KR101324647B1

KR101324647B1 - 다발성신경경화증의 치료 또는 예방용 조성물 및 이의 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR101324647B1
Application number: KR1020100126263A
Authority: KR
Inventors: 권오승; 락쉬미 칸다가다라; 임혜연; 강민정; 정병화; 정봉철; 마문 하크
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2010-12-10
Filing date: 2010-12-10
Publication date: 2013-11-01
Also published as: KR20120064981A

Abstract

본 발명은 다발성신경경화증의 치료 또는 예방용 조성물 및 이의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 부작용 또는 독성 등의 우려 없이 다발성신경경화증을 효과적으로 치료 또는 예방하기 위한 조성물 및 이의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

Description

다발성신경경화증의 치료 또는 예방용 조성물 및 이의 스크리닝 방법 {COMPOSITION FOR TREATING OR PREVENTING OF MULTIPLE SCLEROSIS AND SCREENING THEREOF}

다발성신경경화증(multiple sclerosis, MS)의 증상을 완화시키거나 면역계의 기능을 억제시키기 위한 여러 가지 약물들의 개발이 많이 시도되었으나 현재까지 상기 질환을 효과적으로 치료할 수 있는 약물은 아직 보고되지 않았다. 치료 약물과 관련하여서는 다발성 신경경화증의 발현기전이 자가면역(autoimmune) 시스템에 의하여 야기되기 때문에 면역계에 작용하는 약물을 개발하려는 연구가 비교적으로 많은 편이었다.

이와 관련하여, 사이토카인(Cytokine)과 단백질류의 면역 억제제로는 미국의 Berlex 실험실에서 개발된 Betaseron(interferon (IFN)-ß)은 FDA에서 1993년에 승인을 얻어 현재 임상적으로 사용되고 있다(Panitch, Mult. Scler. 1, S17-S21, 1995; Crucian et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol. 3, 411-416, 1996; Johnson, J. Neural Transm. Suppl. 49, 111-115, 1997). 이 약물은 면역반응을 일으키는데 관여하고 있는 IFN-γ를 분비하는 T-cell을 감소시키는 역할을 하여 주로 재발성-완화성(Relapsing-Remitting) 다발성 신경경화증 환자의 치료에 효과를 나타낸다고 보고되었다(Crucian et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol. 3, 411-416, 1996). 또한 IFN-ß는 T-cell의 증식을 억제하고 stimulated T- 및 B-lymphocytes에서 CD25의 유도를 차단시켰다. IFN-γ, tumor necrosis factor-a (TNF-a) 및 interleukin (IL)-13은 IFN-ß에 의하여 억제되었으나 IL-2는 2배, IL-10의 분비는 거의 4배나 증가 되었다 (Rep et al., Neuroimmunol, 67, 111-118, 1996).

아미노산의 합성 copolymer인 Coploymer I (Cop I; myelin basic protein analogue; Copaxone)는 다발성신경경화증의 동물모델인 EAE(실험적알러지성뇌수막염, experimental allergic encephalomyelitis)를 억제하는데 매우 효과적인 것으로 보고되었다. Cop I은 EAE를 유도하지 않았고 여러 종의 동물에서 EAE를 억제하였다. 이는 MBP(myelin basic protein)와 Cop I 사이의 면역교차반응 및 항원 특이성의 억제(suppressor) 세포의 유도, 그리고 MHC(major histocompatibibty complex) 분자와 결합하는 MBP와 경쟁함으로써 이루어진다. Cop I은 임상 phase II 및 phase III에서 Relapsing-Remitting MS 환자에서 악화 속도(exacerbation rate)를 감소시키고 환자의 상태를 개선시켰다(Teitelbaum et al., J. Neural. Transm. 49, 85-91, 1997).

