KR101326685B1 - Method for preparing ortho-dihydroxyisoflavones using a biotransformation system - Google Patents
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Abstract
본 발명은 생변환 시스템을 이용한 오르토-디하이드록시이소플라본의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 항산화 기능이 우수하고 미백 효과를 가지는 오르토-디하이드록시이소플라본을 효율적으로 제조하기 위하여 다이드제인과 제니스테인을 방선균 유래의 미생물, 특히 스트렙토마이세스 에버미틸리스, 노카르디아 파르키니카( Nocardia farcinica ) 또는 스트렙토마이세스 린콜네시스(Streptomyces lincolnesis)로 생변환시키는 오르토-디하이드록시이소플라본의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for preparing ortho-dihydroxyisoflavones using a bioconversion system, and more particularly, to efficiently prepare ortho-dihydroxyisoflavones having an antioxidant function and a whitening effect. Jane and Genistein can be used for microorganisms derived from actinomycetes, especially Streptomyces Ever US Antilles, no-carboxylic Dia key Danica Pardo (Nocardia relates to a process for preparing a dihydroxy isoflavone - farcinica) ortho or converting a raw Streptomyces Lin kolne sheath (Streptomyces lincolnesis).
오르토-디하이드록시이소플라본, 미백용 화장료, 항산화 Ortho-dihydroxyisoflavones, whitening cosmetics, antioxidant
Description
도 1은 각 시험물질들의 HPLC 분석 결과이다(피크 (1), 대사산물(metabolite)로서 7,3',4'-트리하이드록시이소플라본(7,3',4'-trihydroxyisoflavone); 피크 (2), 기질인 다이드제인; 피크 (3), 대사산물로서 7,5,3',4'-테트라하이드록시이소플라본(7,5,3',4'-tetrahydroxyisoflavone); 피크 (4), 기질인 제니스테인. HPLC 분석조건은, UV 254 nm, 유속, 1ml/min, 사용된 용매 ACN:DW=3:7, TFA 1% 함유).1 shows the results of HPLC analysis of each test substance (peak (1), 7,3 ', 4'-trihydroxyisoflavone (7,3', 4'-trihydroxyisoflavone) as a metabolite; peak ( 2), Dyzein as a substrate; Peak (3), 7,5,3 ', 4'-tetrahydroxyisoflavone (7,5,3', 4'-tetrahydroxyisoflavone) as a metabolite; Peak (4) Genistein, substrate,
도 2a는 7,3',4'-트리하이드록시이소플라본의 NMR 분석 결과이며, 도 2b는 7,5,3',4'-테트라하이드록시이소플라본의 NMR 분석 결과이다.FIG. 2A is a result of NMR analysis of 7,3 ', 4'-trihydroxyisoflavone, and FIG. 2B is a result of NMR analysis of 7,5,3', 4'-tetrahydroxyisoflavone.
도 3은 스트렙토마이세스 에버미틸리스를 이용한 다이드제인에 대한 반응용기로서 기존의 반응용기(A)와 산소 공급을 원활하게 하기 위하여 본 발명에서 사용한 회분식 반응기(B)를 보여주는 사진이다.3 is Streptomyces It is a photograph showing the batch reactor (B) used in the present invention in order to smoothly supply the existing reaction vessel (A) and oxygen as the reaction vessel for Dyzedine using Evermitil.
도 4는 GC-MS 분석, 기질인 다이드제인과 반응물들의 BSTFA의 유도체화를 이용한 분석 결과이다( 1): 다이드제인, 상온, 18.5min, MS, 398; 2) 7,3',4'-트리하이드록시이소플라본, 상온, 24.4min, MS, 486; 3) 7,8,4'-트리하이드록시이소플라본, 상온, 25.1min, MS, 486; 4) 7,6,4'-트리하이드록시이소플라본, 상온, 26.8min, MS, 486).Figure 4 is a result of analysis using the derivatization of BSTFA of GC-MS analysis, the substrate dyed zein and the reactants (1): dyed zein, room temperature, 18.5min, MS, 398; 2) 7,3 ', 4'-trihydroxyisoflavones, room temperature, 24.4 min, MS, 486; 3) 7,8,4'-trihydroxyisoflavones, room temperature, 25.1 min, MS, 486; 4) 7,6,4'-trihydroxyisoflavones, room temperature, 26.8 min, MS, 486).
도 5는 다이드제인을 스트렙토마이세스 에버미틸리스로 생변환하여 생성되는 여러 변형된 이소플라본들의 구조식이다.5 shows streptomyces with Dyzedein Ever US structural formula of a number of modified isoflavones are converted to generate a raw subtilis.
