KR101331891B1 - 막으로 둘러싸인 세포 또는 세포 소기관의 내부 또는외부로의 생분자 전달에 적합한 나노입자 - Google Patents

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Abstract

막 파괴 성분 및 운반되어야 할 생분자 및 마커의 부착을 위한 결합 부위를 포함하는, 열 민감 코팅으로 코팅된, 초상자성 코어를 포함하는, 열 유도 엔도좀성 방출을 통해 시험관내 또는 생체외 조건에서 세포 배양물에 생분자를 전달하기 위한 나노 크기 입자. 교번 자기장을 본 발명에 의해 개시된 세포 배양물 수용 입자에 적용함으로써 다수의 상기 생분자 및 엔도좀성 파괴 분자의 방출 효과를 개시시키기 위한 방법.
나노입자, 초상자성, 열 유도, 교번 자기장, 세포, 엔도좀, 파열

Description

막으로 둘러싸인 세포 또는 세포 소기관의 내부 또는 외부로의 생분자 전달에 적합한 나노입자{A NANOPARTICLE SUITABLE FOR DELIVERY OF A BIOMOLECULE INTO OR OUT OF A MEMBRANE ENCLOSED CELL OR CELL ORGANELLE}
발명의 기술분야
본 발명은 막으로 둘러싸인 세포 또는 세포 소기관의 내부 또는 외부로 물질을 전달하는데 적합한, 상기 물질에 대한 열 유도 방출(heat-induced release)을 통해 물질 전달이 이루어지는 입자와 관련이 있고, 상기 물질에 대한 열 유도 방출을 통해 막으로 둘러싸인 세포 또는 세포 소기관의 내부 또는 외부로 물질을 전달하는 방법뿐만 아니라, 다른 응용분야에서의 상기 입자의 용도와 관련이 있다.
발명의 배경
신뢰도 높은 생분자 전달 방법은 수많은 생명공학 연구자들에게 필수불가결한 도구이다. 트랜스펙션, siRNA 평가 및 다양한 세포 표지 방법의 스크리닝은 표적 세포 배양물로의 효율적인 전달이 중요한 대표적인 예이다. 시험관내 조건에서의 용도를 위한 성공적인 비바이러스성 생분자(biomolecule) 전달 방법은 일련의 장애를 극복하여야 하고, 표적 세포에 대하여 독성 효과를 미치지 아니하여야 하며, 여전히 세포내로 선택된 기능성 생분자의 효율적인 전달이 여전히 가능하여야 한다. 전달 과정에서의 첫 단계는 생분자가 표적 세포의 표면에 도달하도록 하는 것이다. 상기 생분자는 세포 배양물 내의 배지 성분과 독립하여 세포로 전달되어야 하며, 부착 세포주 및 현탁액 내의 세포 둘 모두에 도달되어야 한다. 일단 세포 표면에 전달되면, 생분자는 세포막/세포벽을 통과하거나 엔도사이토시스(endocytosis) 경로를 통해 세포내로 진입하게 된다. 일단 엔도좀내의 pH가 낮아지게 되면, 세포질과 엔도좀(endosome) 둘 모두 다양한 분해 효소를 포함한다. 효율적인 전달 방법은 바람직하게는 관심의 대상인 생분자(이것이 DNA, RNA, 단백질 또는 그 외 다른 분자로 만들어졌는지 여부에 관계없이)의 세포내 분해를 최소화하여야 한다. 생분자가 엔도사이토시스를 통해 세포 내로 진입되는 전달 과정이 성공적으로 달성되도록 하기 위해, 엔도좀성 구획(compartment)으로부터 가능한 많은 생분자들의 세포질로의 엔도좀성 방출을 촉진하는 것이 바람직할 수 있다. 일단 세포질내에서, 생분자는 바람직하게는, 예를 들어, 세포 핵과 같은 특정 세포내 구획으로 표적화되어야 한다.
오늘날 가용한 모든 비바이러스성 생분자 전달 방법과 관련한 기본 기술들은 2종류의 방법으로 구분될 수 있다. 세포막을 통과하여 세포질 내로 생분자를 전달하는, 전자천공, 미세주입 및 유전자 폭격과 같은 물리적 방법. 표적 세포의 엔도사이토시스를 이용하는 화학적/합성적 방법. 상기 2종류의 기술들은 특별한 특징들뿐만 아니라, 한계를 지니고 있으나, 잘 확립된 방법들이다. 줄기 세포, 초대배양(primary) 세포주뿐만 아니라, 배양된 표준 실험실 세포주에 관한 시험관내 연구에 기초하여 그 수가 증가된 고효율 전임상 세포는 효율적이고, 확고하며, 저렴한 생분자 전달 방법을 필요로 한다. 이러한 요구를 충족시키기 위하여, 화학적 및 합성적 전달 방법의 전달 효율을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 효율을 증가시키기 위한 한가지 방법은 엔도좀성 방출을 활발하게 촉진하는 것이다.
발명의 요약
일 양상에서, 본 발명은 물질에 대한 열-유도 방출을 통해 막으로 둘러싸인 세포 또는 세포 소기관의 내부 또는 외부로 상기 물질을 전달하는데 적합한 입자로서, 하기 성분을 포함하는 입자와 관련이 있다: 상기 물질 및 막 파괴제가 결합되는, 열 민감 코팅으로 캡슐화된, 교번 자기장 내에서 열을 발생시킬 수 있는, 초상자성(superparamagnetic) 코어.
추가 양상에서, 본 발명은 숙주 세포의 유전자 코드 및/또는 물질 대사를 변형시키기 위한 입자의 용도와 관련이 있다.
추가 양상에서, 본 발명은 엔도좀성 또는 리소좀성(lysosomal) 세포 소기관으로부터 상기 물질을 방출시키기 위한 입자의 용도와 관련이 있다.
