KR101330448B1 - Method for regulation of metabolic homeostasis, stress resistance, and lifespan by the endogenous siRNA(endo-siRNA) pathway - Google Patents
Method for regulation of metabolic homeostasis, stress resistance, and lifespan by the endogenous siRNA(endo-siRNA) pathway Download PDFInfo
- Publication number
- KR101330448B1 KR101330448B1 KR1020110090023A KR20110090023A KR101330448B1 KR 101330448 B1 KR101330448 B1 KR 101330448B1 KR 1020110090023 A KR1020110090023 A KR 1020110090023A KR 20110090023 A KR20110090023 A KR 20110090023A KR 101330448 B1 KR101330448 B1 KR 101330448B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- dcr
- drosophila
- stress
- sirna
- endo
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 title claims abstract description 18
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 title claims abstract description 14
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 title description 9
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 title description 6
- 230000037361 pathway Effects 0.000 title description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 38
- 230000006355 external stress Effects 0.000 claims abstract description 29
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 16
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 claims description 92
- 241000255588 Tephritidae Species 0.000 claims description 50
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 42
- 230000035882 stress Effects 0.000 claims description 22
- 230000008645 cold stress Effects 0.000 claims description 12
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 claims description 12
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 claims description 11
- 230000001603 reducing effect Effects 0.000 claims description 5
- 108700017247 Drosophila DCR-2 Proteins 0.000 claims description 4
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000037352 starvation stress Effects 0.000 claims description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims 2
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 claims 1
- 101000907904 Homo sapiens Endoribonuclease Dicer Proteins 0.000 abstract description 23
- 102100023387 Endoribonuclease Dicer Human genes 0.000 abstract description 13
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 abstract description 11
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 7
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 abstract description 2
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 52
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 42
- UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N triformin Chemical compound O=COCC(OC=O)COC=O UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 14
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 14
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 13
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 12
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 12
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 12
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 10
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 10
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 10
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 9
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 8
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 8
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 7
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 101150028074 2 gene Proteins 0.000 description 6
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 6
- 238000001325 log-rank test Methods 0.000 description 6
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 5
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 4
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 4
- 208000036815 beta tubulin Diseases 0.000 description 4
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 4
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 4
- 230000037149 energy metabolism Effects 0.000 description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- 210000000087 hemolymph Anatomy 0.000 description 4
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 4
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 4
- FIKAKWIAUPDISJ-UHFFFAOYSA-L paraquat dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].C1=C[N+](C)=CC=C1C1=CC=[N+](C)C=C1 FIKAKWIAUPDISJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 238000001061 Dunnett's test Methods 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 3
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 3
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 2
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010057163 Ribonuclease III Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 2
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 2
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- XDIYNQZUNSSENW-UUBOPVPUSA-N (2R,3S,4R,5R)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O XDIYNQZUNSSENW-UUBOPVPUSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WRDABNWSWOHGMS-UHFFFAOYSA-N AEBSF hydrochloride Chemical compound Cl.NCCC1=CC=C(S(F)(=O)=O)C=C1 WRDABNWSWOHGMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 101100009017 Caenorhabditis elegans dcr-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N Dodecane Natural products CCCCCCCCCCCC SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700023136 Drosophila Set Proteins 0.000 description 1
- 108700019186 Drosophila lin Proteins 0.000 description 1
- 101100009019 Drosophila melanogaster Dcr-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700013639 Drosophila w Proteins 0.000 description 1
- 208000032928 Dyslipidaemia Diseases 0.000 description 1
- 208000031448 Genomic Instability Diseases 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 108010034791 Heterochromatin Proteins 0.000 description 1
- 101000780643 Homo sapiens Protein argonaute-2 Proteins 0.000 description 1
- 206010020565 Hyperaemia Diseases 0.000 description 1
- 208000035150 Hypercholesterolemia Diseases 0.000 description 1
- 208000031226 Hyperlipidaemia Diseases 0.000 description 1
- 206010022489 Insulin Resistance Diseases 0.000 description 1
- 208000017170 Lipid metabolism disease Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 102100034207 Protein argonaute-2 Human genes 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 102000003661 Ribonuclease III Human genes 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 102100029677 Trehalase Human genes 0.000 description 1
- 108010087472 Trehalase Proteins 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004146 energy storage Methods 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 210000004458 heterochromatin Anatomy 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 201000001421 hyperglycemia Diseases 0.000 description 1
- 208000006575 hypertriglyceridemia Diseases 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000006372 lipid accumulation Effects 0.000 description 1
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000011285 magnesium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011654 magnesium acetate Substances 0.000 description 1
- 229940069446 magnesium acetate Drugs 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000000575 proteomic method Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000021595 spermatogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/033—Rearing or breeding invertebrates; New breeds of invertebrates
- A01K67/0333—Genetically modified invertebrates, e.g. transgenic, polyploid
- A01K67/0337—Genetically modified Arthropods
- A01K67/0339—Genetically modified insects, e.g. Drosophila melanogaster, medfly
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/70—Invertebrates
- A01K2227/706—Insects, e.g. Drosophila melanogaster, medfly
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
Abstract
본 발명은 엔도-siRNA (endo-siRNA) 생성에 관여하는 다이서 (dicer) 유전자 발현을 조절하는 단계를 포함하는 대사 항상성, 외부 스트레스 저항성 또는 수명 조절 방법에 관한 것이다. 상기한 본 발명은 대사 관련 장애 치료제 개발 및 엔도-siRNA (endo-siRNA)의 생리적 기능 연구에 유용하게 이용될 수 있다.The present invention relates to a method for regulating metabolic homeostasis, external stress resistance or lifespan, comprising regulating dicer gene expression involved in endo-siRNA production. The present invention described above can be usefully used for the development of therapeutic agents for metabolic disorders and the study of physiological function of endo-siRNA.
Description
본 발명은 다이서 (Dicer) 단백질의 활성에 의해 생성되는 엔도-siRNA에 의한 유전자 발현조절을 통해 대사 항상성, 외부 스트레스 저항성 또는 수명이 조절되는 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게, 본 발명은 생체 내에서 생성되는 작은 간섭 RNA (endogenous small interfering RNA: 이하 "엔도-siRNA" 또는 “endo-siRNA”라 칭함) 생성을 억제하는 Dicer-2 (이하, “Dcr-2”라 칭함) 돌연변이를 이용한 대사 항상성, 외부 스트레스 저항성 또는 수명 조절 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a method in which metabolic homeostasis, external stress resistance or lifespan is regulated through gene expression regulation by endo-siRNA produced by the activity of Dicer protein. More specifically, the present invention provides Dicer-2 (hereinafter, “Dcr-2”) which inhibits generation of endogenous small interfering RNA (hereinafter referred to as “endo-siRNA” or “endo-siRNA”) produced in vivo. Metabolic homeostasis, external stress resistance, or life control methods using mutations.
많은 동물에서 약 21 뉴클레오티드 (nucleotide: 이하 “nt”라 칭함)의 길이를 갖는 작은 RNA들이 발현하고 있으며 이러한 작은 RNA들은 염기서열 상보적인 표적 mRNA에 작용하여 전사체의 분해 또는 번역 (translation) 억제를 유도한다 (Development 135: 1201-1214). 이러한 작은 RNA들은 다양한 생물학적 과정, 바이러스 저항성과 유전체의 안정성에 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다 (Development 135: 1201-1214). In many animals, small RNAs with a length of about 21 nucleotides (hereinafter referred to as "nt") are expressed, and these small RNAs act on sequential complementary target mRNAs to inhibit degradation or translation of the transcript. Inducement (Development 135: 1201-1214). These small RNAs are known to play important roles in a variety of biological processes, viral resistance and genome stability (Development 135: 1201-1214).
작은 RNA는 크게 작은 간섭 RNA (small interfering RNA: 이하, “siRNA”라 칭함)와 마이크로 RNA (microRNA: 이하, “miRNA”라 칭함)로 구분될 수 있다 (Development 135: 1201-1214)(도 12 참조). 초파리 (Drosophila)는 Dicer-1 (이하, “Dcr-1”라 칭함)과 Dicer-2 (이하, “Dcr-2”라 칭함) 2개의 RNase III 효소를 발현하며, 이러한 단백질들은 각각 miRNA와 siRNA 생성에 중요하게 작용한다고 보고되었다 (Cell 117:69-81). Small RNAs can be largely divided into small interfering RNAs (hereinafter referred to as "siRNAs") and micro RNAs (microRNAs referred to as "miRNAs") (Development 135: 1201-1214) (FIG. 12). Reference). Drosophila expresses two RNase III enzymes, Dicer-1 (hereinafter referred to as “Dcr-1”) and Dicer-2 (hereinafter referred to as “Dcr-2”), which are miRNA and siRNA, respectively. It has been reported to play an important role in production (Cell 117: 69-81).
초기에는 siRNA가 실험적으로 세포내에 전달된 두 가닥의 RNA (double stranded RNA: 이하, “dsRNA”라 칭함) 또는 바이러스 감염에 의해 생성된다고 생각되었으나 최근 추가적인 연구를 통해 초파리 체세포 및 생식세포 자체 내에서 만들어지는 엔도-siRNA (endo-siRNA)를 확인하였다 (Mol. Cell 31:309-312, Curr. Biol. 18:795-802, Nature 453:798-802, Science 320: 1077-1081, Nature 453:793-797, Nat. Struct. Mol. Biol. 15:581-590, Nature 453:803-806). 초파리에서 이러한 엔도-siRNA (endo-siRNA)는 트랜스포존 (transposon), 긴 헤어핀 구조 (hairpin structure)를 갖는 전사체 (transcript) 그리고 염기서열 상보적인 서로 다른 전사체간의 결합 부위로부터 Dcr-2의 활성을 통해 생성된다. 이러한 발견은 다양한 엔도-siRNA (endo-siRNA)가 트랜스포존 (transposon)의 방어 기작으로서의 기능의 가능성을 제시하였다.Initially, siRNAs were thought to be produced by two strands of RNA (double stranded RNA) or viral infections, which have been experimentally delivered intracellularly, but recent further research has been done in Drosophila somatic cells and germ cells themselves. L. has identified endo-siRNA (Mol. Cell 31: 309-312, Curr. Biol. 18: 795-802, Nature 453: 798-802, Science 320: 1077-1081, Nature 453: 793 -797, Nat. Struct. Mol. Biol. 15: 581-590, Nature 453: 803-806). In Drosophila, these endo-siRNAs are responsible for the activity of Dcr-2 from binding sites between transposons, transcripts with long hairpin structures, and sequential complementary transcripts. Is generated. This finding suggests the potential of various endo-siRNAs to function as defense mechanisms of transposons.
