KR101333207B1

KR101333207B1 - Genetic markers associated with endometriosis and use thereof

Info

Publication number: KR101333207B1
Application number: KR1020110069577A
Authority: KR
Inventors: 이홍구; 이규섭; 황진희
Original assignee: 부산대학교 산학협력단
Priority date: 2011-07-13
Filing date: 2011-07-13
Publication date: 2013-11-26
Also published as: KR20130008899A

Abstract

본 CRMP-2 (Collapsin response mediator protein 2), FGH(S-formylglutathione hydrolase), UCH-L1(Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L1) 또는 MYL9(Myosin regulatory light polypeptide 9) 중에서 선택되는 1개 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 자궁내막증 진단용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 자궁내막증 진단용 키트에 관한 것이다. MRNA of at least one gene selected from the present Collapsin response mediator protein 2 (CRMP-2), S-formylglutathione hydrolase (FGH), Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L1 (UCH-L1), or Myosin regulatory light polypeptide 9 (MYL9) Or it relates to a composition for diagnosing endometriosis comprising an agent for measuring the protein level encoded by the gene and a kit for diagnosing endometriosis comprising the composition.

Description

자궁내막증과 연관된 유전자 마커 및 이의 용도 {Genetic markers associated with endometriosis and use thereof}Genetic markers associated with endometriosis and use

본 발명은 자궁내막 세포에서 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 자궁내막증 진단용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 자궁내막증 진단용 키트에 관한 것이다. The present invention relates to a composition for diagnosing endometriosis comprising an agent for measuring the expression level of genes in endometrial cells and to a kit for diagnosing endometriosis comprising the composition.

자궁내막증은 자궁내강 이외의 장소에 자궁내막 선과 기질 조직이 증식하는 질환으로서 흔히 복막 난소, 나팔관, 더글라스와에서 발견되며 드물게 흉막, 폐, 뇌에서 발견되기도 한다. 자궁내막증은 가임기 여성의 3-10%에서 발생하는 흔한 질환으로서, 골반통을 호소하는 여성 중 5-20%, 불임 여성 중 20-50%에서 발견된다.Endometriosis is a disease in which endometrial glands and stromal tissues proliferate outside the uterine lumen, and are commonly found in the peritoneal ovary, fallopian tubes, and Douglas, and rarely in the pleura, lungs, and brain. Endometriosis is a common disease that occurs in 3-10% of women of childbearing age and is found in 5-20% of women with pelvic pain and 20-50% of infertile women.

자궁내막증의 병인으로는 월경혈 역류, 비정상적인 자궁내막, 변화된 복강 환경, 증가된 혈관형성능, 부적절한 면역학적 반응, 유전적인 요인, 환경적인 요인 등이 복합적으로 관여하며, 흔히 알려진 가설로는 월경혈 역류설 (retrograde menstruation theory), 체강상피 화생설 (coelomic metaplasia theory), 태생 잔존세포설 (embryonic rest theory), 림프혈관 전이설 (lymphovascular metastasis theory) 등이 있으나, 어느 한 가지 가설만으로 자궁내막증의 병인을 완전히 설명할 수 없다.The etiology of endometriosis is a combination of menstrual blood flow, abnormal endometrium, altered celiac environment, increased angiogenic ability, inadequate immunological response, genetic factors, and environmental factors. retrograde menstruation theory, coelomic metaplasia theory, embryonic rest theory, and lymphovascular metastasis theory, but one hypothesis alone can fully explain the pathogenesis of endometriosis. Can't.

최근 자궁내막에서 줄기세포 (stem cell)와 전구세포 (progenitor cell)가 자궁내막의 기저층과 기질의 혈관조직 주위에 많이 존재하며 자궁내막조직의 성장, 증식 및 분화에 관여하는 것으로 알려지면서 자궁내막증을 이해하기 위한 새로운 전환점을 맞이하고 있다. 또한 이러한 사실을 근거로 자궁내막증이 줄기세포 혹은 전구세포에 의하여 발생한다는 가설이 새롭게 제시되고 있는데, 이는 이소성 자궁내막 (ectopic endometrium)의 발생과 관련된 여러 자궁내막증 가설들을 세포 수준에서 설명할 수 있으며 자궁내막증과 연관된 신체 변화들을 설명할 수도 있다.Recently, stem cells and progenitor cells in the endometrium are present around the vascular tissues of the basal layer and stroma of the endometrium and are known to be involved in the growth, proliferation and differentiation of endometrial tissues. We are entering a new turning point to understand. Based on this fact, a new hypothesis that endometriosis is caused by stem cells or progenitor cells has been newly proposed, which can explain various endometriosis hypotheses related to the development of ectopic endometrium at the cellular level. It may also explain physical changes associated with endometriosis.

자궁내막 줄기세포 혹은 전구세포의 월경혈 역류설을 뒷받침하는 연구로서 자궁내막증 환자의 정상부위 자궁내막 기저층과 이소성 자궁내막 간에 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 사이토크롬 p450 표현형이 유사하다는 보고가 있는데, 이는 줄기세포가 많이 존재하는 자궁내막 기저층의 세포 중 일부가 이소성 자궁내막으로 이식될 수 있음을 의미한다. A study supporting menstrual hemorrhagic reflux of endometrial stem cells or progenitor cells has been reported to be similar between the estrogen receptor, progesterone receptor, and cytochrome p450 phenotype between the normal endometrial basement and the ectopic endometrium of endometriosis patients. This means that some of the cells of the endometrial basal layer, which are present in large numbers, can be implanted into the ectopic endometrium.

이에 본 발명자들은 자궁내막증의 예측 및 진행 여부를 확인할 수 있는 신규한 유전자 마커를 개발하기 위한 연구를 계속한 결과, 자궁내막증 환자의 월경혈에서 유래한 자궁내막 세포에서 특이적으로 발현이 억제되는 유전자를 선별함으로써, 본 발명을 완성하였다.
Therefore, the present inventors continued to develop a novel gene marker capable of confirming the prediction and progression of endometriosis. As a result, the present inventors have found a gene whose expression is specifically suppressed in endometrial cells derived from menstrual blood of endometriosis patients. By selecting, the present invention has been completed.

대한민국 공개특허공보 제 10-2009-0009212 (2009.01.22)Republic of Korea Patent Publication No. 10-2009-0009212 (2009.01.22)

본 발명의 목적은 자궁내막증 진단 마커를 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide an endometriosis diagnostic marker.

본 발명의 또 다른 목적은 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 자궁내막증 진단용 조성물을 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide a composition for diagnosing endometriosis comprising an agent for measuring the mRNA level of a gene or a protein thereof.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 자궁내막증 진단 키트를 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide an endometriosis diagnostic kit comprising the composition.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 자궁내막증 진단 마커를 이용하여 자궁내막증의 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide a method of providing information for diagnosing endometriosis using the endometriosis diagnostic marker.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 자궁내막증 진단 마커를 이용하여 자궁내막증 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
Still another object of the present invention is to provide a method for screening a endometriosis therapeutic agent using the endometriosis diagnostic marker.

