KR101322973B1

KR101322973B1 - 로도박터 스페로이드의 변이균주 추출물을 포함하는 성장촉진용 배지조성물 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR101322973B1
Application number: KR1020110108641A
Authority: KR
Inventors: 민지호; 김양훈; 박주용; 이현정
Original assignee: 전북대학교산학협력단
Priority date: 2011-10-24
Filing date: 2011-10-24
Publication date: 2013-10-29
Also published as: KR20130044534A

Abstract

본 발명은 미생물 및 동물세포의 성장촉진용 배지조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 미생물 및 동물세포의 성장촉진용 배지조성물은 로도박터 스페로이드의 변이균주 MBTLJ-8 추출액인 PACs를 유효성분으로 포함하여 구성된다.
본 발명에 의해 미생물의 생성을 빠르게 하고, 동물세포의 성장 촉진 및 세포내 스트레스를 감소시킴과 동시에 미세수중생물의 성장 및 생식을 촉진시키는 미생물 및 동물세포의 성장촉진용 배지조성물이 제공된다.

Description

로도박터 스페로이드의 변이균주 추출물을 포함하는 성장촉진용 배지조성물 및 그 제조방법{Medium Composition for Accelerating Growth Including Extracts of Mutant typed Rhodobacter sphaeroids and the Manufacturing Method}

본 발명은 로도박터 스페로이드의 변이균주 추출물을 포함하는 성장촉진용 배지조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 특히 미생물의 생성을 빠르게 하고, 동물세포의 성장 촉진 및 세포내 스트레스를 감소시킴과 동시에 미세수중생물의 성장 및 생식을 촉진시키는 로도박터 스페로이드의 변이균주 추출물을 포함하는 성장촉진용 배지조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

광합성 미생물을 이용하여 이산화탄소를 저감하거나 배양된 광합성 미생물을 활용하는 부분에서는 1990년대 초반부터 활발하게 이루어져 왔으며, 고효율의 광생물 반응기 개발에서부터 고농도 이산화탄소에 대한 내성을 가지는 균주의 분리, 그리고 파일럿 플랜트 스케일 운전을 위한 모델링 등 다양한 방향으로 연구가 진행되고 있다.

미국 에너지성(Department of Energy)의 지원으로 Aqueasearch Inc.는 2001년부터 시약급 이산화탄소를 산업체 배출 이산화탄소로 대체하여 사용하기 위한 연구를 시작하였으며, Cyanotech. Inc.에서는 보일러 가동시 발생하는 이산화탄소를 미세조류 배양원료로 활용하는 시스템을 시험 운전 중에 있다. 또한, 미국 Sapphire Inc.에서는 조류 기반의 가솔린 및 항공기 연료 개발을 추진하고 있고, 이렇게 배양된 광합성 미생물을 통해 여러 유용물질로 전환할 수 있는 신규 미생물 종을 탐색하기 위한 기반 연구가 진행 중에 있다.

국내에서도 이산화탄소를 고정화하여 유용물질을 생산하는 연구가 다수 진행중에 있는데, 한국에너지기술연구원에서는 이를 사료 첨가제화하는 기술을 완료한 바 있으며, KIST에서는 미세조류를 대량 배양할 수 있는 광생물반응기 개발을 추진 중에 있다.

광합성 미생물을 이용하여 광분해 메커니즘에 의해 공기 중의 CO₂를 고정화하면서, 물을 분해하여 수소를 생산하는 기술은 오래 전부터 이상적인 생물학적 수소생산 방법으로 연구되고 있으며, 이 기술은 주로 조류(藻類, algae)와 남조류(藍藻類, cyanobacteria)의 광합성 및 수소생산 능력이 뛰어난 미생물의 분리 확보 연구와 아울러 특성을 규명하는 연구가 수행 중에 있다.

일반적으로 광합성세균은 자연계의 식물순환 사이클에서 1군(群)을 이루는 중요한 미생물로서, 해양, 토양, 하천, 호수 등지에 1,000 내지 10,000개체/cc 수준으로 존재하며, 자연계의 정화에 중요한 역할을 수행하는 미생물들 중 엽록소를 지니고 있으므로 스스로 동화작용을 할 수 있는 미생물들을 일컫는다.

따라서 광합성세균은 자연계의 먹이사슬에서 1차 생산자로서 역할을 하며, 플랑크톤 등의 먹이가 되어 어류의 먹이 발생에 1차적인 요소가 되며, 종류로는 홍색비유황세균(purple non-sulfur bacteria), 홍색유황세균(purple sulfur bacteria), 녹색비유황세균(green non-sulfur bacteria) 및 녹색유황세균(green sulfur bacteria)으로 구분되고, 이들은 조류(algae)나 식물의 광합성과는 달리 그 과정 중에 산소를 발생시키지 않는 것을 특징으로 한다.

홍색비유황세균인 로도박터 속 미생물은 다양한 대사조건, 즉, 호기적 조건, 혐기 어둠조건, 혐기 광조건 모두에서 성장할 수 있다. 또한, 로도박터 속 미생물은 태양에너지를 화학에너지로 전환시킴으로써 이산화탄소(CO2)의 고정을 포함하여 세포대사 활동에 필요한 에너지를 생성시켜 아미노산, 단백질, 비타민, 항균물질, 색소, 영양물질 등 다양한 영양분을 포함하고 있다. 또한, 같은 균종이라 해도 키우는 환경, 배지의 종류에 따라 배양액 중 또는 세균이 갖고 있는 영양물질이 달라진다.