또한 꼬마 선충 (C. elegans)과 포유류에서도 엔도-siRNA (endo-siRNA)가 확인되었다 (Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9:673-678). 엔도-siRNA (Endo-siRNA)는 초파리에서 온도 변화에 대한 저항성을 유지하는 것과 이질염색질 (heterochromatin)의 형성에 관여한다고 보고된 바 있으며, 꼬마 선충에서는 정자 형성 (spermatogenesis) 과정에 중요한 역할을 담당하고 있음이 보고되었다 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106:21258-21263, PLoS One 4:e7576, Genetics 183:1283-1295). 그러나 아직까지는 생체 내 전반적인 엔도-siRNA (endo-siRNA)의 기능이 구체적으로 알려져 있지 않다. Endo-siRNA has also been identified in C. elegans and mammals (Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9: 673-678). Endo-siRNA (Endo-siRNA) has been reported to be involved in maintaining resistance to temperature changes and in the formation of heterochromatin in Drosophila, and in nematodes, it plays an important role in spermatogenesis. Has been reported (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106: 21258-21263, PLoS One 4: e7576, Genetics 183: 1283-1295). However, the overall function of end-siRNA (endo-siRNA) in vivo is not known yet.
본 발명의 배경이 되는 기술로서 하기 선행기술문헌에 기재된 기술들이 있으나, 엔도-siRNA (endo-siRNA)의 생체 내에서의 생리 기능에 대해서는 구체적인 기재가 없다.
As a background technology of the present invention, there are techniques described in the following prior art document, but there is no specific description about the physiological function of endo-siRNA (endo-siRNA) in vivo.
본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점 및 요구를 해결하고자 하는 것으로, 이에 본 발명자들은 엔도-siRNA (endo-siRNA)가 생성되지 않는 Dcr-2의 결핍 돌연변이 초파리 두 라인을 이용하여 Dcr-2에 의해 조절되는 단백질 21개를 동정하였으며, 엔도-siRNA (endo-siRNA)에 의한 유전자 발현 조절이 외부 스트레스 및 수명의 조절에 관여되어 있고 에너지 대사유지에 중요하게 기능을 하고 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. The present invention is to solve the problems and demands of the prior art as described above, the present inventors in Dcr-2 using two lines of mutant Drosophila deficient in Dcr-2 that does not produce endo-siRNA (endo-siRNA) The present invention was identified by identifying 21 proteins regulated by the gene, and confirming that gene expression regulation by endo-siRNA is involved in the regulation of external stress and lifespan and plays an important role in maintaining energy metabolism. Completed.
따라서 본 발명의 목적은 엔도-siRNA 생성에 관여하는 다이서 유전자의 활성 및 발현을 조절하여 대사 항상성, 외부 스트레스 저항성 또는 수명을 조절하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a method of controlling metabolic homeostasis, external stress resistance or lifespan by regulating the activity and expression of Dicer genes involved in endo-siRNA production.
본 발명의 다른 목적은 다이서 유전자의 발현을 조절하여 대사 항상성, 외부 스트레스 또는 수명이 조절된 모델동물의 제조방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for producing a model animal in which metabolic homeostasis, external stress, or lifespan are controlled by controlling the expression of the Dicer gene.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.
Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.
본 발명의 일 양태에 의하면, 본 발명은 엔도-siRNA (endo-siRNA) 생성에 관여하는 다이서(dicer) 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 인간 외 동물에서의 대사 항상성, 외부 스트레스 저항성 또는 수명 조절 방법을 제공한다.According to one aspect of the invention, the invention provides for metabolic homeostasis, external stress resistance, or in a non-human animal comprising the step of regulating the expression of the dicer gene involved in endo-siRNA production. Provides a life control method.
본 발명의 다른 양태에 의하면, 본 발명은 엔도-siRNA (endo-siRNA) 생성에 관여하는 다이서 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 대사 항상성, 외부 스트레스 저항성 또는 수명이 조절된 모델동물의 제조방법을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides for the production of a model animal with controlled metabolic homeostasis, external stress resistance or lifespan, comprising the step of regulating the expression of Dicer genes involved in endo-siRNA production. Provide a method.
본 발명의 또 다른 양태에 의하면, 본 발명은 다이서(Dicer) 단백질의 활성에 의해 생성되는 엔도-siRNA (endo-siRNA)의 결손으로 인한 대사 관련 장애 모델 동물을 제공한다.According to another aspect of the invention, the invention provides a metabolic related disorder model animal due to a deficiency in endo-siRNA produced by the activity of Dicer protein.
본 발명에 있어서, 상기 다이서 유전자는 엔도-siRNA (endo-siRNA) 생성에 관여하는 RNase III 유전자를 총칭하고, 예들 들어 초파리 다이서-2(dicer -2) 유전자이다. 본 발명의 방법에서 동물은 다이서 유전자를 가지고 있다면 특별한 제한이 없으나, 예를 들어 초파리일 수 있다.In the present invention, the dicer gene collectively refers to the RNase III gene involved in endo-siRNA production, for example, the fruit fly dicer- 2 gene. The animal in the method of the present invention is not particularly limited as long as it has a Dicer gene, but may be, for example, a fruit fly.
본 발명에 있어서, 상기 다이서 유전자 발현 조절은 다이서 유전자 발현 억제 및 과발현을 모두 포함한다. 다이서 유전자 발현을 억제하면 엔도-siRNA (endo-siRNA)의 생성이 저해되어 외부 스트레스에 대한 저항성이 감소하고 수명이 단축되며 트리글리세라이드 (triglyceride) 및 글루코오스 (glucose)가 감소하고, 글리코겐 (glycogen)이 증가된다. In the present invention, the dicer gene expression control includes both dicer gene expression inhibition and overexpression. Inhibiting Dicer gene expression inhibits the production of endo-siRNA, reducing its resistance to external stress, shortening its lifespan, reducing triglycerides and glucose, and reducing glycogen Is increased.
본 발명에 있어서, 외부 스트레스는 특별히 제한이 있는 것은 아니나, 예를 들어 산화 스트레스, 소포체 스트레스, 기아 스트레스, 저온 스트레스 등을 들 수 있다.In the present invention, the external stress is not particularly limited, and examples thereof include oxidative stress, vesicle stress, hunger stress, and low temperature stress.
상기 다이서 유전자 발현 억제는 당업계에 알려진 통상적인 유전자결손 방법, 예를 들면, 화학물질이나 자외선과 같은 빛을 이용하거나, 상동재조합 기술을 통한 유전자 재조합 기술을 이용하여 다이서 유전자 부위가 변이되어 결실된 돌연변이체를 얻을 수 있고, 유전자 팝-아웃기술을 이용할 수 있다. 본 발명의 돌연변이는 점돌연변이(point mutagenesis) 방법으로 제조될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 당업계의 알려진 돌연변이 방법 중 적합한 방법을 선택하여 수행할 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 EMS 돌연변이 라인인 dcr -2 돌연변이 (dcr -2 R416X 와 dcr-2 L811fsX ) 초파리를 이용하였다.
The dicer gene expression suppression is a conventional gene deletion method known in the art, for example, by using a light such as chemicals or ultraviolet light, or by using a genetic recombination technology through homologous recombination technology, the dicer gene region is mutated Deleted mutants can be obtained and gene pop-out techniques can be used. Mutations of the present invention may be prepared by a point mutagenesis method, but are not limited thereto, and may be performed by selecting a suitable method from among known mutation methods in the art. In an embodiment of the present invention, the EMS mutation line dcr- 2 mutation ( dcr- 2 R416X and dcr-2 L811fsX ) Drosophila was used.
본 발명의 또 다른 양태에 의하면, 엔도-siRNA (endo-siRNA) 생성에 관여하는 다이서(dicer) 억제제 또는 활성 증강제를 포함하는 대사 관련 장애 조절제를 제공한다.According to another aspect of the present invention, there is provided a metabolic related disorder modulator comprising a dicer inhibitor or an activity enhancer involved in endo-siRNA production.
상기 다이서 억제제는 이에 한정되는 것은 아니나, 다이서 유전자의 발현을 억제하는 다이서 돌연변이 단백질 또는 이를 코드하는 폴리뉴클레오티드이다. The dicer inhibitor is, but is not limited to, a dicer mutant protein or polynucleotide encoding the dicer gene.
상기 다이서 활성 증강제는 이에 한정되는 것은 아니나, 다이서 유전자의 발현을 유도하는 다이서 돌연변이 단백질 또는 이를 코드하는 폴리뉴클레오티드이다.The dicer activity enhancer is, but is not limited to, a dicer mutant protein or polynucleotide encoding the dicer gene.
본 발명에 있어서, 대사 관련 장애는 이에 한정되는 것은 아니나, 제I형 당뇨병, 제II형 당뇨병, 부적합한 글루코오스 내성, 인슐린 저항증, 고혈당증, 고지질혈증, 고중성지방혈증, 고콜레스테롤혈증, 이상지질혈증 또는 증후군 X이다. In the present invention, metabolic related disorders include, but are not limited to, type I diabetes, type II diabetes, inadequate glucose tolerance, insulin resistance, hyperglycemia, hyperlipidemia, hypertriglyceridemia, hypercholesterolemia, dyslipidemia Hyperemia or syndrome X.
본 발명의 조절제는 제약상 허용되는 담체를 혼합할 수 있다. 본 발명의 조절제의 투여방법은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여가 바람직하며, 정맥내 주사에 의한 투여가 더욱 바람직하다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 화합물의 경우 약 0.1 내지 100 ㎎/㎏ 이고, 바람직하게는 0.5 내지 10 ㎎/㎏ 이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.