추가 양상에서, 본 발명은 막 파괴제의 열 유도 방출과 조합하여 물질의 열 유도 방출을 통해 막으로 둘러싸인 세포 또는 세포 소기관의 내부 또는 외부로 상기 물질을 전달하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는, 방법과 관련이 있다:
- 막으로 둘러싸인 세포 또는 세포 소기관 및 본 발명에 따른 입자를 다수 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
- 상기 샘플에 교번 자기장을 적용시키는 단계, 이에 따라, 상기 입자 코어의 열 에너지는 상기 입자의 열 민감 코팅의 분해를 유발하며, 상기 막 파괴제가 막으로 둘러싸인 세포 또는 세포 소기관의 막을 파괴하도록 유발하며, 상기 물질을 방출시킨다.
도면의 간단한 설명
도 1: 나노입자의 산화철(iron oxide) 코어에 관한 일 실시예의 TEM 이미지.
도 2: 열 효과
(A) 10 MHz의 주파수를 지닌 교번 자기장에서 나노입자의 전자파 흡수율(specific absorption rate)(SAR-값)과 적용된 자기장 강도 간의 관계. (B) 해당 그래프는 10 MHz, 2.9 mT의 교번 자기장에 노출된 0.15 M NaCl 중의 7 mg Fe/ml의 샘플 100 ㎕ 내에서의 온도의 증가를 도시하고 있다. 수치는 입자가 없는 레퍼런스 샘플에서의 온도 증가에 대하여 교정되었다. 광섬유(fiber optic) 프로브(IPITEK)를 이용하여 온도 측정을 실시하였다.
도 3: 실험 셋업(Experimental setup)의 전체 도시.
도 4: 실시예 5에 기재한 바 대로, 입자로 처리된 세포에 대한 고구배 자기 분리(high gradient magnetic separation) 시험에 따른 결과.
도 5: 아미노기, 선형 PEI 및 분지형 PEI를 지닌 표면이 변형된, 역자기 나노입자의 DNA 결합력 조사. TE 버퍼 중에서 10분간 플라스미드 DNA(phRLSV40-luc, 3.7kb)와 함께 상이한 양의 입자들을 인큐베이션하였다. 피코그린(PicoGreen)을 첨가한 후, FITC 필터가 장착된 마이크로플레이트 형광 판독기로 형광을 측정하였다. 감소된 형광은 응축된 DNA를 나타낸다.
도 6: 실시예 11에 기재한 바 대로, K562 세포에 대한 트랜스펙션으로부터 얻은 결과. "세포"로 표기된 샘플은 트랜스펙션되지 않은 세포에서 생성된 백그라운드 대조군이다.
발명의 상세한 설명
앞서 언급한 바와 같이, 본 발명은 생분자 전달에 적합한 입자를 제공하는데, 상기 입자는 다양한 임의의 표적 세포 내의 엔도좀성 방출과 다양한 생분자의 고효율 전달을 결합시킨다.
본 발명은 지금부터 첨부된 도면을 참조하여 보다 상세히 설명될 것인데, 상기 도면에는 본 발명의 바람직한 구체예들이 제시되어 있다. 그러나, 본 발명은 매우 다양한 형식으로 구체화될 수 있으며, 본 발명이 본 명세서에 제시된 것과 같은 도시된 구체예들로 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다. 그 보다, 이러한 구체예들은 본 발명의 개시내용을 더 명확하게 하고 당업계의 통상의 기술자에게 본 발명의 영역을 완벽하게 이해시키고자 제공된 것이다.
본 발명자들은 본원에 앞서 PCT 국제공개공보 WO 01/18168호에서 교번 자기장을 막으로 둘러싸인 세포 또는 세포 소기관에 부착된 초상자성 입자의 샘플에 적용시킴으로써 생물학적 막으로 둘러싸인 구조물 내부로 또는 이로부터 생입자(bioparticle)를 도입하거나 추출하는 방법을 소개한 바 있는데, 상기 교번 자기장 적용에 따른 열 에너지의 증가는 상기 입자의 초상자성 코어의 가열을 초래하고, 이어서 세포막 또는 세포 소기관 막의 일시적 개방을 초래한다.
본 명세서에 기재된 본 발명은 시험관내 또는 생체외(ex vivo)에서의 생분자 전달을 위하여 디자인된 입자에 관한 것인데, 상기 입자는 교번 자기장에 노출시, 초상자성 코어로부터 방출된 열 에너지를 이용하여 입자의 열 민감 코팅으로부터 막 파괴 분자(예를 들어, 지질, 콜레스테롤 또는 계면활성제)를 방출시켜 화학적 막의 파열을 유발하게 된다. 상기 입자의 초상자성 코어에 대한 가열이 일어나는 동안 전달되어야 하는 물질(예를 들어, 생분자)(이하 "적재(cargo) 분자"라고 칭함) 및 엔도좀 막과 같은 세포 또는 세포 소기관 막의 파열을 촉진할 수 있는 분자 둘 모두가 방출된다. 본 명세서의 문맥에서, 용어 "물질" 및 "카고 분자"는 호환적으로 사용된다. 물질 또는 카고 분자는 본 발명의 입자를 통해 표적 세포로 전달된다. 물질 또는 카고 분자의 한 예는 생분자이다.
생약 및 생물공학에서 자성 입자(magnetic particle)의 응용은 지속적으로 증가하고 있다. 오늘날 자성 나노입자는 정제, 정량, 트랜스펙션, 온열요법, 약물 전달, 그 중에서도 MRI에 의한 영상화에 사용되고 있다. 약물 전달을 위한 리포좀 내부에 전구약물(prodrug)과 함께 포집된(entrapped) 초상자성 입자는 미국 특허출원 US2003211045호에 소개된 바 있는데, 상기 리포좀 내부의 자성 입자에 대한 가열이 전구약물을 약물로 전환시키게 된다. 또한 초상자성 코어가 유기 화합물 및 비히클 형성 지질로 캡슐화된 또 다른 입자가 미국 특허 US5441746호에 개시되어 있는데, 여기서 상기 입자는 암 세포 사멸을 촉진하기 위하여 초상자성 코어에 대한 유도성 가열을 받게 된다.
