP 음성 EpiSCs는 후기 단계의 상배엽(E6.5 or E7.5)의 것과 유사하다는 것을 암시한다.
Along with this, the data of the present invention show that Oct4-GFP positive EpiSCs show cells of early stage upper germ (E5.5), while Oct4-GFP negative EpiSCs show late stage upper germ (E6.5 or E7.5). It is similar to that of.
Dppa5Dppa5 과발현은 초기 단계 Overexpression is at an early stage 상배엽Epidermis 분획을 증가시킴 Increase fraction
다음으로 본 발명자들은 Oct4-GFP 양성 EpiSCs 및 초기 단계 상배엽에서는 특이적으로 발현되지만 Oct4-GFP 음성 EpiSCs 및 후기 단계의 상배엽에서는 발현되지 아니하는 유전자인 Dppa5의 과발현이 Oct4-GFP 양성 분획을 증가시킬 수 있는지를 테스트하였다. Dppa5-과발현 EpiSCs는 비감염된 EpiSCs 와 비교하여 Oct4-GFP 양성 세포에서 약 6배의 증가를 보였다(도 7a). Next, we found that overexpression of Dppa5, a gene that is specifically expressed in Oct4-GFP-positive EpiSCs and early stage upper germ layers, but not in Oct4-GFP-negative EpiSCs and late stage upper germ layers, increased the Oct4-GFP positive fraction. Was tested. Dppa5-overexpressing EpiSCs showed about a six-fold increase in Oct4-GFP positive cells compared to uninfected EpiSCs (FIG. 7A).
다음 본 발명자들은 Dppa5-과발현 및 대조군 EpiSCs로부터 Oct4-GFP 양성 세포를 FACS 분류하여 또 다른 10 계대 동안 그들을 배양하였다. Dppa5-과발현 및 대조군 EpiSCs로부터 온 Oct4-GFP 양성 세포는 즉시 Oct4-GFP 발현을 상실하기 시작하였다. 2 계대 후, 10.5%의 Dppa5-과발현 세포 및 6.3%의 대조군 EpiSCs가 GFP 양성을 유지하였다. 대조군 EpiSCs로부터 온 GFP 양성 세포의 수는 4계대에서 그 수준이 모계 비분류된 EpiSCs의 수준인 1.3%에 도달할 때까지 계속 감소하였다. 그러나, GFP 양성 세포는 심지어 수 계대 후에도 Dppa5-과발현 EpiSCs에서 약 4%-6%로 안정적으로 유지되었다. Dppa5 과발현이 EpiSCs를 ES-유사 상태로 복귀시킬 수 있는 가능성을 배제하기 위하여, Oct4-GFP 세포를 Dppa5-과발현 EpiSCs로부터 분류하여, Rex1 프로모터의 메틸화 상태를 bisulfite 시퀀싱 PCR로 조사하였다. Rex1 프로모터는 Oct4-GFP 양성 및 음성 EpiSCs에서와 유사하게, 많이 메틸화되었고 이것은 증가된 Oct4-GFP 양성 분획이 ES 유사 상태를 얻었다기 보다는 여전히 EpiSC 특성을 유지한다는 것을 나타낸다. 따라서 이들 데이터는 Dppa5의 과발현이 초기 단계 상배엽을 나타내는 Oct4-GFP 양성 EpiSC 분획을 증가시킨다는 것을 암시한다.
We then FACS sorted Oct4-GFP positive cells from Dppa5-overexpression and control EpiSCs and cultured them for another 10 passages. Oct4-GFP positive cells from Dppa5-overexpression and control EpiSCs immediately began to lose Oct4-GFP expression. After two passages, 10.5% of Dppa5-overexpressing cells and 6.3% of control EpiSCs remained GFP positive. The number of GFP positive cells from control EpiSCs continued to decrease at four passages until the level reached 1.3%, the level of maternal unclassified EpiSCs. However, GFP positive cells remained stable at about 4% -6% in Dppa5-overexpressing EpiSCs even after several passages. To rule out the possibility that Dppa5 overexpression could return EpiSCs to ES-like states, Oct4-GFP cells were sorted from Dppa5-overexpressing EpiSCs and the methylation status of the Rex1 promoter was examined by bisulfite sequencing PCR. The Rex1 promoter was much methylated, similar to that of Oct4-GFP positive and negative EpiSCs, indicating that the increased Oct4-GFP positive fraction still retained EpiSC properties rather than obtaining an ES-like state. These data thus suggest that overexpression of Dppa5 increases the Oct4-GFP positive EpiSC fraction indicating early stage upper germ layers.