광합성 세균에는 다량의 핵산, 비타민 B, C, E군, 필수아미노산, 카로티노이드, 생리활성물질 등을 가지고 있어 가축사료에 부족한 영양소를 자연상태로 보충하여 살아 숨쉬는 자연사료를 만듦으로써 가축의 사료효율을 높여 증육을 촉진하고 맛과 육색 등 육질을 향상시키는 영향을 바탕으로 가축의 사료 첨가제로 사용이 되며, 토양의 개선과 작물의 질병 경감에 효과로 인하여 비료 첨가 물질로 상용화 되어 적용되고 있다.

또한, 유리물의 분해 촉진 능력이 뛰어나 가축분뇨나 유기물을 액상화시켜 슬러리 피트의 막힘 현상을 없애며, 피트 내 분뇨 찌꺼기 양을 현저히 줄이기 위하여 사용되기도 한다.

또한, 유기물의 퇴비화에 관여하는 발효미생물의 수를 증식시켜 분뇨의 발효를 빠르게 하는 역할을 하기도 한다.

또한, 광합성 세균을 이용한 어류용 사료첨가제 및 이를 포함하는 사료로 여러 가지 특허가 등록되어 있으며, 상용화되고 있다.

또한, 광합성 미생물을 기반으로 수소 생산 및 바이오 에너지의 생산 기반으로 활용되어 지고, 폐수에서의 정화작용을 기반으로 활용되어지고 있다.

이러한 에너지, 농수산업, 환경, 의약, 생물산업 등의 예로 적용이 용이하다 할 수 있다. 하지만, 광합성 세균을 통한 이산화탄소 저감 및 생성된 광합성 세균에서의 추출액을 통해 산업적 미생물의 성장 속도 증진 및 동물세포 생장 물질로의 대체 효과와 세포 내의 스트레스의 감소 또한 미세수중생물의 성장 및 번식 증가에 대해서는 아직 연구 진행이 필요한 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 문제를 해결하기 위한 것으로서, 로도박터 스페로이드의 변이균주의 제작을 통해 보다 효과적인 미생물과 동물세포의 성장을 촉진할 수 있는 대체물질을 만들었고, 변이균주의 성장에 영향을 미치는 조건들을 확인하여 최적의 성장촉진용 배지조성물을 제작하며, 동물세포의 성장, 물벼룩의 성장과 번식 증가 등의 다양한 분야로 활용할 수 있는 성장촉진용 배지조성물을 제공하는 데 있다.

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본 발명의 로도박터 스페로이드의 변이균주 추출물을 포함하는 성장촉진용 배지조성물은 로도박터 스페로이드의 변이균주 MBTLJ-8 추출액인 PACs를 유효성분으로 포함하는 것이 특징이다.

상기 추출액은 로도박터 스페로이드의 변이균주 MBTLJ-8 배양액을 빛이 완전히 없는 상태에서 48시간 동안 배양하는 방법, 15W에서 48시간 동안 배양하는 방법, 15W에서 24시간 동안 배양한 후 빛이 완전히 없는 상태에서 24시간 동안 배양하는 방법 중 선택된 하나의 방법으로 배양한 후, 추출하여 제조되는 것이 특징이다.

본 발명에 의해, 효모인 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae), 그람양성균주인 클로스트리디움 아세토 부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum)의 생성을 빠르게 하고, 자궁경부암 세포인 HeLa cell의 세포성장 촉진 및 세포내 스트레스 감소시킴과 동시에 미세 수중생물인 물벼룩의 성장 및 생식을 촉진시켜 주는 성장촉진용 배지조성물 및 그 제조방법이 제공된다.

도 1, 2, 3은 로도박터 스페로이드 KCTC1434의 변이균주에 대해 16s rRNA를 비교한 블라스트(blast)를 나타낸 도면.
도 4는 로도박터 스페로이드에서 추출한 추출액인 PACs를 제조하는 하나의 방법을 나타낸 도면.
도 5는 로도박터 스페로이드의 변이균주에서 추출한 PACs의 모습.
도 6은 로도박터 스페로이드와 변이균주에서 추출한 PACs를 대장균의 성장 배지에 첨가하였을 때의 성장곡선을 나타낸 그래프.
도 7은 대장균의 최소성장배지에 글루코스(glucose)를 뺀 경우에 대한 PACs의 첨가 유무와 글루코스가 들어간 경우 PACs의 첨가 유무에 대한 대장균의 성장 곡선을 나타낸 그래프.
도 8은 대장균의 최소성장배지에서 PACs에 열처리를 가하였을 경우와 열처리를 안했을 때 PACs 첨가에 의한 대장균의 성장곡선을 나타낸 그래프.
도 9는 사카로마이세스 세레비시아의 성장에 PACs를 첨가하였을 때 성장곡선과 PACs를 열불활성(Heat inactivation)과정을 시킨 후의 성장곡선을 나타낸 그래프.
도 10은 우라실에 대한 영양요구성 돌연변이인 사카로마이세스 세레비시아의 성장에서 우라실이 빠진 최소배지에서 PACs를 농도별로 첨가 하였을 때의 성장곡선을 나타낸 그래프.
도 11은 우라실에 대한 영양요구성 돌연변이인 사카로마이세스 세레비시아의 성장에 우라실이 빠진 최소배지에서 PACs를 농도별로 첨가하여 성장시켰을 때 생성된 에탄올에 대해 나타낸 그래프.
도 12는 클로스트리디움 아세토부틸리쿰의 성장에 PACs를 첨가한 배지와의 글루코스(glucose) 소모 속도를 나타낸 그래프.
도 13은 클로스트리디움 아세토부틸리쿰의 성장에 PACs를 첨가한 경우와의 에탄올 생성에 대해 나타낸 그래프.
도 14는 클로스트리디움 아세토부틸리쿰의 성장에 PACs를 첨가한 경우와의 가스 생성에 대해 나타낸 그래프.
도 15는 NCS의 첨가 여부와 PACs의 조건에 따라 달라지는 동물세포수를 나타낸 도면.
도 16, 17은 NCS의 첨가 여부와 PACs의 조건에 따라 달라지는 동물세포수를 나타낸 도면.
도 18은 물벼룩에 Algae와 PACs를 각각 첨가하였을 때 시간 경과에 따라 달라지는 생식과 성장정도를 나타낸 도면.
도 19는 빛의 세기에 따른 로도박터스페로이드의 성장 비교를 나타낸 도면.
도 20은 빛의 노출정도에 따른 로도박터스페로이드의 성장 비교를 나타낸 도면.
도 21은 화학적으로 변이시킨 균주를 빛 조건이 다르게 배양하였을 때 카로티노이드 함량을 나타낸 도면.
도 22는 화학적으로 변이시킨 균주를 빛 조건이 다르게 배양하였을 때 박테리오클로로필 함량을 나타낸 도면.