이러한 이전에 소개된 지질 캡슐화된 초상자성 코어와는 대조적으로, 본 발명은, 교번 자기장 내에서 열을 발생시키면서, 시험관내 또는 생체외 조건에서 비바이러스성 생분자를 전달하기 위하여 선정된, 초상자성 입자를 개시한다. 입자/카고 분자 복합체가 엔도사이토시스를 통해 세포에 의해 받아들여지게 되는, 세포 표면으로 카고 분자를 운반하는 것 이외에, 본 발명의 입자는, 교번 자기장에 노출될 때, 카고 분자의 엔도좀성 방출이 향상된다. 따라서, 본 발명의 입자 표면은 균질하지 아니하며, 그 대신 가열 펄스에 따라 방출되거나 배열이 변화되는 열 민감 구조체 복합물을 지닌다. 본 발명에 기재된 다수의 입자 각각은 카고 분자, 하나 이상의 막 파괴제, 표적 세포 및 신호-분자(예를 들어, 펩티드) 및 전달 과정의 영상화를 위한 형광 마커를 인지하고 이에 결합할 수 있는 인식 분자와 관련된, 다수의 커플링 및/또는 부착 부위를 지닌다.
본 발명의 일 구체예에서, 초상자성 코어의 크기는 8 내지 15 나노미터 사이이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 상기 초상자성 코어는 자철석, 마게마이트(maghemite), 산화철수화물(iron oxide hydrate), 일반식 MeOxFe2O3의 페라이트(여기서 Me는 Co, Ni, Mn, Be, Mg, Ca, Ba, Sr, Cu, Zn, Pt, Al, Cr, Bi으로 구성된 군에서 선택된 2가 금속임) 및 이들의 조합물로 이루어 진다.
본 발명의 추가 구체예에서, 열 민감 코팅은 상기 코어와 직접 접촉하는 미셀(micelle)형 구조를 포함하는데, 상기 미셀형 구조는 하나 이상의 소수성 분자 및 소수성과 친수성 부분 둘 모두를 포함하는 하나 이상의 분자로 만들어 진다. 열 민감 코팅은 하나 또는 다수의 이황화 결합, 과산화물(peroxide) 결합 또는 아조(azo) 결합 또는 이들의 조합을 통해 상기 물질 및 막파괴제에 결합된다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 친수성 부분 구조는 중합체, 지질, 합성 분자, 단백질 또는 이들의 조합물을 포함한다.
본 발명의 추가 구체예에서, 하나 이상의 인식 분자가 또한 열 민감 코팅에 결합되는데, 상기 인식 분자는 항체, 항체의 단편 및 렉틴으로 구성된 군에서 선택된다.
본 발명의 추가 구체예에서, 막 파괴제는 콜레스테롤, 소수성 단백질, 계면활성제(surfactants) 및 이들의 조합물로 구성된 군에서 선택된다.
본 발명의 추가 구체예에서, 상기 물질 또는 카고 분자는 DNA 분자, RNA 분자 및 이들의 조합물로 구성된 군에서 선택된다.
본 발명에 따른 방법의 일 구체예에서, 상기 자기장은 0.1 내지 5 MHz 범위의 주파수의 교번 자기장 방향을 갖는다. 상기 자기장은 1 내지 100 mT 범위의 자기장 강도를 가질 수 있다.
본 발명의 추가 구체예에서, 상기 자기장은 일련의 펄스로, 각 펄스의 지속 시간, 바람직하게는, 1 내지 600초, 더 바람직하게는, 1 내지 45초에 걸쳐서, 반복적으로 노출된다. 상기 자기장은 불균일하며 경사 교번 자기장 방향을 지니는 교번 자기장일 수 있는데, 상기 교번 자기장은 2개의 코일에 의해 생성되며, 상기 샘플은 상기 코일 사이에 삽입된다. 상기 코일은 공급된 교류 전류의 포지티브(positive) 또는 네거티브(negative) 부분 중 어느 한 부분을 공급받을 수 있다.
본 발명은 코팅 층 또는 층들로 캡슐화된 초상자성 코어로 구성되는데, 내층(inner layer)은 초상자성 코어와 직접 접촉된다(실시예 1 및 2 참조). 입자의 초상자성 코어는 다음의 3가지 요망되는 특징을 충족한다; MRI를 이용하여 추적이 가능하며, 자기 분리 기술을 이용하여 이러한 입자를 받아 들인 세포가 분류될 수 있으며(실시예 2 및 5를 참조바라며 가장 중요한 특징임); 열을 발생시키는 것이 가능하게 제작될 수 있다. 교번 자기장은 입자의 회전 및 입자내의 자기 모멘텀의 회전으로 인하여 각 입자의 자성 코어 내에 열을 유발시킨다(실시예 3 참조). 이러한 현상은 모두 열 손실을 초래한다. 주어진 순간에 이들 중 어느 하나가 우세할 것인지는 입자 크기, 자기장 주파수 및 입자 코팅에 따라 달라진다. 입자 코어의 바람직한 크기는 8 내지 15 나노미터인데, 이러한 크기 간격의 코어는 교번 자기장의 더 낮은 메가헤르츠(㎒) 범위의 주파수를 이용하는 것을 가능케 하고 따라서 표적 세포 및 주위 성장 배지에 대한 역(eddy) 가열이 회피될 수 있게 하기 때문이다. 입자의 코팅은 입자의 크기가 전체적으로 바람직하게는 50나노미터 미만으로 유지될 수 있도록 가능한 얇게 유지되어야 한다. 소형 입자는 다양한 세포 표면에 대한 결합을 위한 고효율의 표면 및 유리한 동력학을 조장한다(실시예 10 참조). 상기 입자가 중력에 의해 시험 튜브내에서 침전되지 않을 정도로 충분히 작다면, 현탁핵 중의 세포 및 부착된 세포 주 둘 모두와 상호작용할 수 있다.