도 6은 스트렙토마이세스 에버미틸리스의 다이드제인에 대한 반응 및 GC 분석 결과이다(반응 조건, 코일(coil) 사용. rpm 220, 반응시간-1달, R2YE 배지 사용).Figure 6 Streptomyces Ever the reaction and GC analysis of the daidzein US subtilis (the reaction conditions, the coil (coil) used. 220 rpm, the reaction time -1 month, using R2YE medium).
도 7은 분석을 위한 BSTFA를 이용한 유도체화 과정을 보여주는 모식도이다.7 is a schematic diagram showing a derivatization process using BSTFA for analysis.
도 8a 및 도 8b는 시험물질들의 MS 스펙트럼 결과이다.8A and 8B show MS spectral results of test materials.
본 발명은 생변환 시스템을 이용한 오르토-디하이드록시이소플라본의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 항산화 기능이 우수하고 미백 효과를 가지는 오르토-디하이드록시이소플라본을 효율적으로 제조하기 위하여 다이드제인과 제니스테인을 방선균 유래의 미생물, 특히 스트렙토마이세스 에버미틸리스, 노카르디아 파르키니카( Nocardia farcinica ) 또는 스트렙토마이세스 린콜네시스(Streptomyces lincolnesis)로 생변환시키는 오르토-디하이드록시이소플라본의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for preparing ortho-dihydroxyisoflavones using a bioconversion system, and more particularly, to efficiently prepare ortho-dihydroxyisoflavones having an antioxidant function and a whitening effect. Jane and Genistein can be used for microorganisms derived from actinomycetes, especially Streptomyces Ever US Antilles, no-carboxylic Dia key Danica Pardo (Nocardia relates to a process for preparing a dihydroxy isoflavone - farcinica) ortho or converting a raw Streptomyces Lin kolne sheath (Streptomyces lincolnesis).
이소플라본은 주로 콩에 함유된 식물성 화합물로서, 이소플라본을 아글리 콘(aglycon)으로 하는 배당체(glucosides)로 존재하다 발효과정 중 미생물의 대사에 의해 비당질 형태로 전환된다. 이러한 이소플라본은 항암, 항산화, 항동맥경화, 혈당강하 및 골다공증 예방 등의 효능이 있는 것으로 알려져 있어 이에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 특히 이소플라본 중 7,8,4'-트리하이드록시이소플라본, 7,6,4'-트리하이드록시이소플라본, 7,3',4'-트리하이드록시이소플라본 및 7,5,3',4'-테트라하이드록시이소플라본은 오르토-디하이드록시이소플라본(ortho-dihydroxyisoflavone, ODI)으로서 항산화 효과가 다른 이소플라본에 비해 높고 화학적 합성이 어려워 그 가치가 높다. Isoflavones are primarily vegetable compounds found in soybeans, which are present as glycosides that contain isoflavones as aglycons. This isoflavone is known to have the efficacy of anti-cancer, anti-oxidation, anti-arteriosclerosis, hypoglycemia and osteoporosis, and research is being actively conducted. Especially 7,8,4'-trihydroxyisoflavones, 7,6,4'-trihydroxyisoflavones, 7,3 ', 4'-trihydroxyisoflavones and 7,5,3' of isoflavones The, 4'-tetrahydroxyisoflavone is ortho-dihydroxyisoflavone (ODI), and its antioxidant effect is higher than that of other isoflavones.
다이드제인과 제니스테인은 수많은 식물(plant)과 대두(soybean)에서 발견되는 다이페놀(diphenol)의 파이토에스트로겐(phytoestrogen) 화합물이다. 이 화합물들은 항산화제, 항균제 및 금속 킬레이트제의 효과가 있다고 보고되고 있다 (Middleton et al., 1992; Dixon et al., 2002). 더욱이, 인류의 건강을 위해서 의약용이나 화학치료제로 사용되고 있다(Foti et al., 2005). 최근에는 항산화제로서 다이드제인이나 제니스테인의 위치특이적인 수산화된 형태의 화합물들에 대한 관심이 증가하고 있다. 오르토-특이적 수산화된(Ortho-specific hydroxylated) 형태의 이소플라본들이 기존의 다이드제인과 제니스테인 보다 높은 생물학적 영향성이 있다고 보고되고 있으며(Rufer and Kulling, 2006), 항-염증(anti-inflammatory)과 항-알러지(anti-allergenic) 활성을 가지고 있다고 알려져 있다(Rufer and Kulling, 2006). 또한 단백질 타이로신 키나아제(tyrosine kinase)의 억제제로서 항암(anticarcinogenic) 성질을 가지고 있으며(Akiyama et al., 1987), 강력한 타 이로시나아제(tyrosinase) 억제제와 리폭시게나아제(lipoxygenase)의 억제제로 이용된다(Chang et al., 2005; Voss et al., 1992). 또 암에 관련된 질병의 원인을 낮추는 화합물로서 이용된 사례도 보고되었다(Klus and Barz, 1995; Coward et al., 1993). 이러한 수산화된 형태(hydroxylated form)의 화합물들은 유기화학적 방법으로 합성이 어렵기 때문에 천연물 추출이나 생합성 방법으로만 생산이 가능하다.DyedZane and Genistein are diphenol phytoestrogen compounds found in many plants and soybeans. These compounds are reported to have the effect of antioxidants, antimicrobials and metal chelating agents (Middleton et al., 1992; Dixon et al., 2002). Moreover, it is used as a medicine or chemotherapy for human health (Foti et al., 2005). Recently, there has been a growing interest in the site-specific hydroxylated compounds of dydzein and genistein as antioxidants. Ortho-specific hydroxylated forms of isoflavones have been reported to have a higher biological effect than conventional dydzeins and genisteins (Rufer and Kulling, 2006), and anti-inflammatory It is known to have anti-allergenic activity (Rufer and Kulling, 2006). It is also an inhibitor of the protein tyrosine kinase and has anticarcinogenic properties (Akiyama et al., 1987) and is used as a potent tyrosinase inhibitor and inhibitor of lipoxygenase (lipoxygenase). Chang et al., 2005; Voss et al., 1992). It has also been reported to be used as a compound to lower the causes of cancer-related diseases (Klus and Barz, 1995; Coward et al., 1993). These hydroxylated forms of compounds are difficult to synthesize by organic chemical methods, so they can only be produced by natural extraction or biosynthesis.