광합성 세균은 태양에너지를 활용하여 이산화탄소를 고정화하는 특징과 함께 Rubisco site를 통해 카로티노이드, 비타민, 아미노산, 당, 단백질 등의 유용한 영양분을 만들어내고 있다.

이러한 생성물은 생리활성물질로 잘 알려져 있는 분야도 있고, 현재 다양한 연구를 통해 생리활성 및 항균성 등 여러 분야에서 진행하고 있으며 의약, 식품, 생물산업 분야에서 중요한 원료 및 필수품으로 활용되고 있다.

광합성 세균 중 홍색비유황세균 (Purple non-sulfur bacteria)은 다양한 환경에서 자랄 수 있으며, 다양한 생산물을 만들 수 있다.

로도박터 스페로이드는 이런 홍색유황세균의 한 종류로서 여러 가지 유용한 생리활성물질을 만들어 낸다고 알려져 있다.

본 발명에서는 이러한 로도박터 스페로이드의 변이균주의 제작을 통해 보다 효과적인 미생물과 동물세포의 성장을 촉진할 수 있는 대체물질을 만들었고, 변이균주의 성장에 영향을 미치는 조건 중의 하나인 빛 상태를 달리하여 배양하고, 이렇게 배양하여 얻은 세포에서 추출한 추출액(PACs)을 통해 생물의 성장에 효과를 나타내는 물질은 여러 가지 분석을 통하여 특징을 확인하였으며, 동물세포의 성장, 물벼룩의 성장과 번식 증가 등의 다양한 분야로 활용하였고, 변이균주의 제작을 통해 보다 나은 효과를 알아보았다.

본 발명에서는 광합성 세균인 로도박터 스페로이드의 변이균주 MBTLJ-8에서 추출한 추출액을 PACs라 명명하였고, 국립농업과학원 농업유전자원센터에 2010. 8. 12. 기탁하였으며, 기탁번호는 KACC91572P이다.

위에서 PACs라 함은 Photosynthetic Activating(or Alternative) Compounds의 약자로서 광합성을 통해 합성된 생리활성물질 혹은 대체물질이라는 의미이다.

상기 PACs는 로도박터 스페로이드 KCTC1434에서 추출한 추출액보다 미생물의 성장속도를 더 증가시키는 효과가 있음을 확인하였다.

따라서 MBTLJ-8을 통해 배양하는 환경에서의 빛 조건의 변화에 의한 광합성 세균의 추출액인 PACs의 효과로서 박테리아와 효모의 성장 속도를 향상시킴과 생성물의 생성을 촉진하고, HeLa cell에서의 세포성장과 세포스트레스에 대한 저감 및 물벼룩의 생장 촉진을 통한 번식 증진에 등에 대한 생산성의 효율 증가 및 대체물질로의 역할, 그리고 빛 조건에 따른 PACs의 차이를 알아보았고, PACs의 열처리에 따라 미생물의 성장속도의 증가에는 변화가 없지만, 동물세포에서는 열처리의 결과에 따라 성장의 차이의 발생함으로써 효율적 미생물의 배양 및 동물세포와 미세수중생물의 대체물질로 사용 가능함을 알 수 있다.

또한, 미세수중생물의 성장 및 번식증가에 대해서도 효과가 있음을 알 수 있다.

상기 언급한 내용을 보다 더 자세히 설명하기 위해, 아래와 같이 실시예를 통해 상세히 설명하나, 이들이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

변이균주 생성

로도박터 스페로이드 KCTC 1434를 sistrom's minimal medium 5ml에 접종하여 30℃, 150rpm으로 48시간 동안 진탕배양하였다.

상기 얻어진 배양액 0.5ml을 sistrom's minimal medium 5ml에 첨가하여 30℃, 180 rpm으로 빛이 완전히 없는 상태에서 본배양(本培養)하였다.