면역억제용 합성화합물들에 속하는 약물로는 linomide, corticosteroids, azathioprine, cyclophosphamide, cyclosporin A, cladribine 및 colchicine 등이 있다. linomide (quinoline-3-carboxamide)는 rat에 피하주사 시 EAE 유도를 매우 강하게 억제시켰으며, EAE의 임상적인 증상을 개선시키고, myelin 항원이 유도한 T-cell의 반응을 억제하였다. 또 IL-4, IL-10 및 tumor growth factor-ß (TGF-ß)의 상향조절(upregulation)과 proinflammatory cytokine인 IFN-a와 TNF-a는 억제하는 것이 보고되었다 (Diab et al., J. Neuroimmunol. 85, 146-154, 1998).

고용량(1000 mg, iv, 4 days)의 프레드니솔론(prednisolone)은 임상실험에서 혈청의 IL-10 농도 및 IL-10 mRNA 발현을 증가시켰으며 이와는 대조적으로 염증을 매개시키는 cytokine인 TNF-a및 IFN-γ의 mRNA 발현을 감소시켰다 (Gayo et al., J. Neuroimmunol. 85, 122-130, 1998).

아자치오프린(Azathioprine)은 다발성신경경화증 환자에서 TNF-a의 감소와 억제-유발(suppressor-inducer) lymphocyte의 증가를 일으켰다 (Salmaggi et al., J. Neurol. 244, 167-174, 1997). 아자치오프린은 총 1191명의 다발성 신경경화증 환자 중에서 1991년 12월 31일 이전까지 암이 발생한 환자 수는 모두 23 명으로 나타났다 (Confavreux et al., Neurol. 46, 1607-1612, 1996). 또한 아자치오프린을 투여 받은 다발성 신경경화증 환자에서는 척수 내(intrathecal) IgG의 합성의 감소를 일으키는 것으로 보고되었다(Caputo et al., Acta. Neurol. Scand. 75, 84-86, 1987).

클라드리빈(Cladribine)은 Scripps 연구소에서 2 년간의 다발성 신경경화증 환자의 임상시험에서 neurological performance scores를 측정한 결과 증상의 개선을 나타내는 것으로 보고되었다(Beutler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 1716-1720, 1996). In vitro에서 antigen presenting cell과 T-cell의 mixture에 colchicine을 처리하면 T-cell의 증식이 억제됨을 보였다 (Tateyama, Hokkaido Igaku Zasshi 63, 72-79, 1988). 그 외 면역기능을 억제하는 것으로는 cyclophosphamide (Ten Berge et al., Cell. Exp. Immunol. 50, 495-502, 1982)와 cyclosporin A 등이 있다.

그 밖에 다발성 신경경화증의 증상을 개선시키는 약물로 사용될 수 있는 것으로서, baclofen (GABA agonist)은 tizanidine, dantrolene sodium, diazepam 등과 함께 spasticity를 감소시킬 목적으로 사용되며, carbamazepine은 antiepiletic drug으로서, amantadine은 다발성 신경경화증 환자의 증상 중 피로함을 개선시키기 위해서, delta 9-tetrahydrocanabinol은 척수 spasticity에 기인한 오심(nausea)의 예방 및 식욕증진을 위해서 사용되어진다.

상술한 바와 같이 다발성 신경경화증의 증상을 치료 또는 예방하기 위한 다양한 약물들이 연구되고 있으나, 상기 물질들은 부작용 내지 독성의 우려가 있으며, 여전히 다발성 신경경화증을 효과적으로 치료 또는 예방할 수 있는 물질은 개발되지 않아 효과적인 치료제의 개발이 요구되고 있다.

이에 본 발명은 상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 부작용 또는 독성 등의 우려 없이 다발성신경경화증을 효과적으로 치료하기 위한 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 LeuSH를 유효성분으로 포함하는 다발성신경경화증의 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 a) 시료를 준비하는 단계; b) 상기 시료에 NADPH 산화효소의 기질을 첨가하는 단계; c) 상기 기질이 첨가된 시료에 후보물질을 접촉시키는 단계; 및 d) 상기 시료와 후보물질 사이의 반응을 확인하여 NADPH 산화효소의 활성을 억제하는 물질을 선별하는 단계를 포함하는, 다발성신경경화증의 치료 또는 예방용 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 e) 실험적알러지성뇌수막염(EAE, experimental allergic encephalomyelitis) 질병이 유도된 피검 동물 시료를 준비하는 단계; f) 상기 EAE 질병이 유도된 동물 시료에 후보물질을 투여하는 단계; g) 후보물질이 투여된 동물 시료와 후보물질이 투여되지 않은 동물 시료의 체중 또는 임상증상을 비교하여 시료의 체중 또는 임상 증상을 유의적으로 개선시키는 물질을 선별하는 단계를 포함하는, 다발성신경경화증의 치료 또는 예방용 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다.