상기 과제를 해결하기 위해 본 발명은 CRMP-2, FGH, UCH-L1 및 MYL9 로 이루어진 그룹에서 1 이상 선택되는 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 자궁내막증 진단용 조성물을 제공한다. In order to solve the above problems, the present invention is a composition for diagnosing endometriosis comprising an agent for measuring mRNA or protein level of a gene selected from one or more genes selected from the group consisting of CRMP-2, FGH, UCH-L1 and MYL9 To provide.

또한 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 자궁내막증 진단용 키트를 제공한다.In another aspect, the present invention provides a kit for diagnosing endometriosis comprising the composition.

또한 본 발명은 CRMP-2, FGH, UCH-L1 및 MYL9 로 이루어진 그룹에서 1 이상 선택되는 유전자에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 자궁내막증 의심 환자의 생물학적 시료로부터 단백질을 측정하는 단계; 및 상기 단백질 수준의 증가를 정상 대조구 시료의 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는 자궁내막증 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공한다. In another aspect, the present invention comprises the steps of measuring the protein from a biological sample of suspected endometriosis using an antibody that specifically binds to at least one gene selected from the group consisting of CRMP-2, FGH, UCH-L1 and MYL9; And it provides a method of providing information for diagnosing endometriosis comprising comparing the increase in the protein level with the protein level of the normal control sample.

또한 본 발명은 (a) CRMP-2, FGH, UCH-L1 및 MYL9 로 이루어진 그룹에서 1 이상 선택되는 유전자가 도입된 세포를 배양하는 단계; (b) 상기 CRMP-2, FGH, UCH-L1 및 MYL9 로 이루어진 그룹에서 1 이상 선택되는 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 증가 또는 억제 후보 물질을 상기 세포에 처리하는 계; 및 (c) 처리된 세포와 대조구의 상기 유전자의 발현 수준을 비교하는 단계를 포함하는 자궁내막증 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
In another aspect, the present invention comprises the steps of (a) culturing a cell introduced with one or more genes selected from the group consisting of CRMP-2, FGH, UCH-L1 and MYL9; (b) treating the cells with candidate cells for increasing or inhibiting expression of a protein encoded by a gene selected from one or more selected from the group consisting of CRMP-2, FGH, UCH-L1 and MYL9; And (c) comparing the expression levels of the genes of the treated cells with the treated cells.

본 발명에 따르면, CRMP-2, FGH, UCH-L1 및 MYL9 로 이루어진 그룹에서 1이상 선택되는 유전자는 자궁내막증 환자의 월경혈에서 유래한 자궁내막 세포에서 발현이 억제되기 때문에, 자궁내막증의 진단 및 진행, 예후를 신속하고 용이하게 모니터링 할 수 있는 마커로 유용하게 이용될 수 있다.
According to the present invention, since one or more genes selected from the group consisting of CRMP-2, FGH, UCH-L1 and MYL9 are suppressed in endometrial cells derived from menstrual blood of endometriosis patients, diagnosis and progression of endometriosis This can be useful as a marker for quickly and easily monitoring the prognosis.

도 1은 자궁 내막세포의 단백질을 2차원 전기영동 하여 분리한 결과이다.
도 2는 1차적으로 동정된 네 가지의 단백질에 대하여 다시 한 번 2-DE를 수행한 결과이다.
도 3은 ESI-Q-TOF를 이용하여 단백질 동정을 한 데이터이다.
도 4는 Western blot을 통해 단백질의 발현 양상을 비교한 결과이다. Figure 1 is the result of separation by two-dimensional electrophoresis of the protein of the endometrial cells.
Figure 2 shows the results of performing 2-DE once again for the first four proteins identified.
3 is data obtained by protein identification using ESI-Q-TOF.
Figure 4 is a result of comparing the expression of the protein through Western blot.

하나의 양태로서, 본 CRMP-2, FGH, UCH-L1 및 MYL9 로 이루어진 그룹에서 1 이상 선택되는 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 자궁내막증 진단용 조성물을 제공한다In one embodiment, the present invention provides a composition for diagnosing endometriosis comprising an agent for measuring mRNA or protein level of a gene selected from one or more selected from the group consisting of CRMP-2, FGH, UCH-L1 and MYL9.

본 발명에서 용어, ‘진단’은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 자궁내막증 발병 여부를 확인하는 것이다.In the present invention, the term 'diagnosis' means identifying the presence or characteristic of the pathological state. For the purposes of the present invention, the diagnosis is to determine whether endometriosis develops.

본 발명에서 용어, ‘자궁내막증(endometriosis)’은 자궁내막의 선(gland)조직과 기질(stroma)이 자궁이 아닌 다른 부위의 조직에 부착하여 증식하는 것을 의미한다.In the present invention, the term 'endometriosis' means that the gland tissue and stroma of the endometrium attach and proliferate to tissues other than the uterus.

본 발명에서 용어, ‘진단용 마커, 진단하기 위한 마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)’는 자궁내막증 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 세포에 비하여 자궁내막증을 가진 세포에서 증가양상을 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. In the present invention, the term 'diagnosis marker, a diagnostic marker or a diagnostic marker' is a substance capable of diagnosing endometriosis cells from normal cells, and is increased in cells with endometriosis compared to normal cells. Polypeptides or nucleic acids (eg, mRNA, etc.), lipids, glycolipids, glycoproteins, organic biomolecules such as sugars (monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides, etc.) and the like.

본 발명의 목적상, 자궁내막증 진단 마커는 CRMP-2, FGH, UCH-L1 또는 MYL9로, 월경혈 유래 자궁내막 세포에서 발현이 억제되는 유전자들이다. 유의성 있는 진단 마커의 선택과 적용은 진단 결과의 신뢰도를 결정짓는다. 유의성 있는 진단 마커란, 진단하여 얻은 결과가 정확하여 타당도(validity)가 높고 반복 측정 시에도 일관된 결과를 나타내도록 신뢰도 (reliability)가 높은 마커를 의미한다. 본 발명의 자궁내막증 진단 마커는, 자궁내막증의 발병과 함께 직접적 또는 간접적 요인으로 발현이 항상 억제되는 유전자들로 반복된 실험에도 동일한 결과를 나타내며, 발현 수준의 차이가 대조군과 비교할 때 매우 커서 잘못된 결과를 내린 확률이 거의 없는 신뢰도가 높은 마커들이다. 그러므로 본 발명의 유의성 있는 진단 마커의 발현 정도를 측정하여 얻은 결과를 토대로 진단된 결과는 타당하게 신뢰할 수 있다.For the purposes of the present invention, endometriosis diagnostic markers are CRMP-2, FGH, UCH-L1 or MYL9, which are genes whose expression is suppressed in menstrual blood-derived endometrial cells. The selection and application of significant diagnostic markers determines the reliability of the diagnostic results. Significant diagnostic markers mean markers of high reliability such that the results obtained by diagnosis are accurate to provide high validity and consistent results in repeated measurements. The endometriosis diagnostic marker of the present invention shows the same result in repeated experiments with genes whose expression is always suppressed by direct or indirect factors with the onset of endometriosis, and the difference in expression level is very large when compared with the control group. These markers are highly reliable with little chance of falling. Therefore, the result of diagnosis based on the result obtained by measuring the expression level of the significant diagnostic marker of the present invention can be reasonably reliable.