본배양하여 OD600의 수치가 0.955가 될 때 N-Methyl-N'-nitro-N-nitroso guanidine을 각 배양액 5ml에 각각 2㎕와 20㎕를 각각 넣은 다음 1시간, 2시간, 20시간 후에 각각의 샘플을 채취하여 멸균수를 넣어 배양액과 세포의 농도가 10^-5 또는 10^-6이 되도록 희석하여 agar plate에 0.1ml 넣고, spreading하여 N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine가 들어가지 않은 샘플과 같이 비교하여 각각 생성된 colony의 생성비율에서 사멸율이 99.9%가 되는 플래이트에서 colony를 채취하여 16s rRNA의 각 염기서열을 확인하고 기존의 로도박터 스페로이드 KCTC1434와 비교하여 16s rRNA가 다른 균주(MBTLJ-8, MBTLJ-13, MBTLJ-20)을 선별하였다(도 1, 2, 3)

Sistrom's minimal medium의 조성

KH₂PO₄			2.72g
(NH₄)₂SO₄			0.5g
NaCl			0.5g
니트릴로아세테이트			0.2g
MgSO₄ _·7H₂O			0.3g
CaCl₂ _·2H₂O			0.033g
FeSO₄ _·2H₂O			0.0002g
(NH₄)₆Mo₇O₂₄(1% solution)			0.2ml
CaCl₂ _·2H₂O			0.033g
FeSO₄ _·7H₂O			0.0002g
(NH₄)₆Mo₇O₂₄(1% solution)			0.2ml
20% 글루코즈			100ml
효모추출물			5g
트립톤			5g
미량원소용액/100ml	EDTA	1.765g	0.1ml
	ZnSO₄ _·7H₂O	10.95g
	FeSO₄ _·7H₂O	5g
	MnSO₄ _·H₂O	1.54g
	CuSO₄ _·5H₂O	0.392g
	Co(NO₃)_2·6H₂O	0.248g
	H₃BO₃	0.114g
비타민 용액/100ml	니코틴산	1g	0.1ml
	티아민 HCl	0.5g
	바이오틱	0.01g
최종부피			1L

* KOH를 이용하여 PH7로 맞춘 후 카사미노산(casamino acid) 2g을 첨가하여 멸균하여 사용한다.

변이균주 확인을 위한 16s rRNA 동정을 위한 프라이머 서열

	프라이머 서열
16s rRNA-F	5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'
16s rRNA-R	5'-GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3'

로도박터 스페로이드의 배양을 통해 얻은 세포로 추출한 추출액인 PACs의 제조

본 발명에서는 로도박터 스페로이드를 sistrom's minimal medium 5ml 에 접종하여 30℃, 180 rpm으로 48시간 동안 진탕배양하였다.

얻어진 배양액 1ml을 sistrom's minimal medium 100ml에 첨가하여 30℃, 180 rpm으로 48시간동안 빛이 완전히 없는 상태에서 본배양하였다.

상기 배양된 세포와 배지를 50ml 튜브에 담아 4℃, 5000 rpm, 30분 동안 원심분리기를 통해 세포와 배지를 분리시키고 침전되어 있는 세포만 회수하였다.

배양액의 1/20이 되도록 모은 세포에 멸균수를 넣어 부피를 맞춘 후에 냉장상태에서 20초 pulse, 10초 휴식 조건으로 총 30분 동안 초음파 분쇄기(sonicator)를 통해 분쇄하였다.

그 후 4℃, 13000rpm, 30분 동안 원심분리한 상층액을 0.2㎛ 필터로 걸러서 나온 용액을 PACs라고 명명하였다(도 4, 5).

또한, 빛 조건을 달리하였을 때 PACs가 다른 세포나 수중 생물에 미치는 영향이 달라지는지를 확인하기 위하여 100ml sistrom's minimal medium에 접종액 1 ml을 첨가하고 빛에 노출된 상태를 달리하여 배양하였다.

15W 빛에 노출된 상태에서 48시간 동안 배양한 세포, 15와트(W) 빛에 노출된 상태에서 24시간 동안 배양 후 빛을 차단시켜 24시간 동안 배양한 세포, 그리고 빛에 노출되지 않은 상태에서 48시간 동안 배양한 세포를 각각 PACs으로 만든 후 3가지 조건의 PACs를 얻었다.

로도박터 스페로이드 KCTC 1434에서 추출한 추출액과 변이균주에서 추출한 추출액이 포함된 배지에서의 대장균(Escherichia coli BL21(DE3))의 성장확인

본 발명에서는 대장균을 LB액체 배지(1% 트립톤, 0.5% 효모추출물 및 0.5% NaCl) 5ml에 접종하여 37℃, 160 rpm으로 12시간 동안 진탕배양하였다.

그리고 대장균(E. coli)의 최소배지인 M9배지에 상기 실시예 2의 MBTLJ-8에서 추출한 PCSs 0.4 %가 들어간 배지 100ml에 접종액 1ml씩 넣고 37℃, 160 rpm으로 시간별 성장을 UV spectrometer를 통해 600nm에서 대장균의 성장을 확인한 결과 PACs가 들어가지 않은 배지에서의 대장균의 성장이 제일 늦었고, 로도박터 스페로이드 KCTC1434에서 추출한 추출액이 포함된 배지에서는 약간의 성장 속도의 증가가 있었다.

하지만 변이균주 MBTLJ-8의 PACs에서의 대장균의 성장에서 월등히 빠른 성장속도의 증가를 나타냄을 확인하였다(도 6).

대장균의 최소배지인 M9 배지 조성

1M MgSO₄(sterile)			2ml
20% glucose(sterile)			20ml
1M CaCl₂(sterile)			0.1ml
M9 salts	Na₂HPO₄-7H₂O	1.765g	200ml
	KH₂PO₄	10.95g
	NaCl	5g
	NH₄Cl	1.54g
	최종부피	1L
	멸균함
최종부피			1L

PACs가 포함된 배지에서의 대장균(Escherichia coli BL21(DE3))의 성장확인

본 실시예에서는 대장균을 LB액체 배지(1% 트립톤, 0.5% 효모추출물 및 0.5% NaCl) 5ml에 접종하여 37℃, 160 rpm으로 12시간 동안 진탕배양하였다.