본 발명을 통해서 알 수 있는 것과 같이, GOF18 마우스로부터 유래한 EpiSC에 대한 연구는 다른 분화단계의 인 비보 상배엽의 발생 능력 뿐만 아니라, 초기 배아 발생, 분화 과정 및 생식 세포 발생에 대한 더 좋은 이해를 제공한다. EpiSCs는 인간 ESCs와 많은 공통성을 가지므로, 인간 ESCs도 EpiSCs와 유사하게 이종성을 나타내어 이들 세포의 치료제 가능성에 영향을 미칠 수 있다.As can be seen from the present invention, the study of EpiSCs derived from GOF18 mice provides a better understanding of early embryonic development, differentiation process and germ cell development as well as the ability to develop in vivo autologous germ cells at different stages of differentiation. to provide. Since EpiSCs have much in common with human ESCs, human ESCs are heterologous, similar to EpiSCs, and can affect the therapeutic potential of these cells.
도 1은 GOF18 EpiSCs의 특성을 나타낸 그림.
(A) 초기 및 후기 계대에서 확립된 GOF18 EpiSC 라인에서 Oct4-GFP 발현 및 형태.
(B 및 C) T9 EpiSCs (B) 및 ESCs (C)를 가지는 GOF18 EpiSCs를 비교한 전체 유전자 발현 마이크로어레이의 산포도. 검은 선은 유전자 발현 수준에서 2배 차이의 경계를 나타냄. 가로좌표 샘플과 비교하여 세로좌표 샘플에서 높게 발현되는 유전자를 녹색 동그라미로 나타내고; 적게 발현되는 것을 적색으로 나타냄. 다능성 세포(Pou5f1/Oct4, Sox2, Nanog, Klf2, Klf4, Klf5,Sall4, Dnmt3l, Esrrb, Fbxo15, 및 Zfp42/Rex1),생식세포 (Stella [Dppa3], Dppa4, Dppa5, Iftm3[Fragilis]), 및 상배엽 (Fgf5, T) 마커들의 위치는 오렌지 점으로 나타냄. 우측 칼라 바는 산포 밀도를 나타냄; 산포 밀도가 높을수록, 청색이 더 진해짐. 유전자 발현 수준은 log2 스케일로 묘사함.
(D) EpiSCs에서 다능성 마커의 단백질 수준. Oct4, Nanog, 및 Sox2의 수준을 웨스턴 불럿에 의하여 ESCs 및 EpiSCs에서 비교하였다;3T3 세포를 음성 대조군으로 사용하였다.
(E) ESCs 및 EpiSCs에서 Oct4, Nanog,및 Sox2에 대한 면역형광분석을 나타낸 그림. DAPI를 핵 염색에 사용함.
도 2는 GOF18 EpiSCs에서 Oct4-GFP의 동적 발현을 나타내는 그림.
(A) EpiSCs에서 Oct4-GFP 양성 세포의 퍼센트는 FACS 분류에 의하여 측정됨.
(B) Oct4-GFP 양성 및 Oct4-GFP 음성 EpiSCs를 FACS 분류하고 개별적으로 배양함.배양 1 주 후 형광 현미경 하에서 관찰된 Oct4-GFP 양성 세포로부터 온 Oct4-GFP 음성 콜로니 및 Oct4-GFP 음성 세포로부터 온 Oct4-GFP 양성 콜로니를 나타냄.
(C) Oct4-GFP 양성 및 Oct4-GFP 음성 세포로부터 온 Oct4-GFP 양성 세포의 퍼센트를 초기 분류 7일 후에 FACS로 측정하였다.
(D) 클론 어세이의 요약. FACS-분류된 Oct4-GFP 양성 및 음성 싱글 세포를 96-웰 플레이트 상에 플레이팅하고, 1주일 동안 형광 현미경 하에서 Oct4-GFP 발현을 모니터하였다. 단지 GFP 양성 세포, 단지 GFP 음성 세포 또는 GFP 양성 및 음성 세포의 혼합물을 함유하는 클론 세포주의 수를 나타냄.
도 3은 Oct4-GFP 양성 및 음성 EpiSCs가 구별되는 유전자 발현 및 후성적 프로파일을 가지는 것을 나타낸 그림.