본 발명에서 용어 ‘생물학적 시료’는 자궁내막증 발병에 의해 자궁내막증 마커의 유전자 발현 수준이 차이나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the term 'biological sample' includes samples such as tissues, cells, whole blood, serum, plasma, saliva, sputum, cerebrospinal fluid, or urine, which differ in gene expression levels of endometriosis markers due to the development of endometriosis, It is not limited.

생물학적 시료 중의 유전자 발현 수준은 mRNA 또는 단백질의 양을 확인함으로써 확인할 수 있다. 본 발명에서 ‘mRNA 발현수준 측정’자궁내막증을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 자궁내막증 마커 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정한다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 ‘단백질 발현수준 측정’자궁내막증을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 자궁내막증 마커 유전자로부터 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 바람직하게는, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. Gene expression levels in biological samples can be confirmed by identifying the amount of mRNA or protein. In the present invention, 'mRNA expression level measurement' in order to diagnose endometriosis, the amount of mRNA is measured by confirming the presence and expression level of mRNA of endometriosis marker genes in a biological sample. Analytical methods for this purpose include reverse transcriptase (RT-PCR), competitive reverse transcriptase (RT) PCR, real time reverse transcriptase (Realtime RT-PCR), and RNase protection assay (RPA). , Northern blotting, DNA chips, etc., but are not limited to these. In the present invention, in order to diagnose 'protein expression level' endometriosis, a process of confirming the presence and degree of expression of a protein expressed from an endometriosis marker gene in a biological sample, preferably, specific for the protein of the gene The amount of the protein can be confirmed by using the antibody to bind to. Methods for this analysis include Western blot, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, Ouchterlony immunodiffusion, rocket, But are not limited to, immunoelectrophoresis, immunohistochemistry, immunoprecipitation assays, complement fixation assays, fluorescence activated cell sorters (FACS), protein chips, and the like. .

따라서, 본 발명의 구체적인 일 양태에서는, CRMP-2, FGH, UCH-L1 또는 MYL9 유전자에 특이적인 프라이머 서열을 포함하는 자궁내막증 진단 마커 조성물을 제공한다.Accordingly, in one specific aspect of the present invention, an endometriosis diagnostic marker composition comprising a primer sequence specific for CRMP-2, FGH, UCH-L1 or MYL9 gene is provided.

본 발명의 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다. 본 발명의 프라이머는, 각 마커 유전자 특이적인 프라이머로 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산이다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다."Primer" of the present invention means a short nucleic acid sequence capable of forming a base pair with a complementary template with a short free 3-terminal hydroxyl group and functioning as a starting point for template strand copying. Primers can initiate DNA synthesis in the presence of reagents and four different nucleoside triphosphates for polymerization reactions (i. E., DNA polymerase or reverse transcriptase) at appropriate buffer solutions and temperatures. The primer of the present invention is a sense and antisense nucleic acid having 7 to 50 nucleotide sequences for each marker gene-specific primer. Primers can incorporate additional features that do not alter the primer's basic properties that serve as a starting point for DNA synthesis.

본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로 아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 또한 검출 가능한 시그날을 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 표지의 예로는 방사성 동위원소, 형광성 분자, 바이오틴 등이 있다.The primers of the present invention can be chemically synthesized using the phosphoramidite solid support method, or other well-known methods. Such nucleic acid sequences may also be modified using many means known in the art. Non-limiting examples of such modifications include methylation, “capsulation”, substitution of one or more homologs of natural nucleotides, and modifications between nucleotides, eg, uncharged linkages such as methyl phosphonate, phosphoester, phosph Modifications to captive amidate, carbamate, etc.) or charged linkers (eg, phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.). The nucleic acid can be in the form of one or more additional covalently linked residues such as a protein such as a nuclease, a toxin, an antibody, a signal peptide, a poly-L-lysine, an intercalator such as acridine, ), Chelating agents (e.g., metals, radioactive metals, iron, oxidizing metals, etc.), and alkylating agents. The nucleic acid sequences of the present invention can also be modified using labels that can directly or indirectly provide a detectable signal. Examples of labels include radioisotopes, fluorescent molecules, biotin, and the like.

또 다른 양태로서, 본 발명은 CRMP-2, FGH, UCH-L1 및 MYL9 로 이루어진 그룹에서 1이상 선택되는 유전자의 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 자궁내막증 진단 마커 조성물을 제공한다.In another aspect, the present invention provides an endometriosis diagnostic marker composition comprising an antibody specific for a protein of a gene selected from one or more groups selected from the group consisting of CRMP-2, FGH, UCH-L1 and MYL9.

본 발명에서,‘항체’란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.In the present invention, "antibody" means a specific protein molecule directed to the antigenic site. For purposes of the present invention, an antibody refers to an antibody that specifically binds to a marker protein and includes both polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, and recombinant antibodies.

상기한 바와 같이 자궁내막증 마커 단백질이 규명되었으므로, 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.Since endometriosis marker proteins have been identified as described above, the production of antibodies using them can be readily prepared using techniques well known in the art.

다클론 항체는 상기한 자궁내막증 마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.Polyclonal antibodies can be produced by methods well known in the art for injecting the endometriosis marker protein antigen described above into an animal and collecting blood from the animal to obtain a serum comprising the antibody. Such polyclonal antibodies can be prepared from any animal species host, such as goats, rabbits, sheep, monkeys, horses, pigs, small dogs, and the like.

단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein (1976) European Journal of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다.Monoclonal antibodies are known in the art by the hybridoma method (see Kohler and Milstein (1976) European Journal of Immunology 6: 511-519), or phage antibody libraries (Clackson et al, Nature, 352: 624). -628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222: 58, 1-597, 1991). The antibody prepared by the above method can be separated and purified by gel electrophoresis, dialysis, salt precipitation, ion exchange chromatography, affinity chromatography, and the like.

또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다. 본 발명의 또 다른 양태에서는, 본 발명에 따른 상기 자궁내막증 진단용 조성물을 포함하는 자궁내막증 진단 키트를 제공한다. 바람직하게, 상기 자궁내막증 진단 키트는 분석방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.The antibodies of the present invention also include functional fragments of antibody molecules, as well as complete forms having two full length light chains and two full length heavy chains. A functional fragment of an antibody molecule refers to a fragment having at least antigen binding function, and includes Fab, F (ab '), F (ab') 2 and Fv. In still another aspect of the present invention, there is provided a diagnostic kit for endometriosis comprising the composition for diagnosing endometriosis according to the present invention. Preferably, the endometriosis diagnostic kit may further comprise one or more other component compositions, solutions or devices suitable for the analysis method.

