KR101321082B1

KR101321082B1 - 나노입자를 이용한 비표지방식의 압타머 바이오센서

Info

Publication number: KR101321082B1
Application number: KR20100085232A
Authority: KR
Inventors: 이지연; 윤종해; 최정연; 한준희; 김석규; 이지훈; 남학현; 차근식; 신재호
Original assignee: 주식회사 아이센스
Priority date: 2010-09-01
Filing date: 2010-09-01
Publication date: 2013-10-23
Also published as: KR20120023208A

Abstract

본 발명은 단일가닥핵산인 압타머(aptamer)를 이용하여 압타머와 특이적 결합을 하는 단백질(분석물질)을 전기화학적으로 정량 분석하기 위한 압타머 바이오센서로서, 압타머 끝에 효소나 형광물질, 동위방사원소 등의 표지 없이 전기화학적 활성을 갖는 나노입자(nanoparticle)를 이용한 비표지 방식의 압타머 바이오센서에 관한 것이다.
본 발명의 압타머 센서는 기존에 연구 되었던 두 개의 다른 압타머를 이용한 샌드위치 면역분석법 형태의 표지 압타머 센서와는 달리 두 개의 압타머를 사용하지 않으면서 간편하고, 빠른 시간 내에 측정할 수 있는 비표지 방식의 센서로서, 빠른 시간 내에 전기화학적으로 측정하기 위해서 전기화학적 활성을 띈 나노입자를 합성, 이용하여 압타머와 특이적 결합을 하는 단백질(분석물질)을 정량 분석함으로써 방법론(methodology)을 구축하였다.
본 발명의 압타머 센서는 기존의 복잡한 실험과정에서 오는 낮은 정확도와 재현성의 문제점을 획기적으로 개선하였다.

Description

나노입자를 이용한 비표지방식의 압타머 바이오센서 {Label-free Electrochemical Aptamer Sensor Using Nanoparticles}

본 발명은 나노입자를 이용한 비표지 방식의 압타머 바이오센서에 관한 것으로서, 전기화학적 활성을 갖는 나노입자를 도입시켜 전기화학적 신호를 얻었으며, 나노입자의 크기를 조절하여 단백질-압타머 결합 물질에 의해 발생하는 가리움 효과에 따른 신호를 얻었다.

상업적으로 가장 잘 알려진 트롬빈 압타머를 이용하여 비표지 방식으로 트롬빈을 정량하는 체계적인 방법을 구축함으로써, 알려지지 않은 많은 종류의 압타머를 본 발명에 제시된 방법을 이용하여 특정 단백질에 대한 압타머의 염기서열을 예측할 수 있다.

최근 들어 새로운 분자 인식 물질인 압타머는 단백질이나 효소, 심지어 작은 약물까지 다양한 목적물질에 대한 특이적인 결합능력 때문에 매우 큰 관심을 끌고 있으며, 이를 바탕으로 한 면역센서가 개발되고 있다. 면역센서에서 흔히 사용되는 항체와 비교해 보았을 때, 압타머는 높은 친화력과 특이성을 가지며 염기서열만 알면 생체 밖에서 화학적으로 합성이 가능하므로 대량생산 할 수 있다는 장점을 가지고 있다. 이온, 작은 유기분자, 단백질, 세포 등의 광범위한 목적물질에 결합능력을 가지고 있어 수많은 물질에 대한 측정이 가능하고, 온도에 안정하며 독성을 갖지 않아 실험 시 간편하다. 또한 작은 크기 때문에 치료상 목적에 적용하는데 이상적이다. 이러한 많은 장점을 갖는 압타머를 이용한 센서에는 표지방식 센싱 시스템과 비표지 방식의 센싱 시스템이 있다. 표지 방식의 센싱 시스템은 다양한 기술로 측정할 수 있고, 높은 민감도를 갖는 반면에 전처리 과정이나 분석하는데 오랜 시간이 걸리고, 복잡한 감지(sensing)과정을 갖는다는 단점을 지니고 있다(X. Chu et al., Anal . Chem .,2007, 79, 7492-7500). 후자의 경우 간편하며, 분석시간이 짧은 반면에 고가의 장비가 필요하고 검출한계가 높다는 단점을 지니고 있다.(X.B. Yin et al ., Anal . Chem ., 2009, 81, 9929-9305 및 M.C. Rodrluezet al ., Talanta , 2009, 78, 212-216).

이러한 단점들을 모두 보완하기 위해 바이오 기술(Biology Technology, BT)을 기반으로 나노기술(Nano Technology)을 융합시켜 하나의 융합기술인 나노-바이오(NT-BT)기술을 통해 단백질을 검출하는 바이오센서 연구가 활발히 진행되고 있다. 나노-바이오 분야에서는 특정 바이오 물질의 검출, 분석 및 정량화를 위한 다양한 방법들이 개발되고 있다.

