KR101329127B1

KR101329127B1 - 올리고뉴클레오타이드 결합 항체를 이용한 당단백질 검증방법

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Publication number: KR101329127B1
Application number: KR1020110064207A
Authority: KR
Inventors: 김용삼; 고정헌; 유향숙; 조창희; 유종신
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2011-06-30
Filing date: 2011-06-30
Publication date: 2013-11-14
Also published as: KR20130003127A

Abstract

본 발명은 당단백질 검증방법에 관한 것으로서, 좀더 자세히는 암의 발생 및 진행과정 중 당질변이를 보이는 후보마커로서 당단백질들을 검증하기 위해 당단백질에 대한 항체의 N-형 당쇄에 DNA를 표지한 후 항원-항체 반응에 의해 당질변이 후보와 결합한 DNA-항체 복합체를 전사반응의 주형으로 이용하여 얻어지는 전사체를 분석함으로써 후보마커 당단백질의 당질 변이를 민감하게 추적하는 방법에 관한 것이다.

Description

올리고뉴클레오타이드 결합 항체를 이용한 당단백질 검증방법 {A glycoprotein validation method based on oligonucleotide-tagged antibodies}

본 발명은 당단백질 검증방법에 관한 것으로서, 좀더 자세히는 암의 발생 및 진행과정 중 당질변이를 보이는 후보마커로서 당단백질들을 검증하기 위해 당단백질에 대한 항체의 N-형 당쇄에 DNA를 표지한 후 항원-항체 반응에 의해 당질변이 후보와 결합한 DNA-항체를 전사반응의 주형으로 이용하여 얻어지는 전사체를 분석함으로써 후보마커 당단백질의 당질 변이를 민감하게 추적하는 방법에 관한 것이다.

미국 FDA는 진단 목적을 위하여 암과 관련된 마커로서 여러 개의 항원을 승인하였다. 이중에서는 전립선암의 전립선-특이적 항원 (Prostate-specific antigen; PSA), 대장암의 암태아성 항원 (carcinoembryogenic antigen; CEA), 고환암 및 간암 진단을 위한 알파-태아단백질 (alpha-fetoprotein; AFP) 등이 있으며 이외에도 CA125, CA19-9, BTA, BNP 등의 단백질 바이오마커들이 임상적으로 이용되고 있으나, 단백체 연구를 통하여 발굴된 단백질 바이오마커 중에서 FDA 승인을 받고 임상에 도입된 바이오마커는 거의 없다.

많은 연구결과들은 암이 발생하고 진행하는 과정에서 특정 당단백질의 양적 증가와 함께 발현후수식 (Post Translational Modification)의 일환으로 단백질에 결합되어 있는 당질의 변화가 발생함을 보고하고 있다. 또한, 여러 연구팀에서 이와 같은 당질 변이가 어떻게 암의 발생과 진행을 유도하는지에 대한 분자기작 연구가 진행되고 있다. 이러한 연구결과에 비추어 당질 변이를 보이는 당단백질 중 종양 특이성을 보이는 단백질을 찾아 종양 바이오마커로 활용하려는 연구들도 진행 중이다.

그러나, 단백질의 당질변화를 민감하게 분석하는 데는 많은 장애가 있다. 질량분석기를 이용한 분석의 경우, 당질의 비통일성 (heterogeneity)과 특정 당단백질을 순수 정제해야 하는 난제로 인해 이용에 큰 제약이 따른다. 순수 정제의 어려움을 극복하기 위하여 당단백질에 대한 항체를 이용할 경우, 항체 자체가 당단백질이므로 당단백질에 부착된 항체의 당질구조에 의해 간섭을 받아 분석하고자 하는 당단백질의 당질변화를 특이적으로 추적하기 어렵다.

따라서, 종양 진단을 위한 마커로서 당단백질의 당질 변이를 정확하게 분석하기 위해서는 당단백질 항체의 당질구조에 의한 간섭 문제 등을 해결해야 한다.

그러므로, 본 발명의 목적은 상기 문제점들을 극복하고 당질의 변이를 보이는 당단백질의 당질과 변이를 민감하게 검증하는 방법을 제공하려는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 다수의 당단백질의 당질변이를 동시에 추적하는 방법을 제공하여 암 바이오마커 개발의 검증과정에 활용하려는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 발굴된 당질변이 기반 암 바이오마커를 활용한 암진단 키트에서 이용되는 더욱 민감한 당단백질 검출방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 구성은 질병 특히 암 발생과 진행에 관련된 후보마커로서 당단백질을 인식하는 항체의 당쇄에 합성된 DNA를 결합시킨 후, DNA가 부착된 항 당단백질 항체를 시료와 반응시키고, 렉틴 친화 크로마토그래피로 당단백질과 반응하는 항체를 분리한 다음, 항체에 결합된 DNA를 주형으로 하여 전사반응을 진행시키고, 얻어진 전사체 (transcript)를 정량함으로써 당단백질의 당질변이를 추적하는 것이다.