상기한 바와 같이, 수산화된 형태의 이소플라본의 경우 천연물로부터의 추출이나 미생물을 이용한 생합성을 통해서만 분리 및 정제가 가능하다. 천연물 추출 시에 다이드제인과 제니스테인은 이소플라본의 주요 성분으로서 얻기가 용이하지만, 수산화된 형태는 그렇지 못하다. 다시 말해서, 대두 또는 식물에 함유되어 있는 오르토-디하이드록시이소플라본 같은 경우 그 수득율이 높지 않으며, 미생물을 이용한 생합성 또한 그다지 많이 연구되어 있지 않은 상황이다. As described above, in the case of the isoflavone in the hydroxide form, it is possible to isolate and purify only through extraction from natural products or biosynthesis using microorganisms. Dyezein and Genistein are easy to obtain as main components of isoflavones in natural product extraction, but not in the hydrated form. In other words, in the case of ortho-dihydroxyisoflavones contained in soybeans or plants, the yield is not high, and biosynthesis using microorganisms is not studied much.
종래의 기술은 천연물 추출에서 얻은 낮은 수율의 수산화된 형태의 화합물 회수와 반응성이 낮은 미생물을 이용한 수산화된 형태의 화합물을 분석하였으나, 미생물을 이용한 오르토-디하이드록시이소플라본의 생산성에 대한 보고는 없다. 또한 동물유래의 간세포를 이용한 오르토-디하이드록시이소플라본의 반응성에 대한 보고는 있지만 낮은 반응성으로 인하여 생산성이 낮은 문제점이 있었다(Kulling et al, 2001). Prior art analyzes low yield of hydrated compounds obtained from natural product extraction and hydrated forms of compounds using less reactive microorganisms, but there is no report on the productivity of ortho-dihydroxyisoflavones using microorganisms. . In addition, although there are reports on the reactivity of ortho-dihydroxyisoflavones using animal-derived hepatocytes, there was a problem of low productivity due to low reactivity (Kulling et al, 2001).
이에 본 발명자들은 다이드제인과 제니스테인을 방선균 유래의 미생물, 특히 스트렙토마이세스 에버미틸리스, 노카르디아 파르키니카 ( Nocardia farcinica ) 또는 스트렙토마이세스 린콜네시스(Streptomyces lincolnesis)로 생변환시킴으로써 항산화 기능이 우수하고 미백 효과를 가지는 오르토-디하이드록시이소플라본을 효율적으로 제조할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다. The present inventors have found that daidzein and genistein by actinomycete microorganisms of origin, in particular Streptomyces Ever US subtilis, no carboxylic Dia Parque key Danica (Nocardia farcinica) or Streptomyces Lin kolne sheath (Streptomyces lincolnesis) a raw conversion by antioxidant properties and excellent ortho having a whitening effect-found that it is possible to efficiently produce the dihydroxy isoflavone, thereby completing the present invention.
