KR101321144B1 - Vitrification medium for stem cells and vitrification method for stem cells using the same - Google Patents
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Abstract
본 발명은 줄기세포(stem cell)의 동결보존(cryopreservation)에 사용되는 조성물 및 상기 조성물을 이용하는 줄기세포의 동결보존방법에 관한 것이다. 본 발명의 줄기세포 동결보존액 및 이를 이용한 동결보존방법에 따르면, 줄기세포를 장기간 보존이 가능하고, 해동 후 생존율이 높을 뿐만 아니라, 해동 후 별도의 처리 없이도 바로 생체에 적용할 수 있는 우수한 효과가 있다. The present invention relates to a composition used for cryopreservation of stem cells and a cryopreservation method of stem cells using the composition. According to the stem cell cryopreservation solution of the present invention and the cryopreservation method using the same, the stem cells can be stored for a long time, have a high survival rate after thawing, and have an excellent effect that can be directly applied to a living body without additional treatment after thawing. .
Description
본 발명은 줄기세포(stem cell)의 동결보존(cryopreservation)에 사용되는 조성물 및 상기 조성물을 이용하는 줄기세포의 동결보존방법에 관한 것이다.The present invention relates to a composition used for cryopreservation of stem cells and a cryopreservation method of stem cells using the composition.
줄기세포(stem cell)는 신체 내의 모든 장기와 조직의 근간이 되는 세포로서 자기 재생이 가능하고, 적절한 환경 아래 각종 혈구세포와 조직세포뿐만 아니라 특정한 기관이나 조직으로 분화할 수 있는 능력을 지닌 세포이다. 1998년 Dr. Thomson이 처음으로 사람의 배아세포로부터 줄기세포를 분리하는데 성공한 이래, 이 줄기세포를 이용하여 많은 희귀병이나 난치병들을 치료하려는 연구와 시도가 활발하게 일어나고 있고, 특히 재생불량성 빈혈, 암종, 관절염, 뇌졸중, 백혈병, 악성 자가면역성 질환 등에서도 좋은 치료 결과를 보고하고 있으며, 일부 난치병에서는 상용화 단계에 이르고 있다.
Stem cells, which are the basis of all organs and tissues in the body, are capable of self-renewal and have the ability to differentiate into specific organs or tissues as well as various blood cells and tissue cells under appropriate circumstances. . 1998 Since Thomson's first success in separating stem cells from human embryonic cells, research and attempts have been actively made to use them to treat many rare and intractable diseases, particularly aplastic anemia, carcinoma, arthritis, stroke, Leukemia, malignant autoimmune diseases, etc. have reported good treatment results, and some intractable disease is reaching the commercialization stage.
줄기세포는 크게 배아줄기세포(embryonic stem cells) 및 성체줄기세포(adult stem cells)로 나눌 수 있다.Stem cells can be largely divided into embryonic stem cells (adryonic stem cells) and adult stem cells (adult stem cells).
배아줄기세포는 배아로부터 줄기세포를 획득하여 이를 여러 가지의 세포로 분화시켜 각종 장기와 조직을 형성시키고자 하나, 아직까지 이의 단계적 발생과 분화하는 기전을 명확히 알고 있지 못하므로 적용에 문제점이 있다. 또한, 배아줄기세포로부터 줄기세포를 획득하는 방법은 다른 조직에서 획득한 줄기세포보다 분화능이 뛰어나서 활용도가 월등하게 높은 장점을 가지는 방법이기는 하지만, 생명윤리적, 정치사회적, 생물학적 규제 면에서 제한적이며 임상에 적용하기에는 재현성 및 부작용 등 아직 풀어야할 과제가 많다.Embryonic stem cells attempt to form various organs and tissues by acquiring stem cells from embryos and differentiating them into various cells, but there is a problem in application because it does not know the stages of development and differentiation. In addition, the method of obtaining stem cells from embryonic stem cells is a method of obtaining differentiation ability from stem cells obtained from other tissues and thus having a much higher utilization rate, but is limited in terms of bioethics, political, social, and biological regulation and is clinically limited. There are still many challenges to solve, such as reproducibility and side effects.
이에 비하여, 성체줄기세포는 사람과 동물의 태아시기부터 태반, 제대혈, 혈액, 폐, 간, 또는 골수로부터 발생되어 나오는 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cells)로 대표되는 것으로서 골아세포, 근육, 연골, 건, 및 지방조직으로 발전할 수 있는 능력을 가지고 있음이 입증되었고, 이의 분리와 활용에 관하여 많은 연구가 수행되어 왔다. 또한, 이들 중간엽줄기세포는 혈액, 심장근육세포, 간세포 및 신경세포로도 분화가 가능함이 주장되고 있다. 현재까지는 주로 골수나 지방조직으로부터 줄기세포를 확보하는 기술이 개발되어 왔으나, 이 방법은 수술적(침습적)으로 채취하여야 하므로 고통이 수반되며 채취과정이 어려운 문제점이 있다. 한편, 다능성을 가지고 있는 줄기세포는 제대혈로부터도 다량 획득이 가능하다. 제대혈 유래 줄기세포는 재생능력이 우수하여 증식배양이 잘 되며, 제대혈 속의 림프구는 골수나 혈액보다 덜 성숙되어 있어 면역학적 부적합 확률이 낮아 거부반응이나 감염 위험성이 매우 적은 편이어서 골수기증자를 찾지 못한 환자에게 골수이식 대안으로 떠오르고 있다. 또한, 제대혈 이용의 장점은 폐기되는 탯줄에서 중간엽줄기세포와 조혈모세포를 채취하면 되므로 기증자에게 아무런 신체상 고통이 없다는 점이다.
In contrast, adult stem cells are represented by mesenchymal stem cells that originate from the placenta, umbilical cord blood, blood, lung, liver, or bone marrow from the fetal phase of humans and animals, and represent osteoblasts, muscle, cartilage, It has proved its ability to develop healthy and adipose tissue, and much research has been conducted on its isolation and utilization. In addition, these mesenchymal stem cells are claimed to be able to differentiate into blood, cardiomyocytes, hepatocytes and neurons. Until now, techniques for securing stem cells from bone marrow or adipose tissue have been developed, but this method has to be collected surgically (invasive), so the pain is accompanied and the collection process is difficult. On the other hand, stem cells having pluripotency can be obtained in large quantities from umbilical cord blood. Umbilical cord blood-derived stem cells have excellent regenerative capacity and are well-proliferated, and lymphocytes in umbilical cord blood are less mature than bone marrow or blood, and thus have a low risk of rejection or infection due to a low probability of immunological incompatibility. Has emerged as an alternative to bone marrow transplantation. In addition, the advantage of using cord blood is that there is no physical pain to the donor because the mesenchymal stem cells and hematopoietic stem cells are collected from the discarded umbilical cord.
제대혈뿐만 아니라 체지방 등 각종 신체 조직으로부터 분리된 조혈줄기세포, 중간엽줄기세포 및 분화된 줄기세포의 장기보존을 위하여서는 냉동기법의 활용이 필수적이며, 유사시를 대비한 장기보관뿐만 아니라, 제대혈로부터 다량의 줄기세포를 증식하여 확보하고, 필요한 조직 재생을 위한 각종 세포로의 분화 및 치료를 위한 이식 등에서 매우 유용한 것이다. 그러나, 아직까지 채취할 수 있는 제대혈이 한정적이며, 또한 채취된 제대혈에 포함되어 있는 줄기세포의 양이 한정적이다. 그리고, 인체에 무해하며 재현성이 우수한 동결보존 기술의 개발이 매우 요구되는 실정이다.For long-term preservation of hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, and differentiated stem cells isolated from various body tissues such as body fat, as well as cord blood, freezing techniques are essential, and long-term storage for emergencies as well as large amounts from cord blood It is very useful in proliferating and securing stem cells and transplanting for differentiation and treatment into various cells for necessary tissue regeneration. However, cord blood can still be collected and the amount of stem cells contained in the collected cord blood is limited. In addition, the development of cryopreservation technology, which is harmless to the human body and excellent in reproducibility, is highly required.