즉, DNA가 부착 (결합)된 항체 (DNA-항체 복합체)는 시료 내에 존재하는 후보마커 당단백질과 결합하게 되고, 이 후보마커 당단백질의 당질변이를 인식하는 렉틴 컬럼크로마토그래피를 거쳐 당질변이를 보이는 후보마커 당단백질만을 선별한 후 항체에 결합되어 있는 DNA를 주형으로 하고 T7-폴리머레이즈 등의 효소를 사용하여 전사체를 만들어 내게 된다. 이때 폴리머레이즈 효소 반응에 형광인자가 표지된 UTP 등을 기질에 포함시킴으로써 형광을 띤 전사체를 얻게 된다. 이 형광 전사체는 특정 서열을 갖도록 디자인된 DNA로부터 얻어진 산물이며, 이 형광 전사체를 인식할 수 있는 뉴클레오타이드를 결합시킨 DNA 칩에서 반응시켜 특정 부위에서 얻어지는 신호를 검출할 수 있게 된다. 즉 DNA 칩 상에서 얻어진 형광강도는 시료 내에 존재하는 당질변이 후보마커 당단백질의 양과 비례관계를 보이게 된다. 결론적으로 DNA 칩 상에서 얻어지는 형광강도를 통해 시료 내의 당질변이 마커 당단백질을 정량함으로써 발굴단계에서 얻어진 후보마커 당단백질의 당질변이를 민감하게 검출할 수 있게 된다.

본 발명은

a) 당단백질에 대한 항체의 N-형 당쇄를 산화시키는 단계;

b) 산화된 항체에 서열이 알려진 DNA를 공유결합시키는 단계;

c) 결합된 DNA-항체 복합체를 정제하는 단계;

d) 정제된 DNA-항체 복합체와 당단백질을 포함하는 생체시료를 반응시키는 단계;

e) 반응된 DNA-항체-당단백질 복합체를 분석물질로 하여 렉틴 친화 크로마토그래피를 수행하는 단계;

f) 렉틴에 결합된 DNA-항체-당단백질 복합체로부터 전사체 (transcript)를 생산하는 단계;

g) 생산된 전사체를 정성, 정량 분석하는 단계;를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 결합 항체를 이용한 당단백질 검증방법을 제공한다.

본 발명은 상기 a)단계에서 항체의 당쇄를 NaIO₄로 산화시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 상기 b) 단계에서 상기 DNA가 5' 말단을 히드라진 그룹으로 공유결합시킨 DNA임을 특징으로 한다.

본 발명은 상기 b) 단계에서 상기 DNA가 T7-프로모터를 포함하는 DNA와 전사체를 코딩하는 DNA, 그리고 상기 두 DNA에 상보적인 서열을 갖는 DNA를 혼성화시켜 얻어진 이중나선 DNA임을 특징으로 한다.

본 발명은 상기 b) 단계 이후 C) 단계 이전 NaBH₄를 이용하여 DNA-항체 결합을 안정화시키는 과정을 부가하는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 상기 c) 단계에서 렉틴에 반응하는 항체를 제거하기 위하여 렉틴 친화 크로마토그래피를 수행하는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 상기 c) 단계에서 특정 렉틴에 반응하는 항체를 제거하기 위한 렉틴 친화 크로마토그래피의 렉틴은 L₄-PHA (Phytohemagglutinin-L₄), LCA (lens culinaris agglutinin), DSA (Datura stramonium agglutinin), AAL (Aleuria aurantia agglutinin), 셀렉틴 (Selectin), Con A (Concanavalin-A), WGA (Wheat germ agglutinin), 자칼린 (Jacalin), SNA (Sambucus Nigra agglutinin) 및 갈렉틴 (galectin) 중 하나 이상임을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 e) 단계에서 렉틴 친화 크로마토그래피는 L₄-PHA (Phytohemagglutinin-L₄), LCA (lens culinaris agglutinin), DSA (Datura stramonium agglutinin), AAL (Aleuria aurantia agglutinin), 셀렉틴 (Selectin), Con A (Concanavalin-A), WGA (Wheat germ agglutinin), 자칼린 (Jacalin), SNA (Sambucus Nigra agglutinin) 및 갈렉틴 (galectin) 중 하나 이상의 렉틴을 이용하여 DNA-항체-항원 복합체를 포집하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 f) 단계에서 렉틴과 결합한 당단백질의 용출이 용이한 경우, 당단백질을 용출시키고, 용출된 당단백질 분획을 이용하여 전사체를 생산함을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 f) 단계에서 렉틴과 결합한 당단백질의 용출이 용이하지 않은 경우에는 DNA-항체-항원-렉틴이 결합된 비드 복합체를 그대로 이용하여 전사체를 생산함을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 f) 단계에서 형광 표지된 기질을 사용하여 형광을 띠는 전사체를 생산함을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 g) 단계에서 전사체의 정량, 정성 분석이 DNA칩 상에서 진행되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 g) 단계에서 유리 슬라이드에 전사체와 상보적인 서열을 갖는 DNA를 결합시켜 전사체와의 혼성화를 통해 전사체를 정량하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 g) 단계에서 유리 슬라이드를 알데히드로 표면처리하여 DNA를 결합시키는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 생체시료로서 정상 대조군 시료와 환자 분석군 시료를 이용하여 시료 내에 존재하는 당단백질의 당질구조 변이를 분석하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 다수의 항체에 각각 서로 다른 서열을 갖는 DNA를 결합시켜 다수의 당단백질을 동시에 분석하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 DNA-항체 복합체를 포함하는 암 진단 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 항 당단백질 항체의 산화된 N-형 당쇄에 서열이 알려진 DNA가 공유결합된, 당단백질 정량 및/또는 정성 분석용 DNA-항 당단백질 항체 복합체를 제공한다.