따라서, 본 발명의 목적은 다이드제인과 제니스테인을 생변환시켜 오르토-디하이드록시이소플라본을 제조하는 방법을 제공하는 것이다. Accordingly, it is an object of the present invention to provide a method for bioconverting dyedzein and genistein to produce ortho-dihydroxyisoflavones.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 다이드제인과 제니스테인을 방선균 유래의 미생물, 특히 스트렙토마이세스( Streptomyces ) 속 및 노카르디아 ( Nocardia ) 속 미생물로 생변환시켜 오르토-디하이드록시이소플라본을 제조하는 방법을 제공한다.In order to achieve the above object, in the present invention, daidzein and genistein of the actinomycetes-derived microorganisms, particularly Streptomyces (Streptomyces) and in To Saint converted to no-carboxylic Dia (Nocardia) spp ortho- provides a method for producing a dihydroxy-isoflavone.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명은 방선균 유래의 미생물을 이용하여 목적 화합물 즉, 오르토-특이적으로 수산화된 형태의 이소플라본을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 먼저 본 발명에서는 다이드제인과 제니스테인을 기질로 사용하여 오르토-디하이드록시이소플라본을 제조할 수 있는 균주를 스크리닝하였다. The present invention relates to a method for preparing a target compound, i.e., an ortho-specifically hydrated form of isoflavones, using microorganisms derived from actinomycetes. First, in the present invention, ortho-di Strains capable of producing hydroxyisoflavones were screened.
본 발명에 의하여 선별된 균주로는 스트렙토마이세스 에버미틸리스, 노카르 디아 파르키니카 ( Nocardia farcinica ) 및 스트렙토마이세스 린콜네시 스(Streptomyces lincolnesis) 등을 들 수 있다. 이들 균주 중 스트렙토마이세스 에버미틸리스가 가장 높은 오르토-디하이드록시이소플라본 생산성을 보였으며, 또한 제니스테인의 3' 위치에서 위치특이적으로 수산화반응(hydroxylation)을 시키는 것을 확인하였다. Strains selected by the present invention include Streptomyces Evermitilis , Nocar Dia Parque key Danica (Nocardia farcinica ) and streptomyces Rinkol Nessie's (Streptomyces lincolnesis ). Strains of Streptomyces Ever US subtilis highest ortho- showed dihydroxy isoflavone productivity was also confirmed that for the hydroxylation (hydroxylation) to position-specific at the 3 'position of the genistein.
본 발명에서 사용되는 용어는 당업계에서 통상적으로 사용되는 것으로 당업자라면 그 의미를 누구나 이해할 수 있을 것이나, 본 명세서에서 간략히 설명하면 다음과 같다:The terms used in the present invention are commonly used in the art and those skilled in the art will understand the meaning, but briefly described in the present specification are as follows:
1) ODI: 오르토-디하이드록시이소플라본(ortho-dihydroxyisoflavone)1) ODI: ortho-dihydroxyisoflavone
2) ISP2 배지(1l 기준): 맥아 추출물 5g, 효모 추출물 2g 및 글루코오스 2g. 2) ISP2 medium (1 l basis): 5 g malt extract, 2 g yeast extract and 2 g glucose.
3) YEME 배지 (1l 기준): 맥아 추출물 3g, 효모 추출물 3g, 펩톤 5g, 수쿠로우스 300g, MgCl2.6H2O (2.5M) 2ml 및 글라신 (20%) 25ml.3) YEME medium (1 l basis): 3 g malt extract, 3 g yeast extract, 5 g peptone, 300 g sucurose, 2 ml MgCl 2 H 2 O (2.5M) and 25 ml glassine (20%).
4) R2YE 배지: 수크로오스 103g, 글루코오스 10g, 10.12g, K2SO4 0.25g, 효모 추출물 5g, 디프코 카사미노산(Difco casamino acid) 0.1g, TES 완충액(5.73%, pH 7.2) 100ml, KH2PO4 (0.5%) 10ml, CaCl2.2H2O (3.68%) 80ml, L-프롤린(20%) 15ml, 미량 원소 용액(Trace element solution) 2ml 및 NaOH(1N) 5ml.4) R2YE medium: 103 g sucrose, 10 g glucose, 10.12 g, 0.25 g K 2 SO 4 , 5 g yeast extract, 0.1 g Difco casamino acid, 100 ml TES buffer (5.73%, pH 7.2),
5) HPLC: 고성능액체크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography).5) HPLC: High Performance Liquid Chromatography.
6) GC-MS: 가스크로마토그래피-질량 분석기(Gas Chromatography-Mass Spectrometry).6) GC-MS: Gas Chromatography-Mass Spectrometry.
7) NMR: 핵자기공명 분광법(Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy).7) NMR: Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy.
8) BSTFA: GC 분석을 위한 유도체. N,O-비스(트리메틸실리)트리플루오로아세트아미드(N,O-bis(trimethylsily)trifluoroacetamide).8) BSTFA: Derivative for GC analysis. N, O-bis (trimethylsily) trifluoroacetamide (N, O-bis (trimethylsily) trifluoroacetamide).
9) rpm: 분당 회전수 또는 디스크의 분당 회전속도.9) rpm: revolutions per minute or revolutions per minute of the disk.