종전에는 줄기세포를 포함한 각종의 체세포와 수정란, 난자 및 정자와 같은 생식세포, 혈액 등의 냉동보존을 위하여 DMSO(dimethyl sulfoxide)와 같은 물질이 항동제로 널리 사용되어 왔다. DMSO는 5~20% 범위의 농도로서 사용되어 왔으며, 이는 세포 포면에서 초자화함으로서 세포막과 단백질을 안정화시킨다. 이와 더불어 글리세롤(glycerol), 에틸렌 글리콜(ethylene glycol), 하이드록시셀룰로오스(hydroxycellulose), 디사카라이드(disaccharides) 수크로오스(sucrose), 말토오스(maltose), 트레할로오스(trehalose)와 같은 물질이 생존율 향상을 위하여 DMSO와 혼합하여 사용되기도 하였다. Previously, substances such as dimethyl sulfoxide (DMSO) have been widely used as anti-inflammatory agents for cryopreservation of various somatic cells including stem cells, germ cells such as eggs and sperm, and blood. DMSO has been used at concentrations ranging from 5-20%, which stabilizes cell membranes and proteins by vitrifying at the cell surface. In addition, materials such as glycerol, ethylene glycol, hydroxycellulose, disaccharides sucrose, maltose and trehalose improve survival rates. It was also used in combination with DMSO.
그러나, DMSO는 냉동-융해 후 세포의 생존과 성장을 방해하여 배양액에 혼입되는 것이 바람직하지 않으며, 동결된 줄기세포를 직접 이식하고자 할 경우 생체에 주입되면 세포 독성이 강하여 직접 주입이 회피된다. 그러므로 줄기세포에 독성이 적고 환자의 생체 내에 직접 주입이 가능한 항동제의 개발이 필요하다.However, DMSO is not desirable to be incorporated into the culture medium by interfering with the survival and growth of cells after freezing-thawing, and when injected directly into the frozen stem cells, the cytotoxicity is strong and direct injection is avoided. Therefore, there is a need for the development of anti-inflammatory drugs that are less toxic to stem cells and can be directly injected into the patient's body.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 줄기세포를 안전하게 장기간 보존할 수 있으며, 해동후 바로 생체에 적응할 수 있는 동결보존액 및 이를 이용한 중기세포의 동결보존방법을 제공하고자 하는 것이다.The present invention has been made to solve the above problems, the problem to be solved in the present invention can safely preserve the stem cells long-term, cryopreservation solution that can be adapted to the living body immediately after thawing and freezing of medium-term cells using the same It is to provide a preservation method.
상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 PBS(phosphate buffered saline) 용액 중 0.2~0.4M의 수크로오스(sucrose), 40부피% 이상의 에틸렌글리콜(ethylene glycol) 및 10~30부피%의 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone)을 포함하는 줄기세포(stem cell) 동결보존액을 제공하는 것을 특징으로 한다.
In order to solve the above problems, the present invention is 0.2 ~ 0.4M sucrose (Sucrose), 40% by volume or more of ethylene glycol (ethylene glycol) and 10 to 30% by volume of polyvinyl chloride in PBS (phosphate buffered saline) solution It is characterized by providing a stem cell (stem cell) cryopreservation solution containing a lollidon (polyvinylpyrrolidone).
상기 줄기세포는 성체줄기세포(adult stem cell)인 것이 바람직하다.The stem cell is preferably an adult stem cell (adult stem cell).
상기 성체줄기세포는 골수(bone marrow), 말초혈액, 제대혈 또는 체지방 유래인 것이 바람직하다.
The adult stem cells are preferably derived from bone marrow, peripheral blood, umbilical cord blood or body fat.
또한, 본 발명은 배양된 줄기세포를 원심분리하여 세포침전물을 얻고, 상기 세포침전물에 상기 본 발명의 동결보존액을 첨가한 후, 액체질소탱크에 보관하는 줄기세포 동결보존방법을 제공하는 것을 특징으로 한다.
In addition, the present invention is to obtain a cell precipitate by centrifugation of the cultured stem cells, and after adding the cryopreservation solution of the present invention to the cell precipitate, characterized in that it provides a stem cell cryopreservation method for storing in a liquid nitrogen tank. do.
상기 방법에 있어서, 세포침전물에 동결보존액을 첨가하기 전, 상기 세포침전물에 40부피% 이상의 에틸렌글리콜(ethylene glycol)을 포함하는 PBS(phosphate buffered saline) 용액을 첨가하는 단계를 더 포함하는 것이 바람직하다.In the method, it is preferable that the method further comprises adding a phosphate buffered saline (PBS) solution containing at least 40% by volume of ethylene glycol to the cell precipitate before adding the cryopreservation solution to the cell precipitate. .
상기 줄기세포는 성체줄기세포(adult stem cell)인 것이 바람직하다.The stem cell is preferably an adult stem cell (adult stem cell).
상기 성체줄기세포는 골수(bone marrow), 말초혈액, 제대혈 또는 체지방 유래인 것이 바람직하다.The adult stem cells are preferably derived from bone marrow, peripheral blood, umbilical cord blood or body fat.
본 발명의 줄기세포 동결보존액 및 이를 이용한 동결보존방법에 따르면, 줄기세포를 장기간 보존이 가능하고, 해동 후 생존율이 높을 뿐만 아니라, 해동 후 별도의 처리 없이도 바로 생체에 적용할 수 있는 우수한 효과가 있다.According to the stem cell cryopreservation solution of the present invention and the cryopreservation method using the same, the stem cells can be stored for a long time, have a high survival rate after thawing, and have an excellent effect that can be directly applied to a living body without additional treatment after thawing. .
도 1은 제대혈 유래의 단핵세포구로부터 발달된 성체줄기세포를 나타낸 사진이다. A는 제대혈 유래 단핵세포구로부터 발달된 성체줄기세포를 50 배율로 사진 촬영한 것이고, B는 제대혈로부터 분리된 단핵세포구로부터 발달된 성체줄기세포를 PAS 염색하여 50 배율로 사진 촬영한 것이다.
도 2는 제대혈 유래 단핵세포구로부터 발달된 성체줄기세포를 연골세포로 분화시킨 것을 위상차 현미경으로 50 배율로 사진 촬영한 것이다.
도 3은 제대혈 유래 단핵세포구로부터 발달된 성체줄기세포를 배양접시에서 특수배양액으로 배양하여 연골세포로 분화시킨 것을 사프라닌-O(Safranin-O)로 염색하여 위상차 현미경으로 100 배율로 사진 촬영한 것이다. 붉은 색으로 염색된 세포가 연골세포로 분화된 것이다.
도 4는 제대혈 유래 단핵세포구로부터 발달된 성체줄기세포를 배양접시에서 특수배양액으로 배양하여 연골세포로 발달시킨 것을 면역항체반응법으로 염색하여 타입-II 콜라겐(Type-II collagen)의 발현을 형광현미경으로 50 배율로 사진 촬영한 것이다. 녹색으로 염색된 세포가 연골세포로 분화된 것임을 나타내는 것이다.
도 5는 초자화동결법(vitrification)으로 초급속으로 냉동보존된 제대혈 유래 줄기세포를 융해 후, 생존을 확인하기 위하여 트리판 블루(Trypan blue)로 염색하여 위상차현미경으로 100 배율로 사진 촬영한 것이다. 밝고 투명한 세포가 살아있는 세포이며, 어두운 청색으로 염색된 세포가 죽은 세포이다.