본 발명의 일 구현예에 따라, LeuSH를 유효성분으로 포함하는 다발성신경경화증의 치료 또는 예방용 약학 조성물이 제공된다.

본 발명자들의 실험 결과, LeuSH(L-Leucinethiol)의 신규한 용도로서 NADPH 산화효소 및/또는 MMP(기질 금속단백분해효소, matrix metalloproteinase)의 활성 억제 효과를 발견하였으며, 이러한 효과로 인해 다발성신경경화증의 치료 또는 예방에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

상기 LeuSH(L-Leucinethiol)는 하기와 같은 구조를 가지며, NADPH 산화효소와 MMP, 특히 MMP9의 활성을 감소시키는 특성이 있다.

NADPH 산화효소는 산소 (O₂)로부터 슈퍼옥사이드이온(super oxide ion, O₂-)을 생성하는데 관여하는 효소로서, 상기 NADPH 산화효소가 활성화되면 혈관에서 활성 산소가 많아져 MMP의 활성화가 일어난다. MMP는 세포외 기질을 분해하는데 중요하게 작용한다.

다발성신경경화증이 있는 경우 상기 NADPH 산화효소 및/또는 MMP9의 활성이 증가되므로, 이러한 NADPH 산화효소와 MMP9의 활성을 감소시킬 수 있는 물질을 개발할 경우, 다발성신경경화증의 치료 또는 예방에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대되어 본 발명자들이 연구를 한 결과, 상기 LeuSH가 EAE 유도된 마우스 모델에서 임상 증상 및 체중 등에 있어서 현저한 개선 효과를 나타냄을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 LeuSH를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 종래의 단백질 약물과 같은 부작용 내지 독성 등과 같은 문제를 나타내지 않으면서도 다발성신경경화증을 효과적으로 치료 또는 예방하는데 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에서, 치료라는 용어는 증상의 경감 또는 개선, 질환의 범위의 감소, 질환 진행의 지연 또는 완화, 질환 상태의 개선, 경감 또는 안정화, 부분적 또는 완전한 회복, 생존의 연장 기타 다른 이로운 치료 결과 등을 모두 포함하는 의미로 사용된다.

상기 유효성분인 LeuSH의 사용량은 투여대상 및/또는 질환의 치료 또는 예방에 적합한 함량이 될 수 있으며 이는 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류, 투여 경로, 조성물의 분비율, 치료 기간 및 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 예를 들어, 대상체가 성인인 경우 본 발명의 약학 조성물을 1일 1회 내지 수회에 걸쳐 투여 또는 복용시 유효성분인 LeuSH 중량을 기준으로 총 6 ~ 10 mg/kg(체중), 바람직하게는 8 mg/kg(체중)의 용량이 유효량으로 투여 또는 복용될 수 있으며 또한, 전체 조성물 내의 유효성분인 LeuSH 의 중량은 목적하는 제형의 종류 및 효과에 따라서 적절하게 조절 가능하며, 예컨대, 총 조성물 중량을 기준으로 바람직하게는 95.0 내지 99.9 중량%, 더욱 바람직하게는 97.0 내지 99.9중량%일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 다만, 상기 유효성분의 투여량 또는 복용량은, 유효성분의 함량을 지나치게 높게 포함하여 부작용을 초래하지 않을 정도이어야 함은 당업자에게 자명하다.

본 발명의 다른 일 구현 예는 다발성신경경화증의 치료 또는 예방용 물질을 in vitro 또는 in vivo 에서 스크리닝하는 방법을 제공한다.