또한, glucose가 빠진 최소액체배지와 glucose가 들어있는 최소배지, 그리고 glucose가 빠진 최소액체배지에 상기 실시예 2의 변이균주 MBTLJ-8에서 추출한 PACs 0.4 %가 들어간 배지와 glucose와 PACs를 함께 넣은 최소배지 각각의 배지 100ml에 접종액 1ml씩 넣고 37℃, 160 rpm으로 시간별 성장을 UV spectrometer를 통해 600nm에서 대장균의 성장을 확인한 결과 우선 glucose가 빠진 경우에는 PACs 포함 여부에 상관없이 대장균이 자라지 않음을 확인하였다.

glucose가 포함된 배지의 경우에는 대장균이 성장을 했고, glucose에 PACs까지 포함된 경우는 보다 빨리 대장균이 성장하는 것을 확인하였다(도 7).

이 결과로서 PACs는 gluocse와 같은 탄소원으로 영향을 주지는 않고 생리활성적으로 cell의 성장을 보다 빠르게 하는 촉매 같은 역할을 한다는 것을 알 수 있었다.

또한, PACs를 열처리(54℃, 30분, 중탕처리)를 한 후의 PACs와 열처리를 가하지 않은 PACs에 대해 위와 같은 방법으로 최소액체배지에 대장균의 성장을 확인한 결과 열처리와 관계없이 모두 같은 성장속도의 증가를 가져왔다(도 8).

PACs 이 포함된 배지에서의 효모(S. cerevisiae S2805)의 성장확인

효모의 경우 또한 최소액체배지(SC media : 0.67% Yeast nitrogen base, 0.5% casamino acid, 2% glcuose) 5ml에 효모를 접종하여 30℃, 180rpm으로 20시간 동안 진탕배양하였다.

glucose를 넣고 변이균주 MBTLJ-8로 제조한 PACs를 넣은 경우 100ml 최소액체배지에 30℃, 200rpm에서 250ml 삼각플라스크에서 100ml의 배지를 넣어 각 시간별 성장을 UV 분광광도계(spectrometer)를 통해 OD600에서 효모의 성장을 확인한 결과 PACs를 넣지 않은 배지에서보다 성장 속도가 더 빠르다는 것을 확인하였다.

또한, PACs를 54℃, 30분 동안 열불활성(heat inactivation)과정을 시킨 후 사용하였을 때도 heat inactivation 시키지 않았던 상기의 실험과 동일하게 성장 속도를 빠르게 진행하는 결과를 얻었다(도 9).

또한, 우라실(uracil)에 대한 영양용 구성 돌연변이 효모(S. cervisiae s2805)에서 최소액체배지(SC media)에 우라실(uracil)이 빠진 상태에서 효모를 성장시킬 경우 우라실(uracil)의 결핍으로 인해 자라지 않았지만, PACs를 첨가시킨 경우 PACs의 농도와 비례적으로 효모가 성장함을 알 수 있었다(도 10).

또한, 성장한 배지에서 1ml을 채취하여 원심분리를 통해 cell을 제거하고 남은 배지를 0.2μm의 필터로 여과한 후 HPLC를 통해 배지안의 glucose 농도 및 에탄올의 농도를 확인한 결과 PACs가 포함된 양에 비례하게 생성물인 에탄올(ethanol)이 생성함을 확인하였다(도 11).

PACs가 포함된 배지에서의 클로스트리움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum)의 성장 확인

그람양성균주인 클로스트리움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum)의 경우는 변이균주 MBTLJ-8로 제조한 PACs를 첨가하였을 때 37℃에서 15ml 바이알에서 10ml의 배지를 넣은 후 10분간 질소 퍼짐을 통해 배지의 상태를 혐기조건으로 맞춘 후 각 시간별 성장을 UV spectrometer를 통해 OD600에서 측정하여 균주의 성장을 확인한 결과 성장 초기보다 빠른 성장을 확인하였다(도 12).

또한, 성장한 배지에서 1ml을 채취하여 원심분리를 통해 cell을 제거하고 남은 배지를 0.2μm 필터로 여과한 후 HPLC를 통해 배지안의 glucose 농도 및 에탄올의 농도를 확인한 결과 에탄올 생산에서 PACs가 포함된 배지에서 성장 초기 부분인 30시간 부분에서 더 많은 에탄올이 생성함을 알 수 있었다(도 13).

또한, 혐기조건의 바이알에 10ml의 주사기를 연결하여 가스 생산을 할 경우 압력에 의해 주사바늘이 올라가는 것을 확인한 결과 PACs가 들어간 바이알에서 성장 초기에 가스 생산을 더 많이 한다는 것을 확인하였다(도 14).

HeLa cell에 화학적으로 변이시킨 균주로 추출한 PACs를 처리하였을 때 세포 성장 확인 및 세포내 스트레스 확인

본 발명에서는 변이시킨 균주인 MBTLJ-8로 제조한 PACs를 자궁경부암 세포인 HeLa에 처리하여 세포성장을 확인하였다.

60 파이 culture용 dish에 L-글루타민(L-glutamin), 페니실린(Penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin), 그리고 5% NCS가 첨가된 DMEM 4ml을 넣어주고 HeLa cell세포를 넣어 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 12시간 동안 배양한 후, 배지를 제거하고 DPBS로 세척하였다.