도 6은 초자화동결법으로 초급속으로 냉동보존된 사람 제대혈 유래 줄기세포를 융해한 다음 7일간 배양하여 정상으로 발달된 것을 50 배율로 사진 촬영한 것이다.1 is a photograph showing adult stem cells developed from umbilical cord blood-derived monocytes. A is photographed at 50 magnification of adult stem cells developed from umbilical cord blood-derived monocytes, and B is photographed at 50 magnification by PAS staining of adult stem cells developed from monocytes isolated from umbilical cord blood.
Figure 2 is a photograph of the differentiation of adult stem cells developed from umbilical cord blood-derived monocytes into chondrocytes at 50 magnification with a phase contrast microscope.
FIG. 3 shows that adult stem cells developed from umbilical cord blood-derived monocytes were cultured with special culture medium in a culture plate and differentiated into chondrocytes, stained with safranin-O, and photographed at 100 magnification using a phase contrast microscope. It is. Red stained cells are differentiated into chondrocytes.
Figure 4 shows that adult stem cells developed from umbilical cord blood-derived mononuclear cell cells were cultured with special culture fluid in a culture plate and developed into chondrocytes, and stained with the antibody-type immunofluorescence method to fluoresce the expression of Type-II collagen (Type-II collagen). The picture was taken at 50 magnification under a microscope. Green stained cells indicate that they have differentiated into chondrocytes.
FIG. 5 shows the umbilical cord blood-derived stem cells cryopreserved at a rapid rate by vitrification, and stained with trypan blue to confirm their survival and photographed at 100 magnification with a phase contrast microscope. Light and transparent cells are living cells, and dark blue stained cells are dead cells.
FIG. 6 is a photograph taken at 50 magnification of a human cord blood-derived stem cell cryopreserved at a rapid rate by vitrification and cultured for 7 days and then developed normally.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 PBS(phosphate buffered saline) 용액 중 0.2~0.4M의 수크로오스(sucrose), 40부피% 이상의 에틸렌글리콜(ethylene glycol) 및 10~30부피%의 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone)을 포함하는 줄기세포(stem cell) 동결보존액을 제공하는 것을 특징으로 한다.
The present invention is a stem containing 0.2 ~ 0.4M sucrose (phospho buffered saline) solution, more than 40% by volume of ethylene glycol (ethylene glycol) and 10 ~ 30% by volume of polyvinylpyrrolidone (polyvinylpyrrolidone) It is characterized by providing a cell (stem cell) cryopreservation solution.
상기 줄기세포는 성체줄기세포(adult stem cell)일 수 있으며, 골수(bone marrow), 말초혈액, 제대혈 또는 체지방 유래일 수 있다.
The stem cells may be adult stem cells, and may be derived from bone marrow, peripheral blood, umbilical cord blood or body fat.
DMSO 등을 이용한 완만동결(slow freezing)에 비하여 초자화동결(vitrification) 에 의한 급속냉동기법은 생체 세포를 동결보존제에 넣어 초급속으로 동결시킴으로서 세포 내에 얼음 결정의 형성을 방지하여 생존성을 향상시킬 수 있다. 이 기법으로 사람과 동물의 생식세포나 줄기세포의 장기보존에 효과적으로 사용되어 오고 있다. 초자화동결에 의한 급속냉동기법은 완만동결기법에 비하여 다음과 같은 장점이 있어 사람과 동물의 생식세포나 줄기세포의 장기보존에 효과적으로 사용되어 오고 있다. Compared to the slow freezing using DMSO, the rapid freezing method by vitrification can improve the viability by preventing the formation of ice crystals in the cells by freezing at a rapid rate by placing the living cells in a cryopreservative. have. This technique has been used effectively for long-term preservation of germ and stem cells in humans and animals. Rapid freezing by vitrification freezing has the following advantages over slow freezing and has been used effectively for long-term preservation of germ and stem cells in humans and animals.
(1) 세포 손상이 적다. (1) Less cell damage
(2) 안전하고 간편하며 급속도로 냉동보존이 가능하다. (2) It is safe and simple, and can be frozen quickly.
(3) 프로그램화된 냉각장치가 필요하지 않다. (3) No programmed chiller is required.
(4) 세포의 생존율이 높다. (4) The cell survival rate is high.
(5) 독성이 적어 생체 내 직접 주입이 가능하다.(5) It is less toxic and can be directly injected in vivo.
세포의 동결과정에서 일어나는 세포내 수분의 결빙현상은 세포의 구조 손상의 주요한 요인이다. 근래에는 항동제로 널리 사용되어 오던 DMSO, 글리세롤(glycerol), 에틸렌글리콜(ethylene glycol)과 같은 세포투과성 동결방지제에 수크로오스(sucrose), 말토오스(maltose), 트레할로오스(trehalose) 등과 같은 이탄당 물질이나 덱스트란(dextran), 혈청, 알부민 등의 비투과성 동결방지제를 혼합하여 수정란이나 줄기세포를 장기간 보존하려는 기술이 개발되고 있다. 세포 투과성 동결방지제는 세포 내로 침투하여 세포내 수분량을 감소시켜 동결시 세포 내 빙정형성을 억제하여 세포를 보호하지만, 비투과성 동결방지제는 동결직전 세포 내 수분의 유출을 조장하여 세포 내외의 삼투평형을 초래하여 세포막의 손상을 방지한다.
Freezing of intracellular moisture during cell freezing is a major factor in cell structural damage. Recently, it has been widely used as an anti-inflammatory agent, and cell-permeable cryoprotectants such as DMSO, glycerol, and ethylene glycol are peat sugar substances such as sucrose, maltose and trehalose. A technique for long term preservation of fertilized eggs or stem cells by mixing non-permeable cryoprotectants such as dextran, serum, and albumin has been developed. Cell-permeable cryoprotectants protect cells by inhibiting intracellular ice crystal formation during freezing by reducing intracellular water content, while non-permeable cryoprotectants encourage the outflow of intracellular water just before freezing to prevent osmotic equilibrium inside and outside the cell. To prevent damage to the cell membrane.
상기 PBS(phosphate buffered saline) 용액에는 10부피%의 FBS(fetal bovine serum)를 더 포함할 수 있다.
The phosphate buffered saline (PBS) solution may further include 10% by volume of fetal bovine serum (FBS).
상기 수크로오스는 다양한 생물체에 높은 농도로 발견되며 생물체가 건조되더라도 생존하게 하는 기능을 가지고 있다. 이 물질은 세포가 동결되거나 건조될 때에 안정되게 하는 기능을 가지고 있어서 이를 혼합한 용액은 세포의 초자화를 형성하여 냉동보존이나 건조과정에서 단백질을 보호하며 인지질의 파괴를 방지함으로서 세포막을 보호한다. 수크로오스의 농도가 0.2M 미만인 경우에는 세포의 해동 후 생존율이 급격이 감소하게 되며, 0.4M을 초과하는 경우에는 세포 독성이 나타나는 문제점이 있다.
The sucrose is found in high concentrations in various organisms and has a function to survive the drying of the organisms. The substance has the function of stabilizing cells when they are frozen or dried, and the mixed solution forms the cell's vitrification, protecting proteins during cryopreservation or drying and protecting cell membranes by preventing phospholipid destruction. If the concentration of sucrose is less than 0.2M, the survival rate after the thawing of the cells is sharply reduced, if the concentration exceeds 0.4M there is a problem that cytotoxicity appears.