본 발명자들은 NADPH 산화효소를 억제함으로써 다발성신경경화증을 치료 또는 예방할 수 있음을 최초로 확인하였다.

따라서 본 발명의 일 구현예는 상기 NADPH 산화효소 억제 활성의 확인을 통해 다발성신경경화증의 치료 또는 예방용 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

상기 스크리닝 방법은 in vitro 에서 수행할 수 있으며, 구체적으로 a) 시료를 준비하는 단계; b) 상기 시료에 NADPH 산화효소의 기질을 첨가하는 단계; c) 상기 기질이 첨가된 시료에 후보물질을 접촉시키는 단계; d) 상기 시료와 후보물질 사이의 반응을 확인하여 NADPH 산화효소의 활성을 억제하는 물질을 선별하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 시료와 후보물질 사이의 반응을 확인하여 NADPH 산화효소의 활성을 억제하는 물질을 선별하는 단계는, 이에 제한되지 않으나 바람직하게는 형광 측정법(Cao et al. Hypertension, 50, 663-671, 2007 참조)을 사용하여 수행할 수 있으며, 바람직하게는 NADPH 산화효소 억제제로 잘 알려진 양성지표물질인 아포사이닌(apocynin)을 대조군으로 사용하여 각각의 후보물질 첨가에 따른 효과와 아포사이닌(apocynin) 첨가에 따른 효과를 비교하여 이와 동등하거나 우수한 효과를 나타내는 물질을 선별하는 방법으로 이루어질 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.

상기 NADPH 산화효소의 기질로는 이에 제한되지는 않지만 바람직하게는 ß-NADPH를 사용할 수 있다. 상기 NADPH 산화효소가 ß-NADPH를 기질로 사용하여 과산화물을 생성하면, 생성된 과산화물이 예컨대 DHE(Dihydroethidium)를 산화시켜 에티듐(ethidium)을 생성하고 이에 따라 상기 형광 측정법을 사용하여 NADPH 산화효소의 활성을 측정함으로써 NADPH 산화효소의 활성을 효과적으로 억제하는 물질을 선별할 수 있으며, 상기 선별된 물질은 다발성신경경화증의 치료 또는 예방을 위해 유용하게 사용될 수 있다.

또는 in vivo 스크리닝 방법을 사용할 수 있으며, 상기 in vivo 스크리닝 방법은 바람직하게는 e) 실험적알러지성뇌수막염(EAE, experimental allergic encephalomyelitis) 질병이 유도된 피검 동물 시료를 준비하는 단계; f) 상기 EAE 질병이 유도된 동물 시료에 후보물질을 투여하는 단계; g) 후보물질이 투여된 동물 시료와 후보물질이 투여되지 않은 동물 시료의 체중 또는 임상증상을 비교하여 시료의 체중 또는 임상 증상을 유의적으로 개선시키는 물질을 선별하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 EAE 질병이 유도된 피검 동물은 인간의 다발성신경경화증과 유사한 동물 모델이므로 EAE 질병에 대한 효과가 인정될 경우 다발성신경경화증에 대한 효과를 기대할 수 있다.

상기 피검 동물 시료에서 EAE 질병을 유도하는 단계는 특별히 제한되지 않고 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있다. EAE 질병의 유도 여부는 바람직하게는 생물학적 시료의 체중 및/또는 임상증상을 측정하여 확인할 수 있다.

EAE 질병이 유도되면 시료에 후보물질을 투여하고, 후보물질이 투여된 군과 후보물질이 투여되지 않은 EAE 질병 유도군의 EAE 질병 유도후의 체중 및/또는 임상 증상을 비교한다. 비교 결과를 토대로 대상의 체중을 증가시켜 EAE 질병으로 인해 감소된 체중을 회복시키는 효과 및/또는 바람직하지 못한 임상 증상을 유의적으로 감소 내지 개선시키는 효과 등, 다발성신경경화증의 치료 또는 예방에 유의한 효과를 나타내는 물질을 선별할 수 있다.