입자의 코팅은 안정한 콜로이드 용액 중에서 입자가 서로 서로 잘 분리되도록 유지하는데 매우 중요하다. 다양한 버퍼 및 세포 배양 배지에서의 안정성은, 다양한 생화학적 커플링 기술을 이용한, 표면 변형의 관점에서 뿐만 아니라, 살아 있는 세포에 대한 효과의 관점 둘 모두에서 나노입자의 유용성 및 유효성에 중요하다. 입자 표면으로의 카고 분자 및/또는 세포 인지 분자의 커플링 화학과 관련하여, 아미노-PEG가 입자의 표면에 도입될 수 있는데, NHS(N-히드록시숙신이미드 에스터), SPDP(N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오) 프로판산염), 글루타르 알데히드(glutaric aldehyde) 및 그 외 생접합(bioconjugate) 기술에 의한 커플링으로 도입될 수 있다. 시험관내 또는 생체외 조건에서 세포에 전달되어야 하는 카고 분자는 공유결합적으로, 정전기적으로(electrostatically) 또는 반 데르 발스 상호작용을 통해 코팅에 부착된다. 카고 분자가 DNA 또는 RNA 분자인 경우, DNA 또는 RNA 분자의 전기음성적 백본과, 코팅의 외층 내에 통합되는 DOTAB와 같은 전기양성적으로 하전된(positively charged) 분자 또는 열 민감 코팅의 외부 표면 층의 아미노-PEG 분자에 공유결합적으로 커플링되는 폴리리신, PEI(폴리에틸렌이민(polyetylenimin)), 프로타민, 아르기닌- 또는 리신-풍부 펩티드와 같은 전기양성적으로 하전된 분자 간의 정전기적 상호작용이 용이하게 이용된다. 형광 마커 또는 표적 세포 인지 분자와 같은 추가의 분자들은 카고 분자와 동일한 절차에 의해 부착된다.
입자가 유전자 전달 목적을 위한 DNA 또는 RNA 분자와 같은 카고 분자에 결합된 복합체일 때, 상기 입자는 안정적이고 무독성 캐리어로서 역할하여야 한다. 추가적으로, 상기 입자는 이들의 적재-분자를 분해로부터 보호하여야 하며 또한 세포 내의 표적 부위에서 동일한 바로 그 분자의 방출을 촉진하여야 한다. 입자 표면에 근접하여 카고 분자가 복합체를 형성하게 함으로써, 분해 효소에 대한 입체 장애가 도입되는데, 이는 차례로 카고 분자에 대한 효소적 분해를 막는데 유리할 수 있다.
카고 분자 뿐만 아니라, 나노입자는 신호-분자(예를 들어, 펩티드) 및 형광 마커를 운반할 수 있다. 본 발명은, 상이한 카고 분자를 운반하는 것 외에, 나노 입자의 표면으로부터 열 방출 효과를 유도할 수 있다. 열 유도 전달의 이면에 존재하는 생각은 입자에 대한 근접 부근에서 분자의 확산속도를 증가시키고, 입자 표면에 부착된 분자의 방출을 촉진하고자 하기 위함이다.
2개층의 분자가 코팅을 형성한다. 내층은 소수성 분자, 예를 들어, 올레산과 같은 지방산, 또는 소수성 분자들의 혼합물로 이루어 진다. 제2 층은 분자들의 혼합물로 이루어지는데, 이 분자들 각각은 하나의 소수성 부분과 하나의 친수성 부분에 의해 특징지워진다. 상기 소수성 부분은 제1 층과 함께 이중층, 미셀형 구조를 형성하는 반면, 친수성 부분은 물 기반 버퍼 및 성장 배지 내에서 입자에 안정성을 부여하는 주변 매체(medium) 쪽으로 향하게 된다. 이러한 친수성 부분은 추가로 카고 분자 및 입자의 코팅 표면에 부가적으로 부착된 임의의 인식 분자 또는 신호 분자를 부착시키는데 이용된다.
코팅 지질 전이 온도에 상응하는 온도에 코팅이 노출될 때, 입자로부터 코팅의 누출이 유발되기 때문에 상기 기재된 코팅은 분자 내부 재배열 또는 붕괴(disruption)와 함께 반응하게 되며, 이것은 차례로 상기 코팅에 부착된 물질의 방출을 야기시킨다. 상 전이 온도는 질서정연한 겔 상으로부터(이때, 탄화수소 사 슬은 완전히 신장되어 있고 촘촘하게 들어차 있음) 무질서한 지질 결정 상으로(이때, 탄화수소 사슬은 불규칙하게 배열되어 있고 유동적임) 지질의 물리적 상태에서의 변화를 유발하는데 필요한 온도로 정의된다. 상 전이 온도에 직접적으로 영향을 미치는 몇가지 인자가 있는데, 이에는 탄화수소 길이, 불포화도, 전하, 및 헤드 그룹 종이 포함된다.
입자의 초상자성 코어가 교번 자기장 내에서 열을 발생시키도록 제작될 수 있기 때문에, 가열 절차는 입자에 매우 근접한 부근의 공간(volume)에서 매우 정밀하게 이루어질 수 있다. 그리하여 표적 분자는 전체적으로 가열되지 아니할 것이다.
외부 지질 층에 다양한 분자를 포함시킴으로써, 다목적 열 방출 나노입자가 만들어 진다. 콜레스테롤과 같은 공지의 헬퍼 분자인, DOPE(디오레오일-포스파티딜에탄올아민) 지질은 표면 외층의 부분/구성원으로써 운반된다. 트리톤(Triton) X와 SDS(소디움 도데실 설페이트)와 같은 합성 세제 및 유사 분자들도 외부 코팅 층의 부분/구성원이 될 수 있다. 이러한 세제가 입자내에 통합될 경우, 이들은 표적 세포에 대한 독성이 더 적어지지만, 입자로부터 방출될 경우, 이들은 엔도좀성 막(들)의 파괴를 촉진하게 된다(상세하게는 실시예 11을 참조). 또한, 외부 코팅 층 내의 분자와 카고 분자 사이의 온도 민감 공유결합 브릿지를 선택함으로써, 엔도좀성 구획으로부터 연이은 유출(escape)을 위하여 나노입자로부터의 카고 분자의 방출을 훨씬 더 강력하게 촉진할 수 있게 된다(실시예 4 및 6 참조).