본 발명에서는 다이드제인과 제니스테인을 상기 선별된 균주로 생변환시키는 단계를 포함한다. 즉, 본 발명에서는 상기 선별된 균주를 통하여 다이드제인(daidzein)과 제니스테인(genistein)으로부터 3' 위치에 특이적으로 수산화(hydroxylation)된 화합물을 제조하는 하기 반응식 1의 생변환 과정을 거치게 된다:The present invention includes the step of converting dyed zein and genistein to the selected strains. That is, the present invention undergoes the biotransformation process of
하기 반응식 2는 이소플라본의 대표적인 구성화합물인 다이드제인(daidzein)으로부터 오르토-특이적(ortho-specific) 위치에 특이적으로 수산화(hydroxylation)된 화합물이 생성되는 과정을 보여준다:
본 발명에 의하여 생산된 오르토-디하이드록시이소플라본으로는 7,8,4'-트리하이드록시이소플라본, 7,6,4'-트리하이드록시이소플라본, 7,3',4'-트리하이드록시이소플라본 및 7,5,3',4'-테트라하이드록시이소플라본 등을 들 수 있다.Ortho-dihydroxyisoflavones produced according to the present invention include 7,8,4'-trihydroxyisoflavones, 7,6,4'-trihydroxyisoflavones, 7,3 ', 4'-tree Hydroxyisoflavones, 7,5,3 ', 4'-tetrahydroxyisoflavones, and the like.
본 발명은 기질특이적으로 반응성이 높은 균주를 사용함으로써 목적 화합물의 생산성과 4가지의 원하는 위치특이적 수산화된 형태, 즉, 7,8,4'-트리하이드록시이소플라본, 7,6,4'-트리하이드록시이소플라본, 7,3',4'-트리하이드록시이소플라본 및 7,5,3',4'-테트라하이드록시이소플라본(Orobol)을 생산할 수 있었다(Orobol 같은 경우 미생물을 이용한 생합성은 처음이다).The present invention utilizes substrate-specifically reactive strains to produce the desired compound and to produce four desired site-specific hydroxylated forms, namely 7,8,4'-trihydroxyisoflavones, 7,6,4. '-Trihydroxyisoflavones, 7,3', 4'-trihydroxyisoflavones and 7,5,3 ', 4'-tetrahydroxyisoflavones (Orobol) could be produced (in the case of Orobol Biosynthesis used is the first).
본 발명에서는 변화된 반응 용기와 반응 시간에 따라 오르토-디하이드록시이소플라본을 생합성할 수 있었다.In the present invention, ortho-dihydroxyisoflavones could be biosynthesized according to the changed reaction vessel and reaction time.
본 발명에 의한 반응조건은 다음과 같다: 회분식 반응조 안에 반응시 균주에 원활한 산소공급을 위하여 코일(coil) 또는 글라스 비드(glass bead)를 사용한다. 시험관에서 일차 배양한 균주를 1 리터의 원뿔형 플라스크(conical flask)에 균주를 계대배양하여 48시간 배양한 다음 새로운 배지를 이용하여 반응성을 조사한다. 이때 사용하는 배지는 ISP2, YEME 또는 R2YE이 바람직하다. 이 중 영양분이 많은 R2YE를 사용하였을 때 균주의 성장과 더불어 반응성이 좋다. 반응시간은 12시간 간격으로 확인한다. 24시간 반응시킨 경우에 7,3',4'-트리하이드록시이소플라본 및 7,5,3',4'-테트라하이드록시이소플라본(Orobol)의 생산량이 증가하였고, 36시간 이후에는 7,8,4'-트리하이드록시이소플라본 및 7,6,4'-트리하이드록시이소플라본의 생산량이 증가하였으며, 48시간 이후에는 변형된 이소플라본을 얻을 수 있었다(도 7). 사용된 기질의 농도(반응부피당)는 10 mM로 하고 균주배양과 반응온도는 28℃로 한다. The reaction conditions according to the present invention are as follows: Coil or glass beads are used for smooth oxygen supply to the strain when reacting in a batch reactor. The primary cultured strain in vitro was cultured for 48 hours by passage of the strain into a 1 liter conical flask, and then tested for reactivity using fresh medium. The medium to be used is preferably ISP2, YEME or R2YE. Among them, the nutrient-rich R2YE is used and the reactivity is good with the growth of the strain. The reaction time is checked every 12 hours. When reacted for 24 hours, the yield of 7,3 ', 4'-trihydroxyisoflavone and 7,5,3', 4'-tetrahydroxyisoflavone (Orobol) increased, and after 36
본 발명에 의한 오르토-디하이드록시이소플라본은 항산화제 또는 미백효과를 가지는 극성의 화합물이다. Ortho-dihydroxyisoflavone according to the present invention is a polar compound having an antioxidant or a whitening effect.