구체적인 일 양태로서, 상기 진단 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 각 마커 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp 의 길이이다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.In a specific embodiment, the diagnostic kit may be a diagnostic kit comprising essential elements necessary to perform reverse transcriptase. The RT-PCR kit contains the respective primer pairs specific for the marker gene. The primer is a nucleotide having a sequence specific to the nucleic acid sequence of each marker gene, and has a length of about 7 bp to 50 bp, more preferably about 10 bp to 30 bp. It may also contain a primer specific for the nucleic acid sequence of the control gene. Other reverse transcription polymerase reaction kits may be used in combination with test tubes or other appropriate containers, reaction buffers (varying in pH and magnesium concentration), deoxynucleotides (dNTPs), enzymes such as Taq polymerase and reverse transcriptase, DNAse, RNAse inhibitor DEPC DEPC-water, sterile water, and the like.

또 다른 양태로는, 바람직하게 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수있다.In another aspect, it may be a diagnostic kit, preferably comprising the necessary elements necessary to carry out the DNA chip. The DNA chip kit may include a substrate to which a cDNA or oligonucleotide corresponding to a gene or a fragment thereof is attached, and reagents, preparations, enzymes, and the like for producing a fluorescent-labeled probe. The substrate may also comprise cDNA or oligonucleotide corresponding to the control gene or fragment thereof.

또한 바람직하게는, ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. ELISA 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.Also preferably, it may be a diagnostic kit characterized by including the necessary elements necessary to perform the ELISA. ELISA kits contain antibodies specific for the marker protein. Antibodies are antibodies that have high specificity and affinity for each marker protein and have little cross-reactivity to other proteins. They are monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, or recombinant antibodies. The ELISA kit may also include antibodies specific for the control protein. Other ELISA kits can be used to detect antibodies that can bind a reagent capable of detecting the bound antibody, such as a labeled secondary antibody, chromophores, an enzyme (e. G., Conjugated to an antibody) Other materials, and the like.

또다른 양태로서, 본 발명은 상기 자궁내막증 진단용 조성물 또는 상기 자궁내막증 진단 키트를 이용한 자궁내막증 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a method for providing information for diagnosing endometriosis using the endometriosis diagnostic composition or the endometriosis diagnostic kit.

구체적인 일 양태로서, 본 발명은 CRMP-2, FGH, UCH-L1 및 MYL9 로 이루어진 그룹에서 1 이상 선택되는 유전자에 특이적인 항체를 사용하여 자궁내막증 의심 환자의 생물학적 시료로부터 단백질을 측정하는 단계; 및 상기 단백질 수준의 증가를 정상 대조구 시료의 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는 자궁내막증 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공한다.In a specific embodiment, the present invention comprises the steps of measuring the protein from a biological sample of a patient suspected of endometriosis using an antibody specific for a gene selected from the group consisting of CRMP-2, FGH, UCH-L1 and MYL9; And it provides a method of providing information for diagnosing endometriosis comprising comparing the increase in the protein level with the protein level of the normal control sample.

생물학적 시료에서 단백질을 분리하는 과정은 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있으며 단백질 수준은 다양한 방법으로 측정할 수 있다.The process of separating proteins from biological samples can be carried out using known processes and protein levels can be measured by various methods.

mRNA 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅, DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.Analytical methods for measuring mRNA levels include, but are not limited to, reverse transcriptase polymerase reaction, competitive reverse transcriptase polymerase reaction, real time reverse transcriptase polymerase reaction, RNase protection assay, northern blotting, and DNA chip.

상기 검출 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 mRNA 발현량과 자궁내막증 의심환자에서의 mRNA 발현량을 비교할 수 있고, 자궁내막증 마커 유전자에서 mRNA로의 유의한 발현량의 증가여부를 판단하여 자궁내막증 의심 환자의 실제 자궁내막증 발병 여부를 진단할 수 있다.Through the above detection methods, it is possible to compare the mRNA expression level in the normal control group with the mRNA expression level in suspected endometriosis, and to determine whether the endometriosis marker gene is significantly increased in mRNA. The diagnosis of endometriosis can be diagnosed.

mRNA 발현수준 측정은 바람직하게는, 자궁내막증 마커로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하는 역전사효소 중합효소반응법 또는 DNA 칩을 이용하는 것이다.mRNA expression level measurement is preferably by using a reverse transcriptase polymerase reaction method or a DNA chip using a primer specific for the gene used as an endometriosis marker.

상기의 역전사효소 중합효소반응은 반응 후 전기영동하여 밴드 패턴과 밴드의 두께를 확인함으로써 자궁내막증 진단마커로 사용되는 유전자의 mRNA 발현 여부와 정도를 확인 가능하고 이를 대조군과 비교함으로써, 자궁내막증 발생 여부를 간편하게 진단할 수 있다(도 8~11). 한편, DNA 칩은 상기 자궁내막증 마커 유전자 또는 그 단편에 해당하는 핵산이 유리 같은 기판에 고밀도로 부착되어 있는 DNA 칩을 이용하는 것으로서, 시료에서 mRNA를 분리하고, 그 말단 또는 내부를 형광 물질로 표지된 cDNA 프로브를 조제하여, DNA 칩에 혼성화시킨 다음 자궁내막증의 발병 여부를 판독할 수 있다. 또 다른 구체적인 양태로서, 본 발명은 CCNB1 중에서 선택되는 1개 이상의 단백질에 특이적인 항체를 자궁내막증 의심 환자의 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성으로 단백질 수준을 확인하는 단계, 및 상기 단백질 형성량의 증가를 정상 대조구 시료의 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는 자궁내막증 진단 방법을 제공한다.The reverse transcriptase polymerase reaction is electrophoresis after the reaction to confirm the band pattern and the thickness of the band to determine the mRNA expression and extent of the gene used as a diagnostic marker for endometriosis and to compare with the control group, whether endometriosis occurs Can be easily diagnosed (Figs. 8 to 11). On the other hand, the DNA chip uses a DNA chip in which the nucleic acid corresponding to the endometriosis marker gene or a fragment thereof is attached to a glass-like substrate with high density, and isolates the mRNA from the sample, and the end or the inside of the DNA chip is labeled with a fluorescent material. cDNA probes can be prepared, hybridized to DNA chips and read for the development of endometriosis. In another specific embodiment, the present invention comprises the steps of contacting an antibody specific for at least one protein selected from CCNB1 with a biological sample of a suspected endometriosis to confirm protein levels by antigen-antibody complex formation, and the amount of protein formation A method of diagnosing endometriosis, comprising comparing the increase of the protein level to a normal control sample, is provided.

단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.Analytical methods for measuring protein levels include Western blot, ELISA, radioimmunoassay, radioimmunoassay, oukteroni immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, FACS, Protein chips and the like, but is not limited thereto.

상기 분석 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 항원-항체 복합체의 형성량과 자궁내막증 의심환자에게서의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, 자궁내막증 마커 유전자에서 단백질로의 유의한 발현량의 증가 여부를 판단하여, 자궁내막증 의심 환자의 실제 자궁내막증 발병 여부를 진단할 수 있다.Through the above assay methods, the amount of antigen-antibody complex formation in the normal control group and the amount of antigen-antibody complex formation in suspected patients with endometriosis can be compared, and a significant increase in the expression level of the endometriosis marker gene to the protein can be compared. By determining whether or not, the actual endometriosis of the patient suspected of endometriosis can be diagnosed.