상기 시료는, in vitro 스크리닝의 경우, 동물, 바람직하게는 인간, 설치류 등을 포함하는 포유동물로부터 유래하는 세포, 조직, 혈액, 등일 수 있고, in vivo 스크리닝의 경우, 동물, 바람직하게는 인간, 설치류 등을 포함하는 포유동물일 수 있다.

상기 후보물질은 모든 종류의 화합물을 포괄하는 의미로, 예컨대, 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 합성 화합물, 발효 생산물, 세포 추출액, 식물 추출액, 또는 동물 조직 추출액 일 수 있으며, 신규한 물질뿐 아니라 널리 알려진 것일 수도 있다.

상술한 스크리닝 방법들을 통하여 본 발명의 약학 조성물의 유효성분인 LeuSH이 스크린에 사용된 다른 물질의 억제효과와 비교하여 NADPH 산화효소 활성을 가장 강력하게 억제하는 효과 및 EAE 질병의 현저한 개선효과를 가지는 것을 확인하여 다발성신경경화증의 치료 또는 예방에 효과적으로 사용될 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 약학 조성물은 상기 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 부형제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 부형제로는 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등의 가용화제를 사용할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다. 액상 용액 형태로 제제화될 경우, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 또는 이들의 혼합물을 담체로 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또는 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

이 밖에도 본 발명의 약학 조성물의 제형 및 약제학적으로 허용 가능한 담체는 특별히 제한되지 않으며, 당업계의 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다. 또한 각종 면역관련 질환의 치료 또는 예방을 위한 유효량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 예를 들어, 대상체가 성인인 경우 본 발명의 약제학적 조성물은 1일 1회 내지 수회에 걸쳐 투여 또는 복용시 총 6 ~ 10 mg/kg(체중), 바람직하게는 8 mg/kg(체중)의 용량이 유효량으로 투여 또는 복용될 수 있다. 다만, 각 활성 성분의 복용량 또는 투여량이 각 활성 성분의 함량을 지나치게 높게 포함하여 부작용을 초래하지 않을 정도이어야 함은 당업자에게 자명하다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 약학 조성물은 NADPH 산화효소 및/또는 MMP의 활성을 효과적으로 억제할 수 있을 뿐만 아니라 다발성신경경화증의 치료 또는 예방에 뛰어난 효과를 가지므로 상기 질환의 치료 또는 예방에 유용하게 사용될 수 있다. 또한 본 발명의 스크리닝 방법을 사용함으로써 본 발명의 약학 조성물 외에도 이와 같은 우수한 효과를 갖는 물질을 개발할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 실시예 1에 따른 후보물질들의 NADPH 산화효소 활성 억제효과를 나타낸 것이다(n=3/각농도).
도 2는 실시예 1에 따른 후보물질들의 NADPH 산화효소 활성 억제효과를 IC₅₀ 값으로 나타내어 비교한 것이다.
도 3은 실시예 2에 따른 임상점수(도 3a)와 체중(도 3b)의 변화를 나타낸 것이다(평균 ± SEM (각 군당 n=6), *는 SAS의 GLM 방법에 의한 통계적 유의성(* p<0.05)).

이하 본 발명의 이해를 돕기 위해 바람직한 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. NADPH 산화효소 활성 억제제 스크리닝