Modulators of the invention may be mixed with a pharmaceutically acceptable carrier. The method of administering the modulator of the present invention is not particularly limited, but may be parenterally administered (for example, intravenously, subcutaneously, intraperitoneally, or topically) or orally according to a desired method. Preferably, administration by intravenous injection is more preferred. Dosage varies depending on the patient's weight, age, sex, health condition, diet, time of administration, method of administration, rate of excretion and severity of disease. The daily dosage is about 0.1 to 100 mg / kg for the compound, preferably 0.5 to 10 mg / kg, and more preferably administered once to several times a day.
이하, 본 발명에 대해 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명자들이 엔도-siRNA (endo-siRNA)의 생성이 결손된 서로 다른 두 dcr -2 돌연변이 (dcr -2 R416X 와 dcr -2 L811fsX ) 초파리의 머리와 몸으로부터 추출한 단백질들을 이용하여 two-dimensional gel 분석 (이하, “2D-gel”이라 칭함)과 MALDI-TOF mass spectrometry 분석을 실시하였고, 정상 초파리와 비교하여 dcr-2 돌연변이 (dcr-2 R416X 와 dcr -2 L811fsX ) 초파리에서 1.5배 이상 발현 차이 (증가 또는 감소)를 보이는 21개의 단백질을 확인하였다. 이렇게 확인된 단백질들을 그 기능별로 분석한 결과 대부분 대사 작용과 외부 스트레스 및 수명에 관련된 단백질들이었다 (도 2, 3, 및 표 1). We found two different dcr- 2 mutations ( dcr- 2 R416X and one) that lacked the production of endo-siRNA (endo-siRNA). dcr -2 L811fsX) using proteins extracted from the head and body of the fruit flies were subjected to two-dimensional gel analysis (hereinafter, "2D-gel"quot;) and MALDI-TOF mass spectrometry analysis, as compared to normal flies dcr- 2 mutations ( dcr-2 with R416X dcr- 2 L811fsX ) We identified 21 proteins that showed a 1.5-fold difference in expression (increase or decrease) in Drosophila. As a result of analyzing the identified proteins by their function, most of them were proteins related to metabolism, external stress, and lifespan (FIGS. 2, 3, and Table 1).
따라서 이러한 발현 변화를 보이는 단백질들의 기능을 기반으로 엔도-siRNA (endo-siRNA)의 생체 내에서의 생리학적 기능을 확인하기 위해 먼저 dcr -2 돌연변이 (dcr -2 L811fsX ) 초파리를 이용하여 다양한 외부 스트레스 (산화 스트레스, 소포체 스트레스, 기아 스트레스, 저온 스트레스)에 대한 저항성을 측정하였다. 초파리의 암, 수컷 모두에서 정상적인 초파리에 비해 dcr -2 돌연변이 (dcr -2 L811fsX ) 초파리에서 외부 스트레스(산화 스트레스, 소포체 스트레스, 기아 스트레스, 저온 스트레스)에 대한 저항성이 감소하는 것을 확인하였고, 이러한 dcr-2 돌연변이 초파리에 dcr -2 유전자를 재도입시킨 초파리에서는 정상 초파리와 유사하게 외부 스트레스에 대한 저항성이 회복되는 것을 확인하였다 (도 6 - 도 8). Therefore, in order to confirm the in vivo physiological function of endo-siRNA (endo-siRNA) based on the function of proteins exhibiting this expression change, first dcr- 2 mutation ( dcr- 2 L811fsX ) Drosophila was used to measure resistance to various external stresses (oxidative stress, endoplasmic reticulum stress, hunger stress, cold stress). It was confirmed that the resistance to external stresses (oxidative stress, ER stress, starvation stress, cold stress) decreases from a Drosophila cancer, dcr -2 mutation compared to normal flies in both male (dcr -2 L811fsX) fruit flies, such dcr In the fruit flies re-introduced in the dcr- 2 gene into the -2 mutant fruit flies, resistance to external stress was restored similarly to the normal fruit flies (FIGS. 6-8).
또한 이러한 초파리의 외부 스트레스에 대한 민감성은 초파리의 수명과 매우 밀접하게 연관되어 있기 때문에 dcr -2 돌연변이 (dcr -2 R416X 와 dcr -2 L811fsX ) 초파리들의 수명을 정상 초파리와 비교 분석하였다. dcr -2 돌연변이 (dcr -2 R416X 와 dcr -2 L811fsX )와 dcr-2 트랜스 헤테로 자이고트 (transheterozygote, dcr-2 R416X /dcr-2 L811fsX ) 돌연변이 초파리는 정상 초파리에 비해 수명이 감소하였으며 dcr-2 유전자를 재도입시킨 초파리는 외부 스트레스에 대한 저항성과 같이 정상 초파리의 수명과 유사한 수준으로 회복된 것을 확인할 수 있었다 (도 10). In addition, the sensitivity of Drosophila to external stress is closely related to Drosophila lifespan, so the dcr- 2 mutation ( dcr- 2 R416X and dcr -2 L811fsX ) Drosophila lifespan was compared with normal Drosophila. dcr -2 mutation (with dcr -2 R416X dcr -2 L811fsX) and trans-2-dcr hetero Xi Goat (transheterozygote, dcr-2 R416X / dcr-2 L811fsX) mutant Drosophila decreased life span as compared to normal fruit fly Drosophila, which reintroduce the dcr-2 gene is an external stress It was confirmed that the resistance was restored to a level similar to the lifespan of normal fruit flies, such as resistance (FIG. 10).
그리고 2D-gel과 MALDI-TOF mass spectrometry 분석 결과 정상 초파리 비해 엔도-siRNA (endo-siRNA) 결손 초파리에서 발현 차이를 보이는 단백질들 중 대부분 대사 작용에 관여하는 단백질들이 차지하였으며, 또한 외부 스트레스에 대한 저항성 측정중 기아(starvation)에 대한 저항성 차이는 체내의 지질(lipid) 축적과 매우 밀접하게 연관되어 있다. 따라서 체내 지질(lipid)의 저장량을 트리글리세라이드(triglyceride)로 측정하였으며 정상 초파리의 성충과 유충에 비해 dcr -2 돌연변이 (dcr-2 R416X 와 dcr-2 L811fsX )의 성충과 유충의 몸 전체에서 트리글리세라이드(triglyceride)의 수준이 낮은 것을 확인하였다. 또 다른 탄수화물 (carbohydrate)의 에너지 저장 형태인 글리코겐(glycogen)의 수준을 측정한 결과 dcr-2 돌연변이 (dcr-2 R416X 와 dcr-2 L811fsX ) 유충의 몸 전체에서 정상 유충에 비해 증가되어 있는 것을 확인하였다. 체내의 트리글리세라이드(triglyceride)와 글리코겐(glycogen)의 수준과 매우 밀접하게 연결되어 조절되는 체액 내의 글루코오스(glucose)의 수준은 정상 유충의 체액보다 dcr-2 돌연변이 (dcr-2 R416X 와 dcr-2 L811fsX ) 유충의 체액에서 감소되어 있음을 확인하였다 (도 11).
In addition, 2D-gel and MALDI-TOF mass spectrometry analysis showed that most of the proteins with different expressions in endo-siRNA-deficient Drosophila compared to normal Drosophila were proteins involved in metabolism, and also resistant to external stress. The difference in resistance to starvation during the measurement is very closely related to lipid accumulation in the body. Therefore, measuring the amount of storage in the body lipid (lipid) into triglyceride (triglyceride) and was dcr -2 mutation (R416X dcr-2 compared to the normal adult and larvae of the fruit fly dcr-2 L811fsX ) and low levels of triglycerides in the body and adults of larva was confirmed. The levels of glycogen, an energy storage form of another carbohydrate, were measured, indicating that dcr-2 mutations ( dcr-2 R416X and dcr-2 L811fsX ) larvae throughout the body was confirmed to increase compared to the normal larvae. The levels of glucose in body fluids, which are closely linked to the levels of triglyceride and glycogen in the body, are regulated by dcr-2 mutations ( dcr-2 R416X and dcr-2 L811fsX ) was confirmed to be reduced in the body fluid of the larvae (FIG. 11).
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 의한 엔도-siRNA (endo-siRNA)의 생성에 관여하는 다이서 유전자의 발현 및 활성을 조절하여 대사 항상성, 외부 스트레스 및 수명을 조절할 수 있고, 다이서 돌연변이를 이용하여 대사 항상성, 외부 스트레스 및 수명이 조절된 모델동물을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명은 대사 관련 장애 치료제 개발 및 엔도-siRNA (endo-siRNA)의 생리적 기능 연구에 유용하게 이용될 수 있다.
As described above, the endo-siRNA of the present invention (endo-siRNA) Metabolic homeostasis, external stress and lifespan can be regulated by regulating the expression and activity of Dicer genes involved in the production, and dicer mutations can be used to provide a model animal with controlled metabolic homeostasis, external stress and lifespan. In addition, the present invention can be usefully used for the development of therapeutic agents for metabolic related disorders and the study of physiological function of endo-siRNA.
도 1은 정상 초파리와 서로 다른 두 라인의 dcr -2 돌연변이 (dcr -2 R416X 와 dcr-2 L811fsX ) 초파리에서의 RNAi 관련 단백질들의 웨스턴 블롯 (western blot)한 결과이다. β-Tubulin은 loading control로 사용되었다. * 표시는 비특이적인 밴드이다.
도 2는 Dcr-2에 의해 조절되는 단백질의 단백질체학 분석 (proteomic analysis)을 진행한 이미지이다. 정상 초파리와 서로 다른 두 라인의 dcr -2 돌연변이 (dcr -2 R416X 와 dcr -2 L811fsX ) 초파리의 머리 (A)와 몸 (B)에서 2D-gel 분석을 한 대표 이미지이다. 화살표와 원으로 표시된 점 (spot)에 대한 단백질 동정을 위해 MALDI-TOF를 진행하였다. 각 점 번호 (spot number) 대응되는 단백질들은 표 1에 표시하였다.