본 발명에서 용어 ‘항원-항체 복합체’란 자궁내막증 마커 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.As used herein, the term 'antigen-antibody complex' refers to a combination of an endometriosis marker protein and an antibody specific thereto, and the amount of the antigen-antibody complex is quantitatively measured through the magnitude of a signal of a detection label. It is possible.

이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹중에서 선택할 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 ß-글루쿠로니다제, ß=D-글루코시다제, ß-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, ß-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4 W(CN)8 , [Os(bpy) 3 ]²⁺,[RU(bpy) 3 ]²⁺, [MO(CN) 8 ]^4-등이 포함되며 이로 제한되지 않는다. Such a detection label may be selected from the group consisting of enzymes, fluorescent materials, ligands, luminescent materials, microparticles, redox molecules and radioisotopes, but is not necessarily limited thereto. When enzymes are used as detection labels, available enzymes include ß-glucuronidase, ß = D-glucosidase, ß-D-galactosidase, urease, peroxidase or alkaline phosphatase, acetylcholinese Therapase, glucose oxidase, hexokinase and GDPase, RNase, glucose oxidase and luciferase, phosphofructokinase, phosphoenolpyruvate carboxylase, aspartate aminotransferase, phosphphenolpyruvate deca Carboxylase, ß-latamase and the like. The minerals include, but are not limited to, fluorescein, isothiocyanate, rhodamine, picoeriterine, picocyanin, allophycocyanin, o-phthaldehyde, fluororescamine and the like. Ligands include, but are not limited to, biotin derivatives. Emitters include, but are not limited to, acridinium esters, luciferin, luciferase, and the like. Fine particles include, but are not limited to, colloidal gold, colored latex, and the like. Redox molecules include ferrocene, ruthenium complex, biologen, quinone, Ti ion, Cs ion, diimide, 1,4-benzoquinone, hydroquinone, K4 W (CN) 8, [Os (bpy) 3] ²⁺ , [RU (bpy) 3] ²⁺ , [MO (CN) 8] ^4- and the like.

단백질 발현수준 측정은 바람직하게는, ELISA법을 이용하는 것이다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 보다 바람직하게는, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출한다. 자궁내막증 마커 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여, 자궁내막증 발병 여부를 확인할 수 있다.Protein expression level measurement is preferably by using an ELISA method. ELISA is a direct ELISA using a labeled antibody that recognizes an antigen attached to a solid support, an indirect ELISA using a labeled antibody that recognizes a capture antibody in a complex of antibodies that recognize an antigen attached to a solid support, attached to a solid support Direct sandwich ELISA using another labeled antibody that recognizes the antigen in the antibody-antigen complex, a labeled antibody that recognizes the antibody after reacting with another antibody that recognizes the antigen in the complex of the antigen with the antibody attached to the solid support Various ELISA methods include indirect sandwich ELISA using secondary antibodies. More preferably, the antibody is enzymatically developed by attaching the antibody to the solid support, reacting the sample, and then attaching a labeled antibody that recognizes the antigen of the antigen-antibody complex, or to an antibody that recognizes the antigen of the antigen-antibody complex. It is detected by the sandwich ELISA method which attaches a labeled secondary antibody and enzymatically develops. Endometriosis marker protein and antibody can be confirmed by determining the degree of complex formation, the presence of endometriosis.

또한, 바람직하게는, 상기 자궁내막증 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 이용하는 것이다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동하여, 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀루로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 유전자의 발현에 의해 생성된 단백질의 양을 확인하여, 자궁내막증 발병 여부를 확인할 수 있다. 상기 검출 방법은 대조군에서의 마커 유전자의 발현량과 자궁내막증이 발병한 세포에서의 마커 유전자의 발현량을 조사하는 방법으로 이루어진다. mRNA 또는 단백질 수준은 상기한 마커 단백질의 절대적(예: ㎍/㎖) 또는 상대적(예: 시그널의 상대 강도) 차이로 나타낼 수 있다. 또한, 바람직하게는, 상기 자궁내막증 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 면역조직 염색을 실시하는 것이다.Also preferably, Western blot using at least one antibody against the endometriosis marker. The whole protein is isolated from the sample, electrophoresed to separate the protein according to size, and then transferred to the nitrocellulose membrane to react with the antibody. By confirming the amount of the generated antigen-antibody complexes using labeled antibodies, the amount of protein produced by the expression of genes can be confirmed to determine whether endometriosis develops. The detection method consists of a method of examining the expression level of the marker gene in the control group and the expression level of the marker gene in cells with endometriosis. mRNA or protein levels can be expressed as absolute (eg μg / ml) or relative (eg relative intensity of signals) differences of the marker proteins described above. Also preferably, immunohistostaining is performed using at least one antibody against the endometriosis marker.

또한, 바람직하게는, 상기 자궁내막증 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용하는 것이다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여, 자궁내막증 발병 여부를 확인할 수 있다.In addition, preferably, one or more antibodies against the endometriosis marker are arranged at a predetermined position on the substrate to use a protein chip immobilized at a high density. In the method of analyzing a sample using a protein chip, the protein is separated from the sample, and the separated protein is hybridized with the protein chip to form an antigen-antibody complex, which is read to confirm the presence or expression level of the protein, Determine if you have endometriosis.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 전술한 유전자의 단백질이 상향 발현 또는 하향 발현되는 세포를 배양하고, 발현억제 또는 발현증가 후보물질을 세포에 처리한 뒤, 후보 물질을 처리하지 않은 대조구 세포에서의 자궁내막증 진단 마커(단백질, mRNA)의 발현 정도와 비교하여 자궁내막증 관련 단백질 발현을 저해하거나 증가시키는 자궁내막증 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.In still another aspect of the present invention, the present invention provides a control cell which is cultured in a cell in which the protein of the above-described gene is up-expressed or down-expressed, and treated with an expression inhibitory or expression-increasing candidate to the cell, and which is not treated with the candidate material. The present invention provides a method for screening a endometriosis therapeutic agent that inhibits or increases endometriosis-related protein expression compared to the expression level of an endometriosis diagnostic marker (protein, mRNA) in.

스크리닝에는 바람직하게는, 자궁내막증 진단 마커의 mRNA 발현정도를 프라이머 또는 프로브를 이용하는 방법이 이용될 수 있으며, 그 중에서도 RT-PCR이 바람직하다. 대조구와 비교하여 진단 마커의 발현을 감소시키거나 증가시키는 자궁내막증 치료제를 선별하여 자궁내막증 치료에 사용할 수 있다.
For screening, preferably, a method using a primer or a probe may be used for the mRNA expression level of the endometriosis diagnostic marker, and among them, RT-PCR is preferable. In comparison to the control, endometriosis treatments that reduce or increase the expression of diagnostic markers can be selected and used to treat endometriosis.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples. However, the following examples are illustrative of the present invention, and the contents of the present invention are not limited by the following examples.