1-1. 실험 방법

6주령의 암컷 C57BL/6 생쥐(체중 20 ±2 g)의 뇌조직(전뇌)을 적출하고 상기 적출된 뇌 조직을 뇌 조직 50mg 당 완충액(50 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl₂, 0.25%(v/v) Triton x-100) 1ml에 용해시킨 후, 6000g에서 30분 동안 원심분리하여 상등액을 취하고 최종농도가 60%(v/v)가 되도록 에탄올을 가하여 침전시키고 다시 10,000g 에서 30분 동안 원심분리하여 뇌 조직 균질액을 제조하였다. 제조된 뇌 조직 균질액에 dihydroethidium (10 μmol/L), salmon testes DNA(Sigma)(0.5 mg/ml), ß-NADPH (0.1 mmol/L)와 후보물질(0 - 500 μM)을 첨가한 후 암실에서 37℃의 배양기에서 30분간 반응시켜 NADPH 산화효소 활성의 억제 정도를 측정하였다. 상기 첨가된 물질 중 Dihydroethidium(DHE)은 과산화물에 의해 산화되며 에티듐(ethidium)을 생성하고, ß-NADPH는 과산화물을 생성하는 NADPH 산화효소의 기질로서 사용되었다. 상기 후보물질로는 3, 4-Dichloroisocoumarin (DCC), L-Leucinethiol (LeuSH), Bestatin (BST) 및 4-Amidinophenylmethanesulfonylfluoride (APMSF)를 사용하였고, 대조군으로는 NADPH 산화효소 억제제로 잘 알려진 양성지표물질인 아포사이닌(apocynin)을 사용하였다.

NADPH 산화효소의 활성은 Cao et al. Hypertension, 50, 663-671, 2007에서 보고된 방법에 따라 dihydroethidium을 기질로 사용하여 형광 측정법으로 측정하였다. 형광은 여기(excitation) 485 nm와 발광(emission) 590 nm로 설정하여 FL WinLab software (ver 4.00.02)의 지원을 받아 luminescence spectrometer (LS 50-B, Perkin Elmer, UK)로 측정하였고, 측정된 효소 활성은 nmole/minute/mg protein으로 나타내었다.

1-2. 실험 결과

NADPH 산화효소 활성의 억제 정도를 측정한 결과, LeuSH이 스크린에 사용된 다른 물질과 비교하여 NADPH 산화효소의 활성을 가장 강력하게 억제함을 확인할 수 있었다(도 1 및 도 2).

구체적으로 각 물질의 효과를 비교하기 위하여 IC₅₀ 값을 계산하고 그 결과를 도 2에 나타냈다. 대조군인 아포사이닌을 25 μM의 양으로 사용하였을 때의 NADPH 산화효소의 활성 억제 효과와 비교하였을 때, 후보물질들은 각각 DCC의 경우 22.11 μM, LeuSH의 경우 36.1 μM, BST의 경우 115.07 μM, 그리고 APMSF의 경우 284.30 μM에서 각각 아포사이닌 25 μM의 억제효과와 동등한 정도의 효과를 나타냈다. 이러한 결과에서 알 수 있듯이, 후보 물질들 중에 DCC와 LeuSH이 보다 우수한 NADPH 산화효소 활성 억제효과를 나타냈으며, 특히 500μM의 양에서는 LeuSH이 가장 강력한 억제 효과를 가짐을 확인할 수 있었다.

실시예 2. In vivo EAE 유도된 마우스 모델에 대한 LeuSH 의 효과 평가

2-1. 실험 방법

H37Ra 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)(Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) 3 mg을 1 mg /ml 의 완전프로인트항원보강제(complete Freund's adjuvant)(Sigma)와 혼합하여 4 m /ml 결핵균-CFA 용액을 만들고, 이 용액을 5.1 mg MOG₃₅ _-55(Takara, 충남)를 PBS 3.4 ml 에 녹인용액과 잘 혼합하였다. 이 혼합용액 200 ul (400 ug 결핵균과 150ug MOG₃₅ _-55 함유)를 6주령의 암컷 C57BL/6 생쥐에 피하주사 한 후, 즉시 200 ng의 백일해독소(pertussis toxin)(Sigma)를 복강 투여하고, 2일이 경과한 후 백일해독소를 동량으로 다시 투여하여 마우스 내 EAE 질병을 유발시킨 후, 체중과 임상증상을 측정하여 질병이 유도된 것을 확인하였다. 마우스 내 EAE 질병이 유도된 후 17일째부터 시작하여 30일째까지 2일 간격으로 1회씩 후보물질인 LeuSH를 각각 1 및 8mg/kg의 양으로 복강으로 투여하였으며, EAE가 유도된 후 마우스의 임상 점수(clinical score)(표 1 및 도 3a)와 체중(표 2 및 도 3b), 및 장기 무게(표 3)를 매일 같은 시각에 측정함으로써 LeuSH의 투여에 따른 변화를 측정하였다(평균 ± SEM (n=6/각 군당), *는 SAS의 GLM 방법에 의한 통계적 유의성을 나타냄(* p<0.05)). 임상 증상은 다음과 같은 6 단계로 분류하여 나타내었다: 0, 임상 증상 없음(no clinical sign); 1, 꼬리가 축 늘어짐(flaccid tail); 2, 한쪽 뒷다리의 약화(one hind limb weakness); 3, 두 뒷다리의 약화(two hind limbs weakness); 4, 뒷다리 마비(hind limb paralysis); 5, 사지마비(tetraplegia); 6, 빈사상태/사망(moribund/death).