상기 에틸렌글리콜은 비교적 세포 독성이 적으며, 세포막 내에 빠르게 확산 침투하여 신속하게 평형을 이루는 장점이 있다. 에틸렌글리콜의 함량은 용액 중 40부피% 이상, 바람직하게는 40~60부피%인 것이 바람직하다. 상기 함량이 40부피% 미만인 경우에는 세포의 해동 후 생존율이 급격히 감소하는 문제점이 있으며, 60부피%를 초과하는 경우에는 세포 독성이 나타나는 문제점이 있다.
The ethylene glycol has a relatively low cytotoxicity, and has the advantage of rapidly equilibrating rapidly spreading and penetrating into the cell membrane. The content of ethylene glycol is preferably 40 vol% or more in the solution, preferably 40 to 60 vol%. When the content is less than 40% by volume, there is a problem that the survival rate after the thawing of the cells is sharply reduced, and when the content exceeds 60% by volume, there is a problem of cytotoxicity.
상기 폴리비닐피롤리돈은 세포 독성이 적고 용해성이 좋으며 낮은 점도를 가지고 있으며 냉동보존제에 의한 거대분자 물질의 침투를 증진시키는 작용을 한다. 또한 줄기세포의 동결과정에서 세포막을 보호하는 작용을 한다. 폴리비닐피롤리돈의 함량은 용액 중 10~30부피%이며, 상기 함량이 10부피% 미만이 경우에는 해동 후 생존율이 급격히 감소하는 문제점이 있고, 30부피%를 초과하는 경우에는 세포 독성이 나타나는 문제점이 있다.
The polyvinylpyrrolidone has a low cytotoxicity, good solubility, low viscosity, and serves to enhance the penetration of macromolecular substances by cryopreservatives. It also acts to protect the cell membrane during stem cell freezing. The content of polyvinylpyrrolidone is 10 to 30% by volume in the solution, when the content is less than 10% by volume there is a problem that the survival rate after thawing is sharply reduced, if the content exceeds 30% by volume cytotoxic There is a problem.
또한, 본 발명은 배양된 줄기세포를 원심분리하여 세포침전물을 얻고, 상기 세포침전물에 본 발명의 상기 동결보존액을 첨가한 후, 액체질소탱크에 보관하는 줄기세포 동결보존방법을 제공한다.
The present invention also provides a stem cell cryopreservation method by centrifuging the cultured stem cells to obtain a cell precipitate, and adding the cryopreservation solution of the present invention to the cell precipitate, and then storing it in a liquid nitrogen tank.
상기 방법은 세포침전물에 동결보존액을 첨가하기 전, 상기 세포침전물에 40부피% 이상의 에틸렌글리콜(ethylene glycol)을 포함하는 PBS(phosphate buffered saline) 용액을 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다.
The method may further comprise adding a phosphate buffered saline (PBS) solution containing 40 vol% or more of ethylene glycol to the cell precipitate before adding the cryopreservation solution to the cell precipitate.
상기 줄기세포는 성체줄기세포(adult stem cell)일 수 있으며, 골수(bone marrow), 말초혈액, 제대혈 또는 체지방 유래일 수 있다.
The stem cells may be adult stem cells, and may be derived from bone marrow, peripheral blood, umbilical cord blood or body fat.
상기 PBS(phosphate buffered saline) 용액에는 10부피%의 FBS(fetal bovine serum)를 더 포함할 수 있다.
The phosphate buffered saline (PBS) solution may further include 10% by volume of fetal bovine serum (FBS).
아래에서는 바람직한 본 발명의 바람직한 구체예를 통하여 본 발명을 상세하게 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail through preferred embodiments of the present invention.
1. 제대혈 유래 단핵세포구의 획득1. Acquisition of Umbilical Cord Blood-Derived Monocytes
본 발명에서 전구세포는 골수, 말초혈액, 제대혈, 체지방, 등으로부터 분리 가능하다. 본 발명에서 사용하는 제대혈은 인간을 포함한 포유동물에서 태반과 태아를 연결하는 제대정맥으로부터 채취된 혈액으로 정의되며, 본 발명의 조혈모세포 또는 전구세포 배양 및 증식 방법에서는 인간의 제대혈을 사용하는 것이 바람직하다. 제대혈은 분만 후 태반이 박리되기 전에 채취하며, 제대혈로부터 단핵세포를 분리하기 위해서는 피콜-하이팩 밀도구배 분리법(Ficoll-Hypaque density gradient method)과 같은 공지의 방법을 사용할 수 있다.Progenitor cells in the present invention can be separated from bone marrow, peripheral blood, umbilical cord blood, body fat, and the like. Umbilical cord blood used in the present invention is defined as blood collected from the umbilical vein connecting the placenta and the fetus in a mammal including a human, and in the method of culturing and proliferating the hematopoietic stem or progenitor cells of the present invention, human umbilical cord blood is preferably used. Do. Umbilical cord blood is collected after delivery and before detachment of the placenta, and known methods such as Ficoll-Hypaque density gradient method can be used to separate monocytes from umbilical cord blood.
구체적으로, 제대혈을 인산염 완충용액(phosphate buffered saline, PBS)과 혼합하여 희석한 후, 희석된 제대혈과 동량의 피콜-하이팩 용액(Ficoll-Hypaque, 밀도; 1.077 g/㎖)에 중첩시킨다. 이를 원심분리하여 적혈구층, 단핵세포층 및 혈청층을 분리한다. 파스퇴르 피펫(pasteur pipette) 등을 이용하여 단핵세포층만을 새로운 튜브로 옮기고, PBS 등으로 세척하여 단핵세포층 채취시 혼입된 피콜-하이팩 용액이나 오염된 혈소판을 제거한다. 이와 같이 분리된 단핵세포는 다분화능 전구/줄기세포의 분리 및 배양에 바로 이용하거나 초저온 냉동시켜 장기간 보관 후 사용할 수 있다.
Specifically, the cord blood is diluted with phosphate buffered saline (PBS) and diluted, and then superimposed on diluted cord blood and the same amount of Ficoll-Hypaque solution (Ficoll-Hypaque, density; 1.077 g / ml). It is centrifuged to separate the erythrocyte layer, monocyte layer and serum layer. Pasteur pipettes (pasteur pipette) or the like to transfer the mononuclear cell layer only to a new tube, and washed with PBS or the like to remove the collected picol-hipack solution or contaminated platelets. The mononuclear cells thus separated can be used immediately for isolation and culture of multipotent progenitor / stem cells or can be used after prolonged storage by cryogenic freezing.
2. 체지방 유래 단핵세포구의 획득2. Acquisition of Body Fat-Derived Monocytes
체지방조직은 항생제가 포함된 PBS 용액으로 잘 세척하고 0.075% collagenase 로 15 분간 처리한 다음 glucose 및 10% FBS가 함유된 DMEM 용액으로 중화시킨다. 원심분리로 세포들을 획득하여 배양에 사용한다.
Body fat tissue was washed well with PBS solution containing antibiotics, treated with 0.075% collagenase for 15 minutes, and neutralized with DMEM solution containing glucose and 10% FBS. Cells are obtained by centrifugation and used in the culture.
3. 전구세포의 배양 및 증식 확인3. Confirmation of proliferation and proliferation of progenitor cells
제대혈과 체지방으로부터 분리 배양된 단핵세포구를 10% FBS, L-glutamine 및 antibiotics가 첨가된 low-glucose DMEM 배양액으로 37℃에서 5% CO2 배양조건에서 배양으로 증식시킨다. 이틀이 지난 후 배양용기 바닥에 붙지 않은 세포들은 PBS로 세척하고, 배지를 2~3일마다 교체하면서 배양하여 전구세포를 수득한다.