또한, 본 발명은

N-형 당쇄를 산화시킨 항 당단백질 항체에 서열이 알려진 코딩 DNA를 공유결합시킨 1종 이상의 DNA-항 당단백질 항체 복합체;

지지체에 결합된 렉틴;

DNA 전사체를 제조하기 위한 RNA 폴리머레이즈;

상기 RNA 폴리머레이즈의 기질; 및

코딩 DNA 서열을 포함하는 DNA칩;을 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.

상기 암은 대장암, 위암, 폐암, 간암, 자궁암, 유방암, 췌장암을 포함하는 고형암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 RNA 폴리머레이즈의 기질은 발색 또는 발광 기질을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 렉틴은 L₄-PHA(Phytohemagglutinin-L₄), LCA(lens culinaris agglutinin), DSA(Datura stramonium agglutinin), AAL(Aleuria aurantia agglutinin), rhE-셀렉틴, 콘카나발린 A(Concanavalin-A, Con-A), WGA(Wheat germ agglutinin), 자칼린(Jacalin), SNA(Sambucus Nigra) 및 갈렉틴(galectin) 중 선택된 것임을 특징으로 한다.

본 발명은 렉틴 블랏이나 ELISA, 질량분석기에 기반한 종래의 당단백질 분석방법보다 훨씬 민감하고 빠른 당질변이 추적 방법을 제공한다.

본 발명은 항체의 당쇄를 산화시키고 DNA를 공유결합시킴으로써 항체가 가지는 당쇄에 의해 나타나는 간섭 현상을 저해하여 분석 오류를 최소화한 당질변이 추적 방법을 제공한다.

본 발명은 다수 개의 DNA-항체를 이용하여 다수의 당단백질의 당질변화를 동시에 추적하는 고도처리 (high-throughput) 방식을 구현한다.

도 1은 본 발명의 전 과정을 나타내주는 도면이다. 우선 위 패널에서 항체의 당쇄를 산화시켜 DNA를 결합시킨 DNA-항체 복합체 제작과정을 보여주고 있고, 가운데 패널에서는 5' 말단에 히드라진 그룹을 결합시킨 T7-프로모터 DNA와 코딩 DNA, 그리고 5' 말단에 바이오틴을 결합시킨 상보적 DNA를 보여주고 있다. 아래 패널에서는 생체시료에 DNA-항체 복합체를 넣고 특정 당단백질을 결합시킨 후 렉틴 크로마토그래피를 수행하여 얻어지는 DNA-항체-항원 복합체를 이용하여 T7-전사반응을 통해 전사체를 생산하고 이를 DNA칩에서 분석하는 일련의 과정이 묘사되어 있다.
도 2는 실시예 1에서 AFP의 항체를 산화시킨 후 바이오틴 또는 항체를 결합시키고 결합여부를 아비딘-HRP를 이용한 웨스턴블랏으로 확인한 결과이다.
도 3a는 실시예 2에서 기술한 DNA-항체 복합체가 콘카나발린 A (Concanavalin A)가 인식할 수 없는 구조로 당쇄의 변형이 일어난 것을 나타내는 도면이다.
도 3b는 AFP를 결합시킨 DNA-항체-항원 복합체의 경우, 복합체 내에 존재하는 항원인 AFP에 의해 콘카나발린 A에 의해 결합되고 이를 정제에 이용할 수 있음을 보여주는 도면이다.
도 4는 실시예 3에서 얻어진 산물이 RNA 전사체임을 나타내주는 도면이다. 여기에서 "DNA-Ab"는 항원이 결합된 상태의 DNA-항체-항원 복합체를 의미한다.
도 5는 실시예 4에서 사용된 DNA칩과 얻어진 RNA 전사체를 DNA칩에 반응시켰을 때 Seq1 부분의 DNA에만 선택적으로 혼성화함을 보여주는 도면이다.
도 6은 두 사례의 간암환자 혈청을 웨스턴블랏, DNA-항체 검증기법을 이용하여 분석한 결과를 나타내주는 도면이다. 왼쪽 패널이 본 발명의 방법을 이용한 분석 결과이고, 오른쪽 패널이 웨스턴 블랏 분석 결과이다. 본 발명의 방법은 웨스턴블랏보다 높은 민감도와 특이성으로 AFP를 검출할 수 있음을 보여주고 있다.

암의 발생과 진행과정에서 생체분자들의 양적, 질적 변화가 수반된다. 그 중 대표적인 질적 변화가 당단백질의 당질변이 (aberrant glycosylation)로 N-형이나 O-형 당단백질의 구성요소에 부가적인 당이 결합하거나 반대로 당질의 감소를 통해 다양한 당단백질의 변화가 나타난다 (Torben et al., Electrophoresis 20, 362-371, 2000).