열처리를 하지 않은 PACs를 넣어주었을 때는 세포가 dish에 붙지 않고 배지에 떠있는 것을 확인할 수 있지만, 54℃, 30분 동안 열처리를 하게 되면 세포가 dish에 부착되어 잘 자라는 것을 확인할 수 있었다(도 15).

이로 인해, PACs의 효과를 알아볼 때 NCS 대신 열처리를 한 Dark PACs, Light PACs, Light-Dark PACs를 가하였고, 이때 PACs의 농도를 1%, 5%, 10%로 다양하게 넣어주었으며, Control로 NCS를 넣지 않은 조건과 5% NCS를 넣어준 조건도 함께 실험하였다.

상기와 같이 처리한 후 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하였다.

세포수를 확인하기 위하여 배지를 제거하고 DPBS로 세척하여 1×TE buffer 200㎕를 넣어준 후 2분 동안 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 반응시킨 다음 DPBS 800㎕를 첨가하여 세포를 떨어뜨렸다.

dish에서 떨어뜨린 세포 10㎕와 Trypan blue 염색 용액 10㎕를 섞어준 뒤 세포계수기(Hemocytometer)에 커버글라스(cover glass)를 덮고 10㎕를 로딩(loading)하였으며, 현미경으로 관찰하면서 셀 카운터기(cell counter)를 이용해 세포수를 확인하였을 때 Dark PACs에서 가장 잘 자라는 것을 확인하였다(도 16).

PACs를 처리하였을 때, 세포내에서 스트레스 여부를 확인하기 위하여 Lyso Tracker dye를 처리하여 공초점 레이저 주사현미경(Confocal Laser Scanning Microscope)을 이용해 리소좀을 확인하였다.

Coverglass bottom dish에 2ml DMEM을 넣어주고 세포를 넣어준 뒤 30℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 12시간 배양한 뒤 배지를 제거하고 DPBS로 세척한 후, NCS를 넣지 않은 DMEM, 5% NCS, 5% Dark PACs, 5% Light PACs, 5%Light-Dark PACs를 넣은 DMEM을 2ml 씩 각각 넣어주고 30℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 배양하였다.

DPBS로 세척한 뒤 리소좀만 염색시키는 Lyso Tracker Red DND-99 100nM을 처리하여 1분 동안 30℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 반응시켜 염색하고 DPBS로 세척한 뒤 4% Para chloroform 500㎕를 넣어주어 30℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 고정시킨 후 DPBS로 세척하고 DPBS 1ml을 넣어 세포가 마르지 않게 하였다.

공초점 레이저 주사현미경(Confocal Laser Scanning Microscope)으로 리소좀을 확인하였을 때, 5% NCS를 넣어준 세포에서 가장 적게 확인이 되었으며, Dark PACs를 처리한 세포에서는 NCS를 넣어주지 않은 세포에서보다 리소좀이 적게 확인이 되었다.

하지만 Light PACs나 Light-Dark PACs에서는 NCS를 넣어주지 않은 세포에서 보다 리소좀이 많이 확인되었다.

이렇게 확인된 리소좀의 빛의 세기를 수치화하여 비교해보았을 때, 0% NCS를 기준으로 Dark PACs를 처리한 세포에서는 낮게, Light PACs, Light-Dark PACs를 처리한 세포에서는 높게 확인되었다(도 17).

화학적으로 변이시킨 균주로 추출한 PACs를 넣어주었을 때 미세수중생물인 물벼룩의 성장 및 생식의 영향확인

본 발명에서는 물벼룩을 배양시 Daphnia water(0.012% MgSO₄, 0.0192% NaHCO₃, 0.0008% KCl, 0.012% CaSO₄·2H₂O)에 YTC(Yeast, Tetramine, Ceropyl), Algae를 넣어 주는데, Algae 대신 변이시킨 균주 MBTLJ-8에서 추출한 PACs를 넣어주었을 때 물벼룩의 성장이나 생식에 영향을 미치는지 확인해 보았으며, 이때에는 열처리하지 않은 PACs를 사용하였다.

600ml 비커에 Daphnia water 500ml, 10마리의 물벼룩을 넣어주었다.

그리고 4개의 비커에 YTC 1ml, YTC 1ml + Algae 100㎕, YTC 1ml + Dark PACs 100㎕, YTC 1ml + Light PACs 100㎕을 각각 넣어주고, 매일 Daphnia water를 갈아 주었으며 20℃, Light 8시간, Dark 1시간 인큐베이터에서 3주 동안 배양하였다.

Algae와 Dark PACS를 넣어준 물벼룩은 9일째 첫 번째 baby를 낳았으며, 11일째 Light PACs를 넣어준 물벼룩에서도 baby를 확인할 수 있었다.

또한 3주 동안 배양하였을 때 전체 baby수를 확인해본 결과 PACs를 넣어준 물벼룩에서 많은 baby를 낳았으며 Dark PACs를 넣어준 물벼룩이 가장 많이 낳은 것을 확인할 수 있다(도 18).

빛 조건에 따른 로도박터스페로이드의 성장 변화확인

본 발명에서는 상기 실시예 1에서 나타낸 화학적 변이시킨 MBTLJ-8 균주를 sistrom's minimal medium 5ml에 접종하여 진탕배양하고, 접종액 1ml을 sistrom's minimal medium 100ml에 넣고 빛을 차단시킨 조건, 3와트(W) 빛에 노출시킨 조건, 15와트(W) 빛에 노출시킨 조건으로 30℃, 180 rpm, 48시간 동안 각각 배양하였다.