기재된 본 발명의 일 구체예에서, 기재된 발명에 따른 입자가 시험관내 또는 생체외 조건에서 세포 배양물로의 물질 전달을 위하여 이용되는 방법이 제공된다. 요망되는 물질 또는 물질들은 카고 분자로서 정전기적 상호작용, 공유결합 또는 반 데르 발스 상호작용을 통해 입자 표면에 결합된다. 입자/카고 분자 복합체는 세포 배양 배지와 혼합된다. 입자의 표면은 친화성 분자(affinity molecule)을 운반할 수 있는데, 상기 분자는 표적 세포 표면 상의 특정 표적에 결합하거나, 입자/적재 복합체가 표적 세포의 전기음성 표면 구역과 상호작용하는 것을 촉진시키는, 순(net) 전기양성 전하를 지닐 수 있다. 입자는 표적 세포의 엔도사이토시스에 의해 재빨리 캡슐화되며, 그런 다음 초기 엔도좀은 세포로 운반되고, 이어서 세포에 의해 후기 엔도좀으로 가공되며, 세포 내에 존재하는 골지(Golgi) 및 소포체(endoplasmatic reticulum) 구획으로 운반될 수 있다. 이후 자기장이, 수초 내지 수분간의 지속 및 이와 동일한 시간의 지속 중단을 수반하는, 펄스로 적용된다. 2 내지 수백의 펄스들이 적용될 수 있으며 반복된 가열은 입자 코딩 분자로부터 누출을 야기시키고 그리하여 이들에 결합된 카고 분자 및 막 파괴 분자 둘 모두의 방출을 야기시킨다. 막 파괴제 자체가 엔도좀성 막내에 삽입되고 그리하여 엔도좀의 파열을 일으키게 된다. 카고 분자가 입자 코팅에 공유결합적으로 커플링되어 있는 경우, 예를 들어, 이황화 브릿지와 같은 열 민감 공유결합은 가열될 때 추가적으로 방출 효과를 촉진할 수 있다. 자기장에 노출시키기 이전에 세포 및 입자의 인큐베이션 시간은 전달 과정에 영향을 미치며 각각의 특이적 세포주에 대해 개별적으로 최적화된다. 또한, 자기장은 각 처리마다 1시간 미만 내지 수시간의 인큐베이션 시간을 갖는 시간 내내 전달 과정이 개선되도록 하기 위하여 1회 이상 적용될 수 있다.
처리된 세포는 자동적으로 표지되고 MRI로 추적될 수 있으며, 또한 형광 마커가 입자 코팅에 부가되어 형광 현미경으로 상기 과정을 추적할 수 있는 가능성을 제공할 수 있다. 또한, 세포는 세척되고 임의의 시간에 고구배 자기장 분리방법(high gradient magnetic field separation methods)을 이용하여 분류될 수 있으며, 영구 자석의 움직임에 노출될 경우, 세포가 현미경하에서 움직여질 수 있다.
실시예 1
철 카르복실레이트 염의 열 분해
11±1 ㎚의 단분산(monodisperse) 입자를 생산하기 위하여, 하기 과정에 따랐다. 360 mg의 산화철(III)을 빻아서 더 작은 입자로 만들고 5 g의 올레산 및 11 g의 1-옥타데센(octadecene)을 첨가하였다. 용액을 혼합하고 3목 보틀 플라스크에 옮기고, 자석 스터러와 함께 히팅맨틀(heating mantel)에 장치하고 온도가 적어도 320℃에 도달할 때까지 가열하였으며, 상기 온도에서 1-옥타데센이 끓기 시작하였다. 1시간의 반응시간 동안, 온도를 모니터하였으며, 온도가 상기 언급된 온도 밑으로 내려가지 않도록 유지되는 것이 바람직하다. 인큐베이션 1시간 후, 용액을 실온에서 식혔다. 에탄올, 클로로포름 또는 이들의 조합물로 반복하여 세척함으로써 과량의 시약들로부터 입자를 정제하고 최종적으로 클로로포름 또는 헥산에 재현탁시켰다.
실시예 2
폴리(에틸렌글리콜)-지질 표면 코팅
간략히 요약하면, 입자를 클로로포름 중에서 현탁시켰으며, 그 다음 순서로 진공하에서 건조시켰다. 30-60% 몰(mol) 인지질(예를 들어, 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 또는 화학 구조가 유사한 그 외의 인지질) 내지 40% 몰 또는 그 이상의 PEG-지질(예를 들어, 1,2-디팔미토일-sn-글리세포-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000], 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌 글리콜) 2000] 또는 유사한 PEG-지질, 또는 화학 구조가 유사한 그 외 지질) 중 어느 하나를 포함하는 클로로포름 용액을 건조된 입자에 부가하였는데, 상기 건조된 입자는 이후 용액이 되었다. 클로로포름을 증발시키고 1-4 시간 동안 입자를 더 건조시켰다. 이후 물, NaCl 또는 일반적인 생리학적 버퍼를 이용하여 입자를 수화시켰으며, 100㎚ 필터를 통해 멸균 여과 될 수 있는 깨끗한 용액을 회수하기 위해 유순하게 초음파분해하였다. 고구배 자기분리로 지질 및 PEG-지질로부터 입자를 정제하고, 정제된 입자를 40℃에서 보관하였다. 그러나, 상기 입자는 이의 특성에 주목할만한 변화 없이 수주간 실온에서 보관될 수 있다. 입자는 생리학적 염 농도를 갖는 일반적인 버퍼 중에서 수주간 안정한 콜로이드로 유지된다. 시간의 상한이 시험되지는 아니하였으나, 3일 이상의 기간 동안 10% FCS(혈청)을 포함하는 복합 성장 배지 중에서도 안정하게 유지되었으므로, 입자는 훨씬 더 긴 시간 동안 용액에서 유지될 수 있을 것이다.
자기 컬럼(고구배 자기분리 컬럼) 또는 크기 배제 크로마토그래피로 커플링 화합물 및/또는 염으로부터 입자 현탁액을 손쉽게 정제하였다.
고구배 자기분리 컬럼(Magnetic high gradient separation column)
입자 현탁액을 자기 매트릭스를 포함하는 컬럼에 적용시켰는데, 상기 매트릭스는 1.2T의 센 영구 자기장에 노출되었다. 매트릭스가 센 자기장에 노출되는 한 입자가 자기 매트릭스에 유지된다. 자기장이 사라졌을 때, 입자를 물 또는 바람직한 버퍼 용액으로 용출시켰다. 또한 더 적은 부피로 용출시킴으로써 자성 컬럼에서 자성유체(ferrofluid)를 농축시키는 것이 가능하였다.