도 3은 2D-gel 분석을 하여 정상 초파리와 dcr -2 돌연변이 (dcr -2 R416X 와 dcr -2 L811fsX ) 초파리의 머리 (H)와 몸 (B)에서 발현 차이를 보이는 점 (spot)의 확대 이미지이다. 각 화살표와 원으로 차이를 보이는 점을 표시하였다. 각 점 번호 (spot number) 대응되는 단백질들은 표 1에 표시하였다.
도 4는 정상 초파리와 서로 다른 두 라인의 dcr -2 돌연변이 (dcr -2 R416X 와 dcr-2 L811fsX ) 초파리에서 발현 차이를 보이는 단백질에 대응하는 mRNA 전사체의 발현 수준을 비교 분석한 데이터이다. 머리(A)와 몸(B)에서 정량적 RT-PCR 방법을 이용하여 분석하였고 rp49의 발현 수준으로 정상화 (normalization)하였다. 독립적으로 3 반복한 데이터를 정상 초파리에서의 각 전사체 발현 수준을 1로 기준하여 dcr-2 돌연변이에서의 전사체 발현 수준을 평균 ± 표준오차로 표기하였다.
도 5는 정상 초파리와 서로 다른 두 라인의 dcr -2 돌연변이 (dcr -2 R416X 와 dcr-2 L811fsX ) 초파리에서의 dG9a 단백질의 웨스턴 블롯 (western blot) 이미지이다. β-Tubulin은 loading control로 사용되었다.
도 6은 dcr -2 유전자의 결손이 다양한 외부 스트레스에 대한 저항성에 미치는 영향을 나타낸다. 10일 된 수컷 초파리에서 10 mM 파라쿼트(paraquat) (A), 100 mM DTT (B), 기아(starvation) (C), 저온 스트레스(cold stress) (D)에 노출되었을 때의 생존율을 분석하였다. 각 유전형 마다 20마리씩 3 세트를 진행하여 평균 ± 표준오차로 생존 곡선을 만들었다. 통계 분석으로 log-rank test를 진행하여 p<0.001 보였다.
도 7은 dcr -2 유전자의 결손이 다양한 외부 스트레스에 대한 저항성에 미치는 영향을 나타낸다. 10일 된 암컷 초파리에서 10 mM 파라쿼트(paraquat) (A), 100 mM DTT (B), 기아(starvation) (C), 저온 스트레스(cold stress) (D)에 노출되었을 때의 생존율을 분석하였다. 각 유전형 마다 20마리씩 3 세트를 진행하여 평균 ± 표준오차로 생존 곡선을 만들었다. 통계 분석으로 log-rank test를 진행하여 p<0.001 보였다.
도 8은 dcr -2 트랜스 헤테로자이고트(transheterozygote) 돌연변이의 산화 스트레스(oxidative stress)에 대한 저항성을 측정하였다. 10일 된 수컷 (A), 암컷 (B) 초파리에서 10 mM 파라쿼트(paraquat)에 노출되었을 때의 생존율을 분석하였다. 각 유전형 마다 20마리씩 3 세트를 진행하여 평균 ± 표준오차로 생존 곡선을 만들었다. 통계 분석으로 log-rank test를 진행하여 p<0.001 보였다.
도 9는 dcr -2 돌연변이 (dcr -2 L811fsX ) 초파리의 유전적 배경에 dcr -2 재도입하여 RNAi 현상의 회복을 검증한 결과를 나타낸다. (A) 정상 초파리 (B) dcr -2 돌연변이 (dcr -2 L811fsX ) 초파리 (C) dcr -2 재도입 초파리
도 10은 dcr -2 유전자의 결손이 수명에 미치는 영향을 나타낸다. 각 유전형 마다 20마리씩 15 세트를 진행하여 평균 ± 표준오차로 생존 곡선을 만들었다. 통계 분석으로 log-rank test를 진행하여 p<0.001 보였다.
도 11은 Dcr-2의 활성이 에너지 대사 조절에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸다. 트리글리세라이드(triglyceride) 수준을 3령 유충 전체 몸 (A, 왼쪽)과 성충의 암, 수컷 (A, 오른쪽)에서 분석하였다. 그리고 3령 유충의 체액 (hemolymph)내에서 트레할로오스(trehalose)와 글루코오스(glucose) 수준을 비교 분석하였다 (B). 수컷 초파리의 전체 몸에서 글리코겐(glycogen)의 수준을 분석하였다 (C). 데이터는 평균 ± 표준오차로 나타내었고 통계분석으로는 ANOVA 이후 Dunnett's test로 분석하여 *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.0001로 표기하였다.
도 12는 초파리에서의 RNAi pathway를 간략하게 나타낸 도면이다.
도 13은 본 발명에 의해 엔도-siRNA (endo-siRNA)의 생성을 억제하여 대사, 스트레스 저항성 및 수명을 조절하는 방법에 대한 모식도이다.1 shows a dcr- 2 mutant ( dcr- 2 R416X with two different lines) from a normal Drosophila. dcr-2 L811fsX ) Western blot of RNAi related proteins in Drosophila. β-Tubulin was used as loading control. * Marks are nonspecific bands.
2 is an image of a proteomic analysis of a protein regulated by Dcr-2. Normal Drosophila and two different lines of the dcr- 2 mutation ( dcr- 2 with R416X dcr -2 L811fsX ) Representative images of 2D-gel analysis in the head (A) and body (B) of Drosophila. MALDI-TOF was performed to identify proteins for spots indicated by arrows and circles. The protein corresponding to each spot number is shown in Table 1.
Figure 3 shows the normal Drosophila and dcr- 2 mutant ( dcr- 2 R416X with 2D-gel analysis). dcr -2 L811fsX ) is an enlarged image of spots showing differences in expression in the head (H) and body (B) of Drosophila. Each arrow and circle marks the point of difference. The protein corresponding to each spot number is shown in Table 1.
Figure 4 shows the dcr- 2 mutant ( dcr- 2 R416X with two different lines from normal Drosophila). dcr-2 L811fsX ) Data comparing the expression levels of mRNA transcripts corresponding to proteins with different expressions in Drosophila. Head (A) and body (B) were analyzed using quantitative RT-PCR method and normalized to the expression level of rp49 . Independently repeated 3 data were expressed as mean ± standard error of transcript expression levels in dcr-2 mutants based on 1 transcript expression level in normal Drosophila.
5 shows the dcr- 2 mutant ( dcr- 2 R416X with two different lines from normal Drosophila). dcr-2 L811fsX ) Western blot image of dG9a protein in Drosophila. β-Tubulin was used as loading control.
6 shows the effect of the deletion of the dcr- 2 gene on resistance to various external stresses. Survival was analyzed when exposed to 10 mM paraquat (A), 100 mM DTT (B), starvation (C), cold stress (D) in 10-day-old male fruit flies. Three sets of 20 animals per genotype were run to create survival curves with mean ± standard error. Statistical analysis showed that the log-rank test showed p <0.001.
7 shows the effect of the deletion of the dcr- 2 gene on resistance to various external stresses. Survival was analyzed when exposed to 10 mM paraquat (A), 100 mM DTT (B), starvation (C) and cold stress (D) in 10-day-old female Drosophila. Three sets of 20 animals per genotype were run to create survival curves with mean ± standard error. Statistical analysis showed that the log-rank test showed p <0.001.
FIG. 8 measured resistance to oxidative stress of a dcr- 2 transheterozygote mutant. Survival was analyzed when exposed to 10 mM paraquat in 10 day old male (A) and female (B) fruit flies. Three sets of 20 animals per genotype were run to create survival curves with mean ± standard error. Statistical analysis showed that the log-rank test showed p <0.001.
Figure 9 shows the results of the dcr -2 reintroduce the genetic background of the mutant Drosophila dcr -2 (dcr -2 L811fsX) verifying the restoration of the RNAi phenomenon. (A) Drosophila (B) dcr- 2 mutant ( dcr- 2 L811fsX ) Drosophila (C) dcr- 2 reintroduction Drosophila
10 shows the effect of deletion of the dcr- 2 gene on longevity. 15 sets of 20 animals for each genotype were made to create survival curves with mean ± standard error. Statistical analysis showed that the log-rank test showed p <0.001.
11 shows the results of analyzing the effect of Dcr-2 activity on energy metabolism regulation. Triglyceride levels were analyzed in the entire body of three larvae (A, left) and adult females and males (A, right). In addition, trehalose and glucose levels were compared and analyzed in hemolymphs of three larvae (B). Glycogen levels were analyzed in the whole body of male fruit flies (C). The data were expressed as mean ± standard error, and statistical analysis was performed by Dunnett's test after ANOVA *, p <0.05; **, p <0.01; ***, p <0.0001.
12 is a view showing briefly the RNAi pathway in Drosophila.
Figure 13 is a schematic diagram of a method for controlling metabolism, stress resistance and lifespan by inhibiting the production of endo-siRNA by the present invention.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the accompanying drawings. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .
<< 실시예Example 1> 1> dcrdcr -2-2 돌연변이 초파리들에서 In mutant fruit flies RNAiRNAi 현상에 관련된 단백질들의 발현 변화 확인 Identification of changes in expression of proteins involved in the phenomenon
dcr -2 돌연변이 초파리들에서 Dcr-2와 그와 상호작용을 통해 단백질 안정성에 영향을 받는 R2D2 단백질을 제외한 다른 RNAi (miRNA와 siRNA 포함) 관련 단백질들의 변화를 확인하기 위해 웨스턴 블롯 (western blot)을 이용하여 단백질의 발현을 비교분석 하였다. In the dcr- 2 mutant Drosophila, Western blot was used to identify changes in RNAi (including miRNA and siRNA) related proteins other than R2D2 protein, which is affected by protein stability through interaction with Dcr-2. The expression of proteins was compared and analyzed.