A separate cultures from cord blood mononuclear cells and fat gu eseo 10% FBS, 37 ℃ with L-glutamine and low-glucose DMEM culture medium with antibiotics is added 5% CO 2 Proliferate in culture under culture conditions. After two days, the cells which did not adhere to the bottom of the culture vessel were washed with PBS and cultured with changing medium every 2-3 days to obtain progenitor cells.
4. 단핵세포구로부터 중간엽줄기세포의 배양4. Cultivation of Mesenchymal Stem Cells from Monocytes
단핵세포구를 10% FBS, L-glutamine 및 antibiotics가 첨가된 줄기세포 배양액으로 37℃에서 5% CO2 배양조건에서 배양으로 증식시킨다. 배지를 일주일에 2회 이상 교체하면서 배양하여 전구세포를 수득한다. 이 배양된 세포들은 위상차현미경으로 발달과 형태학적 특성을 확인한 다음, PAS 염색으로 줄기세포임을 확인한다.
Stem cell cultures containing 10% FBS, L-glutamine and antibiotics were added to monocytes at 37 ° C for 5% CO 2. Proliferate in culture under culture conditions. The progenitor cells are obtained by culturing the medium while changing the medium at least twice a week. These cultured cells were identified by stem phase microscopy with PAS staining after their development and morphological characteristics.
5. 줄기세포의 확인5. Identification of Stem Cells
발달된 세포가 줄기세포임을 확인하기 위하여 Periodic acid-Schiff's staining system(Sigma)을 이용하여 염색을 실시한다. 먼저, dish에서 media를 깨끗이 제거하고 공기 중에서 건조시킨 다음 formaline-ethanol fixative solution (formaline을 ethanol에 10%로 희석함)으로 1분간 고정한 후 증류수로 수회 수세하여 고정액을 제거한다. 고정 후, periodic acid solution으로 실온에서 5분간 반응시킨 후 증류수로 수세한다. 다음 Schiff's reagent로 실온에서 15분간 반응시켰고 증류수로 수세한다. 대조염색은 hematoxylin solution으로 90초간 실시하였고 증류수로 수세 한 후 dish를 공기 중에서 완전히 건조시킨다.To confirm that the developed cells are stem cells, staining is performed using Periodic acid-Schiff's staining system (Sigma). First, remove the media from the dish, dry in air, fix it with formaline-ethanol fixative solution (formaline diluted to 10% in ethanol) for 1 minute, and wash with distilled water several times to remove the fixative. After fixation, react with periodic acid solution at room temperature for 5 minutes and wash with distilled water. The reaction was then carried out for 15 minutes at room temperature with Schiff's reagent and washed with distilled water. Counterstaining was carried out for 90 seconds with hematoxylin solution, washed with distilled water, and the dish was completely dried in air.
증식된 세포의 갯수 및 유형은 유동 세포측정, 세포 분류, 면역세포화학(예를 들어, 조직 특이성 또는 세포-표지 특이적 항체로 염색시킴), 형광 활성화 세포 분류(fluorescence activated cell sorting, FACS), 자기 활성화 세포 분류(magnetic activated cell sorting, MACS)와 같은 표준 세포 검출 기술을 사용하는 형태 및 세포의 표면 표지에서의 변화를 측정하거나, 광학 현미경 또는 공초점(confocal) 현미경을 사용하여 세포의 형태를 검사하거나, 또는 PCR 및 유전자 발현 프로파일링(profiling)과 같이 당해 분야에 잘 공지된 기술을 사용하여 유전자 발현에서의 변화를 측정함으로써 쉽게 모니터링 될 수 있다.
The number and type of proliferated cells can be determined by flow cytometry, cell sorting, immunocytochemistry (eg staining with tissue specific or cell-label specific antibodies), fluorescence activated cell sorting (FACS), Morphology using standard cell detection techniques such as magnetic activated cell sorting (MACS) and measuring changes in the cell's surface label, or by using optical or confocal microscopy Or can be easily monitored by measuring changes in gene expression using techniques well known in the art such as PCR and gene expression profiling.
6. 줄기세포의 분화과정에 대한 세포화학적 관찰6. Cytochemical Observation of Stem Cell Differentiation
분화가 진행되는 중간엽줄기세포를 기간별로 조직을 채취하여 위상차현미경(phase contrast microscope)으로 형태학적 조사를 실시하고, Safranin-O 및 type II collagen 을 immunostaining 하여 chondroblast 생성 특이 물질의 발현을 확인한다.
Mesenchymal stem cells undergoing differentiation were harvested for each period, followed by morphological examination using a phase contrast microscope, and immunostaining of Safranin-O and type II collagen to confirm the expression of chondroblast-generating specific substances.
7. Safranin-O 염색에 의한 분화 확인7. Confirmation of Differentiation by Safranin-O Staining
배지를 깨끗이 제거하고 공기 중에서 건조시킨 다음 formaline-ethanol fixative solution (formaline을 ethanol에 10%로 희석함)으로 1분간 고정한 후 증류수로 수세하여 고정액을 제거한다. 고정된 세포는 0.1% safranin-O solution으로 1분간 염색하였고 증류수로 수세한 다음 공기 중에서 자연 건조시킨다.
Remove the medium, dry in air, fix it with formaline-ethanol fixative solution (formaline diluted to 10% in ethanol for 1 minute), and wash with distilled water to remove the fixative. The fixed cells were stained with 0.1% safranin-O solution for 1 minute, washed with distilled water and then air dried.
8. 면역세포화학염색(Immunocytochemical staining)에 의한 분화 확인8. Confirmation of Differentiation by Immunocytochemical Staining
배지를 깨끗이 제거하고 공기 중에서 자연 건조한다. formaline-ethanol fixative solution (formaline을 ethanol에 10%로 희석함)으로 1분간 고정한 후 증류수로 수회 수세하여 고정액을 완전히 제거한다. 1% normal goat serum (in PBS)으로 1시간 동안 실온에서 blocking을 실시한다. 1차 항체인 Human-collagen type II (Millipore)를 1% normal goat serum에 1:20 희석배율로 희석하여 4℃에서 하룻밤 동안 반응시킨다. PBS로 5분간 2회 수세한다. 2차 항체인 FITC-conjugated anti-rabbit IgG는 PBS에 1:100 희석배율로 희석하여 실온 상태인 암소에서 2시간 동안 반응시킨다. 다음 PBS로 5분간 3회 수세하여 결합하지 않은 2차 항체는 제거하였고 형광현미경에서 관찰하여 확인한다.
Remove the medium thoroughly and air dry in air. Fix for 1 minute with formaline-ethanol fixative solution (formaline diluted to 10% in ethanol) and wash with distilled water several times to remove the fixative completely. Block at room temperature for 1 hour with 1% normal goat serum (in PBS). The primary antibody, Human-collagen type II (Millipore), is diluted in a 1:20 dilution ratio in 1% normal goat serum and reacted at 4 ° C. overnight. Wash twice with PBS for 5 minutes. The secondary antibody, FITC-conjugated anti-rabbit IgG, was diluted in PBS at a 1: 100 dilution and allowed to react for 2 hours in the dark at room temperature. Next, washed with PBS three times for 5 minutes to remove the unbound secondary antibody was confirmed by fluorescence microscopy.
9. DMSO를 이용한 줄기세포의 완만냉동법 9. Slow Freezing of Stem Cells Using DMSO
분리 배양한 줄기세포를 10% DMSO가 함유된 DMEM 용액에 줄기세포를 1 x 105 cells/㎖ 농도로 1 ㎖ 씩 cryotube 에 담은 다음 freezing chamber ( Nalgene Cryo freezing container)에 넣고 -80℃ freezer 에 넣어 분당 1℃씩 냉각시켜 냉동시킨다. 다음 날 cryotube 를 꺼내어 액체질소탱크에 이동 보관시킨다. 동결보존된 줄기세포의 해동은 cryovial 용기로부터 꺼내어 37℃ 수조에서 녹힌 다음, 이를 DMEM 배양액에 넣고 500 x g에서 5분간 2번 원심분리하여 냉동제를 세척한다. 줄기세포 수를 혈구계산기로 계산한 다음 Keratinocyte 배양액에 1 x 105 cells/㎖ 로 60 mm dish에 접종하고 5% CO2 배양기에 넣어 배양한다.