지금까지 당단백질의 당질변이가 어떻게 암의 발생 및 진행을 유도하는지에 대한 많은 연구들이 수행되었다. 대표적인 예가 당전이효소인 N-아세틸글루코사민 전이효소 V (N-acetylglucosaminyltransferase V; GnT-V)에 의한 당질변이로, N-형 당단백질의 코아 만노스에 N-아세틸글루코사민 (GlcNAc)이 부가되어 만노스-β1,6-GlcNAc 가지가 형성된다. 형성된 가지는 매트립테이즈 (matriptase)의 안정화를 통해 암의 전이에 관여하기도 하며 (Ihara et al., J. Biol. Chem. 277, 16960-16967, 2002), TIMP-1 (tissue inhibitor of metalloproteinase-1)의 젤라티네이즈 (gelatinase) 저해능력을 떨어뜨려 암의 침윤 및 전이 능력을 향상시키기도 한다 (Kim et al., Mol. Cell. Proteome. 7, 1-14, 2008). 또 잘 알려진 다른 예는 시알릴 루이스 (sialyl Lewis) 구조이다. 이 구조는 주로 N-형이나 O-형 당단백질의 당쇄말단에 형성되며, 글루코사민, 퓨코스, 갈락토스, 시알산으로 이루어진다. 이 시알릴 루이스 구조는 혈관에 놓인 암이 전이를 이루는 과정에서 혈관벽에서 발현되는 E-셀렉틴 (selectin)의 타겟이 되어 암의 진행에 관여한다 (Takada et al., Cancer Res. 53, 354-361, 1993). 실제 암세포의 표면에서 E-셀렉틴의 리간드가 되는 시알릴 루이스 구조의 발현이 유방암에서 림프절 전이와 관련이 있다는 최근의 보고 (Wei et al., Int. J. Surg. Pathol. 18, 193-200, 2010)를 비롯하여 다수의 암에서 E-셀렉틴과 암의 관련성이 보고되고 있다. 이 외에도 다양한 당질변이가 암에서 관찰된다는 보고가 있어 특정 당단백질의 당질 변화를 추적함으로써 암의 예측, 진단을 가능케 하는 바이오마커의 개발 가능성이 제시되고 있다.

대표적인 사례를 알파태아단백질 (alpha-fetoprotein; AFP)에서 찾아볼 수 있다. AFP는 태아에서 높은 발현을 보이나 성인이 되는 과정에서 발현이 정지되어 정상의 성인에서는 통상 발견되지 않는다. 그런데 간암환자에서 그 양이 높게 발현되어 혈액 중에서 AFP가 20 ㎍/㎖ 이상으로 검출될 경우, 간암의 존재를 예측하는 인자로 사용될 수 있음이 검증되어 현재 FDA의 승인을 받은 간암 바이오마커로 활용되고 있다. 하지만, 문제는 AFP를 통한 간암의 예측에 한계가 있다는 점이다. 암 환자를 정확하게 예측할 수 있는 지표인 민감도 (sensitivity)가 50% 수준이며 특히, 비 간암환자와 간암환자를 구분할 수 있는 특이성 (specificity)도 60% 내외여서 사회경제학적 비용을 높인다는 한계를 갖고 있었다. 그런데 당단백질인 AFP의 N-형 당쇄에 퓨코스 (fucose)가 결합된 형태인 AFP-L3는 간암 예측에서 AFP보다 높은 특이성을 나타내며, 작은 간암조직도 예측할 수 있는 높은 민감도를 보인다는 점에서 AFP보다 우수한 간암 바이오마커로 인식되어 (Hirai et al., J. Chromatogr. 604, 91-94, 1992; Zhou et al., World J. Gastroenterol. 12, 1175-1182, 2006) 또 다른 간암 바이오마커로 승인을 받게 되었다. AFP 외에도 현재 FDA의 승인을 받은 대부분의 암 바이오마커는 당단백질이며, CA125나 CA19-9과 같이 당단백질의 당질변화나 당질변화 그 자체가 암 바이오마커로 활용되는 예가 다수 존재한다 (Ludwig et al., Nat. Rev. Cancer 5, 845-856, 2005).

암의 효과적인 치료는 얼마나 빠른 시기에 암을 진단하였느냐에 절대적으로 의존하기 때문에 암의 조기진단과 모니터링을 가능케 하는 암 바이오마커의 필요성과 진단시장 규모는 매우 크다고 할 수 있다. 하지만 특정 생체물질이 바이오마커로 활용되기 위해서는 일정한 개발단계를 거쳐 바이오마커로서 가져야 할 요건들이 입증되어야 한다. 바이오마커 개발과정은 대략 두 가지 단계를 포함하는데, 이는 비교적 소수의 시료수로부터 질병과의 연관성을 보이는 후보군을 도출해내는 발굴단계 (discovery phase)와 후보군들을 검증해서 높은 민감도 (sensitivity)와 특이도 (specificity)를 보이는, 임상적으로 또한 경제적으로 유용한 바이오마커를 선별하는 검증단계 (validation phase)로 구분할 수 있다 (Rifai et al., Nat. Biotech. 24, 971-983, 2006). 이 중 검증단계는 많은 수의 후보마커들 중 선별작업 (qualification, verification)을 거쳐 통과된 유망후보마커들을 다수의 임상시료를 통해 검증해내는 작업으로서, 많은 시간과 임상시료를 요할 뿐만 아니라, 정확하게 후보마커를 검증해 낼 수 있는 민감하고 정밀한 검증기법을 필요로 한다. 하지만 아직까지 변이당질을 민감하고 정확하게, 그리고 다수의 시료에서 동시에 추적해 낼 수 있는 검증기법은 없는 상황이다.

최근 고체상 지지체 (solid support)에 다양한 종류의 렉틴을 부착하여 당단백질의 변화를 관찰하는 렉틴 에레이 (lectin array) 기술들이 개발되어 있다. 하지만 이 기술은 수 차례의 세척과정에서 렉틴-당질 결합의 손실을 가져와 많은 정보의 손실이 생기며, 기계적 민감도가 매우 낮다는 단점과 함께, 당질의 변화를 보이는 당단백질의 정체 (identity)를 알 수 없다는 결정적 단점이 작용한다.