(A) Oct4-GFP 음성 및 양성 EpiSCs를 미분류된 EpiSCs와 비교한 전체 유전자 발현 마이크로어레이의 산포도.
(B) Oct4-GFP 음성 및 양성 EpiSCs를 ESC와 비교한 전체 유전자 발현 마이크로어레이의 산포도. 검은선은 유전자 발현 수준에서 2배 차이의 경계를 나타냄. 가로좌표 샘플과 비교하여 세로좌표 샘플에서 높게 발현되는 유전자를 녹색 동그라미로 나타내고; 적게 발현되는 것을 적색으로 나타냄. 다능성 세포(Pou5f1/Oct4, Sox2, Nanog, Klf2, Klf4, Klf5,Sall4, Dnmt3l, Esrrb, Fbxo15, 및 Zfp42/Rex1),생식세포 (Stella [Dppa3], Dppa4, Dppa5, Iftm3[Fragilis]), 및 상배엽 (Fgf5, T) 마커들의 위치는 오렌지 점으로 나타냄. 우측 칼라 바는 산포 밀도를 나타냄; 산포 밀도가 높을수록, 청색이 더 진해짐. 유전자 발현 수준은 log2 스케일로 묘사함.
(C) ESCs, Oct4-GFP 양성 및 음성 EpiSCs, T9 EpiSCs, 및 GOF18 EpiSCs에서 전체 유전자 발현 패턴의 히트 맵(Heat map). 상단의 색은 log2 스케일로 유전자 발현을 코드화함. 적색 및 청색은 각각 높은 그리고 낮은 유전자 발현을 나타냄.
(D) 계통도 클러스터링은 Oct4-GFP 양성 EpiSCs가 ESC가 아니라 모계 EpiSCs 또는 T9 EpiSCs와 밀접하다는 것을 보여줌.
(E) 내생적 Oct4 유전자 및 Oct4-GFP 전이유전자의 프로모터의 DNA 메틸화 상태를 bisulfite 시퀀싱 PCR에 의하여 결정함.
(F) Dppa5, Stella (Dppa3), Vasa, 및 Fragilis (Iftm3) 프로모터 부위를 Oct4-GFP 양성 및 음성 EpiSCs 뿐만 아니라 ESCs, MEFs, 및 PGCs에서 bisulfite 시퀀싱 PCR에 의하여 분석.
도 4는 Oct4-GFP 양성 및 음성 EpiSCs는 구별되는 ESC 전환 효율을 나타낸다는 것을 보여주는 그림.
(A) 전환 조건(2i+LIF)를 사용하여 Oct4-GFP 양성 및 음성 EpiSCs를 ES-유사 세포로 전환. 처리 4일 후 EpiSCs의 형태 및 alkaline phosphatase (AP) 활성을 나타냄.
(B) Oct4-GFP 양성 및 음성 EpiSCs의 상대적인 전환 효율을 AP-양성 콜로니의 수를 계수하여 결정함. 데이터는 3회 반복의 평균 ± SEM을 나타냄; n = 3.
(C) 전환된 ES 유사 세포에서 Dppa5, Stella, Vasa, 및 Fragilis 프로모터 부위를 bisulfite 시퀀싱 PCR에 의하여 분석함.
도 5는 Oct4-GFP 양성 및 음성 EpiSCs는 다른 발생 단계의 인 비보 상배엽을 나타낸다는 것을 보여주는 그림.
(A 및 B) 인 비보 샘플(E5.5 대 E6.5 상배엽)(A) 및 인 비트로 샘플(Oct4-GFP 양성 대 음성 EpiSCs) (B)에서 유전자 발현 패턴 비교. 발현 수준은 각각 E6.5 상배엽(A) 및 Oct4-GFP 음성 EpiSCs (B)의 것과 표준화하였다.
(C) RT-PCR 값의 히트 맵. RT-PCR RQ 비는 인 비보를 인 비트로 샘플과 비교하기 위하여 사용됨. 그 인 비보 비율은 E6.5 상배엽의 RT-PCR RQ 값을 E5.5 상배엽 샘플의 값으로 나누어서 계산됨. 그 인 비트로 비율은 GFP 음성 EpiSC의 RT-PCR RQ 값을 GFP 양성 EpiSC 샘플의 값으로 나누어서 계산됨.상단의 칼라 바는 각각 그 비율값을 코드화함; 적색 및 청색은 각각 높고 낮은 비율을 나타냄.