실시예Example 1. 샘플 준비 1. Sample Preparation

부산대학교병원 임상시험심사위원회 승인 (승인번호 2008072)하에 부산대학병원 산부인과를 방문한 25세에서 40세 사이 여성 중, 수술로 진단된 중등도 및 중증 자궁내막증 (moderate or severe endometriosis) 환자 6명을 실험군으로 하였으며, 초음파 검사에서 자궁, 난소 및 나팔관 소견이 정상이면서 골반통 및 월경 장애 증상을 나타내지 않는 정상 월경주기의 여성 6명을 대조군으로 하였다. 본 샘플은 2번에 걸쳐 수집되었으며, 1차 수집된 각 자궁내막증 환자 3명, 정상인 3명으로 1차적 분석이 이루어졌으며, 2차 수집된 각 3명에 대해 1차에서 분석한 결과를 cross-check함으로 재검증을 실시하였다.Among the women between 25 and 40 years of age who visited the obstetrics and gynecology department of Pusan National University Hospital under the approval of the Institutional Review Board of Pusan National University Hospital (Approval No. 2008072), six patients with moderate or severe endometriosis diagnosed as surgery Six women of normal menstrual cycle with normal uterine, ovarian and fallopian tube findings and no symptoms of pelvic pain and menstrual disorder were used as controls. The sample was collected twice, and the primary analysis was performed on three patients with primary endometriosis and three normal individuals. Recheck was performed by checking.

실시예Example 2. 2. 월경혈Menstrual blood 유래 미분화 자궁내막 세포 분리 및 배양 Isolation and Culture of Derived Undifferentiated Endometrial Cells

월경주기 2일째에서 4일째 사이에의 월경혈을 흡입용 카테타를 이용하여 자궁내막의 손상을 최대한 줄이면서 월경혈을 1ml 정도 채취하였다. 채취한 월경혈은 0.125% collagenase가 첨가된 DMEM 배양액으로 옮겨 20분마다 피펫팅하면서 5% CO2가 포함된 37°C 배양기(incubator)에서 1시간 동안 배양하였다. 이후 1,000rpm 조건에서 10분간 원심분리를 시행하여 세포들만 따로 회수하였고, 회수된 세포들은 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin, 1% amphotericin B가 첨가된 DMEM 배지로 옮겨 48시간 동안 배양하였다. 이후 적혈구 등의 부유물을 제거하기 위하여 PBS 용액으로 3회 수세한 뒤 다시 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지에서 배양하였다. 배양 2주 혹은 배양 접시의 70~80% 가량 세포가 배양된 후에 0.125% trypsin/1 mM EDTA를 처리하여 세포를 회수하였다.
Menstrual blood was collected from the second to fourth menstrual cycles by using a catheter for inhalation. The collected menstrual blood was transferred to DMEM culture medium containing 0.125% collagenase and incubated for 1 hour in a 37 ° C incubator containing 5% CO2 while pipetting every 20 minutes. Thereafter, centrifugation was performed at 1,000 rpm for 10 minutes to recover only the cells, and the recovered cells were transferred to DMEM medium containing 10% FBS, 1% penicillin / streptomycin, and 1% amphotericin B, and cultured for 48 hours. After washing three times with PBS solution to remove the suspended solids, such as red blood cells and incubated again in DMEM medium with 10% FBS. Cells were recovered by treatment with 0.125% trypsin / 1 mM EDTA after 2 weeks of culture or about 70-80% of the cells in the culture dish.

실시예Example 3. 단백질 추출 3. Protein Extraction

월경혈에서 분리한 자궁내막 세포에서 단백질을 분리하기 위하여, 분리된 자궁내막 세포에 urea 8M, 4% w/v CHAPS, 1% w/v EDTA, Tris pH 8.3 10mM, Protease inhibitor(GE Healthcare, USA)가 들어 있는 lysis solution을 첨가하였다. 그 후 실온에서 30분간 배양하고, 5분에 한 번씩 5초 정도 가볍게 vortexing해 주었다. 이 후 20℃, 13000rpm, 15분 동안 원심분리한 후, 상층액을 따서 다른 1.5ml 튜브에 넣고 vortexing 한 후 분주 한 후 -80℃에 보관하였다. 단백질 정량은 two-dimensional (2-D) Quant Kit를 이용하였다.
To isolate proteins from endometrial cells isolated from menstrual blood, urea 8M, 4% w / v CHAPS, 1% w / v EDTA, Tris pH 8.3 10 mM, Protease inhibitor (GE Healthcare, USA) Lysis solution was added. After that, the cells were incubated for 30 minutes at room temperature, and gently vortexed for 5 seconds every 5 minutes. After centrifugation for 20 minutes, 13000rpm, 15 minutes, the supernatant was picked up in another 1.5ml tube, vortexed and dispensed and stored at -80 ℃. Protein quantification was performed using a two-dimensional (2-D) Quant Kit.

실시예Example 4. 2차원 전기영동 ( 4. 2D Electrophoresis ( TwoTwo -- dimensionaldimensional ElectrophoresisElectrophoresis (2- (2- DEDE ))을 통한 분석Analysis through))

자궁내막 세포에서 추출한 단백질을 이용하여 2DE를 실시 하였다. 자궁내막 세포에서 추출한 단백질을 7M Urea, 2M Thiourea, 4% CHAPS, 0.1% EDTA(500mM), 0.002% w/v bromphenol blue, 75mM DTT, 1% v/v Pharmalyte(PH3-10NL)이 포함된 IEF buffer에 용해시켰다. 그 후 pH 3-10NL ImmobilineDryStrip gels(GE Healthcare; 18cm)에 샘플 100ug을 섞은 rehydration을 350ul 분취한 다음 20℃에서 12시간 동안 수화시켰다. IEF 과정은 IEF electrophoresis nuit(GE Healthcare)을 사용했으며, 30V에서 12시간 동안 rehydration, focusing은 500V에서 1시간, 1000V에서 1시간, 8000V에서 7시간 동안 하였다. 그 후 focused lPG Strip을 equilibration 하였다. 1차 equilibration은 6M Urea, 50mM Tris/HCl (pH 8.8), 2% SDS, 30% glycerol, 0.002% w/v bromphenol blue, 1% DDT가 포함된 equilibration buffer에서 15분간 실시하고, 2차 uilibration은 6M Urea, 50mM Tris/HCl (pH 8.8), 2% SDS, 30% glycerol, 0.002% w/v bromphenol blue, 2.5% iodoacetamide 가 포함된 equilibration buffer에서 15분동안 실시하였다. 이 후 equilibrated Strip을 SDS-PAGE gel (18cm, 12%)에 넣었다. SDS-PAGE는 Ettan DALT 2-DE gel system(GE Healthcare, USA)에서 실시하였다. SDS-PAGE가 끝난 gel을 PlusOne Silver Staining Kit(HE Healthcare)를 이용해서 gel을 staining하고, staining된 gel은 Umax scanner Power Look 2100XL(sofrware: Magic Scan version V5.2, UMAX)로 스캔하여 확인하였다. pair matching, normalization은 ProteomWeaver software(Defines, Munich, Germany)를 사용하였으며, 2배 이상 차이나는 spot은 ESI-Q-TOF/MS를 이용하여 분석하였다.2DE was performed using proteins extracted from endometrial cells. Proteins from endometrial cells were extracted with 7M Urea, 2M Thiourea, 4% CHAPS, 0.1% EDTA (500 mM), 0.002% w / v bromphenol blue, 75 mM DTT and 1% v / v Pharmalyte (PH3-10NL). It was dissolved in buffer. Thereafter, 350 ul of rehydration of 100 μg of the sample mixed with pH 3-10NL ImmobilineDryStrip gels (GE Healthcare; 18 cm) was hydrated at 20 ° C. for 12 hours. The IEF process was performed using IEF electrophoresis nuit (GE Healthcare). Rehydration and focusing were performed at 30V for 12 hours, 1 hour at 500V, 1 hour at 1000V, and 7 hours at 8000V. After that, the focused lPG Strip was equilibrated. Primary equilibration was performed for 15 minutes in equilibration buffer containing 6M Urea, 50mM Tris / HCl (pH 8.8), 2% SDS, 30% glycerol, 0.002% w / v bromphenol blue, 1% DDT. The reaction was carried out for 15 minutes in an equilibration buffer containing 6M Urea, 50 mM Tris / HCl (pH 8.8), 2% SDS, 30% glycerol, 0.002% w / v bromphenol blue, 2.5% iodoacetamide. Afterwards equilibrated Strip was added to SDS-PAGE gel (18cm, 12%). SDS-PAGE was performed on an Ettan DALT 2-DE gel system (GE Healthcare, USA). SDS-PAGE finished gel was stained with a PlusOne Silver Staining Kit (HE Healthcare), and the stained gel was confirmed by scanning with Umax scanner Power Look 2100XL (sofrware: Magic Scan version V5.2, UMAX). Pair matching and normalization were performed using ProteomWeaver software (Defines, Munich, Germany), and spots that differed more than two times were analyzed using ESI-Q-TOF / MS.