또한, 렉틴과 당의 비교적 약한 결합력을 극복하기 위해 항체를 추가적으로 이용하여 ELISA 방법을 응용한 렉틴-ELISA 방법이 시도되고 있다. 이 경우 당단백질을 포획하는데 사용되는 항체 자체가 당단백질이어서 항체의 당질구조가 분석물질인 당단백질의 당질변화를 추적하는 과정을 간섭하게 된다. 이를 극복하기 위해 항체의 Fc 부분을 파파인으로 절단한 Fab만을 사용하거나, 당쇄에 다른 화학그룹을 결합시키는 시도들이 시행되고 있으나, 변형된 항체의 안정성과 특이성의 변화 등이 문제로 발생하고 있으며 Fc의 당질이 파파인의 작용을 저해하여 절단이 완전히 이루어지지 않았다는 보고도 있다 (Raju et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 341, 797-803, 2006). 질량분석기를 통한 당질 분석방법은 가장 직접적인 당질구조의 정보를 제공한다는 면에서는 장점을 가지고 있으나, 초정밀고속처리 (High- throughput)가 불가능하고 항체를 기반으로 하는 방법보다 민감도가 훨씬 떨어진다는 단점이 있다. 이와 같은 상황에서 당질변이 기반 암 바이오마커의 개발을 위해서는 민감하고 빠르게, 그리고 다수의 당단백질의 당질변화를 추적, 검증할 수 있는 기술은 필수적이라고 할 수 있다.

이에 본 발명자들은 항체의 당질에 DNA를 표지한 DNA-항체 복합체를 이용하여 특정 당단백질의 당질변화를 효율적으로 추적, 검증하는 방법을 제공한다. 전체적인 개념 모식도는 도 1에 묘사되어 있다. 이 당질변화 검증기술은 크게 두 단계로 구분된다.

첫 번째 단계에서는 항체에 올리고뉴클레오타이드를 결합하여 DNA-항체를 만드는 단계이다. 항체의 당쇄를 산화, 개방화시켜 알데히드의 결합반응기를 생성하고 5' 말단을 히드라진으로 수식화한 올리고뉴클레오타이드와의 결합 반응을 통해 항체의 당쇄 부분과 DNA간 공유결합을 형성시키며, 이 결합의 안정화를 위해 최종적으로 NaBH₄로 환원하는 과정을 거치게 된다. 분석하고자 하는 각 당단백질의 항체에 서로 다른 서열의 올리고뉴클레오타이드를 결합시켜 DNA-항체 복합체 조합을 만들 수 있으며, 각 복합체를 합쳐 DNA-항체 칵테일을 제조한다. 즉, DNA-항체 칵테일에는 다양한 당단백질에 대한 항체가 서열이 알려진 각 DNA와 결합된 DNA-항체 복합체들이 포함되어 있다.

두 번째 단계에서는 만들어진 DNA-항체 복합체를 이용하여 생체시료 내에 존재하는 항원을 포획하고 포획된 항원의 당질을 이용하여 렉틴 친화 컬럼에서 이 항원을 포획한다. 이때 항원에 같이 결합되어 있는 DNA-항체를 주형으로 전사반응을 진행시키게 된다. 이때 형광이 표지된 UTP를 기질로 사용함으로써 생성되는 전사체가 형광을 띠도록 한다. 생성된 전사체는 그 서열과 상보적으로 염기쌍을 이룰 수 있는 서열을 가진 DNA칩에 가함으로써 전사체의 양을 분석하게 된다. 이 때 DNA칩에는 다양한 서열의 DNA가 결합되어 있으며, 특정 서열은 특정 DNA-항체를 나타내므로, 결국 분석하고자 하는 당단백질을 표현한다. 결과적으로, 본 발명의 방법은 특정 항원의 당질과 당질변화를 형광 전사체의 생산과 맞물리게 함으로써 당질변화의 추적 민감도를 향상시키는 것을 그 특징으로 한다. 또한, 본 발명에서 DNA-항체 칵테일을 사용하면 다수 당단백질의 당질과 당질변화를 동시에 탐색할 수 있는 초정밀고속처리가 가능해진다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.

<실시예 1> DNA를 결합시킨 DNA-항체 복합체 생산

알파태아단백질 (AFP)의 항체에 결합되어 있는 당쇄를 산화시키기 위해 10 ㎍의 IgG 2a형 AFP 항체를 50 mM NaIO₄를 포함하는 PBS 완충액에서 산화시켰다. 반응은 빛을 차단한 암조건, 상온에서 10분간 이루어졌다. 제염컬럼으로 산화제 및 염을 제거한 후 0.2 nmole의 올리고뉴클레오타이드를 결합시켰다. 결합될 올리고뉴클레오타이드는 5' 말단에 히드라진이 결합된 30 bp의 T7-프로모터 DNA, 40bp의 코딩 DNA, 5' 말단에 바이오틴을 표지한 상보적 서열의 70bp DNA를 어닐링 (annealing)하여 얻어졌으며, 올리고뉴클레오타이드에 결합되어 있는 히드라진과 산화 항체의 알데히드기를 결합시켜 DNA-항체 복합체를 형성시켰다 (도 1 참조). 형성된 DNA와 항체 간의 결합을 안정화시켜주기 위해 13 mM의 NaBH₄로 1분간 환원시켜주었다. 반응이 끝난 후 제염컬럼을 이용하여 제염하였다. 또한, 올리고뉴클레오타이드 대신 히드라진바이오틴과 산화항체를 반응시켜 결합을 비교하였다. 산화된 항체에 올리고뉴클레오타이드 또는 히드라진바이오틴이 결합되었는지 알아보기 위해 웨스턴블랏을 수행하였다. 아비딘-HRP (HorseRadish Peroxidase)를 처리하여 바이오틴의 결합여부를 통하여 검증하였다. 도 2와 같이, 산화된 항체에서는 볼 수 없었던 바이오틴 결합이 히드라진바이오틴과 올리고뉴클레오타이드가 결합된 항체에서 관찰되었다. 또한, 뉴클레오타이드 결합에 의한 분자량의 증가도 관찰되어, 항체에 올리고뉴클레오타이드가 결합되어 DNA-항체 복합체가 생성되었음을 확인하였다.