크기 배제 크로마토그래피
입자 현탁액을 세파크릴(Sephacryl™) S-500 하이 레졸루션 겔로 충진된 컬럼에 적용하였다. 자성유체를 크기 배제로 커플링 화합물 및/또는 염으로부터 분리시켰다. 자성유체를 물 또는 바람직한 버퍼 용액으로 용출시켰다.
크기 및 안정성
TEM(transmission electron microscope)을 이용하여 측정된, 입자의 산화철 코어의 평균 직경은 11±1 ㎚이었다(도 1 참조). 전체 입자의 직경은 지질 표면 층의 조성 및 캐리어 액체의 특성에 따라 달라진다. 자기 나노입자는 손쉽게 멸균 여과되며 일반적인 생리학적 버퍼 중에서 안정한 콜로이드이기 때문에, 제조 및 입자의 추가 변형 과정이 진행되는 동안 크기 배제 크로마토그래피, 투석 및 고 자기장 분리를 이용하는 것이 가능하였다. 표준 프로토콜에 따라 플루람(Fluram®)을 사용하여 입자 표면 상의 아미노기를 분석하였고, 입자의 안정성에 영향을 미치지 아니하면서 아미노기의 수량은 입자 당 수백개에서 수천개까지 사이에서 달라질 수 있었다. 더욱이, 아미노기는 기타 작용기 또는 분자의 부가를 위한 일반적이고 잘-확립된 커플링 화학을 이용한 공유결합성 커플링에 용이하게 이용될 수 있다.
실시예 3
교번 자기장 내에서 열 손실
입자의 코어는 초상자성이고, 이러한 입자가 교번 자기장 하에 놓이게 경우, 열이 주위 매체로 손실되게 된다. 입자의 전자파 흡수율(SAR)의 주파수 의존도를 시험 및 평가하였다. 도 2에 도시된 바와 같이, 10 MHz의 주파수 및 2.8 mT의 자기장 강도에서 SAR 수치는 500 와트(watt)/g 이상에 도달되었다.
실시예 4
입자 표면으로부터의 분자의 방출에 대한 열 효과
인지질 및 플루람(Fluram®)을 이용하여 형광적으로 표지된 아미노기를 지니는 아미노-PEG-지질을 운반하는 입자를 포함하는 샘플을 5분간 10 MHz, 2.9 mT로 처리한 후, 이어서 입자 표면 상의 열에 관한 첫번째 징후 및 자기장 내에서의 임의의 열 방출을 획득하기 위하여 자기 분리를 실시하였다. 대조를 위하여, 통상적인 수조에서 40 내지 95℃의 온도로 샘플을 5분간 처리하는 시험을 실시하였다. 입자의 자기 분리에 따른 흐름 속에서 플루람-표지된 아미노기의 방출을 측정하였다. 결과를 다음과 같이 요약할 수 있다:
1. 2 내지 6%의 아미노기가 가열시 입자로부터 방출되었다.
2. 방출된 기의 양은 50 내지 60℃사이에서 최대였고, 이후 더 높은 온도에서 방출량은 감소되었다.
3. 자기장에서 5분간 처리된 샘플은 2 내지 3%의 아미노기를 방출시켰다.
아미노-PEG-nn은 비교적 낮은 온도 증가를 일으키며 입자를 떠난다. 이러한 특성은 입자가 느린 방출에 적합하도록 만든다. 분자가 아미노기에 공유결합적으로 커플링되면, 느리고 반복적인 방출이 교번 자기장 내에서 반복된 처리로 이루어질 수 있다.
실시예 5
아미노-PEG-nn 및 인지질 둘 모두가 동일한 비율(rate)과 온도에서 방출되는지를 확인하기 위하여, FITC 표지된 인지질을 운반하는 입자와 함께 샘플을 통상적인 수조 내에서 40 내지 95℃의 온도로 5분간 처리하였다. 결과를 다음과 같이 요약할 수 있다:
1. FITC 표지된 인지질의 최대 25%가 80℃ 이상의 온도로 5분간 가열시 입자로부터 방출되었다.
2. 80℃ 이상의 온도로 처리된 샘플은 처리후 콜로이드 불안정성을 나타내면서 응집(flocculation)되었다.
본 실시예는 PEG-지질에 비하여 인지질이 산화철 코어를 벗어나는 것이 더 어려우며, 80℃ 이상의 온도로 가열하는 것이 입자 현탁액의 콜로이드 안정성에 심각한 영향을 미친다는 것을 보여준다.
실시예 6
FITC 표지된 HIV를 운반하는 입자를 수반하는 샘플
입자 표면 상의 아미노기에 공유결합적으로 커플링된 TAT-펩티드를 상기한 바와 같이 처리하였다. 본 실시예는 아미노기와 또 다른 분자 간의 열에 민감한 결합을 공유결합적으로 생성시킴으로써 방출 효과가 증가될 수 있는지를 확인하기 위하여 진행되었다. 입자와 TAT-펩티드 사이의 이황화 브릿지를 생성시키는 매개자로서 SPDP를 이용하여 펩티드를 입자에 커플링시켰다. 이황화 브릿지는 비교적 열에 민감한 것으로 공지되어 있다. 결과를 다음과 같이 요약할 수 있다:
1. 3 내지 13%의 TAT-펩티드가 가열시 입자로부터 방출되었다.
2. 방출 효과는 온도에 따라 증가되었다. 실시예 2에 제시된 결과와 비교할 때, 상기 결과는 아마도 이황화 브릿지의 열 유도 붕괴로 인하여 방출 효과가 증가된 것으로 추정된다.
3. 자기장으로 처리된 샘플은 2 내지 5%의 TAT-펩티드를 방출하였다.
실시예 7
세포 배양
부착 세포주 COS-7를 DMEM, 10% FCS 및 5% 스트렙토마이신/페니실린 중에서 배양하였다. 현탁 세포주 K562를 RPMI, 10% FCS 및 5% CO2 중에서 배양하였다. 세포를 주(week) 당 2회 계대(passaging)하였다.