Stem cells were isolated and cultured in DMEM solution containing 10% DMSO in 1 ml of 1 x 10 5 cells / ml in cryotubes, and placed in a freezing chamber (Nalgene Cryo freezing container) and placed in -80 ℃ freezer. Freeze by cooling 1 ° C per minute. The next day the cryotube is taken out and stored in a liquid nitrogen tank. Thawing of cryopreserved stem cells was taken out of the cryovial container and dissolved in a 37 ° C. water bath, then placed in a DMEM medium and centrifuged twice at 500 × g for 5 minutes to wash the freezer. Stem cell counts were counted with a hemocytometer and then inoculated in a 60 mm dish at 1 x 10 5 cells / ml in Keratinocyte culture, and incubated in a 5% CO 2 incubator.
10. 초자화동결(vitrification) 방법에 의한 줄기세포의 급속냉동법10. Rapid freezing of stem cells by vitrification
1) 완충용액의 준비: 우태아 혈청이 20% 함유된 DPBS 용액에 에틸렌 글리콜을 20% 혼합하고 멸균 여과시킨다. 1) Preparation of buffer solution: 20% of ethylene glycol is mixed with DPBS solution containing 20% fetal calf serum and sterile filtered.
2) 초자화동결용액의 준비: 우태아 혈청이 20% 함유된 DPBS 용액에 에틸렌글리콜 40%, 폴리바이닐피로리돈 20% 및 슈크로스 0.3 mol을 혼합하고 멸균 여과시킨다.2) Preparation of the ultrasonification freezing solution: 40% ethylene glycol, 20% polyvinylpyrrolidone and 0.3 mol sucrose were mixed in a DPBS solution containing 20% fetal calf serum and sterile filtered.
3) 분리배양한 줄기세포를 conical tube 에 넣고 원심분리하여(400 x g, 5min) 세포 침전물 약 10 ul 만 남기고 상층액을 버린다.3) Put the cultured stem cells in a conical tube and centrifuge (400 x g, 5 min) to discard the supernatant, leaving only about 10 ul of cell precipitate.
4) 완충용액 50 ㎕를 넣고 혼합하고 5 분간 정치한다4) Add 50 µl of buffer solution, mix and let stand for 5 minutes.
5) 초자화동결용액 500 ㎕를 넣고 40 초간 혼합한다. 5) Add 500 µl of ultrasonification freezing solution and mix for 40 seconds.
6) 즉시 번호를 매긴 cryobial 에 옮겨 담은 다음 즉시 액체질소 통에 넣어 보관한다.
6) Immediately transfer to numbered cryobial and store in liquid nitrogen container immediately.
11. 동결된 줄기세포의 해동11. Thawing of Frozen Stem Cells
동결보존된 줄기세포의 해동은 액체질소통에 보존된 cryovial 용기로부터 꺼내어 37 ℃ 수조에서 녹힌 다음, 이를 0.5 M sucrose /DPBS+20% FBS 배양액 4.5 ㎖을 넣고 혼합시킨 다음 동량(5 ㎖)의 DPBS+20% FBS 를 넣어 혼합시키고 (0.25 M sucrose/DPBS+FBS) 400 x g에서 5 분간 원심분리하여 상층액을 버린다.
Thawing of cryopreserved stem cells was taken out of cryovial containers preserved in liquid nitrogen, dissolved in a 37 ° C. water bath, mixed with 4.5 ml of 0.5 M sucrose / DPBS + 20% FBS culture, and then mixed in an equivalent amount (5 ml) of DPBS. Add + 20% FBS (0.25 M sucrose / DPBS + FBS) and centrifuge for 5 min at 400 xg to discard supernatant.
12. 동결된 줄기세포의 해동 후 생존율 확인 12. Survival rate after thawing frozen stem cells
줄기세포 수를 혈구계산기로 계산한 다음, 줄기세포 배양액에 1 x 105/㎖ 의 세포 밀도로 배양접시에 접종하고 5% CO2 배양기에 넣어 37℃에 배양하여 생존율과 증식을 확인한다. 줄기세포의 냉동보존 후 생존율은 Trypan blue 염색법으로 확인한다.
Stem cell count was calculated using a hemocytometer, and then inoculated in a culture plate at a cell density of 1 x 10 5 / ㎖ in the stem cell culture and put in a 5% CO 2 incubator at 37 ℃ to check the survival rate and proliferation. Survival after cryopreservation of stem cells was confirmed by Trypan blue staining.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail by way of examples.
[[ 실시예Example ]]
1.One. 제대혈 및 체지방 유래 줄기세포의 분리 배양과 확인Isolation and Identification of Umbilical Cord Blood and Body Fat-derived Stem Cells
제대혈은 위원회지침서(IRB)에 따라 대학병원에서 수집한다. 혈액은 시트르산-인산-덱스트로즈 항응혈제 (citrate-phosphate-dextrose anticoagulant, CPDA)가 포함되어 있는 250 ㎖ 표준혈액수집백에 수집되었다.Umbilical cord blood is collected at university hospitals in accordance with the Commission Guidelines. Blood was collected in a 250 ml standard blood collection bag containing citric acid-phosphate-dextrose anticoagulant (CPDA).
냉동 보관되어 있던 제대혈을 37℃ 항온조에 놓어 천천히 흔들면서 해동시킨 후 50 ㎖ 튜브로 옮겨, 400 x g, 10 min의 조건하에서 원심 분리한다. 원심분리 후 침천물로부터 적혈구를 제거하기 위하여 적혈구 용해완충용액을 이용하여 적혈구를 용혈 시킨 후 위와 동일한 조건으로 다시 한 번 원심분리를 실시한다. 최종 침전물을 단핵세포구로 실험에 이용한다.The cord blood stored in the frozen place is placed in a 37 ° C thermostat, slowly shaken to thaw, and then transferred to a 50 ml tube, followed by centrifugation under conditions of 400 x g and 10 min. In order to remove red blood cells from the sediment after centrifugation, red blood cells are lysed using erythrocyte lysis buffer solution and centrifugation is performed once again under the same conditions. The final precipitate is used for the experiment as monocytes.
Ficoll-Hypaque density gradient centrifugation 방법으로 제대혈로부터 분리 배양된 단핵세포구를 10% FBS, L-glutamine 및 antibiotics가 첨가된 low-glucose DMEM 배양액으로 37℃ 5% CO2 배양조건에서 배양으로 증식시킨다. 이틀이 지난 후 디쉬 바닥에 붙지 않은 세포들은 PBS로 세척하고, 배지를 2~3일마다 교체하면서 배양하여 전구세포를 수득한다. 이 배양된 세포들은 phase contrast microscope로 발달과 형태학적 특징을 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 중간엽줄기세포의 모양은 방추형으로 가늘고 길게 뻗은 전형적인 모양으로 관찰되었다(도 1의 A). 또한, 중간엽줄기세포에서 PAS염색을 실시하여 붉은색을 나타내는 PAS 양성반응세포를 확인하였다(도 1의 B).