<실시예 2> DNA-항체의 당쇄파괴 확인 및 렉틴을 이용한 AFP-DNA-항체 복합체 정제

항체와 렉틴을 사용한 당단백질의 당질구조 및 변화를 예측함에 있어 문제로 작용하는 점은 바로 항체가 1쌍의 당쇄를 보유하는 당단백질이라는 점이다. 이를 극복하기 위해 본 발명 이전에는 Fc 부분을 제거한 Fab 항체만을 사용하거나 당쇄 부분을 변형시킨 항체를 사용하기도 하였다.

상기 DNA가 결합된 항체의 경우 당쇄구조가 파괴되었는지의 여부는 이후 DNA-항체-항원 복합체의 정제에 있어 매우 중요한 의미를 가지므로 DNA-항체 복합체의 당쇄파괴가 이루어졌는지를 확인하였다. DNA-항체 복합체를 분석물질로 하여 렉틴의 일종인 콘카나발린 A 컬럼 상에서 렉틴 친화 크로마토그래피를 수행하였다. 평형화 완충액은 1 mM CaCl₂를 포함하는 PBS 완충액이다. 이동속도를 0.2 ml/min로 고정하고 용출 완충액 (0.4 M methyl-pyranomannoside in PBS, pH 7.2) 하에서 용출하였으며 흘러나온 분획 (flow-through fraction, 도면에서 "F"로 표시함), 세척한 분획 (washing fraction, 도면에서 "W"로 표시함), 용출 분획 (elution fraction, 도면에서 "E"로 표시함)으로 분리하였다. 분획의 일부분을 취하여 전기영동을 실시한 후 아비딘-HRP를 이용하여 웨스턴블랏 분석하였다 (도 3a). 그 결과, 대부분의 항체가 콘카나발린 A 컬럼에 결합되지 않고 흘러나왔다. 이는 DNA-항체 복합체의 당쇄구조가 콘카나발린 A에 의해 인식되지 않는 구조로 변형되었고, 또한 추가적으로 당쇄에 결합한 DNA가 콘카나발린 A의 결합을 방해하는 인자로 작용하는 것으로 해석되었다.

본 발명의 방법을 위해서 또 하나의 필수 확인사항으로서, 당쇄구조가 파괴된 DNA-항체 복합체와 그 항원의 일종인 AFP를 반응시켜 얻어지는 DNA-항체-항원 복합체가 항원에 있는 당쇄에 의해 렉틴의 일종인 콘카나발린 A 컬럼에서 결합되는지의 여부를 조사하였다. 상온에서 같은 mole수의 항원(즉, 이 실시예에서는 AFP)와 DNA-항체 복합체를 PBS 완충용액에 넣고 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후 세척하고, 상기 조건에서 콘카나발린 A 컬럼을 이용한 렉틴 친화 크로마토그래피를 실시하였다. 그 결과 일부 항원 (AFP)과 DNA-항체 복합체가 흘러나온 분획 (flow-through fraction, 도면에서 "F"로 표시함)에서 검출되었으나, 상당수의 AFP와 DNA-항체가 용출 분획 (elution fraction, 도면에서 "E"로 표시함)에서 발견되었다 (도 3b). DNA-항체 복합체 자체만으로는 렉틴에 결합하지 않는 도 3b의 결과로 보아 DNA-항체 복합체에 반응하여 결합된 항원의 당쇄가 렉틴 (즉, 콘카나발린 A)에 부착되었음을 알 수 있었다. 즉, 실시예 2를 통하여 DNA-항체-항원 복합체는 항원에 존재하는 당쇄구조에 의해서만 렉틴과 결합할 수 있음을 확인할 수 있었다.

<실시예 3> DNA-항체-항원 복합체를 주형으로 한 전사체 생산

도 3b에서 용출된 DNA-항체-항원 복합체에 존재하는 DNA를 주형으로 하여 T7 전사반응을 진행하였다. 용출된 DNA-항체-항원 복합체에 전사용 혼합용액 (200 Unit T7 RNA 폴리머레이즈, 전사 완충액, 0.5 mM NTPs)을 넣고 최종 부피를 50 ㎕로 하였다. 반응은 37 ℃에서 6시간 동안 진행시켰다. 실험의 목적에 따라 NTP를 결여하거나 DNase, RNase를 첨가하였다. 그 결과 RNase 저해제가 존재하는 조건에서 RNA 전사체를 확인할 수 있었다 (도 4). NTP를 넣지 않거나 DNA-항체 결합체를 넣지 않고 반응을 진행시킨 결과에서는 RNA 전사체를 확인할 수 없었다. 이 RNA 전사체는 DNase의 영향을 받지 않았으며, RNase 처리시 분해됨도 확인하였다. 이상의 결과로부터 항원과 결합한 채로 용출된 DNA-항체 복합체는 T7 전사반응을 위한 주형으로 사용될 수 있었으며, 반응 후 생성된 산물이 RNA 전사체임도 확인하였다.