분석 결과 정상인에서만 발현되는 단백질이 9개, 자궁내막증 환자에만 발현되는 단백질이 2개로 총 11개에 단백질이 확인되었다 (도 1).
As a result, nine proteins expressed only in normal persons and two proteins expressed only in endometriosis patients were identified in a total of 11 proteins (FIG. 1).

실시예Example 5. 5. ESIESI -Q--Q- TOFTOF MSMS /Of MSMS 를 이용한 단백질 동정Protein identification

실시예 4의 이미지 분석을 통하여 단백질 발현 패턴에 차이를 보이는 스팟 (spot)을 선별한 다음, 겔 (gel)에서 해당 스팟 부분을 블루 팁을 이용하여 분리하였다. 분리된 스팟들은 30mM 페리시안화칼륨 (potassium ferricyanide)과 100mM 티오황산나트륨 (sodium thiosulfate)을 1:1로 섞은 용액에 담궈 탈색 (destaining) 시켰다. 탈색된 스팟들을 100mM 암모늄 중탄산염 (ammonium bicarbonate), pH7.8 용액과 아세토니트릴 (acetonitrile) 용액을 사용하여 전처리 하고, 트립신 (trypsin)과 반응시켰다.Spots showing differences in protein expression patterns were selected through the image analysis of Example 4, and then the spot portions of the gels were separated using a blue tip. The separated spots were destained by immersing in a 1: 1 mixture of 30 mM potassium ferricyanide and 100 mM sodium thiosulfate. Decolorized spots were pretreated with 100 mM ammonium bicarbonate, pH7.8 solution and acetonitrile solution and reacted with trypsin.

In gel tryptic digestion 방법으로 처리한 후, 그 추출액을 hybrid Quadrupole-TOF MS/MS spectrometer(QStar Elite, Applied Biosystems, USA) system으로 실시하였다. 분석과정은 다음과 같다. 먼저 Solvent A(Water/Aetonitrile (98:2 v/v), 0.1 % Formic acid)에 의해서 Fraction된 다음 LC-nano ESI-MS/MS system에 주입하였다. Solvent A는 water/ACN(98:2,v/v)에 0.1% formic acid가 첨가되어있다. 분석의 첫 단계는 Zorbax 300SB-C18 trap column (300μm i.d x 5 mm, 5 μm , 100 A Agilent Technologies, part number 5065-9913)에 들어 있으며, 98% solvent A (water/ACN (98:2 v/v), 0.1 % Formic acid) 와 2% solvent B (Water/ACN (2:98 v/v), 0.1 % Formic acid)로 flow rate of 10 μL/min에서 10분간 washing하였다. 그 후 Zorbax 300SB-C18 capillary column (75 μm i.d x 150 mm, 3.5 μm , 100 A part number 5065-9911)에서 flow rate of 300 nL/min로 분리하였다. LC gradient는 2%에서 35% solvent B 30분 이상 흘린 뒤 35% 에서 90% 10분 이상, 90% solvent B를 5분 동안 흘려주고, 마지막으로 5% solvent B를 15분간 흘려주었다. Peptide는 ion spray voltage of 2,300eV에서 코팅된 silica tip (FS360-20-10-N20-C12, PicoTip emitter, New Objective) 전자 분사하였다. Mass data는 Analyst QS 2.0 software (Applied Biosystems, USA)에 의해서 결과를 얻었다. After ingel tryptic digestion, the extract was subjected to a hybrid Quadrupole-TOF MS / MS spectrometer (QStar Elite, Applied Biosystems, USA) system. The analysis process is as follows. First, fractionated by Solvent A (Water / Aetonitrile (98: 2 v / v), 0.1% Formic acid) was injected into the LC-nano ESI-MS / MS system. Solvent A contains 0.1% formic acid in water / ACN (98: 2, v / v). The first step of the assay is contained in a Zorbax 300SB-C18 trap column (300 μm id x 5 mm, 5 μm, 100 A Agilent Technologies, part number 5065-9913) and 98% solvent A (water / ACN (98: 2 v / v), 0.1% Formic acid) and 2% solvent B (Water / ACN (2:98 v / v), 0.1% Formic acid) were washed for 10 minutes at flow rate of 10 μL / min. Thereafter, a Zorbax 300SB-C18 capillary column (75 μm i.d × 150 mm, 3.5 μm, 100 A part number 5065-9911) was separated at a flow rate of 300 nL / min. LC gradient was flowed from 2% to 35% solvent B for more than 30 minutes, then from 35% to 90% for 10 minutes, 90% solvent B for 5 minutes, and finally 5% solvent B for 15 minutes. Peptide was electrosprayed with silica tip (FS360-20-10-N20-C12, PicoTip emitter, New Objective) coated at an ion spray voltage of 2,300 eV. Mass data were obtained by Analyst QS 2.0 software (Applied Biosystems, USA).