빛의 세기를 다르게 하여 로도박터스페로이드의 성장을 비교해보았을 때 15W 빛에 노출된 조건에서 약간 잘 자라는 것을 확인할 수 있었다(도 19).

또한, 빛 노출 시간에 따른 성장 비교를 위해 48시간 동안 빛을 차단시킨 조건과 빛을 차단시키지 않은 조건, 24시간 동안 노출시킨 후 24시간 동안 빛을 차단시켰을 때의 성장을 비교해 보았으며 이때의 빛의 세기는 15와트(W)로 하였다.

48시간 동안 빛에 노출시켰을 때 세포의 성장이 가장 좋은 것을 확인할 수 있으며, 빛을 차단시킨 조건에서도 성장이 그다지 나빠지지 않음을 확인할 수 있었다(도 20).

화학적으로 변이시킨 균주의 세포내 색소함량 확인

본 발명에서는 로도박터 스페로이드를 화학적으로 변이시킨 MBTLJ-8 균주를 빛 조건을 다르게 하였을 때 박테리오클로로필과 카로티노이드 함량이 어떻게 달라지는지를 확인하였다.

먼저, sistrom'sminimal medium 10ml에 상기 실시예 2에서 화학적 변이시킨 로도박터 스페로이드를 접종하여 30℃, 180rpm, 48시간 동안 진탕배양시키고 sistrom's minimal medium 100ml에 접종한 배양액 1ml을 첨가하였다.

그리고 15와트(W) 빛에 노출시킨 상태로 48시간 동안 배양한 조건, 15W 빛에 24시간 동안 노출시킨 후 빛을 차단시키고 24시간 동안 배양한 조건, 빛을 차단시키고 48시간 동안 배양한 조건 각각을 30℃, 180rpm으로 배양하였다.

먼저 48시간 후 흡광도 측정을 위해 UV spectrometer를 통해 600nm에서 측정하였고, 세포의 건조중량을 확인하기 위하여 세포 5ml를 회수한 후 동결건조기를 이용하여 수분을 제거하고 무게를 측정하였다.

박테리오 클로로필을 측정하기 위하여 배양액 10ml를 3000rpm, 10분 동안 원심분리하여 세포만 회수하고, 아세톤 : 메탄올 : 배지 = 7 : 2 : 1의 비율로 넣어준 뒤 빛을 차단시키고 1시간 동안 반응시킨 후 772nm에서 흡광도 측정을 하였을 때 빛을 차단시킨 조건에서 박테리오 클로로필 함량이 가장 높은 것을 확인할 수 있었다(도 21).

그리고 카로티노이드 함량을 측정하기 위하여 배양액을 10000rpm, 20분 동안 원심분리 후 세포를 멸균수로 2번 세척하고 -50℃, 48시간 동안 동결 건조하였다.

건조된 세포에 3M HCl을 넣어주고 28℃, 100rpm으로 30분 동안 반응시키고, 10000rpm, 20분 동안 원심분리하여 상층액을 버렸다.

아세톤을 넣고 28℃, 100rpm, 30분 동안 반응시키고, 10000rpm, 20분 동안 원심분리하여 상층액을 회수하였다.

UV 분광광도계(spectrophotometer)를 통해 480nm에서 흡광도를 측정하였으며 아래의 식에 대입하여 카로티노이드 함량을 확인하였을 때 빛을 차단시킨 조건에서 가장 높은 것을 확인할 수 있다(도 22).