본 발명은 대부분의 이소플라본의 구성요소인 다이드제인이나 제니스테인을 원료로 하여 식물성 재료내에 부족하게 존재하는 오르토-디하이드록시이소플라본과 변형된 이소플라본의 양을 생합성으로 크게 증가시킬 수 있다. The present invention can greatly increase the amount of ortho-dihydroxyisoflavones and modified isoflavones present insufficiently in the plant material by using dyedzein or genistein, which are components of most isoflavones, as biosynthesis.
본 발명에서 기질로서 사용한 다이드제인 및 제니스테인은 국내 (주) 바이오랜드로부터 구입하였다. . Dyezein and Genistein used as a substrate in the present invention was purchased from Bioland Co., Ltd. in Korea. .
본 발명에서는 방선균 유래의 미생물인 스트렙토마이세스 에버미틸리스를 배양하여 다이드제인에 대한 반응성을 조사한 결과, 배양물로부터 에틸아세테이트(EA)의 비중차를 이용하여 오르토-디하이드록시이소플라본 화합물을 회수하여 분리 정제한다. 다시 말해 방선균 유래의 스트렙토마이세스 에버미틸리스로부터 다이드제인의 반응성을 조사하여 오르토-디하이드록시이소플라본의 생산을 축적하고 이 배양물로부터 항산화제물질인 오르토-디하이드록시이소플라본을 제조할 수 있다.In the present invention, in the derived microorganism Streptomyces Streptomyces As a result of culturing evermitilis and examining the reactivity with Dyzezein, the ortho-dihydroxyisoflavone compound is recovered and purified from the culture using specific gravity difference of ethyl acetate (EA). In other words, the actinomycetes-derived Streptomyces By examining the reactivity of Dyzein from Evermitilis, it is possible to accumulate the production of ortho-dihydroxyisoflavones and to prepare an ortho-dihydroxyisoflavone, an antioxidant, from this culture.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명한 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. It will be apparent, however, to those skilled in the art that these embodiments are for describing the present invention and that the scope of the present invention is not limited to these embodiments.
[실시예 1] 그람양성균인 스트렙토마이세스 에버미틸리스(Streptomyces Avermitilis)로부터 다이드제인과 제니스테인의 반응성을 확인[Example 1] Gram-positive bacteria of Streptomyces is from the US Everett subtilis (Streptomyces Avermitilis) determine the daidzein and genistein reactivity
다이드제인의 6 또는 8, 3' 위치에서 위치특이적으로 -OH기를 붙이는 수산화반응을 수행하는 미생물을 스크리닝하고 그 효소를 확인하였다. Microorganisms carrying out a hydroxylation reaction with a -OH group at the 6, 8, and 3 'positions of dydzein were screened and the enzymes identified.
먼저, 각기 다른 조성의 효모(yeast), 곰팡이(fungi) 및 박테리아(bacteria)를 가지고 다이드제인과 제니스테인에 대한 기질 특이성을 조사하였다. 조사된 균 주 중에서 스트렙토마이세스 에버미틸리스, 노카르디아 파르키니카( Nocardia farcinica) 및 스트렙토마이세스 린콜네시스(Streptomyces lincolnesis)가 다이드제인에 대한 반응성을 보였다. 그 중에서 스트렙토마이세스 에버미틸리스가 다이드제인과 제니스테인에 가장 높은 기질 특이성을 보였다. First, substrate specificities for dyedzein and genistein were examined with yeast, fungi and bacteria of different compositions. Streptomyces among investigated strains Ever US subtilis, no carboxylic dia Parr key NIKA (Nocardia farcinica) and Streptomyces The lean kolne sheath (Streptomyces lincolnesis) showed reactivity with daidzein. Among them, Streptomyces Everton is the US Antilles had the highest substrate specificity on daidzein and genistein.
반응 배지는 ISP2 배지를 사용하였고 반응 시 에펜돌프(Eppendorf) 대신에 도 3에 도시된 회분식 반응기(batch reactor)를 사용하였다. 24시간동안 반응시킨 후에 반응물을 에틸아세테이트로 추출하여 진공원심분리기(vacuum centrifuge)를 이용해 증발시킨 다음 분석하였다. HPLC와 NMR 분석 장비를 이용하여 구조를 분석하였으며, 그 결과를 도 1, 도 2a 및 도 2b에 나타내었다. 반응시 사용된 기질의 최종농도는 10 mM이었다. 1H NMR 스펙트럼 결과는 하기와 같다.The reaction medium was ISP2 medium and a batch reactor shown in FIG. 3 was used instead of Eppendorf in the reaction. After reacting for 24 hours, the reaction product was extracted with ethyl acetate and evaporated using a vacuum centrifuge and analyzed. The structure was analyzed using HPLC and NMR analysis equipment, and the results are shown in FIGS. 1, 2A, and 2B. The final concentration of the substrate used in the reaction was 10 mM. 1 H NMR spectrum results are as follows.