2-2. 실험 결과

(1) 임상 점수

	최대값	누적값	평균값
EAE	3.00 ± 0.258	34.17 ± 1.96	1.102 ± 0.064
LeuSH (1 mg/kg)	2.66 ± 0.211	30.33 ± 1.61	0.980 ± 0.051
LeuSH (8 mg/kg)	1.40 ± 0.245*	16.20 ± 1.39*	0.522 ± 0.046*

상기 표 1에서, *는 EAE 유도군과 비교시 고농도 LeuSH 투여군의 임상 점수가 유의성 있게 감소하였다는 것을 나타낸다(군당 n=6, * p<0.05)

임상 점수의 경우, 상기 표 1 및 도 3a에 나타난 바와 같이 특히 LeuSH 8 mg/kg을 투여한 그룹에서 EAE 증상의 유의성 있는 개선효과를 나타내었다. LeuSH 를 투여하지 않은 EAE 동물 대조군은 21일째까지 임상 점수의 최대값이 약 3.0에 도달하였으나, LeuSH 를 처리한 그룹의 경우, 평균값이 각각 약 2.7(1 mg/kg 투여군)과 약 1.4(8 mg/kg 투여군)로 임상 점수가 농도의존적으로 유의성 있게 감소되었다. 유의성검정을 위한 통계처리는 SAS의 GLM을 사용하여 계산하였다.

(2) 체중

	시작일(0일)	10일째	20일째	30일째
Control(정상대조군)	16.80±0.151	19.14±0.193	18.72±0.930	20.23±0.651
EAE	17.00±0.415	18.26±0.067	16.11±0.035*	16.60±0.119*
LeuSH (1mg/kg)	16.46±0.402	18.27±0.307	16.31±0.349*	17.06±0.240*
LeuSH (8mg/kg)	16.39±0.298	17.58±0.512*	17.47±0.168^#	18.13±0.093*^#

상기 표 2 및 도 3b에 나타난 바와 같이, EAE 질병이 유도된 군의 경우 정상대조군과 비교시 20일 및 30일째에 모두 유의성 있는 체중의 감소를 나타냈으며, 저농도의 LeuSH(1 mg/kg)를 투여한 군 역시 이와 유사한 양상으로 체중의 감소를 보인 반면, 고농도의 LeuSH(8 mg/kg)를 투여한 군의 경우 0, 10, 20 및 30일에서 측정한 체중의 평균값이 정상 대조군에 비해서는 유의성 있는 체중의 변화가 나타나지 않았으나, EAE 유도군에 비해서는 특히 20일 및 30일째에 체중이 유의성 있게 증가하여 EAE 질병에 의하여 감소된 체중이 고농도의 LeuSH의 투여에 의해 회복됨을 확인할 수 있었다.

이와 같이, LeuSH의 투여는 EAE 질병으로 인한 체중의 감소를 상쇄하는 효과가 있음을 알 수 있다. *는 정상 대조군과 비교하여 통계적으로 유의성이 나타남을 표시한 것이고 (*p<0.05; 군당 n=6 mice), #는 EAE 유도군과 비교하여 통계적으로 유의성이 나타남을 표시한 것이다(#p<0.05; 군당 n=6 mice). 유의성검정을 위한 통계처리는 SAS의 GLM을 사용하여 계산하였다.