<1-1> 초파리 라인<1-1> fruit fly line
초파리는 25℃, 일반적인 초파리 배지에서 유지하였다. 정상 초파리의 유전형은 y w eyFLP ; FRT42D (이하, "정상 또는 wildtype"라 칭함)이다. dcr -2 돌연변이 초파리들의 유전형은 y w eyFLP ; FRT42D , dcr -2 R416X (이하, “dcr -2 R416X ”라 칭함)와 y w eyFLP ; FRT42D , dcr -2 L811fsX (이하, “dcr -2 L811fsX ”라 칭함)이며, EMS를 이용하여 돌연변이를 유도한 초파리 라인으로 돌연변이로 인한 dcr -2 유전자의 비정상적인 종결코돈이 형성됨으로써 정상적인 Dcr-2 단백질이 형성되지 못하는 돌연변이체들이다 (Cell 117(1):69-81). Drosophila was maintained at 25 ° C. in normal Drosophila medium. Genotype of normal Drosophila is yw eyFLP ; FRT42D (hereinafter referred to as "normal or wildtype"). Genotypes of dcr- 2 mutant Drosophila are yw eyFLP ; FRT42D , dcr- 2 R416X (hereinafter referred to as “ dcr- 2 R416X ”) and yw eyFLP ; FRT42D , dcr- 2 L811fsX (hereinafter referred to as “ dcr- 2 L811fsX ”), is a Drosophila line induced mutations using EMS, and a normal Dcr-2 protein is formed by abnormal termination codon of the dcr- 2 gene due to mutation. These are non-forming mutants (Cell 117 (1): 69-81).
그리고 유전자 재도입을 통한 회복 실험을 위하여 본래의 게놈 프로모터 (genomic promoter)에 의해 아미노 말단에 hemagglutinin (이하, “HA"라 칭함) 붙어 있는 Dcr-2가 발현하도록 DNA를 제조한 후, dcr -2 L811fsX 초파리에 삽입하여 dcr -2 재도입 초파리를 만들었다. 그 유전형은 다음과 같다. y w eyFLP ; FRT42D , dcr -2 L811fsX ; HA - dcr -2 (이하 “dcr -2 L811fsX ; HA - dcr -2”라 칭함)And after producing the DNA to the original genomic promoters Dcr-2 attached hemagglutinin (hereinafter, "HA" hereinafter) at the amino terminus by (genomic promoter) for expression experiments recovery through the introduction of genetic material, dcr -2 Inserted into the L811fsX Drosophila to create a dcr- 2 reintroduced Drosophila, genotypes of which are as follows: yw eyFLP ; FRT42D , dcr -2 L811fsX ; HA - dcr -2 (hereinafter “ dcr -2 L811fsX ; HA - dcr -2 ” Called)
<1-2> <1-2> 웨스턴Western 블롯Blot ( ( westernwestern blotblot ))
본 발명자들은 웨스턴 블롯을 위하여 정상 초파리, 서로 다른 2개의 dcr -2 돌연변이 (dcr -2 R416X 와 dcr -2 L811fsX ) 초파리들을 이용하였다. 단백질은 각 유전형의 초파리들을 용해 버퍼 (lysis buffer: 100mM potassium acetate, 30mM HPES-KOH(pH7.2), 2mM magnesium acetate, 5mM DTT, 1mg/ml Pefabloc SC)에서 균질화 하여 얻었으며, 사용된 항체는 다음과 같다. anti-Dcr-2, anti-R2D2 (Q. Liu로부터 확보), anti-Dcr-1 (Abcam), anti-Ago1 (Abcam), anti-Ago2 (M. Siomi로부터 확보), anti-dFMR, anti-TSN (G. Hannon으로부터 확보) 그리고 anti-β-tubulin (Developmental Studies Hybridoma Bank). We used normal Drosophila, two different dcr- 2 mutations ( dcr- 2 R416X and dcr- 2 L811fsX ) Drosophila were used. Proteins were obtained by homogenizing each genotype Drosophila in lysis buffer (100 mM potassium acetate, 30 mM HPES-KOH (pH 7.2), 2 mM magnesium acetate, 5 mM DTT, 1 mg / ml Pefabloc SC). As follows. anti-Dcr-2, anti-R2D2 (from Q. Liu), anti-Dcr-1 (Abcam), anti-Ago1 (Abcam), anti-Ago2 (from M. Siomi), anti-dFMR, anti- TSN (obtained from G. Hannon) and anti-β-tubulin (Developmental Studies Hybridoma Bank).
그 결과, dcr -2 돌연변이 (dcr -2 R416X 와 dcr -2 L811fsX ) 초파리들에서는 Dcr-2와 Dcr-2와 상호작용으로 단백질 안정성에 영향을 받는 R2D2는 발현하지 않았으며, 이를 제외한 miRNA와 siRNA pathway에 관련된 다른 RNAi 단백질들의 발현양은 변하지 않았다 (도 1).
As a result, the dcr -2 mutation ( dcr -2 R416X and dcr -2 L811fsX ) Drosophila did not express R2D2, which affects protein stability by interacting with Dcr-2 and Dcr-2, but the expression levels of other RNAi proteins related to miRNA and siRNA pathway were not changed (Fig. One).
<< 실시예Example 2> 2> DcrDcr -2에 의해 조절되는 단백질 동정 및 해당 단백질의 -2 Protein Identification and Regulation of Proteins 전사체Transcript 발현 수준 조사 Expression level investigation
본 발명자들은 dcr -2 돌연변이 (dcr -2 R416X 와 dcr -2 L811fsX ) 초파리들에서 발현양이 변화되는 단백질들을 조사하기 위하여 2D-gel 및 MALDI-TOF로 단백질을 동정하였다. We used the dcr- 2 mutation ( dcr- 2 R416X and dcr- 2 L811fsX ) Proteins were identified with 2D-gel and MALDI-TOF to investigate proteins with varying expression levels in Drosophila.
<2-1> <2-1> TwoTwo -- dimensionaldimensional gelgel 분석 (이하, “2D- Analysis (hereinafter, “2D- gelgel ”이라 칭함) 및 단백질 동정And protein identification)
2D-gel 분석은 10일이 지난 동일 수의 암, 수컷 초파리 (정상 초파리, 서로 다른 두 라인의 dcr -2 돌연변이 (dcr -2 R416X 와 dcr -2 L811fsX ) 약 200여 마리의 머리와 몸을 분리하여 독립적으로 3 반복 실시하였다. 단백질 농도는 Bradford assay를 이용하였다. 간단히 2D-gel 분석을 설명하면, 1차 분리는 pH 4-10 nonlinear 구배를 가지는 24 cm strip (Genomine Inc.)에서 등전점전기영동 (isoelectric focusing)을 통해 분리하였다. 그리고 2차 분리는 20- × 24-cm, 10-16% linear gradient sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel에서 전기영동을 통해 분리하였다. 이렇게 분리된 단백질들은 silver staining을 통해 점 (spot)을 확인하였다. 이미지 분석과 단백질 점 (spot)의 정량 분석은 PDQuest software (version 7.0, Bio-Rad)를 이용하였다. 2D-gel analysis showed that 10 days of the same number of cancers, male Drosophila (normal Drosophila, two different lines of dcr- 2 mutation ( dcr- 2 R416X and dcr- 2 L811fsX ) About 200 heads and bodies were separated and repeated three times independently. Protein concentration was determined by Bradford assay. Briefly describing the 2D-gel analysis, the primary separation was separated by isoelectric focusing on a 24 cm strip (Genomine Inc.) with a pH 4-10 nonlinear gradient. Secondary separation was performed by electrophoresis on 20- × 24-cm, 10-16% linear gradient sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel. These isolated proteins were identified by silver staining. Image analysis and quantitative analysis of protein spots were performed using PDQuest software (version 7.0, Bio-Rad).
단백질 동정은 발현 차이를 보이는 점 (spot)을 in-gel trypsin digestion 하고 matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry analysis (이하, "MALDI-TOF"라 칭함, Ettan MALDI-TOF mass spectrometer; GE Healthcare Bioscience)을 통해 진행하였다. 그리고 펩타이드 매스 스펙트라 (peptide mass spectra)는 ProFound program (http://prowl.rockefeller.edu/prowl-cgi/profound.exe)을 이용하여 Drosophila NCBI non-redundant database와 비교하여 조사하였다. Protein identification involves in-gel trypsin digestion of spots with differences in expression and matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry analysis (hereinafter referred to as "MALDI-TOF", Ettan MALDI-TOF mass spectrometer). GE Healthcare Bioscience). Peptide mass spectra were also compared to the Drosophila NCBI non-redundant database using the ProFound program (http://prowl.rockefeller.edu/prowl-cgi/profound.exe).
그 결과, 3 반복의 2D-gel 분석을 통해 정상 초파리와 비교하여 dcr-2 돌연변이 (dcr-2 R416X 와 dcr-2 L811fsX ) 초파리들에서 모두 1.5배 이상 발현 변화를 보이는 spot을 각각 머리에서 15개, 몸에서 16개 확인하였다 (도 2, 3). 각 spot에 해당하는 단백질들을 MALDI-TOF를 이용하여 동정하였다. 분석된 단백질들을 그 기능별로 나누었을 때 대부분 대사작용, 외부 스트레스에 대한 반응, 발생 및 발달과정에 관여하는 단백질들이었다 (표 1). As a result, 2D-gel analysis of 3 iterations of the dcr-2 mutant ( dcr-2 R416X and dcr-2 L811fsX ) In the fruit flies, 15 spots showing more than 1.5-fold expression change were confirmed in 15 heads and 16 body parts, respectively (FIGS. 2 and 3). Proteins corresponding to each spot were identified using MALDI-TOF. When the proteins analyzed were classified by their function, most of them were proteins involved in metabolism, response to external stress, development and development (Table 1).