7,3',4'-트리하이드록시이소플라본: δ 8.37 (s, H-2), δ 7.97 (d, J=8.5 Hz, H-5), δ 7.56 (d,d, J=8.0 and 2.5 Hz, H-6'), δ 7.53 (d, J=2.5 Hz, H-2'), δ 7.42 (d, J=8.0 Hz, H-5'), δ 6.95 (d,d, J=8.5 and 2.5 Hz, H-6), and δ 6.87 (d, J=2.5 Hz, H-8). 7,5,3',4'-테트라하이드록시이소플라본: δ 7.97 (s, H-2), δ 6.22 (d, J=2 Hz, H-6), 6.95 (d, J=2Hz, H-2'), 6.86 (d, J=8Hz, H-5'), 6.91 (d,d, J=2 and 8Hz, H-6').7,3 ', 4'-trihydroxyisoflavone: δ 8.37 (s, H-2), δ 7.97 (d, J = 8.5 Hz, H-5), δ 7.56 (d, d, J = 8.0 and 2.5 Hz, H-6 '), δ 7.53 (d, J = 2.5 Hz, H-2'), δ 7.42 (d, J = 8.0 Hz, H-5 '), δ 6.95 (d, d, J = 8.5 and 2.5 Hz, H-6), and δ 6.87 (d, J = 2.5 Hz, H-8). 7,5,3 ', 4'-tetrahydroxyisoflavone: δ 7.97 (s, H-2), δ 6.22 (d, J = 2 Hz, H-6), 6.95 (d, J = 2 Hz, H -2 '), 6.86 (d, J = 8 Hz, H-5'), 6.91 (d, d, J = 2 and 8 Hz, H-6 ').
[실시예 2] 그람양성균, 스트렙토마이세스 에버미틸리스(Streptomyces Avermitilis)로부터 다이드제인의 변화된 반응성을 확인(Example 2) Gram-positive bacteria, check the changed reactivity of Streptomyces Ever US subtilis daidzein from (Streptomyces Avermitilis)
3' 위치에 수산화시키는 반응뿐만 아니라, 6, 8 위치에 수산화시키는 반응성 을 스트렙토마이세스 에버미틸리스를 이용하여 조사하였다. 미생물의 원만한 산소공급을 위하여 코일(coil)을 넣어 주었고 원뿔형 플라스크(conical flask)를 사용하여 반응성을 조사하였다(도 3의 (B)). 균주 배양을 위해 R2YE 배지를 사용하였고, 반응속도는 220rpm이었다. 24시간동안 반응시킨 후 에틸아세테이트(EA)를 이용하여 추출한 다음 GC-MS를 이용하여 분석하였다. GC 크로마토그램(Chromatogram)에서 다른 체류 시간(Retention time)을 통해서 생산물의 참시료(Authentic sample)를 분석할 수 있었다. BSTFA로 유도체화된 MS 스펙트럼을 통하여 각 분자량을 확인할 수 있었으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다(다이드제인, 상온, 18.5min, MS, 398; 7,3',4'-트리하이드록시이소플라본, 상온, 24.4min, MS, 486; 7,8,4'-트리하이드록시이소플라본, 상온, 25.1min, MS, 486; 7,6,4'-트리하이드록시이소플라본, 상온, 26.8min, MS, 486). Streptomyces not only reacts to the 3 'position but also to the 6 and 8 positions It was investigated using Evermitilis . Coils were put in order to supply oxygen to the microorganisms and their reactivity was investigated using a conical flask (FIG. 3B). R2YE medium was used for strain culture, and the reaction rate was 220 rpm. After reacting for 24 hours, the mixture was extracted using ethyl acetate (EA) and analyzed using GC-MS. Authentic samples of the product could be analyzed through different retention times in the GC chromatogram. The molecular weight was confirmed through the MS spectrum derivatized with BSTFA, and the results are shown in FIG. 4 (Didase, room temperature, 18.5 min, MS, 398; 7,3 ', 4'-trihydroxyiso). Flavones, room temperature, 24.4min, MS, 486; 7,8,4'-trihydroxyisoflavones, room temperature, 25.1min, MS, 486; 7,6,4'-trihydroxyisoflavones, room temperature, 26.8min , MS, 486).