(D) Oct4-GFP 양성 및 음성 EpiSCs에서 Oct4 인헨서 활성의 평가. 상대적인 루시퍼레이즈 활성을 빈 벡터의 활성으로 표준화함. 데이터는 3회 반복의 평균 ± SEM을 나타냄; n = 3.
(E) 인 비보 상배엽에서 Oct4-GFP 리포터 발현의 동적상태를 나타냄. 인 비보 상배엽을 E5.5, 6.5, 및 7.5에서 GOF18 및 GOF18DPE 마우스로부터 분리함. Oct4-GFP 발현을 형광 현미경 하에서 측정함.
GOF18DPE 마우스로부터 특이적인 Oct4-GFP 발현을 보여주기 위하여, 모든 이미지를 동일한 과노출로 촬영하였지만 GOF18 마우스로부터 온 이미지는 정상 노출로 촬영함. E7.5 GOF18DPE 상배엽 하에서 여분의 패널은 PGCs에서 잔류 Oct4-GFP 발현을 나타냄.
도 6은 Oct4-GFP 양성 EpiSCs가 키메라 형성에 기여할 수 있다는 것을 보여주는 그림.
(A) Oct4-GFP 양성 EpiSCs을 ICM으로 통합 후 배반포 주입을 수반.
(B) 13.5 days postcoitum (dpc) 배아의 생식선에서 Oct4-GFP의 발현에 의하여 나타낸 것과 같이 Oct4-GFP 양성 EpiSCs의 생식선 기여.
(C) Oct4-GFP 양성 EpiSCs으로부터 온 코트-칼라 키메라.
(D) Epi-Red 세포의 형태 및 Td-tomato lentivirus의 발현.
(E) Epi-Red 세포는 배반포 주입을 수반하는 ICM으로 통합을 실패함.
도 7은 Dppa5 과발현이 초기 단계 상배엽 분획을 증가시킨다는 것을 나타낸 그림.
(A) Oct4-GFP 양성 분획은 Dppa5를 과발현하여서 증가됨. 대조군 및 Dppa5-과발현 EpiSCs로부터 온 Oct4-GFP 양성 세포의 수를 FACS로 비교함.
(B) 대조군 및 Dppa5-과발현 EpiSCs로부터 온 FACS 분류된 GFP 양성 세포에서 의 Oct4-GFP 발현의 다이나믹을 나타냄. FACS-분류된 Oct4-GFP 양성 세포들은 또 다른 10 계대 동안 배양하고 그 Oct4-GFP 양성 세포의 수를 매 2 계대 후마다 측정함.
(C)Stella (Dppa3), Nanog,및 Rex1 (Zfp42)에 대한 ESCs 양성 및 음성 사이의 동적인 상호교환이 존재. 세 유전자 전부가 발현될 때, ESCs는 주지된 그라운드 상태의 다능성을 나타냄. 그러나 이들 유전자 중 하나의 발현이 감소될 때, 다능성 능력은 크게 감소됨.
EpiSCs는 Oct4-GFP 전이유전자 발현에 의하여 구별되는 두 다른 군을 가지는 이종이다. Oct4-GFP 양성 및 음성 EpiSCs는 동적 평형상태로 존재하고 각각 초기 및 후기 단계의 발생의 인 비보 상배엽에 해당된다.
내생적 Oct4 로커스가 비메틸화되고 양 군에서 발현되지만 Oct4-GFP 전이유전자는 차별적으로 메틸화되고, 초기 및 후기 단계 상배엽 서브군을 구별하게 한다.
도 8은 본 발명의 특징을 요약한 그림이다.1 is a diagram showing the characteristics of GOF18 EpiSCs.
(A) Oct4-GFP expression and morphology in GOF18 EpiSC lines established at early and late passages.
(B and C) Scatter plots of whole gene expression microarrays comparing GOF18 EpiSCs with T9 EpiSCs (B) and ESCs (C). Black lines indicate a 2-fold difference in gene expression levels. Genes that are highly expressed in the ordinate sample compared to the abscissa sample are shown in green circles; Less expressed in red. Pluripotent cells (Pou5f1 / Oct4, Sox2, Nanog, Klf2, Klf4, Klf5, Sall4, Dnmt3l, Esrrb, Fbxo15, and Zfp42 / Rex1), Germ cells (Stella [Dppa3], Dppa4, Dppa5, Iftm3, Fragilis] And the location of epidermal (Fgf5, T) markers is indicated by orange dots. Right color bar indicates scatter density; The higher the dispersion density, the darker the blue color. Gene expression levels are depicted on log2 scale.