<2-2> 정량적 <2-2> quantitative RTRT -- PCRPCR
정상 초파리와 서로 다른 두 라인의 dcr -2 돌연변이 (dcr -2 R416X 와 dcr -2 L811fsX ) 초파리들에서 머리와 몸을 분리하여 각각의 조직에서 TRIzol reagent (Invitrogen)를 이용하여 분리하였다. 분리된 RNA 1 μg을 DNaseI (Invitrogen) 처리를 하고 Random hexamer (Promega)와 MMLV-reverse transcriptase (Invitrogen)를 이용하여 처음-가닥 cDNA를 합성하였다. 이 cDNA를 주형으로 SYBR green supermix (Bio-rad)를 이용하여 정량적 RT-PCR를 수행하였다. PCR에 이용된 각 유전자에 대한 primer는 다음과 같다 (표 2).Normal Drosophila and two different lines of the dcr- 2 mutation ( dcr- 2 with R416X dcr- 2 L811fsX ) Drosophila head and body were separated from each tissue using TRIzol reagent (Invitrogen). 1 μg of the isolated RNA was treated with DNaseI (Invitrogen), and first-stranded cDNA was synthesized using random hexamer (Promega) and MMLV-reverse transcriptase (Invitrogen). Quantitative RT-PCR was performed using SYBR green supermix (Bio-rad) as a template of this cDNA. Primers for each gene used in PCR are as follows (Table 2).
그 결과, 머리에서 3개의 유전자 (CG4408, CG11841, CG6776), 몸에서 3개의 유전자 (CG6084, CG11661, CG4466)가 dcr -2 돌연변이 (dcr -2 R416X 와 dcr -2 L811fsX ) 초파리 두 라인에서 모두 단백질의 발현 패턴과 동일한 방향으로 1.5배 이상의 차이를 보였다. 그 외의 유전자에서는 통계적으로 큰 차이를 보이지 않았다 (도 4). 모든 데이터는 독립적인 3 반복 실험을 통해 얻었다.As a result, three genes (CG4408, CG11841, CG6776) in the head, and three genes (CG6084, CG11661, CG4466) in the body were present with the dcr- 2 mutation ( dcr- 2 R416X and dcr -2 L811fsX ) Drosophila both lines showed a 1.5-fold difference in the same direction as the protein expression pattern. The other genes did not show a statistically significant difference (FIG. 4). All data were obtained through independent 3 replicates.
<2-3> <2-3> 웨스턴Western 블롯Blot ( ( westernwestern blotblot ))
<2-1>의 방법을 이용하여 dcr -2 돌연변이에서 발현 차이를 보이는 단백질의 재확인을 위해 웨스턴 블롯 (western blot)을 실시하였다. <1-2>에서 동일한 방법을 이용하여 실시하였고 사용된 항체는 다음과 같다. anti-dG9a (A. Lambertsson으로부터 확보), anti-β-tubulin (Developmental Studies Hybridoma Bank). Western blots were performed to reconfirm the proteins with different expressions in dcr- 2 mutants using the method of <2-1>. The antibody was used in the same manner as in <1-2> and the antibodies used were as follows. anti-dG9a (obtained from A. Lambertsson), anti-β-tubulin (Developmental Studies Hybridoma Bank).
그 결과, 2D-gel 분석에서 발현 차이를 보이는 것과 동일하게 dG9a 단백질이 정상 초파리에서만 발현하였고 dcr -2 돌연변이 (dcr -2 R416X 와 dcr -2 L811fsX ) 초파리 두 라인에서는 확인되지 않았다 (도 5). As a result, the dG9a protein was expressed only in normal Drosophila, and the dcr- 2 mutation ( dcr- 2 R416X and dcr -2 L811fsX ) was not found in both Drosophila lines (Figure 5).
<2-4> 통계분석<2-4> Statistical Analysis
통계적으로 발현 수준 차이를 검증하기 위해 Prism 5 소프트웨어 (GraphPad)를 사용하였다. 통계 처리는 analysis of variance (이하 “ANOVA”라 칭함)와 다중 검정으로 Dunnett's test를 실시하였다.
<< 실시예Example 3> 3> dcrdcr -2-2 돌연변이 초파리의 다양한 외부 스트레스에 대한 저항성 조사 Investigation of resistance to various external stresses in mutant fruit flies
본 발명자들은 엔도-siRNA (endo-siRNA)의 생체 생리학적 기능을 분석하기 위해 dcr -2 돌연변이 (dcr -2 L811fsX ) 초파리를 이용하여 다양한 외부 스트레스 (산화 스트레스, 소포체 스트레스, 기아 스트레스, 저온 스트레스)에 대한 저항성을 정상 초파리와 비교 분석하였다. The inventors used a dcr- 2 mutant ( dcr- 2 L811fsX ) Drosophila to analyze the biophysiological function of endo-siRNA (endo-siRNA) using various external stresses (oxidative stress, vesicle stress, hunger stress, cold stress). Resistance to was compared with normal fruit flies.
<3-1> 산화 스트레스(<3-1> oxidative stress ( OxidativeOxidative stressstress )에 대한 저항성 측정Resistance measurement
10일 된 초파리 암, 수컷 각각 60마리씩 측정하였으며 바이알 (vial)마다 20마리씩 3 세트로 진행하였다. 모든 초파리들은 스트레스에 대한 저항성을 측정하기에 앞서 먹이가 들어 있지 않은 빈 바이알 (vial)에서 3시간 동안 단식시킨 후, 10mM 파라쿼트(paraquat)가 포함된 5% 수크로오스(sucrose)가 들어 있는 바이알 (vial)로 옮겨서 매 시간마다 초파리의 생존율을 측정하였다. Sixty-day-old Drosophila cancers and 60 males each were measured, and 20 animals per vial were progressed in three sets. All fruit flies were fasted for three hours in an empty vial containing no food prior to measuring their resistance to stress, followed by a vial containing 5% sucrose with 10 mM paraquat. ), The survival rate of the fruit flies was measured every hour.
그 결과, 정상 초파리와 비교하여 암, 수컷 모두에서 dcr -2 돌연변이 (dcr -2 L811fsX ) 초파리가 산화 스트레스에 대한 저항성이 감소한 것을 확인하였으며, dcr -2 재도입 초파리는 정상 초파리와 유사하게 산화 스트레스에 저항성이 증가되는 것을 확인하였다 (도 6, 7). 그리고 추가적으로 dcr -2 트랜스헤테로자이고트 (transheterozygote, dcr -2 R416X /dcr -2 L811fsX ) 돌연변이의 암, 수컷 모두에서도 정상 초파리보다 산화 스트레스에 대한 저항성이 감소한 것을 확인하였다 (도 8).As a result, it was found that in both cancer and male compared with normal fruit flies Drosophila mutant dcr -2 (dcr -2 L811fsX) decreased resistance to oxidative stress, dcr -2 reintroduced in Drosophila fruit flies with normal oxidative stress similarly It was confirmed that the resistance to increase (FIGS. 6 and 7). And further dcr -2 trans hetero Xi Goth (transheterozygote, dcr -2 R416X / dcr -2 L811fsX) of cancer mutations, it was confirmed that both males decreased in resistance to oxidative stress than normal fruit flies (Fig. 8).
<3-2> 소포체 스트레스(<3-2> endoplasmic reticulum stress ( ERER stress)stress) 에 대한 저항성 측정Resistance to
측정에 이용된 초파리는 <3-1>과 동일하다. 모든 초파리들은 스트레스에 대한 저항성을 측정하기에 앞서 먹이가 들어 있지 않은 빈 바이알 (vial)에서 3시간 동안 단식시킨 후, 100 mM DTT(dithiothreitol)이 포함된 5% 수크로오스(sucrose)가 들어 있는 바이알 (vial)로 옮겨 매시간 초파리의 생존율을 측정하였다. Drosophila used for the measurement is the same as <3-1>. All Drosophila were fasted for 3 hours in an empty vial containing no food before measuring resistance to stress, then a vial containing 5% sucrose containing 100 mM dithiothreitol (DTT) vial) to measure the survival rate of fruit flies every hour.
그 결과, 암, 수컷 모두에서 dcr -2 돌연변이 (dcr -2 L811fsX ) 초파리가 정상 초파리와 비교하여 소포체 스트레스(ER stress)에 대한 저항성이 감소한 것을 확인하였으며, dcr -2 재도입 초파리는 정상 초파리의 수준으로 소포체 스트레스(ER stress)에 대한 저항성이 회복되는 것을 확인하였다 (도 6, 7). As a result, and in both cancers were male fruit flies have mutations dcr -2 (dcr -2 L811fsX) compared to normal fruit flies confirm that the resistance to the endoplasmic reticulum stress (ER stress) decreased, dcr -2 reintroduction of a normal fruit fly Drosophila It was confirmed that the resistance to ER stress was restored to the level (FIGS. 6 and 7).
<3-3> 기아(<3-3> starvation StarvationStarvation )에 대한 저항성 측정Resistance measurement
측정에 이용된 초파리는 <3-1>과 동일하다. 스트레스에 대한 저항성을 측정하기 위해서 초파리를 먹이가 들어 있지 않은 빈 바이알 (vial)로 옮겨서 매시간 초파리의 생존율을 측정하였다. Drosophila used for the measurement is the same as <3-1>. To measure the resistance to stress, the fruit flies were transferred to empty vials containing no food to measure the survival rate of fruit flies every hour.
그 결과, 암, 수컷 모두에서 dcr -2 돌연변이 (dcr -2 L811fsX ) 초파리가 정상 초파리보다 기아에 대한 저항성이 감소한 것을 확인하였으며, dcr -2 재도입 초파리는 정상 초파리와 유사하게 기아에 대한 저항성이 향상된 것을 확인하였다 (도 6, 7). As a result, cancer, dcr -2 mutations in both males (dcr -2 L811fsX) it was found that fruit flies are resistant to starvation decreased than normal fruit flies, dcr -2 reintroduced in Drosophila is resistant to starvation similar to the normal fruit flies It was confirmed that the improvement (Fig. 6, 7).