증식
COS-7 및 K562 세포를 수확하고 각각 100 ㎕ 완전 DMEM 또는 RPMI 중에서, 96-웰 플레이트의 웰 당 105 개의 세포를 파종하였다. 증식 기준을 위한 세포를 3회 반복하여(triplicate) 104 내지 105 세포/웰로 파종하였다. 아미노기, 선형 PEI 또는 분지형 PEI를 지닌 입자를 상이한 철(Fe) 농도의 적당한 버퍼 중에서 희석시켰다. 상이한 입자에 관한 각각의 희석액을 최종 철 농도가 50 내지 250 pg Fe/세포가 되도록 하기 위하여 세포에 4배로(quadruples) 첨가하였다. 추가로, 10 MHz, 2.9 mT 교번 자기장에 대한 입자/세포 복합체의 노출시, COS-7 세포 증식에 관한 시험을 도 3에 도시된 실험 셋업을 이용하여 실행하였다. 코일을 냉각시키는데 수조를 사용하였고 요망되는 온도에서 샘플을 유지하였다. RF 자기장에 영향을 받지 않는 광섬유 온도계을 이용하여 샘플 내의 온도를 지속적으로 모니터하였다.
인큐베이션 24시간 경과 후 증식 검정을 실시하였다. 비교적 고농도의 입자를 운반하는 세포가 교번 자기장에 노출되면 증식이 감소되는 것으로 결론지을 수 있었다. 더욱이, PEI(폴리에틸렌이민)로 변형된 입자는 세포에 대한 독성이 더 강화되며, K562가 COS-7보다 입자에 더 민감하였다.
실시예 8
세포의 분리 및 세척
K562 세포를 24 웰 마이크로티터(micrititer) 플레이트에 웰당 1㎖의 배지와 함께 파종하엿다. 혼합된 코팅에 DOTAB/DOPE/인지질을 운반하는 입자를 하기 농도로 세포에 첨가하였다:
샘플 1: 1 피코그램 Fe/세포, 2시간 인큐베이션
샘플 2: 2 피코그램 Fe/세포, 2시간 인큐베이션
샘플 3: 2 피코그램 Fe/세포, 2시간 인큐베이션, 분리 컬럼 내에 사용된 자석 없음
샘플 4: 2 피코그램 Fe/세포, 24시간 인큐베이션
샘플 5: 2 피코그램 Fe/세포, 48시간 인큐베이션
샘플 6: 2 피코그램 Fe/세포, 72시간 인큐베이션
샘플 7: 0 피코그램 Fe/세포, 2시간 인큐베이션.
세포를 배양 접시에서 꺼내고 버퍼(PBS+BSA) 중의 쇼트 원심분리(short centrifugation)로 세척하였다. 살아 있는 세포를 칼세인(Calcein) AM으로 표지하고 난 다음, 이어서 세척을 실시한 다음 고구배 자기분리 컬럼(Milteyi)에 적용하였다. 각 샘플을 컬럼에 걸어 주고, 샘플 번호 3을 외부 균일 자기장(external static magnetic field)에 적용하지 않고 분리하였다. 3배 컬럼 부피의 버퍼로 세포를 세척하고 제조업자의 매뉴얼에 따라 영구 자석으로부터 컬럼을 방출시킴으로써 용출시켰다. 칼세인 형광을 다양한 분획(fractions)에서 검출하였다.
분획:
유동 분획(Flow through, FT)
세척 1, 2, 3(W1, W2, W3)
용리(E)
도 4에 제시된 결과로 부터, 2 피코그램 FE/세포의 첨가가 분리 및 세척을 위하여 고 구배 자기장을 이용할 수 있게 하는데 충분한 자성물질을 처리된 세포에 공급하는데 충분하며, 그 효과가 최대 72시간 까지 지속된다는 것이 명확하게 이해된다.
실시예 9
세포 유입 및 입자의 분포
세포를 통해 해당 위치로 운반되어 온 입자를 추적하기 위하여 초상자성 나노입자와 함께 1시간 및 24시간 인큐베이션된 COS-7 세포에 대한 형광 현미경 관찰을 이용하였다. 입자가 용이하고 비교적 빠르게 세포에 의해 받아들여지며 세포를 통해 균일하게 분포되어 진다는 것을 확인할 수 있다.
또 다른 시험에서, COS-7 세포를 텍사스-레드(Texas-Red)로 표지되고 FITC 표지된 HIV-I TAT-펩티드와 공유결합적으로 변형된 자성 나노입자(100 pg 철/세포)와 함께 12시간 인큐베이션하였다. 천연 상태에서 상기 펩티드는 세포 핵을 표적으로 삼고 이의 내로 진입할 수 있다. (인지질 상의) 텍사스-레드 표지와 FITC 표지된 HIV-I TAT-펩티드 둘 모두는 세포의 세포질내의 공통위치에 자리하게 된다(co-localization).
실시예 10
플라스미드 DNA 결합력
입자 표면 상의 아미노 PEG에 공유결합적으로 커플링된 선형 PEI(폴리에틸렌이민) 또는 분지형 PEI를 지니거나 지니지 않는 나노입자를 버퍼 중에서 동일한 입자 농도로 희석시켰다. DNA에 대한 입자 비율이 상이하게(0.1-500) 동일한 양의 DNA(100 ng)와 입자를 함께 혼합하였다. 표준 DNA를 제조하였다(10-500 ng/ml). 용액을 실온에서 10분간 인큐베이션시키고, 이후 피코그린(PicoGreen®)을 첨가하고 형광을 측정하였다(Ex 485/Em 520). 결과는 도 5에 제시되어 있으며, 결론적으로 모든 입자가 DNA에 결합할 수 있고, 분지형 PEI가 노출된 표면을 지닌 입자가 가장 효과적으로 DNA에 결합한다는 것을 확인할 수 있다.