카로티노이드함량(㎍/g)=

Claims

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로도박터 스페로이드의 변이균주 MBTLJ-8(기탁번호 : KACC91572P) 추출액인 PACs{Photosynthetic Activating(or Alternative) Compounds}를 유효성분으로 포함하는 성장촉진용 배지조성물에 있어서,
상기 추출액은 로도박터 스페로이드의 변이균주 MBTLJ-8를 시스트롬 최소배지(sistrom's minimal medium)에 접종하여 30℃, 180rpm으로 48시간 동안 진탕배양한 후 얻어진 배양액을 시스트롬 최소배지에 첨가하여 30℃, 180rpm으로 48시간동안 빛이 완전히 없는 상태에서 본배양하고 나서 상기 배양된 세포와 배지를 4℃, 5000rpm, 30분 동안 세포와 배지를 원심분리시키고 침전되어 있는 세포만 회수한 다음 다시 상기 배양액의 1/20이 되도록 모은 세포에 멸균수를 넣어 부피를 맞춘 후에 냉장상태에서 20초 pulse, 10초 휴식 조건으로 총 30분 동안 초음파 분쇄한 후에 4℃, 13000rpm, 30분 동안 원심분리한 상층액을 필터로 걸러서 나온 용액을 추출하여 제조되되,
클로스트리디움 아세토 부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum) 또는 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae)에 대해 성장 증가 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 성장촉진용 배지조성물.
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로도박터 스페로이드의 변이균주 MBTLJ-8(기탁번호 : KACC91572P) 추출액인 PACs{Photosynthetic Activating(or Alternative) Compounds}를 유효성분으로 포함하는 성장촉진용 배지조성물에 있어서,
상기 추출액은 로도박터 스페로이드의 변이균주 MBTLJ-8를 시스트롬 최소배지(sistrom's minimal medium)에 접종하여 30℃, 180rpm으로 48시간 동안 진탕배양한 후 얻어진 배양액을 시스트롬 최소배지에 첨가하여 30℃, 180rpm으로 48시간동안 빛이 완전히 없는 상태에서 본배양하고 나서 상기 배양된 세포와 배지를 4℃, 5000rpm, 30분 동안 세포와 배지를 원심분리시키고 침전되어 있는 세포만 회수한 다음 다시 상기 배양액의 1/20이 되도록 모은 세포에 멸균수를 넣어 부피를 맞춘 후에 냉장상태에서 20초 pulse, 10초 휴식 조건으로 총 30분 동안 초음파 분쇄한 후에 4℃, 13000rpm, 30분 동안 원심분리한 상층액을 필터로 걸러서 나온 용액을 추출하여 제조되되,
HeLa cell의 세포성장 및 세포내 스트레스 감소 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 성장촉진용 배지조성물.
로도박터 스페로이드의 변이균주 MBTLJ-8(기탁번호 : KACC91572P) 추출액인 PACs{Photosynthetic Activating(or Alternative) Compounds}를 유효성분으로 포함하는 성장촉진용 배지조성물에 있어서,
상기 추출액은 로도박터 스페로이드의 변이균주 MBTLJ-8를 시스트롬 최소배지(sistrom's minimal medium)에 접종하여 30℃, 180rpm으로 48시간 동안 진탕배양한 후 얻어진 배양액을 시스트롬 최소배지에 첨가하여 30℃, 180rpm으로 48시간동안 빛이 완전히 없는 상태에서 본배양하고 나서 상기 배양된 세포와 배지를 4℃, 5000rpm, 30분 동안 세포와 배지를 원심분리시키고 침전되어 있는 세포만 회수한 다음 다시 상기 배양액의 1/20이 되도록 모은 세포에 멸균수를 넣어 부피를 맞춘 후에 냉장상태에서 20초 pulse, 10초 휴식 조건으로 총 30분 동안 초음파 분쇄한 후에 4℃, 13000rpm, 30분 동안 원심분리한 상층액을 필터로 걸러서 나온 용액을 추출하여 제조되되,
물벼룩 성장 및 생식의 증가 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 성장촉진용 배지조성물.
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배지조성물의 제조방법에 있어서,
로도박터 스페로이드의 변이균주 MBTLJ-8을 시스트롬 최소배지(sistrom's minimal medium)에 접종하여 30℃, 180rpm으로 48시간 동안 진탕배양하여 배양액 3을 제조하는 제1단계;
상기 배양액 3을 다시 시스트롬 최소배지에 첨가하여 30℃에서 180rpm으로 빛이 완전히 없는 상태에서 48시간 동안 본배양(本培養)하여 배양액 4를 제조하는 제2단계;
상기 배양액 4를 4℃, 5000rpm, 30분 동안 원심분리하여 세포와 배지를 분리시킨 후, 침전된 세포만 회수한 다음, 멸균수를 넣고 분쇄한 후 다시 원심분리하고 나서 그 상층액을 여과하여 로도박터 스페로이드의 변이균주 MBTLJ-8의 추출액인 PACs{Photosynthetic Activating(or Alternative) Compounds}가 포함된 배지조성물을 제조하는 제3단계;로 구성되되,
클로스트리디움 아세토 부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum) 또는 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae)에 대해 성장 증가 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 성장촉진용 배지조성물의 제조방법.
배지조성물의 제조방법에 있어서,
로도박터 스페로이드의 변이균주 MBTLJ-8을 시스트롬 최소배지(sistrom's minimal medium)에 접종하여 30℃, 180rpm으로 48시간 동안 진탕배양하여 배양액 3을 제조하는 제1단계;
상기 배양액 3을 다시 시스트롬 최소배지에 첨가하여 30℃에서 180rpm으로 빛이 완전히 없는 상태에서 48시간 동안 본배양(本培養)하여 배양액 4를 제조하는 제2단계;
상기 배양액 4를 4℃, 5000rpm, 30분 동안 원심분리하여 세포와 배지를 분리시킨 후, 침전된 세포만 회수한 다음, 멸균수를 넣고 분쇄한 후 다시 원심분리하고 나서 그 상층액을 여과하여 로도박터 스페로이드의 변이균주 MBTLJ-8의 추출액인 PACs{Photosynthetic Activating(or Alternative) Compounds}가 포함된 배지조성물을 제조하는 제3단계;로 구성되되,
HeLa cell의 세포성장 및 세포내 스트레스 감소 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 성장촉진용 배지조성물의 제조방법.
배지조성물의 제조방법에 있어서,
로도박터 스페로이드의 변이균주 MBTLJ-8을 시스트롬 최소배지(sistrom's minimal medium)에 접종하여 30℃, 180 rpm으로 48시간 동안 진탕배양하여 배양액 3을 제조하는 제1단계;
상기 배양액 3을 다시 시스트롬 최소배지에 첨가하여 30℃에서 180 rpm으로빛이 완전히 없는 상태에서 48시간 동안 본배양(本培養)하여 배양액 4를 제조하는 제2단계;
상기 배양액 4를 4℃, 5000rpm, 30분 동안 원심분리하여 세포와 배지를 분리시킨 후, 침전된 세포만 회수한 다음, 멸균수를 넣고 분쇄한 후 다시 원심분리하고 나서 그 상층액을 여과하여 로도박터 스페로이드의 변이균주 MBTLJ-8의 추출액인 PACs{Photosynthetic Activating(or Alternative) Compounds}가 포함된 배지조성물을 제조하는 제3단계;로 구성되되,
물벼룩 성장 및 생식의 증가 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 성장촉진용 배지조성물의 제조방법.