(D) Protein levels of pluripotency markers in EpiSCs. Levels of Oct4, Nanog, and Sox2 were compared in ESCs and EpiSCs by Western blot; 3T3 cells were used as negative controls.
(E) Figure showing immunofluorescence analysis for Oct4, Nanog, and Sox2 in ESCs and EpiSCs. DAPI is used for nuclear staining.
2 shows the dynamic expression of Oct4-GFP in GOF18 EpiSCs.
(A) The percentage of Oct4-GFP positive cells in EpiSCs was determined by FACS sorting.
(B) FACS sorted and individually cultured Oct4-GFP positive and Oct4-GFP negative EpiSCs. From Oct4-GFP negative colonies and Oct4-GFP negative cells from Oct4-GFP positive cells observed under
(C) The percentage of Oct4-GFP positive cells from Oct4-GFP positive and Oct4-GFP negative cells was measured by FACS after 7 days of initial sorting.
(D) Summary of clone assays. FACS-sorted Oct4-GFP positive and negative single cells were plated on 96-well plates and Oct4-GFP expression was monitored under fluorescence microscopy for 1 week. Number of clone cell lines containing only GFP positive cells, only GFP negative cells or a mixture of GFP positive and negative cells.
Figure 3 shows that Oct4-GFP positive and negative EpiSCs have distinct gene expression and epigenetic profiles.
(A) Scatter plot of the entire gene expression microarray comparing Oct4-GFP negative and positive EpiSCs with unclassified EpiSCs.
(B) Scatter plot of total gene expression microarrays comparing Oct4-GFP negative and positive EpiSCs with ESCs. Black lines indicate two-fold differences in gene expression levels. Genes that are highly expressed in the ordinate sample compared to the abscissa sample are shown in green circles; Less expressed in red. Pluripotent cells (Pou5f1 / Oct4, Sox2, Nanog, Klf2, Klf4, Klf5, Sall4, Dnmt3l, Esrrb, Fbxo15, and Zfp42 / Rex1), Germ cells (Stella [Dppa3], Dppa4, Dppa5, Iftm3, Fragilis] And the location of epidermal (Fgf5, T) markers is indicated by orange dots. Right color bar indicates scatter density; The higher the dispersion density, the darker the blue color. Gene expression levels are depicted on log2 scale.
(C) Heat map of total gene expression patterns in ESCs, Oct4-GFP positive and negative EpiSCs, T9 EpiSCs, and GOF18 EpiSCs. The top color encodes gene expression on a log2 scale. Red and blue represent high and low gene expression, respectively.
(D) Schematic clustering shows that Oct4-GFP positive EpiSCs are closely related to maternal EpiSCs or T9 EpiSCs, not ESCs.
(E) DNA methylation status of endogenous Oct4 gene and promoter of Oct4-GFP transgene is determined by bisulfite sequencing PCR.
(F) Analysis of the Dppa5, Stella (Dppa3), Vasa, and Fragilis (Iftm3) promoter sites by bisulfite sequencing PCR on E4-s, MEFs, and PGCs as well as Oct4-GFP positive and negative EpiSCs.
4 shows that Oct4-GFP positive and negative EpiSCs exhibit distinct ESC conversion efficiencies.
(A) Conversion of Oct4-GFP positive and negative EpiSCs into ES-like cells using conversion conditions (2i + LIF). After 4 days of treatment, it showed the form of EpiSCs and alkaline phosphatase (AP) activity.
(B) Relative conversion efficiency of Oct4-GFP positive and negative EpiSCs was determined by counting the number of AP-positive colonies. Data represent mean ± SEM of 3 replicates; n = 3.
(C) Dppa5, Stella, Vasa, and Fragilis promoter sites in the converted ES-like cells analyzed by bisulfite sequencing PCR.
FIG. 5 shows that Oct4-GFP positive and negative EpiSCs represent in vivo complementary germ layers of different developmental stages.
(A and B) Comparison of gene expression patterns in in vivo samples (E5.5 vs. E6.5 epidermis) (A) and in vitro samples (Oct4-GFP positive vs. negative EpiSCs) (B). Expression levels were normalized to that of E6.5 epidermal (A) and Oct4-GFP negative EpiSCs (B), respectively.