[실시예 3] 그람양성균, 스트렙토마이세스 에버미틸리스(Streptomyces Avermitilis)로부터 다이드제인의 추정된 반응성을 확인Example 3 gram-positive, determine an estimated reactivity of Streptomyces is from the non-Eberhard subtilis (Streptomyces Avermitilis) daidzein
실시예 2에서 확인한 바와 같이 스트렙토마이세스 에버미틸리스는 ODI에 대한 반응성을 가지는 균주임을 알 수 있다. 반응시간을 1달로 하였을 경우, 여러 형태의 변화된 모노수산화된 형태, 모노메톡시화된 형태, 디수산화된 형태, 디메톡시화된 형태, 트리수산화된 형태 및 트리메톡시화된 형태의 화합물을 GC-MS로 분석할 수 있었다. 가능한 반응물의 변형도 및 분석에 대한 결과를 도 5 내지 도 8b에 나타내었다. 다이드제인, 다이드제인의 B-링(B-ring)의 탄소 4번 위치에 수산화 대신 메틸화된 포르모노네틴, 제니스테인 및 제니스테인의 B-링(B-ring)의 탄소 4번 위치에 수산화 대신 메틸화된 바이오체닌 A인 경우 항산화 효과뿐만 아니라 UV에 노출 시 산화방지에 대한 보고가 있다(Widyarini et al. 2001). Streptomyces as confirmed in Example 2 Evermitilis can be seen that the strain having a reactivity to ODI. When the reaction time is 1 month, GC-MS compounds of various forms of the modified monohydrated form, monomethoxylated form, dihydroxylated form, dimethoxylated form, trihydroxylated form and trimethoxylated form are obtained. Could be analyzed. The strains and possible results of the analysis of the possible reactants are shown in FIGS. 5-8B. Instead of hydroxylation at
[실시예 4] 쥐의 색소세포를 이용한 멜라닌 생성 억제효과 측정 Example 4 Measurement of Melanin Inhibition Effect Using Pigment Cells
쥐의 색소세포를 이용하여 실시예 1~2로부터 수득한 ODI 의 멜라닌 생성 억제 효과를 측정하였다. The melanin production inhibitory effect of ODI obtained from Examples 1-2 was measured using the mouse pigment cells.
먼저, C57BL/6 마우스 유래의 쥐의 색소세포(Mel-Ab cell)(Dooley, T.P. et al, Skin pharmacol, 7, pp 188-200)를 DMEM(Dulbeccos modified Eagles media)에 10% 우태반 혈청, 100nM 2-O-테트라데카노일포르빌(tetradecanoyphorbol)-13-아테이트 및 1nM 콜레라 독소(cholera toxin)를 첨가한 배지에서 37℃, 5% CO2의 조건에서 배양하였다. 배양된 Mel-Ab세포를 0.25% 트립신-EDTA로 떼어내고, 24-웰 플레이트에 105 세포/웰(cells/well)의 농도로 세포를 배양하여 이틀째부터 3일 연속으로 10ppm의 하이드로퀴논 및 상기 실시예 1~2로부터 수득한 각 ODI를 첨가하여 배양하였다. 이때, 상기 하이드로퀴논은 양성대조군으로 사용하였다. 그 다음 배양액을 제거하고, PBS로 세척한 후, 1N 수산화나트륨으로 세포를 녹여 400nm에서 흡광도를 측정한 다음, 하기 수학식 1에 따라 멜라닌 생성 억제율을 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다(Dooley의 방법). First, the mouse Mel-Ab cells derived from C57BL / 6 mice (Dooley, TP et al, Skin pharmacol, 7, pp 188-200) were placed in DMEM (Dulbeccos modified Eagles media) in 10% fetal placental serum, Incubation was performed at 37 ° C. and 5% CO 2 in medium to which 100 nM 2-O-tetracanocanophorbol-13-ate and 1 nM cholera toxin were added. The cultured Mel-Ab cells were separated with 0.25% trypsin-EDTA, and the cells were incubated at a concentration of 10 5 cells / well in a 24-well plate to 10 ppm of hydroquinone and the above for 2 days consecutively. Each ODI obtained from Examples 1 and 2 was added and cultured. At this time, the hydroquinone was used as a positive control. Then, the culture medium was removed, washed with PBS, the cells were dissolved with 1N sodium hydroxide, the absorbance was measured at 400 nm, and the melanin production inhibition rate was calculated according to
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 의해 수득한 상기 실시예 1~2의 ODI 들은 하이드로퀴논과 유사한 정도의 멜라닌 생성 억제 효율을 보이는 것을 확인하였다. As shown in Table 1 above, it was confirmed that ODIs of Examples 1 to 2 obtained by the present invention showed melanin production inhibition efficiency similar to that of hydroquinone.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에서는 방성균 유래의 미생물을 이용하여 항산화제 물질 또는 미백 물질인 ODI를 특이적으로 생성 축적시키고, 더 나아가 변화된 형태의 화합물을 생합성하는 제조방법을 제공할 수 있었으며, 이는 앞으로의 학문적 연구와 산업적 활용 시 고부가가치의 발명이 될 것으로 보인다.As described above, the present invention was able to provide a method for producing and accumulating ODI, which is an antioxidant or a whitening substance, by using microorganisms derived from antibacterial bacteria and further biosynthesizing a compound of a changed form. It will be a high value-added invention for future academic research and industrial use.
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