<실시예 4> DNA칩 상에서의 서열특이적 분석

실시예 3에서 기술한 전사반응을 실시하는 과정에서 총 부피 50 ㎕의 반응용액에 0.5 mM UTP 대신 0.17 mM 시아닌 (Cyanin) 3-UTP와 0.33 mM UTP 혼합액을 넣고 반응을 진행하여 만들어진 RNA 전사체가 형광을 나타내도록 하였다. RNA 전사체를 분석하기 위해 유리 슬라이드 위에 각기 다른 서열을 가진 6종류의 DNA를 부착시켰다. 이때 DNA의 양은 각각 700 pmol, 140 pmol, 70 pmol이었으며 3반복하여 플레이팅 (plating)하였다 [도 5 위 패널]. 이 DNA칩에 실시예 3과 같이 반응하여 얻은 RNA 전사체를 혼성화시켰다. 혼성화 챔버 (Hybridization chamber)를 열어 5X SSC (1X SSC: 0.15 M NaCl, 0.015 M Na-citrate, pH 7.0)를 3-5방울씩 떨어뜨려 주었다. 20X SSC에 RNA 전사체를 넣고 99 ℃에서 3분간 끓여 주었다. 이를 30초간 흔들어준 후 13,000 rpm에서 30초간 원심분리하였다. 시료 40 ㎕를 취하여 DNA칩 위에 스팟팅하였다. 커버슬립을 덮어 기포를 제거한 후, 챔버 뚜껑을 닫고 밀폐한 후 55 ℃의 항온수조에 넣어 16시간 동안 혼성화 반응을 시켰다. 반응 후 DNA칩을 챔버에서 분리한 후 세척용액으로 세척하였다. 이때 세척은 2X SSC, 0.1% SDS 용액으로 2회, 0.1X SSC, 0.1% SDS 용액으로 1회, 그리고 0.1X SSC 용액으로 1회 세척하였다. DNA칩을 건조시킨 후 스캐너로 분석하였다. 도 5의 아래 패널의 결과와 같이, 얻어진 RNA 전사체는 6종류의 서열 중 한 서열 (Seq1)의 DNA와만 혼성화함을 알 수 있었으며, 반응 강도는 슬라이드에 결합시킨 DNA의 양에 의존적이었다. 이 결과로 보아 본 발명의 방법을 이용하면 분석하고자 하는 당단백질의 당질변이를 정량적으로, 특이적으로 분석해 낼 수 있음을 알 수 있다.

<실시예 5> 당질변이 검증기법을 이용한 간암환자 혈청 내의 AFP 분석

임의로 순번된 환자 중 AFP 발현이 높은 두 환자의 혈청 내에 존재하는 AFP를 본 발명의 검증방법과 웨스턴블랏을 이용하여 분석하였다. DNA-항체 결합체를 이용한 검증방법을 이용하여 AFP를 분석하기 위해 두 환자의 혈청 각 20 ㎕를 항체기준 30 ㎍의 DNA-AFP 항체 복합체와 섞어주고 940 ㎕의 RPMI1640 배지를 섞어주어 4 ℃에서 밤새 반응시켰다. 반응액 중 25 ㎕를 취하여 T7 전사반응을 진행하였다. 얻어진 산물을 DNA칩에 혼성화시켜 콘카나발린 A에 결합하는 AFP의 양을 결정하였다. 즉, DNA칩 상에서 구현된 결과는 환자시료 0.5 ㎕에서 구현된 결과치이다. 한편 20 ㎕의 혈액내에 존재하는 AFP의 양을 웨스턴블랏을 이용하여 조사하였다. 결과에서와 같이 AFP의 발현을 확인할 수 있었다. 62번 환자 (도면에 HCC 62로 표시됨)의 경우 그 발현양이 웨스턴 블랏의 임계치 수준에 있음을 알 수 있다. 하지만 DNA-항체 결합체를 이용한 검증방법의 경우는 시료 양이 웨스턴블랏에 사용된 시료의 2.5%에 불과하나, 웨스턴블랏 결과보다 선명한 결과치를 보여주는 것으로 보아 민감하게 AFP를 정량해 냄을 알 수 있었다. 또한, 본 발명 방법에 의한 결과는 웨스턴 블랏의 결과와 마찬가지로 형광강도와 AFP의 양이 비례함도 알 수 있었다. 이 결과를 통해 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 결합 항체를 이용한 검증방법을 이용하여 체액 내에 존재하는 당단백질을 민감하게 분석할 수 있으며, 콘카나발린 A 외에 다양한 렉틴을 사용하여 당단백질의 당질변이를 추적하는데 응용할 수 있음을 알 수 있다. 또한 본 실시예에서는 당단백질로서 AFP를 예로 들어 설명하였으나, 서로 다른 서열을 가진 DNA를 결합시킨 다양한 항 당단백질 항체를 사용하여 여러 종류의 당단백질 및 당질변화를 동시에 추적할 수 있다.