(C) Heat map of RT-PCR values. The RT-PCR RQ ratio is used to compare in vivo to samples in beat. The in vivo ratio is calculated by dividing the RT-PCR RQ value of the E6.5 upper germ by the value of the E5.5 upper germline sample. The in vitro ratio is calculated by dividing the RT-PCR RQ value of the GFP negative EpiSC by the value of the GFP positive EpiSC sample. The upper color bars each encode the ratio value; Red and blue represent high and low ratios, respectively.
(D) Evaluation of Oct4 enhancer activity in Oct4-GFP positive and negative EpiSCs. Normalize relative luciferase activity to that of the empty vector. Data represent mean ± SEM of 3 replicates; n = 3.
(E) shows the dynamic state of Oct4-GFP reporter expression in in vivo superior germ layers. In vivo superior germ layers were isolated from GOF18 and GOF18DPE mice at E5.5, 6.5, and 7.5. Oct4-GFP expression is measured under fluorescence microscopy.
To show specific Oct4-GFP expression from GOF18DPE mice, all images were taken with the same overexposure but images from GOF18 mice were taken with normal exposure. Extra panel under E7.5 GOF18DPE epidermis shows residual Oct4-GFP expression in PGCs.
6 shows that Oct4-GFP positive EpiSCs may contribute to chimeric formation.
(A) Integrating Oct4-GFP positive EpiSCs into ICM followed by blastocyst injection.
(B) Germline contribution of Oct4-GFP positive EpiSCs as shown by expression of Oct4-GFP in the gonads of 13.5 days postcoitum (dpc) embryos.
(C) Cote-color chimera from Oct4-GFP positive EpiSCs.
(D) Morphology of Epi-Red cells and expression of Td-tomato lentivirus.
(E) Epi-Red cells failed to integrate into ICM following blastocyst injection.
FIG. 7 shows that Dppa5 overexpression increases early stage epidermal fraction.
(A) Oct4-GFP positive fraction increased by overexpressing Dppa5. The number of Oct4-GFP positive cells from control and Dppa5-overexpressing EpiSCs was compared by FACS.
(B) Dynamics of Oct4-GFP expression in FACS sorted GFP positive cells from control and Dppa5-overexpressing EpiSCs. FACS-sorted Oct4-GFP positive cells were cultured for another 10 passages and the number of Oct4-GFP positive cells measured after every 2 passages.
(C) There is a dynamic interchange between ESCs positive and negative for Stella (Dppa3), Nanog, and Rex1 (Zfp42). When all three genes are expressed, ESCs show pluripotency of known ground states. However, when the expression of one of these genes is reduced, pluripotency is greatly reduced.
EpiSCs are heterologous with two different groups distinguished by Oct4-GFP transgene expression. Oct4-GFP positive and negative EpiSCs exist in dynamic equilibrium and correspond to the in vivo complement germline of early and late development, respectively.
Although the endogenous Oct4 locus is unmethylated and expressed in both groups, the Oct4-GFP transgene is differentially methylated and allows to distinguish early and late stage epidermal subgroups.
8 is a diagram summarizing the features of the present invention.
이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.The following examples are intended to illustrate the present invention and are not to be construed as limiting the scope of the present invention.