-Hypaque density gradient centrifugation method with Ficoll isolated from cord blood mononuclear cells cultured to obtain 10% FBS, L-glutamine and antibiotics are added in the low-glucose DMEM culture medium 37 ℃ 5% CO 2 Proliferate in culture under culture conditions. After two days, the cells that did not adhere to the bottom of the dish were washed with PBS and cultured with changing medium every 2-3 days to obtain progenitor cells. The cultured cells were observed with a phase contrast microscope for their development and morphological characteristics. The shape of mesenchymal stem cells was observed in the shape of a long, thin, elongated typical shape (Fig. 1A). In addition, PAS staining was performed on mesenchymal stem cells to identify PAS-positive cells showing red color (FIG. 1B).
2. 2. 줄기세포로 부터From stem cells 연골세포 분화 Chondrocyte Differentiation
제대혈로부터 분리된 중간엽줄기세포를 chondrogenic differentiation medium으로 배양하면서 연골세포로 분화를 유도한다. 이들의 colony를 위상차 현미경으로 관찰하여 특이한 연골세포로 분화하는 과정을 관찰하였다(도 2).
Mesenchymal stem cells isolated from umbilical cord blood were cultured in chondrogenic differentiation medium to induce differentiation into chondrocytes. Their colony was observed with a phase contrast microscope to observe the process of differentiation into specific chondrocytes (FIG. 2).
3. 줄기세포의 분화과정에 대한 세포화학적 관찰3. Cytochemical Observation on Stem Cell Differentiation
분화가 진행되는 중간엽줄기세포를 기간별로 조직을 채취하여 위상차현미경으로 형태학적 조사를 실시하고, Safranin-O 염색을 하여 다음과 같은 결과를 얻었다. Phase contrast microscope로 확인한 colony 부위가 Safranin-O 염색으로 붉게 염색된 양성반응을 보여 chondroblast 생성 특이 물질의 나타남을 확인하였다(도 3).
The mesenchymal stem cells undergoing differentiation were sampled by period, followed by morphological examination using a phase contrast microscope, and stained with Safranin-O to obtain the following results. The colony site identified by the phase contrast microscope showed a positive reaction stained red by Safranin-O staining to confirm the appearance of a chondroblast-generating specific substance (FIG. 3).
4. 줄기세포의 분화과정에 대한 면역세포화학적 관찰4. Immunocytochemical Observation on Stem Cell Differentiation
분화가 진행되는 중간엽줄기세포를 기간별로 조직을 채취하여 phase contrast microscope로 형태학적 조사를 실시하고, type II collagen을 immunocytochemical staining하여 chondroblast 생성 특이 물질의 발현을 확인하였고, 다음과 같은 결과를 얻었다. Type II collagen 단백질이 명확하게 염색됨을 확인한다. Green색의 형광염료로 염색된 부위가 type II collagen이 발현되는 부위로 확인되었다(도 4).
The mesenchymal stem cells undergoing differentiation were collected for each period, followed by morphological investigation using a phase contrast microscope, and immunocytochemical staining of type II collagen was performed to confirm the expression of chondroblast-generating specific substances. The following results were obtained. Confirm that Type II collagen protein is clearly stained. The region stained with the green fluorescent dye was identified as the region expressing type II collagen (FIG. 4).
5. 5. DMSODMSO 및 And 초자화동결법(vitrification)으로By vitrification 동결보존된 줄기세포의 Of cryopreserved stem cells 융해후After melting 생존율과 Survival rate 증식율Growth rate 비교 compare
분리 배양한 줄기세포를 DMSO를 사용한 완만동결법과 본 발명에서 조성한 동결용액을 사용한 초자화동결법(vitrification)으로 급속냉동 시킨 다음 이들을 융해시키고 줄기세포 수를 혈구계산기로 계산한 다음 Trypan blue 염색법으로 생존율을 확인하였다(도 5). Stem cells isolated and cultured were rapidly frozen by slow freezing using DMSO and by vitrification using freezing solution prepared in the present invention, and then thawed. It was confirmed (FIG. 5).
또한, 융해된 줄기세포를 배양액에 1 x 105/㎖의 세포 밀도로 접종하고 5% CO2 배양기에 넣어 37℃에 7일간 배양하여 증식된 줄기세포를 확인하였다(도 6).In addition, the fused stem cells were inoculated at a cell density of 1 × 10 5 / ml in the culture medium and placed in a 5% CO 2 incubator and cultured at 37 ° C. for 7 days to confirm the proliferated stem cells (FIG. 6).
줄기세포의 생존율과 증식율을 아래 표 1에 나타내었으며, 표 1 에 나타난 바와 같이 DMSO에 의한 완만동결법에서는 81.7% 의 생존율을 보였으며, 초자화동결법(vitrification)에 의한 급속냉동법에서 동결용액 A는 82.5%의 생존율을 보였고, 동결용액 B는 83.3%의 생존율을, 동결용액 C는 80.7%의 생존율을, 그리고 동결용액 D는 84.5%의 생존율을 보였다. 초자화동결법(vitrification)에 의한 급속냉동법은 완만동결법과 상응하는 우수한 생존율을 보여 활용이 가능할 것으로 본다.The survival rate and proliferation rate of the stem cells are shown in Table 1 below. As shown in Table 1, 81.7% survival rate was observed in the slow freezing method by DMSO, and the freezing solution A was 82.5 in the rapid freezing method by vitrification. The survival rate was%, frozen solution B survived 83.3%, frozen solution C survived 80.7%, and frozen solution D survived 84.5%. The rapid freezing method by vitrification is expected to be able to be used because it shows excellent survival rate which is comparable to the slow freezing method.
또한, 액체질소에서 동결보존된 후 융해된 세포를 low glucose DMEM 배양액에서 7일간 배양하여 증식능력을 확인한 결과, 냉동하지 않았던 줄기세포에서는 3.49 배의 증식율을 보인 반면, DMSO에 의한 완만동결법에서는 3.43 배로 증식이 되었고, 초자화동결법(vitrification)에 의한 초급속냉동법에서는 동결용액 A는 3.41 배의 증식율을 보였고, 동결용액 B는 4.81 배의, 동결용액 C는 3.38 배의, 그리고 동결용액 D는 3.62 배 증식율을 보여 냉동하지 않은 대조군에서의 3.49 배의 증식율에 뒤떨어지지 않아 냉동 후에도 발달이 잘 일어나는 것이 관찰되었다. In addition, after lysing the frozen cells in liquid nitrogen and lysing the cells in low glucose DMEM culture for 7 days, the proliferative capacity of the cells was 3.49 times in the freezing stem cells, while 3.43 times in the slow freezing method by DMSO. In the rapid freezing by vitrification, frozen solution A showed 3.41 times growth rate, freezing solution B showed 4.81 times, freezing solution C increased 3.38 times, and freeze solution D increased 3.62 times. It was observed that development did not lag behind the 3.49-fold growth rate in the unfrozen control group even after freezing.
Moon 등(Successful vitrification of human amnion-derived mesenchymal stem cells. Human Reproduction. 2008; 23(8): 1760~70)이 조사한 바에 의하면, 냉동하지 않은 양막 유래 줄기세포의 doubling time은 3.3 일이었고, 냉동보존 후 융해한 다음 3~14 대까지 계대 배양하였을 때에 doubling time 이 3.4 일이라고 보고한 것보다 높은 발달 성적을 나타내고 있다고 사료된다. 초자화동결(vitrification)에 의한 급속냉동기법에 관하여는 앞으로 더 기술을 발전시키면 생존율을 더욱 향상시킬 수 있을 것으로 본다. According to Moon et al. (Successful vitrification of human amnion-derived mesenchymal stem cells.Human Reproduction. 2008; 23 (8): 1760-70), the doubling time of unfrozen amnion-derived stem cells was 3.3 days and was cryopreserved. After thawing, the doubling time was reported to be higher than that of 3.4 days in the 3rd to 14th generations. Regarding the rapid freezing technique by vitrification, further development of technology may further improve survival rate.