<3-4> 저온 스트레스(<3-4> low temperature stress ( ColdCold stressstress )에 대한 저항성 측정Resistance measurement
측정에 이용된 초파리는 <3-1>과 동일하다. 스트레스에 대한 저항성을 측정하기 위해서 초파리를 일반적인 초파리 먹이가 들어 있는 바이알 (vial)로 옮겨서 하루 중 8시간은 4℃에서 저온 스트레스(cold stress)를 주었고 이후 16시간은 25℃에서 회복시켰다. 이렇게 매일 저온 스트레스를 가하면서 초파리의 생존율을 측정하였다. Drosophila used for the measurement is the same as <3-1>. To measure the resistance to stress, the fruit flies were transferred to a vial containing normal fruit fly foods, and 8 hours of the day were subjected to cold stress at 4 ° C., and then 16 hours were recovered at 25 ° C. The daily survival of the fruit flies was measured by applying cold stress every day.
그 결과, 암, 수컷 모두에서 dcr -2 돌연변이 (dcr -2 L811fsX ) 초파리가 정상 초파리보다 저온 스트레스에 대한 저항성이 감소한 것을 확인하였으며, dcr -2 재도입 초파리는 정상 초파리와 유사하게 저온 스트레스에 저항성을 보이는 것을 확인하였다 (도 6, 7). As a result, cancer, and it was confirmed that the mutant fruit flies dcr -2 (dcr -2 L811fsX) in both male resistance to cold stress decreased more than normal fruit fly, Drosophila dcr -2 reintroduction is resistant to cold stress similar to the normal fruit flies It was confirmed that the (Fig. 6, 7).
<3-5> <3-5> dcrdcr -2-2 재도입 Reintroduction 초파리에서의Fruit fly RNAiRNAi 현상의 회복 검증 Recovery verification of the phenomenon
본 발명자들은 dcr -2 재도입 초파리에서 RNAi 현상이 정상적으로 회복되었는지 확인하고자 하였다. 생체 내에서 초파리의 눈 색깔을 담당하는 white 유전자의 발현을 억제할 수 있는 긴 헤어핀 dsRNA (long hairpin dsRNA)를 유도할 수 있는 GMR-wIR 유전자가 도입된 배경에서 정상 초파리, dcr -2 돌연변이 (dcr -2 L811fsX ) 초파리, dcr-2 재도입 초파리의 눈 색깔로 검증하였다. 정상적인 초파리의 경우 dsRNA로 인한 white 유전자의 발현이 억제가 되면 초파리의 눈 색깔이 빨간색(정상)에서 노란색(억제)으로 변하게 되고, dcr -2의 돌연변이로 RNAi 현상이 결손 되면 white 유전자의 발현이 억제가 되지 않아서 초파리의 눈 색깔은 빨간색(정상)으로 유지가 된다. 이러한 초파리에 다시 dcr -2의 재도입을 통해 RNAi 현상을 회복 시켜 주면, dsRNA로 인한 white 유전자의 발현이 다시 억제가 되면서 눈 색깔은 빨간색(정상)에서 노란색(억제)으로 변하게 된 것을 확인하였다 (도 9). The present inventors attempted to determine whether the RNAi phenomenon was normally restored in the dcr- 2 reintroduced Drosophila. Normal Drosophila, dcr- 2 mutation ( dcr) in the background of the introduction of the GMR-wIR gene, which can induce the long hairpin dsRNA, which can inhibit the expression of the white gene responsible for the color of fruit flies in vivo -2 L811fsX ) Drosophila, dcr-2 re-introduced Drosophila eye color. Under normal conditions, when the expression of the Drosophila white gene due to the inhibitory dsRNA in Drosophila eye color is changed to yellow (inhibition) in the red (top), when the RNAi phenomenon defect in the mutant dcr -2 expression of the white gene suppression Drosophila's eye color stays red (normal). When the RNAi phenomenon was restored by re-introducing dcr- 2 into the fruit flies, the white gene expression by dsRNA was suppressed again, and the eye color was changed from red (normal) to yellow (inhibited). 9).
<3-6> 통계분석<3-6> Statistical Analysis
통계적으로 각 외부 스트레스에 대한 생존율의 차이를 검증하기 위해 Prism 5 소프트웨어 (GraphPad)를 사용하였다. 통계 처리는 log-rank test를 실시하였다.
Statistically,
<< 실시예Example 4> 4> dcrdcr -2-2 돌연변이 Mutation 초파리에서In the fruit fly 수명 조사 Life survey
<4-1> 초파리 수명 비교 분석<4-1> Drosophila Life Span Comparison Analysis
본 발명자들은 dcr -2 돌연변이 (dcr -2 R416X 와 dcr -2 L811fsX ) 초파리에서 수명을 정상 초파리와 비교 분석하였다. 측정에 사용된 초파리는 성충 (adult fly)으로 변태한 후에 교배를 시키기 위해 하루 동안 암컷과 수컷을 함께 두었으며, 이후 암, 수를 각각 구분하여 수명을 측정하였다. 초파리의 수명은 암, 수 각각 300마리를 측정하였고 25 ℃, 65 % 습도, 12시간씩 명암이 바뀌는 환경조건에서 측정하였다. We used the dcr- 2 mutation ( dcr- 2 R416X and dcr- 2 L811fsX ) Drosophila life was compared with normal Drosophila. Drosophila used in the measurement was a female and male for one day to breed after the adult fly (adult fly) was mated, and then the life span was measured by dividing the male and female. The life span of fruit flies was measured in 300 females and 30 males and 25 ℃, 65% humidity, and 12 hours of varying contrast.
그 결과, 암, 수컷 모두에서 dcr -2 돌연변이 (dcr -2 R416X 와 dcr -2 L811fsX ) 초파리가 정상 초파리보다 수명이 감소한 것을 확인하였으며 dcr -2 재도입 초파리는 정상 초파리와 유사하게 수명이 회복되는 것을 확인하였다 (도 8). 또한 추가적으로 dcr-2 돌연변이의 트랜스헤테로자이고트(transheterozygote, dcr-2 R416X /dcr-2 L811fsX )의 암, 수컷 모두에서도 정상 초파리보다 수명이 감소한 것을 확인하였다 (도 10). As a result, dcr- 2 mutations ( dcr- 2 R416X and dcr- 2 L811fsX ) Drosophila was confirmed to have a shorter lifespan than normal Drosophila, and dcr- 2 reintroduced Drosophila was found to have a lifespan similar to that of normal Drosophila (FIG. 8). In addition, it was confirmed that in cancer, both male further dcr-2 mutant trans hetero Xi Goat (transheterozygote, dcr-2 R416X / dcr-2 L811fsX) of the life is decreased than normal fruit flies (Fig. 10).
<4-2> 통계분석<4-2> Statistical Analysis
통계적으로 수명의 차이를 검증하기 위해 Prism 5 소프트웨어 (GraphPad)를 사용하였다. 통계 처리는 log-rank test를 실시하였다.
<< 실시예Example 5> 5> dcrdcr -2 -2 돌연변이 Mutation 초파리에서In the fruit fly 에너지 대사 작용 조사 Energy metabolism investigation
본 발명자들은 dcr -2 돌연변이 (dcr -2 R416X 와 dcr -2 L811fsX ) 초파리에서 에너지 대사 작용의 변화를 조사하기 위하여 트리글리세라이드(triglyceride), 글리코겐(glycogen), 글루코오스(glucose)의 수준을 측정하였다. We used the dcr- 2 mutation ( dcr- 2 R416X and dcr -2 L811fsX ) Triglyceride, glycogen, and glucose levels were measured to investigate changes in energy metabolism in fruit flies.
<5-1> <5-1> 트리글리세라이드Triglyceride (( TriglycerideTriglyceride ) 수준 측정Level measurement
dcr -2 돌연변이 (dcr -2 R416X 와 dcr -2 L811fsX ) 초파리들을 포함한 정상 초파리, dcr-2 재도입 초파리의 몸 전체에서 트리글리세라이드 (triglyceride)를 측정하기 위하여 동일시기에 발생된 3령 유충 30마리씩 6세트와 10일 된 수컷 30마리씩 15 세트, 그리고 암컷 30마리씩 10세트를 이용하여 진행하였다. 각 샘플은 600 μl 용해 버퍼 (lysis buffer: 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, and 0.1% Triton X-100)에서 균질화한 후, 0.45 μm-filter (Sartorius)로 여과하였다. 그리고 트리글리세라이드 (triglyceride)는 Triglyceride Assay Kit (ThermoElectron)를 이용해서 측정하였다. 간단하게 설명하면, 약 7 μl의 여과된 샘플을 150 μl triglyceride assay solution과 섞고 37 ℃에서 10분간 유지한 후 200 nm (SpectraMax M5, Molecular Devices)에서 그 흡광도를 측정하였다. 트리글리세라이드 (triglyceride)의 수준은 각 샘플의 단백질 양으로 정상화 (normalization)하였다. dcr -2 mutation (with dcr -2 R416X dcr -2 L811fsX) a
그 결과, dcr -2 돌연변이 (dcr -2 R416X 와 dcr -2 L811fsX )의 유충에서는 정상 유충에 비하여 몸 전체에서 28-50% 트리글리세라이드 (triglyceride)가 감소하는 것으로 나타났고, 성충의 몸 전체에서는 암, 수컷 모두에서 21-49% 트리글리세라이드 (triglyceride)가 감소하는 것으로 확인되었다. 그리고 dcr -2 재도입 유충과 성충에서는 정상 유충과 성충과 유사한 수준으로 회복되었다 (도 11의 A).As a result, the dcr -2 mutation ( dcr -2 R416X and The larvae of dcr -2 L811fsX ) showed 28-50% triglyceride reduction in the whole body compared to the normal larvae, and 21-49% triglyceride in both the female and the female body in the adult body. Was found to decrease. And The dcr- 2 reintroduced larvae and adults recovered to levels similar to those of normal larvae and adults (FIG. 11A).