실시예Example 1:세포 배양 1: Cell Culture
GOF18 EpiSCs의 추출 및 특성화는 Greber, B., Wu, G., Bernemann, C., Joo, J.Y., Han, D.W., Ko, K., Tapia, N.,Sabour, D., Sterneckert, J., Tesar, P., and Scholer, H.R. (2010).Cell Stem Cell 6, 215-226에 기재된 것과 같이 수행하였다. Extraction and characterization of GOF18 EpiSCs is described by Greber, B., Wu, G., Bernemann, C., Joo, JY, Han, DW, Ko, K., Tapia, N., Sabour, D., Sterneckert, J., Tesar, P., and Scholer, HR (2010). Performed as described in
요약하면, E5.5 배아(129/Sv female 3 C56/Bl6 및 DBA/2 백그라운드 GOF18+/+ male)를 수집하였고 HBSS 배지로 옮겼다. 절개하기 위하여, 탈락막(deciduas)을 포셉으로 제거하고 배외 외배엽을 유리 피펫을 사용하여 상배엽으로부터 분리하였다. PBS로 세척 후, 그 상배엽을 EpiSC 배지(20% 넉아웃 혈청 대체물(GIBCO BRL), 2mM glutamine, 13 비필수 아미노산, 및 5 ng/ml bFGF를 함유한 DMEM/F12 (GIBCO BRL)) 내 MEF상에서 배양하였다. MEFs 상에서 3에서 5계대 동안 초기 배양 후, EpiSC 콜로니를 선택해서 30분 동안 FCS로 미리 코팅된 디쉬 상에 옮겼다. Feeder-free EpiSCs를 MEF (CF1 마우스) 조건화 배지에서 배양하였다. 조건화를 위해서, 조사된 MEFs를 5X104 세포/cm2 밀도로 시딩하고 EpiSC 배지에서 24시간 배양하였다. 그 조건화된 배지를 여과하고 bFGF (5 ng/ml)를 첨가하였다. In summary, E5.5 embryos (129 /
feeder-free EpiSCs 계대를 위해서, 콜로니들을 collagenaseIV (Invitrogen)로 5분 동안 37℃에서 배양하고 세포 스크레퍼를 사용하여 가루화하였다. 세포 덩어리를 FCS-코팅된 디쉬에 다시 플레이팅하고 그 배지를 24시간 마다 교환하였다.For feeder-free EpiSCs passages, colonies were incubated with collagenaseIV (Invitrogen) for 5 minutes at 37 ° C. and powdered using a cell scraper. The cell clumps were replated in FCS-coated dishes and the medium was changed every 24 hours.
실시예Example 2: 2: DNADNA 메틸화 분석 Methylation analysis
EpiSCs의 DNA 메틸화 상태는 Han, D.W., Do, J.T., Arauzo-Bravo, M.J., Lee, S.H., Meissner, A., Lee, H.T.,Jaenisch, R., 및 Scholer, H.R. (2009). Stem Cells 27, 1088-1097로부터 온 바이설파이트 시퀀싱 방법에 의하여 결정되었다. PCR 조건 및 프라이머 서열을 포함한 자세한 프로토콜은 Han, D.W., Do, J.T., Gentile, L., Stehling, M., Lee, H.T., 및 Scholer, H.R.(2008).Stem Cells 26, 445-454에 기재되었다.DNA methylation states of EpiSCs are described in Han, D.W., Do, J.T., Arauzo-Bravo, M.J., Lee, S.H., Meissner, A., Lee, H.T., Jainisch, R., and Scholer, H.R. (2009). Determined by the bisulfite sequencing method from Stem Cells 27, 1088-1097. Detailed protocols including PCR conditions and primer sequences were described in Han, DW, Do, JT, Gentile, L., Stehling, M., Lee, HT, and Scholer, HR (2008). Stem Cells 26, 445-454. .
실시예Example 3:전체-지놈 발현 분석 3: Full-Genome Expression Analysis
전체 유전자 발현 프로파일은 Illumina 마이크로어레이로 수행되었다.
Total gene expression profiles were performed with Illumina microarrays.
실시예Example 4: 4: 배반포Blastocyst 주입 Injection
배반포를 B6C3F1 마우스로부터 얻었다. EpiSCs를 collagenase IV 또는 0.25% trypsin EDTA로 처리하여 회수하였고, 10 -1 5 세포들을 주입 피펫에 로딩하고 Piezo(Prime-tech)에 의하여 B6C3F1로 주입하였다. 각 15 주입된 배반포를 가임신 ICR 마우스의 자궁에 옮겼다.Blastocysts were obtained from B6C3F1 mice. EpiSCs were recovered by treatment with collagenase IV or 0.25% trypsin EDTA, and 10 −1 5 cells were loaded into injection pipettes and injected into B6C3F1 by Piezo (Prime-tech). Each 15 injected blastocysts were transferred to the womb of a fertility ICR mouse.
Claims (4)
상기 Oct4-GFP 양성 착상 후 배반엽상피줄기세포(EpiSC)는 초기 상배엽 세포에 해당하고, 상기 Oct4-GFP 음성 착상 후 배반엽상피줄기세포(EpiSC)는 후기 상배엽 세포에 해당하는 것을 특징으로 하는 Oct4-GFP 시스템을 이용한 상배엽 세포의 분리 방법.The method of claim 1,
After Oct4-GFP positive implantation, blastocyst epithelial stem cells (EpiSC) correspond to early epithelial cells, and after Oct4-GFP negative implantation, blastocyst epithelial stem cells (EpiSC) correspond to late epithelial cells. Separation of epidermal cells using Oct4-GFP system.
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