주)week)
DMSO 용액: DMEM 용액에 DMSO가 10% 함유된 용액DMSO Solution: 10% DMSO in DMEM Solution
초자화동결용액 A: PBS 용액에 에틸렌글리콜 40%, 폴리비닐피롤리돈 10% 및 수크로오스 0.3M로 조성된 용액Super magnetization freezing solution A: A solution composed of 40% ethylene glycol, 10% polyvinylpyrrolidone and 0.3 M sucrose in a PBS solution
초자화동결용액 B: PBS 용액에 에틸렌글리콜 40%, 폴리비닐피롤리돈 20% 및 수크로오스 0.3M로 조성된 용액Super magnetization freezing solution B: A solution of 40% ethylene glycol, 20% polyvinylpyrrolidone and 0.3 M sucrose in a PBS solution
초자화동결용액 C: PBS 용액에 에틸렌글리콜 40%, 폴리비닐피롤리돈 30% 및 수크로오스 0.3M로 조성된 용액Super magnetization freezing solution C: A solution of 40% ethylene glycol, 30% polyvinylpyrrolidone and 0.3 M sucrose in a PBS solution
초자화동결용액 D: PBS 용액에 에틸렌글리콜 40%, 폴리비닐피롤리돈 20% 및 수크로오스 0.4M로 조성된 용액
Super magnetization freezing solution D: A solution of 40% ethylene glycol, 20% polyvinylpyrrolidone and 0.4 M sucrose in a PBS solution
8. 8. 초자화동결법(vitrification)으로By vitrification 동결보존된 줄기세포의 Of cryopreserved stem cells 융해후After melting 줄기세포 특이 Stem cell specificity 표지인자Cover factor 발현 확인 Confirmation of expression
동결 후 융해후 줄기세포로서의 기능을 유지하는 지 확인하기 위하여 간엽줄기세포에서 PAS염색을 실시하여 붉은색을 나타내는 PAS 양성반응세포를 확인하였다. 또한 형광 활성After freezing, PAS staining was performed on mesenchymal stem cells to confirm that the cells function as stem cells after thawing. Also fluorescently active
화 세포 분류(fluorescence activated cell sorting, FACS) 기술을 사용하여 줄기세포 특이 표지인자의 발현을 확인하였던 바, CD29, CD44, CD90 및 CD105 에 양성 반응을 보였고, CD14, CD31, CD34, CD45, CD133 및 HLA-DR 인자에 관하여는 음성반응을 보였다.Stem cell specific markers were identified using fluorescence activated cell sorting (FACS) technology, which showed positive response to CD29, CD44, CD90 and CD105, CD14, CD31, CD34, CD45, CD133 and NLA was negative for the HLA-DR factor.
본 발명에 따르면, 다음과 같은 분야에서의 이용이 가능하다.According to the present invention, it can be used in the following fields.
1. 본 발명의 제대혈로부터 줄기세포 전구세포를 분리하고 이들로부터 발달한 줄기세포를 안전하게 장기간 보존할 수 있는 냉동기법을 개발함으로서 줄기세포에 관한 연구 및 이를 이용한 치료에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.1.Isolation of stem cell progenitor cells from the umbilical cord blood of the present invention and the development of a freezing method that can safely preserve stem cells developed from them can be usefully used for research on stem cells and treatment using the same.
2. 줄기세포는 계대배양으로 증식을 시킬 수 있으나, 장기간 배양하면 특성의 변화와 오염 및 발달 능력의 저하 등으로 인하여 필요로 하는 시기에 적합한 줄기세포를 원활하게 공급하는데 장애가 된다. 이를 개선하기 위하여 줄기세포의 장기간 보존을 위한 냉동기법이 유용하다.2. Stem cells can be proliferated by subculture, but if they are cultured for a long period of time, they may be an obstacle to smoothly supplying stem cells suitable for the time of need due to changes in characteristics, pollution and deterioration of developmental capacity. In order to improve this, a freezing technique for long-term preservation of stem cells is useful.
3. 본 냉동보존기법은 초자화동결용액(vitrification solution)을 이용한 초급속동결기법으로서 세포의 냉동보존성이 우수하고 효율적이어서 줄기세포의 안정적이며 장기간 보존에 활용할 수 있을 것으로 본다.3. This cryopreservation technique is an ultra-fast freeze technique using vitrification solution. It is excellent in cryopreservation and efficient of cells and can be used for stable and long-term preservation of stem cells.
4. 본 기술을 활용하여 연골조직 재생을 위한 아가로오스(agarose), 알기닌(alginine), 히알루론산(hyaluronic acid), 젤라틴(gelatin), 피브린 글루(fibrin glue), 세포외 연골 기질(acellular cartilage matrix), 합성폴리머(synthetic polymers) 등과 혼합하여 생활성 스캐폴더(bioactive scaffold)를 제조하는 기술에 활용될 수 있다.4. Agarose, alginine, hyaluronic acid, gelatin, fibrin glue, extracellular cartilage matrix for cartilage regeneration using this technique matrix, synthetic polymers, and the like, and may be utilized in a technique for producing a bioactive scaffold.
5. 본 초자화동결법에 사용한 냉동액의 성분이 줄기세포에 세포독성이 적고 인체에 무해하여 직접 이식이 가능한 장점이 있다.5. The components of the freezing solution used in this method of ultrasonification are less cytotoxic to stem cells and harmless to human body, so it can be directly transplanted.
6. 성체줄기세포에 관한 연구는 급속도로 발전하고 있으며, 치료에 적용하는 단계에 이르렀으므로 국제적으로 경쟁력을 확보하고 해외에 특허료를 지불하지 않기 위하여서는 세포의 보존 방법에 대한 연구가 필요하다.6. Research on adult stem cells has been rapidly developed and applied to treatment. Therefore, it is necessary to study how to preserve cells in order to secure international competitiveness and not pay patent fees abroad.
7. 제대혈로부터 간엽줄기세로를 분리하고 분화시키는 기술을 개발함으로서 사람과 동물의 희귀병과 난치병의 치료기술을 발전시키는데 활용될 것이다.7. Developing techniques for separating and differentiating mesenchymal stem cells from umbilical cord blood will be used to advance the treatment of rare and incurable diseases in humans and animals.
8. 본 기술은 대체장기 생산과 이식기술의 개발에 유용하게 활용될 수 있다.8. This technology can be usefully used for the development of alternative organ production and transplantation technology.
9. 현재 인공관절 개발에 사용되고 있는 대체물질(collagen/GAG matrix, synthetic biodegradable matrix) 등과 병용되고 있는 피브로블라스트(fibroblast)보다는 줄기세포를 사용하면 인공관절 제조기술이 더욱 향상될 수 있을 것으로 기대된다.9. The use of stem cells rather than fibroblasts, which are currently used in the development of artificial joints (collagen / GAG matrix, synthetic biodegradable matrix), is expected to improve artificial joint manufacturing technology. .
10. 제대혈 유래 줄기세포 분리와 분화기술이 확립되고 이러한 기술로 생산된 특수한 줄기세포를 장기간 효율적으로 보관함으로서 안정적이며 원활한 공급이 가능하고, 이를 복제기술과 융합시켜 인간질환 모델동물의 생산, 희귀하거나 멸종위기의 동물 보존, 세포 치료, 대체장기 생산 등에 있어서 아주 효율적이며 유용한 기술로 발전시킬 수 있다. 10. Stem cell-derived stem cell isolation and differentiation technology has been established, and the special stem cells produced by such technology can be stored and stored for a long time efficiently, and can be supplied with cloning technology to produce and rarely produce human disease model animals. It can be developed into a very efficient and useful technology in endangered animal preservation, cell therapy, and alternative organ production.
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