실시예 11
PEG-NH 2 만을 운반하는 입자와 SDS, DOPE 및 DOTAB의 혼합물을 운반하는 입자를 이용한 트랜스펙션의 비교
텍사스 레드 및 루시퍼라제를 코딩하는 플라스미드(phRL-SV40)를 운반하는 DOTAB/DOPE/SDS 코팅을 지니는 입자와 함께 세포(K562)를 3시간 동안 인큐베이션하였으며, 레퍼런스 세포로 루시퍼라제를 코딩하는 플라스미드(phRL-SV40)를 운반하면서 아미노-PEG(NH2)를 지니는 입자를 동일한 방식으로 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 AMF(교번 자기장)에서 30초 펄스 및 펄스 마다 30초간 휴지와 함께 반복적으로 처리하였다.
AMF 노출 후, 세포를 새로운 배양 접시에 파종하고 증식시켰으며, 처리 후 48시간 경과 후, 형광을 판독하였다. 도 6에 도시된 바와 같이, 세제 및 헬퍼 지질(DOTAB/DOPE/SDS)을 운반하는 입자는 상당히 더 높은 발현율을 나타내었다.

Claims (22)

  1. 열-유도(Heat-induced) 방출을 통해, 막으로 둘러싸인 세포 또는 세포 소기관의 내부 또는 외부로 물질을 전달하는데 적합한 입자로서, 열 민감 코팅으로 캡슐화된, 교번 자기장 내에서 열을 발생시킬 수 있는, 초상자성(superparamagnetic) 코어(상기 물질 및 막 파괴제(membrane disruptive agent)가 상기 코어에 결합됨)를 포함하고, 상기 초상자성 코어의 크기가 8 내지 15 나노미터임을 특징으로 하는 입자.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 초상자성 코어가 자철석, 마게마이트(maghemite), 산화철수화물(iron oxide hydrate), 일반식 MeOxFe2O3의 페라이트(ferrite)(여기서, Me는 Co, Ni, Mn, Be, Mg, Ca, Ba, Sr, Cu, Zn, Pt, Al, Cr, Bi로 구성된 군에서 선택되는 2가 금속임) 및 이들의 조합물로 이루어짐을 특징으로 하는 입자.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 열 민감 코팅이 상기 코어와 직접적으로 접촉하는 미셀(micelle)형 구조를 포함함을 특징으로 하는 입자.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 미셀형 구조가 하나 이상의 소수성 분자 및 소수성 부분과 친수성 부분 둘 모두를 포함하는 하나 이상의 분자에 의해 형성됨을 특징으로 하는 입자.
  5. 제 3항에 있어서, 상기 열 민감 코팅은 하나 또는 다수의 이황화 결합, 과산화물(peroxide) 결합 또는 아조(azo) 결합 또는 이들의 조합을 통해 상기 물질 및 막파괴제에 결합됨을 특징으로 하는 입자.
  6. 제 4항에 있어서, 상기 친수성 부분 구조가 중합체, 지질, 합성 분자, 단백질 또는 이들의 조합물을 포함함을 특징으로 하는 입자.
  7. 제 1항에 있어서, 인식 분자(recognition molecule)가 또한 열 민감 코팅에 결합됨을 특징으로 하는 입자.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 인식 분자가 항체, 항체의 단편 및 렉틴으로 구성된 군에서 선택됨을 특징으로 하는 입자.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 막파괴제가 콜레스테롤, 소수성 단백질 및 계면활성제(surfactants) 및 이들의 조합물로 구성된 군에서 선택됨을 특징으로 하는 입자.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 물질이 DNA 분자 및 RNA 분자로 구성된 군에서 선택됨을 특징으로 하는 입자.
  11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 생체외 방법에서 숙주세포의 유전자 코드 및/또는 물질대사의 변형에 사용하기 위한 입자.
  12. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 생체외 방법에서 엔도좀성(endosomal) 또는 리소좀성(lysosomal) 세포 소기관으로부터 상기 물질의 방출에 사용하기 위한 입자.
  13. 막 파괴제의 열 유도 방출과 조합하여 물질의 열 유도 방출을 통해 막으로 둘러싸인 세포 또는 세포 소기관의 내부 또는 외부로 물질을 전달하기 위한 생체외 방법으로서, 하기 단계를 포함하는, 생체외 방법:
    - 막으로 둘러싸인 세포 또는 세포 소기관 및 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 입자를 다수 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
    - 상기 샘플에 교번 자기장을 적용시키는 단계(이에 따라, 상기 입자 코어의 열 에너지가 상기 입자의 열 민감 코팅을 분해시키며, 막파괴제가 막으로 둘러싸인 세포 또는 세포 소기관의 막을 파괴하도록 유발하며 상기 물질을 방출시킴).
  14. 제 13항에 있어서, 상기 자기장은 0.1 내지 5 ㎒ 주파수 범위의 교번 자기장 방향을 지님을 특징으로 하는 생체외 방법.
  15. 제 13항에 있어서, 상기 자기장은 1 내지 100 mT 범위의 자기장 강도를 지님을 특징으로 하는 생체외 방법.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 자기장은 시간에 따라 일련의 펄스 및 휴지로 반복적으로 노출됨을 특징으로 하는 생체외 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 각각의 펄스 지속 시간은 1 내지 600초인 것을 특징으로 하는 생체외 방법.
  18. 제 16항에 있어서, 각각의 펄스 지속 시간은 1 내지 45초인 것을 특징으로 하는 생체외 방법.
  19. 제 13항에 있어서, 상기 자기장은 불균일(non-homogeneous) 교번 자기장 및 경사 교번 자기장 방향을 지니고, 여기서 상기 교번 자기장의 방향은 2개의 코일에 의해 생성되며, 상기 샘플이 상기 코일 사이에 삽입됨을 특징으로 하는 생체외 방법.
  20. 제 19항에 있어서, 상기 코일이 공급된 교류 전류의 포지티브(positive) 또는 네거티브(negative) 부분 중 어느 하나를 공급받음을 특징으로 하는 생체외 방법.
  21. 제 13항에 있어서, 상기 물질이 DNA 분자 및 RNA 분자로 구성된 군에서 선택됨을 특징으로 하는 생체외 방법.
  22. 제 13항에 있어서, 상기 막 파괴제가 콜레스테롤, 소수성 단백질 및 계면활성제 및 이들의 조합물로 구성된 군에서 선택됨을 특징으로 하는 생체외 방법.
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