Claims

a) 당단백질 특이적 항체의 N-형 당쇄를 산화시키는 단계;
b) 산화된 당단백질 특이적 항체에 프로모터를 포함하여 서열이 알려진 이중가닥 DNA를 공유결합시켜 DNA-결합 당단백질 특이적 항체를 생성하는 단계;
c) b) 단계에서 생성된 DNA-결합 당단백질 특이적 항체를 정제하는 단계;
d) 정제된 DNA-결합 당단백질 특이적 항체와 생체시료를 반응시키는 단계;
e) 반응된 생체시료를 분석물질로 하여 렉틴 친화 크로마토그래피를 수행하는 단계;
f) 렉틴에 결합된 DNA-결합 당단백질 특이적 항체로부터 전사체 (transcript)를 생산하는 단계; 및
g) 생산된 전사체를 DNA칩에서 정성, 정량 분석하는 단계;를 포함하는 DNA-결합 당단백질 특이적 항체를 이용한 당단백질 검증방법.
제1항에 있어서,
a) 단계에서 항체의 당쇄를 NaIO₄로 산화시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
b) 단계에서 상기 DNA는 5' 말단을 히드라진 그룹으로 공유결합시킨 DNA임을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
b) 단계에서 상기 DNA는 T7-프로모터를 포함하는 DNA와 전사체를 코딩하는 DNA, 그리고 이 두 DNA에 상보적인 서열을 갖는 DNA를 혼성화시켜 얻어진 이중나선 DNA임을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
b) 단계 이후 c) 단계 이전 NaBH₄를 이용하여 DNA와 당단백질 특이적 항체간 결합을 안정화시키는 과정을 부가하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
e) 단계에서 렉틴 친화 크로마토그래피는 L₄-PHA (Phytohemagglutinin-L₄), LCA (lens culinaris agglutinin), DSA (Datura stramonium agglutinin), AAL (Aleuria aurantia agglutinin), 셀렉틴 (Selectin), Con A (Concanavalin-A), WGA (Wheat germ agglutinin), 자칼린 (Jacalin), SNA (Sambucus Nigra agglutinin) 및 갈렉틴 (galectin) 중 하나 이상의 렉틴을 이용하여 DNA-결합 당단백질 특이적 항체-항원 결합체를 포집하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
f) 단계에서 용출방법이 존재하는 렉틴 친화 크로마토그래피의 경우 용출 분획을 이용하여 전사체를 생산함을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
f) 단계에서 용출방법이 존재하지 않는 렉틴 친화 크로마토그래피의 경우는 렉틴 결합된 비드-DNA-결합 당단백질 특이적 항체-항원 결합체를 그대로 이용하여 전사체를 생산함을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
f) 단계에서 형광 표지된 기질을 사용하여 형광을 띠는 전사체를 생산함을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
g) 단계에서 유리 슬라이드에 전사체와 상보적인 서열을 갖는 DNA를 결합시켜 전사체와의 혼성화를 통해 전사체를 정량하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
g) 단계에서 유리 슬라이드를 알데히드로 표면처리하여 DNA를 결합시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 생체시료는 정상 대조군 시료와 환자 분석군 시료로 하여 시료 내에 존재하는 당단백질의 당질구조 변이를 분석하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
다수의 당단백질 특이적 항체에 각각 서로 다른 서열을 갖는 DNA를 결합시켜 다수의 당단백질을 동시에 분석하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
c) 단계에서 렉틴에 결합 반응하는 항체를 제거하기 위하여 렉틴 친화 크로마토그래피를 수행함을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서,
상기 렉틴은 L₄-PHA (Phytohemagglutinin-L₄), LCA (lens culinaris agglutinin), DSA (Datura stramonium agglutinin), AAL (Aleuria aurantia agglutinin), 셀렉틴 (Selectin), Con A (Concanavalin-A), WGA (Wheat germ agglutinin), 자칼린 (Jacalin), SNA (Sambucus Nigra agglutinin) 및 갈렉틴 (galectin) 중 하나 이상의 렉틴임을 특징으로 하는 방법.
당단백질 특이적 항체의 산화된 N-형 당쇄에 프로모터를 포함하여 서열이 알려진 이중가닥 DNA가 공유결합된, 당단백질 정량·정성 분석용 DNA-결합 당단백질 특이적 항체.
당단백질인 알파-태아단백질 (alpha-fetoprotein) 특이적 항체의 산화된 N-형 당쇄에 프로모터를 포함하여 서열이 알려진 이중가닥 DNA가 공유결합된, DNA-결합 알파-태아단백질 특이적 항체 1종 이상;
지지체에 결합된 렉틴;
상기 DNA-결합 알파-태아단백질 특이적 항체의 DNA로부터 전사체를 제조하기 위한 RNA 폴리머레이즈;
상기 RNA 폴리머레이즈의 기질; 및
상기 전사체를 인식할 수 있는 서열을 포함하는 핵산 칩;을 포함하는 간암 진단용 키트.
삭제
제17항에 있어서,
상기 기질은 발색 또는 발광 기질을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 간암 진단용 키트.
제17항에 있어서,
상기 렉틴은 L₄-PHA(Phytohemagglutinin-L₄), LCA(lens culinaris agglutinin), DSA(Datura stramonium agglutinin), AAL(Aleuria aurantia agglutinin), rhE-셀렉틴, 콘카나발린 A(Concanavalin-A, Con-A), WGA(Wheat germ agglutinin), 자칼린(Jacalin), SNA(Sambucus Nigra) 및 갈렉틴(galectin) 중 선택된 것임을 특징으로 하는 간암 진단용 키트.