<5-2> 글리코겐(<5-2> glycogen ( GlycogenGlycogen ) 수준 측정Level measurement
dcr -2 돌연변이 (dcr -2 R416X 와 dcr -2 L811fsX ) 초파리들을 포함한 정상 초파리, dcr-2 재도입 초파리에서 글리코겐 (glycogen) 수준을 측정하기 위하여 10일 된 암, 수컷을 각각 330마리씩을 이용하였다. 각 샘플을 0.5% Tween 20이 포함된 300 ml의 phosphate buffered saline (PBS)을 가지고 얼음 위에서 균질화한 후, 즉시 70 ℃에서 5분간 유지하였다. 이어서 4 ℃에서 원심 분리하여 그 상층액 5 μl를 50 μl Colorimetric Reaction Mixture (Abcam)에 첨가하였다. 그리고 그 혼합물을 37 ℃에서 30분간 유지한 후 570 nm (SpectraMax M5, Molecular Devices)에서 그 흡광도를 측정하였다. 글리코겐 (glycogen) 수준은 각 샘플의 단백질 양으로 정상화 (normalization)하였다. dcr -2 mutation (with dcr -2 R416X 330 10-day-old females and males were used to measure glycogen levels in normal Drosophila, including dcr- 2 L811fsX ) Drosophila, and dcr-2 Re-introduced Drosophila. Each sample was homogenized on ice with 300 ml of phosphate buffered saline (PBS) containing 0.5
그 결과, dcr -2 돌연변이 (dcr -2 R416X 와 dcr -2 L811fsX ) 초파리의 수컷에서 정상 초파리의 수컷에 비하여 25-28% 글루코겐 (glycogen)의 수준이 증가하는 것으로 확인되었다. 그리고 dcr -2 재도입 초파리의 수컷에서는 정상 초파리의 수컷과 유사한 수준으로 회복되었다 (도 11의 C).As a result, the dcr -2 mutation ( dcr -2 R416X and dcr- 2 L811fsX ) Drosophila males were found to have increased levels of 25-28% glycogen (Glycogen) compared to normal Drosophila males. In males of the dcr- 2 reintroduced Drosophila, the levels were restored to the levels similar to those of the normal Drosophila (FIG. 11C).
<5-3> 글루코오스(<5-3> glucose ( GlucoseGlucose ) 수준 측정Level measurement
dcr -2 돌연변이 (dcr -2 R416X 와 dcr -2 L811fsX ) 초파리들을 포함한 정상 및 dcr -2 재도입된 초파리의 동일시기에 발생한 3령 유충의 체액 (hemolymph)에서 글루코오스 (glucose) 수준을 측정하기 위하여 1 세트에 유충을 3-4마리씩을 이용하였다. 측정 전 2% agar에서 단식시켰으며 트레할로오스 (trehalose, a disaccharide of glucose)를 글루코오스 (glucose)로 변환시키기 위해 약 0.4 μl의 체액 (hemolymph)을 porcine kidney trehalase (Sigma)로 pH 6.8, 0.16 U/ml의 농도를 가지는 200 μl의 Infinity Glucose Reagent (ThermoElectron)와 섞어 37 ℃에서 하루 동안 배양하였다. 전체 체액 (hemolymph)의 글루코오스 (glucose) 농도는 340 nm (SpectraMax M5, Molecular Devices)에서 흡광도를 측정하여 얻었다. 그리고 standard curve는 글루코오스 농도 0-100 mg/ml에서 얻었다. dcr -2 mutation (with dcr -2 R416X dcr -2 L811fsX ) 3-4 larvae per set to measure glucose levels in the hemolymph of three larvae at the same time in normal and dcr- 2 reintroduced fruit flies, including fruit flies. Was used. Fasted at 2% agar prior to measurement and about 0.4 μl of hemolymph was converted to porcine kidney trehalase (Sigma) to convert trehalose (a disaccharide of glucose) to glucose (pH 6.8, 0.16). 200 μl of Infinity Glucose Reagent (ThermoElectron) with a concentration of U / ml was incubated at 37 ° C. for one day. Glucose concentration in total body fluid (hemolymph) was obtained by measuring the absorbance at 340 nm (SpectraMax M5, Molecular Devices). Standard curves were obtained at glucose concentrations of 0-100 mg / ml.
그 결과, dcr -2 돌연변이 (dcr -2 R416X 와 dcr -2 L811fsX ) 유충 두 라인 모두에서 정상 유충에 비하여 10-14% 체액에서 순환하는 글루코오스 (glucose)의 수준이 감소되어 있는 것을 확인하였다. 그리고 dcr -2 재도입 유충에서는 정상 유충과 유사한 수준으로 회복되었다 (도 11의 B).As a result, the dcr -2 mutation ( dcr -2 R416X and dcr -2 L811fsX ) Larvae It was confirmed that the level of circulating glucose (glucose) is reduced in 10-14% body fluid compared to the normal larvae in both lines. And in dcr- 2 reintroduced larvae recovered to levels similar to normal larvae (FIG. 11B).
<5-4> 통계분석<5-4> Statistical Analysis
통계적으로 트리글리세라이드(triglyceride), 글리코겐(glycogen), 글루코오스(glucose)의 수준의 차이의 차이를 검증하기 위해 Prism 5 소프트웨어 (GraphPad)를 사용하였다. 통계 처리는 ANOVA와 다중 검정으로 Dunnett's test를 실시하였다.
Statistically,
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였으나, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 균등물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is obvious that the same is by way of illustration and example only and is not to be construed as limiting the scope of the invention. It is therefore intended that the scope of the present invention be defined by the appended claims and their equivalents.
서열목록 전자파일 첨부Attach an electronic file to a sequence list
Claims (5)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020110090023A KR101330448B1 (en) | 2011-09-06 | 2011-09-06 | Method for regulation of metabolic homeostasis, stress resistance, and lifespan by the endogenous siRNA(endo-siRNA) pathway |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020110090023A KR101330448B1 (en) | 2011-09-06 | 2011-09-06 | Method for regulation of metabolic homeostasis, stress resistance, and lifespan by the endogenous siRNA(endo-siRNA) pathway |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20130026703A KR20130026703A (en) | 2013-03-14 |
| KR101330448B1 true KR101330448B1 (en) | 2013-11-15 |
Family
ID=48177873
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020110090023A KR101330448B1 (en) | 2011-09-06 | 2011-09-06 | Method for regulation of metabolic homeostasis, stress resistance, and lifespan by the endogenous siRNA(endo-siRNA) pathway |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101330448B1 (en) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20080108487A (en) * | 2006-02-28 | 2008-12-15 | 트르스티스 오브 보스톤 유니버시티 | Metabolic regulators and uses thereof |
| KR20090015059A (en) * | 2008-11-10 | 2009-02-11 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | Inhibitors against g6pd enzyme for treating and preventing oxidative stress and/or inflammatory related diseases and method for screening the same |
-
2011
- 2011-09-06 KR KR1020110090023A patent/KR101330448B1/en active IP Right Grant
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20080108487A (en) * | 2006-02-28 | 2008-12-15 | 트르스티스 오브 보스톤 유니버시티 | Metabolic regulators and uses thereof |
| KR20090015059A (en) * | 2008-11-10 | 2009-02-11 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | Inhibitors against g6pd enzyme for treating and preventing oxidative stress and/or inflammatory related diseases and method for screening the same |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Biochem. Biophys. Res. Com. Vol. 371, pp. 525-530 (2008) * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20130026703A (en) | 2013-03-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zhang et al. | Mitochondrial peptide BRAWNIN is essential for vertebrate respiratory complex III assembly | |
| Rackham et al. | Hierarchical RNA processing is required for mitochondrial ribosome assembly | |
| Park et al. | MTERF3 is a negative regulator of mammalian mtDNA transcription | |
| Jacobi et al. | Hepatic Bmal1 regulates rhythmic mitochondrial dynamics and promotes metabolic fitness | |
| Li et al. | Serine and SAM responsive complex SESAME regulates histone modification crosstalk by sensing cellular metabolism | |
| Liu et al. | Glyceraldehyde‐3‐phosphate dehydrogenase promotes liver tumorigenesis by modulating phosphoglycerate dehydrogenase | |
| Neely et al. | A global in vivo Drosophila RNAi screen identifies NOT3 as a conserved regulator of heart function | |
| Phillips et al. | MUT-16 promotes formation of perinuclear mutator foci required for RNA silencing in the C. elegans germline | |
| Cámara et al. | MTERF4 regulates translation by targeting the methyltransferase NSUN4 to the mammalian mitochondrial ribosome | |
| Sterky et al. | LRPPRC is a mitochondrial matrix protein that is conserved in metazoans | |
| Clayton et al. | Inflammation causes remodeling of mitochondrial cytochrome c oxidase mediated by the bifunctional gene C15orf48 | |
| Schwarz et al. | Knockdown of Indy/CeNac2 extends Caenorhabditis elegans life span by inducing AMPK/aak-2 | |
| Ferreira et al. | Stress signaling and cellular proliferation reverse the effects of mitochondrial mistranslation | |
| Sun et al. | Hepatic DNAJB9 drives anabolic biasing to reduce steatosis and obesity | |
| Fang et al. | A membrane arm of mitochondrial complex I sufficient to promote respirasome formation | |
| Wang et al. | Kynureninase contributes to the pathogenesis of psoriasis through pro‐inflammatory effect | |
| Li et al. | Integrated application of multiomics strategies provides insights into the environmental hypoxia response in pelteobagrus vachelli muscle | |
| Navarro-Gonzalez et al. | Mutations in the Caenorhabditis elegans orthologs of human genes required for mitochondrial tRNA modification cause similar electron transport chain defects but different nuclear responses | |
| Endicott et al. | Lysosomal targetomics of ghr KO mice shows chaperone-mediated autophagy degrades nucleocytosolic acetyl-coA enzymes | |
| Bakhshalizadeh et al. | Deficiency of the mitochondrial ribosomal subunit, MRPL50, causes autosomal recessive syndromic premature ovarian insufficiency | |
| Li et al. | RNA Pol II preferentially regulates ribosomal protein expression by trapping disassociated subunits | |
| US9422561B2 (en) | Treatment of disease by modulation of SIRT6 | |
| Yeh et al. | Restoration of PITPNA in Type 2 diabetic human islets reverses pancreatic beta-cell dysfunction | |
| JP2022531466A (en) | Treatment and detection of hereditary neuropathy and related disorders | |
| Wang et al. | Cytosolic adaptation to mitochondria-induced proteostatic stress causes progressive muscle wasting |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20160928 Year of fee payment: 4 |