실험 결과 실시예 4에서 선정된 11개의 후보 단백질 spot에 중 ESI-Q-TOF를 이용하여 특이적으로 발현하는 4개에 spot을 CRMP-2, FGH, UCH-L1, MYL9로 동정하였다 (도 2). 본 네 가지의 단백질에 대하여 2DE를 재수행한 결과, CRMP-2, UCH-L1, MYL9 단백질이 정상인에서 높게 나타나는 것을 다시 한번 확인할 수 있었다 (도 3).
As a result, four spots specifically expressed using ESI-Q-TOF among 11 candidate protein spots selected in Example 4 were identified as CRMP-2, FGH, UCH-L1, and MYL9 (FIG. 2). ). As a result of performing 2DE on the four proteins, it was confirmed that CRMP-2, UCH-L1, and MYL9 proteins were high in normal persons (FIG. 3).

실시예Example 6. 6. WesternWestern BlotBlot 분석을 통한 단백질 발현량 확인 Confirmation of protein expression through analysis

실시예 4의 2DE를 통해 찾은 단백질을 재확인하기 위해서 Western blot을 실시하였다. Western blot was performed to reconfirm the protein found through 2DE of Example 4.

자궁내막 세포에서 추출한 단백질 25ug을 SDS-PAGE를 통해서 전기 영동한후 분리가 끝난 gel을 nitrocellulose membrane에 Trans-blot SD Semi-dry Transfer cell (bio-rad)를 통해서 30분간 transfer하였다. 그 후, membrane에 5% skim milk 가 녹아있는 TBST를 넣어 4℃에서 밤새 blocking하였다. 1차 Rabbit ployclonal to CRMP2 항체(abcam, ab62661, UK)를 1:10000으로 희석하여 4℃에서 3시간 incubation하였다. 2차 항체는 Goat polyclonal Secondary Antibody to Rabbit IgG - H&L (HRP)(abcam, ab6721, UK)를 1:3000으로 희석하여 4℃에서 3시간 incubation하였다. 마지막으로 Enhanced Chemical Luminescence(ECL) regent(GE Healthcare)를 1분 동안 incubation 한 후 HypercassetteTM(Amersham biosciences, UK)에 Fugi Medical x-ray film을 넣어 1-5 분간 노출시켰다. 밴드의 분석은 Image J(NIH, USA) 프로그램을 통해서 분석하였으며, 통계 분석은 student's t-TEST를 통해서 분석하였다. After electrophoresis of 25 ug of protein extracted from endometrial cells through SDS-PAGE, the separated gel was transferred to nitrocellulose membrane for 30 minutes through a Trans-blot SD Semi-dry Transfer cell (bio-rad). Subsequently, TBST containing 5% skim milk was added to the membrane and blocked at 4 ° C. overnight. Primary rabbit ployclonal to CRMP2 antibody (abcam, ab62661, UK) was diluted 1: 10000 and incubated at 4 ° C for 3 hours. The secondary antibody was incubated at 4 ° C for 3 hours by diluting Goat polyclonal Secondary Antibody to Rabbit IgG-H & L (HRP) (abcam, ab6721, UK) at 1: 3000. Finally, after incubating Enhanced Chemical Luminescence (ECL) regent (GE Healthcare) for 1 minute, Fugi Medical x-ray film was added to HypercassetteTM (Amersham biosciences, UK) for 1-5 minutes. The band was analyzed using the Image J (NIH, USA) program, and statistical analysis was performed by student's t-TEST.

실험 결과, CRMP-2의 경우 자궁내막증 환자에 비해 정상인의 자궁내막세포에서 2.21배 높게 발현되는 것을 확인할 수 있었다 (도 4).
As a result, it was confirmed that CRMP-2 was expressed 2.21 times higher in endometrial cells of normal humans than in patients with endometriosis (FIG. 4).

Claims

CRMP-2 (Collapsin response mediator protein 2), FGH(S-formylglutathione hydrolase), UCH-L1(Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L1) 및 MYL9(Myosin regulatory light polypeptide 9)로 이루어진 그룹에서 1 이상 선택되는 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질로써, 자궁내막증 환자에서 특이적으로 발현이 억제되는 것을 특징으로 하는 자궁내막증 진단 바이오 마커.One or more genes selected from the group consisting of Collapsin response mediator protein 2 (CRMP-2), S-formylglutathione hydrolase (FGH), Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L1 (UCH-L1), and Myosin regulatory light polypeptide 9 (MYL9), or Endometriosis diagnostic biomarker, characterized in that the protein encoded by the gene, the expression is specifically suppressed in endometriosis patients.

CRMP-2, FGH, UCH-L1 및 MYL9 로 이루어진 그룹에서 1 이상 선택되는 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 자궁내막증 진단용 조성물.CRMP-2, FGH, UCH-L1 and MYL9 A composition for diagnosing endometriosis comprising an agent for measuring the mRNA or protein level of a gene selected from one or more selected from the group consisting of.

제2항에 있어서, 상기 단백질의 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 것인 자궁내막증 진단용 조성물.The composition for diagnosing endometriosis of claim 2, wherein the agent for measuring the level of the protein comprises an antibody specific for the protein.

제2항의 조성물을 포함하는 자궁내막증 진단용 키트.A kit for diagnosing endometriosis comprising the composition of claim 2.

제4항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 것을 특징으로 하는 자궁내막증 진단용 키트.The kit for diagnosing endometriosis according to claim 4, wherein the kit is an RT-PCR kit, a DNA chip kit or a protein chip kit.

CRMP-2 (Collapsin response mediator protein 2), FGH(S-formylglutathione hydrolase), UCH-L1(Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L1) 및 MYL9(Myosin regulatory light polypeptide 9)로 이루어진 그룹에서 1 이상 선택되는 유전자의 발현 수준을 측정하는 것을 특징으로 하는 자궁내막증 진단을 위한 정보의 제공 방법.At least one gene selected from the group consisting of Collapsin response mediator protein 2 (CRMP-2), S-formylglutathione hydrolase (FGH), Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L1 (UCH-L1), and myosin regulatory light polypeptide 9 (MYL9) Method for providing information for diagnosing endometriosis, characterized by measuring the expression level.

(a) CRMP-2 (Collapsin response mediator protein 2), FGH(S-formylglutathione hydrolase), UCH-L1(Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L1) 및 MYL9(Myosin regulatory light polypeptide 9)로 이루어진 그룹에서 1이상 선택되는 유전자가 도입된 세포를 배양하는 단계; (b) 상기 CRMP-2, FGH, UCH-L1 및 MYL9 로 이루어진 그룹에서 1 이상 선택되는 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 증가 또는 억제 후보 물질을 상기 세포에 처리하는 계; 및 (c) 처리된 세포와 대조구의 상기 유전자의 발현 수준을 비교하는 단계를 포함하는 자궁내막증 치료제의 스크리닝 방법.
(a) At least one selected from the group consisting of Collapsin response mediator protein 2 (CRMP-2), S-formylglutathione hydrolase (FGH), Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L1 (UCH-L1), and Myosin regulatory light polypeptide 9 (MYL9) Culturing the cells into which the gene to be introduced is introduced; (b) treating the cells with candidate cells for increasing or inhibiting expression of a protein encoded by a gene selected from one or more selected from the group consisting of CRMP-2, FGH, UCH-L1 and MYL9; And (c) comparing the expression levels of the genes of the treated cells with the control cells.