(3) 장기 무게

단위(g)	정상 대조군	EAE	LeuSH(1mg/kg)	LeuSH(8mg/kg)
뇌	0.410 ± 0.006	0.395 ± 0.002*	0.407 ± 0.002#	0.408 ± 0.004#
비장	0.184 ± 0.007	0.133 ± 0.003*	0.180 ± 0.009#	0.182 ± 0.009#
폐	0.206 ± 0.012	0.172 ± 0.012*	0.182 ± 0.005*	0.204 ± 0.005#
간	1.096 ± 0.056	0.882 ± 0.023*	1.092 ± 0.029#	1.092 ± 0.055#
흉선	0.046 ± 0.005	0.033 ± 0.002*	0.040 ± 0.000*	0.044 ± 0.002#
심장	0.098 ± 0.004	0.092 ± 0.003	0.097 ± 0.002	0.098 ± 0.002
신장	0.136 ± 0.005	0.122 ± 0.007	0.132 ± 0.005	0.128 ± 0.006

상기 표 3에서, *는 정상 대조군과 비교하여 통계적으로 유의성이 나타남을 표시한 것이고 (*p<0.05; 군당 n=6 mice), #는 EAE 유도군과 비교하여 통계적으로 유의성이 나타남을 표시한 것이다(#p<0.05; 군당 n=6 mice).

상기 표 3에 나타난 바와 같이, EAE 유도군에서는 장기 무게의 유의성 있는 감소가 관찰되었으나, LeuSH 투여군에서는 정상 대조군과 비교시 유의성 있는 차이를 나타내지 않아, LeuSH은 EAE에 의해 유발된 독성을 감소시켰음을 알 수 있었다. 이처럼 LeuSH를 처리한 EAE 유도군에서는 EAE의 임상증상이 농도의존적으로 유의성 있게 개선되었다.

상세하게는 1mg/kg의 LeuSH를 투여한 군에서 폐와 흉선의 무게는 정상 대조군에 비하여 감소하였으나 뇌, 비장 및 간의 무게는 정상 대조군과 차이를 나타내지 않았으며, EAE 유도군에 비해서는 상기 장기들의 무게가 모두 유의성 있게 증가하였음을 나타내었다.

특히, 8mg/kg의 LeuSH를 투여한 군에서는 뇌, 비장, 폐, 간 및 흉선의 경우 무게가 정상 대조군과 비교하여 유의성 있는 차이가 없었고, EAE 유도군에 비해서는 상기 장기들의 무게가 유의성 있게 증가하였음을 나타내었다. 유의성검정을 위한 통계처리는 SAS의 GLM을 사용하여 계산하였다.

그러므로 MMP와 NADPH 산화효소를 억제하는 작용을 가진 LeuSH은 EAE 질병, 즉 다발성신경경화증의 치료후보물질로서의 개발 가능성을 암시해주는 것을 확인하였다.

Claims

L-류신티올(L-Leucinethiol, LeuSH)를 유효성분으로 포함하는 다발성신경경화증의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 LeuSH는 엔에이디피에이치(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate(reduced form), NADPH) 산화효소 억제 활성을 갖는 것인 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 LeuSH는 기질 금속단백분해효소 9 (matrix metalloproteinase 9, MMP9) 억제 활성을 갖는 것인 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 LeuSH를 전체 조성물의 중량을 기준으로 95.0 중량% 내지 99.9 중량%로 함유하는 것인 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 LeuSH를 6 내지 10mg/kg의 용량으로 적용하는 것인 약학 조성물.
a) 시료를 준비하는 단계;
b) 상기 시료에 NADPH 산화효소의 기질을 첨가하는 단계;
c) 상기 기질이 첨가된 시료에 후보물질을 접촉시키는 단계; 및
d) 상기 시료와 후보물질 사이의 반응을 확인하여 NADPH 산화효소의 활성이 억제되는 경우, 상기 후보물질을 다발성신경경화증의 치료 또는 예방용 물질로 판단하는 단계를 포함하는,
다발성신경경화증의 치료 또는 예방용 물질을 스크리닝하는 방법.