많은 나노물질들 중에서 나노입자(또는 나노분체(nanopowder))는 100나노미터(nm) 미만의 1 이상의 차원을 갖는 미세한 입자이다. 나노입자는 그 크기가 임의의 소정 특성과 관련된 임계 길이 등급보다 작게 되는 경우에, 본질적으로 새로운 특성을 나타낼 수 있기 때문에 다양한 분야에서 관심을 받고 있다.

나노입자는 다양한 유기 분자들과 안정한 결합을 형성할 수 있으며, 크기를 다양하게 조절하여 합성할 수 있다는 장점이 있다. 또한 부피비에 비해 넓은 표면적을 갖기 때문에 부피가 같더라도 더 많은 양의 물질을 결합시킬 수 있다는 장점이 있다.

이러한 나노입자의 장점을 이용하여 면역센서 도입시키는 연구(Guonan Chen et al ., Anal . Chem ., 2010, 82, 1527-1534)가 활발히 진행되고 있다.

상기 나노입자 중 전기화학적 활성을 갖는 나노입자 합성에 관한 연구(R. W. Murray et al . Langmuir , 2009, 25, 10370-10375 및 S. George et al . ACS Nano , 2010, 4, 15-19)와 이를 바이오센서에 적용시키는 연구(A. Fainsteinet al ., J. AM. CHEM . SOC .2008, 130, 12690-12697)가 발표되었다.

이에 따라 본 발명은 상기 전기화학적 활성을 갖는 나노입자를 비표지 방식의 압타머 바이오센서에 도입시켰다.

본 발명에서는 매우 간단하면서, 비표지 방식으로서 나노입자를 이용하여 측정함에 따라 높은 민감도와 낮은 검출한계를 갖는 새로운 방식의 전기화학적인 압타머 바이오센서를 연구하였다.

상기 전기화학적 활성을 갖는 나노입자를 이용한 비표지 방식 압타머 바이오센서의 단백질(분석물질) 검출원리는 다음과 같다.

압타머 바이오센서에서 작업전극인 금 전극위에 단백질(분석물질)과 특이적 결합을 하는 압타머를 일정농도 고정시킨다. 이때, 금 전극과 잘 결합하도록 단일가닥 핵산 압타머 DNA 5끝에 티올기를 도입시켰고, 단백질(분석물질)과의 효율적인 결합을 위해 6개의 티민 공간자 또한 도입시켰다. 압타머를 12~14시간 정도 금전극에 고정시킨 후, 금 전극과 결합하지 않은 압타머를 제거하기 위해서 세척과정을 거친다. 그리고 금 전극 표면에 빈 공간을 메워주기 위해서 6-머캅토-1헥산올(6-mercapto-1-hexanol)을 이용하여 압타머와 단백질(분석물질)간의 상호작용이 수월해 지도록 고정시켰다. 이러한 단층을 형성시킨 후 세척과정을 거치고, 단백질(분석물질)을 농도 별로 반응시켜 압타머와 단백질(분석물질)간의 결합을 유도한다. 또 한차례 세척과정을 거친다. 마지막으로 전기화학적 신호를 얻기 위해서 산화-환원 매개체가 도입된 나노입자를 사용했다. 이러한 나노입자는 단백질(분석물질)에 의한 가리움 효과를 극대화 시켜주는 장점을 갖는다. 그러므로 본 압타머 바이오센서는 단백질(분석물질)이 각 농도 별로 압타머와 결합함으로써 단백질(분석물질)의 농도가 고농도 일수록 산화-환원 매개체가 도입된 나노입자가 전극에 도달하지 못하여 산화환원이 용이하지 못하게 되므로, 전기화학적 신호가 작아지게 되는 것이다.

이러한 압타머 바이오센서의 검정곡선은 단백질(분석물질)이 저 농도일수록 전극과 나노입자간의 산화-환원이 수월해지므로 전기화학적 신호가 증가하게 되는 반비례 곡선을 갖는다.

상기 결합된 압타머-단백질 결합물질은 강한 음전하를 띄게 된다.

본 발명에서는 강한 음전하를 띈 전기화학적으로 활성을 갖는 나노입자를 합성하여, 이를 이용하여 나노입자와 압타머-단백질 결합물질간의 반발력을 증대시켜 농도간의 전기화학적 신호차이를 증가시켜 농도간의 구별을 향상시키고자 하였다.

상기 전기화학적 압타머 바이오센서는 값비싼 큰 장비의 요구 없이 경제적이고, 다른 검출장비 못지 않은 낮은 검출한계 및 높은 민감도와 빠른 시간 내에 분석을 할 수 있다는 장점을 갖는다.

기존에 알려져 있는 압타머 바이오센서는 두 개의 압타머를 사용하는 샌드위치 면역분석법으로 연구되어 왔다. 이러한 샌드위치면역분석법은 민감도가 우수하여 널리 이용되기는 하나, 분석물질의 다른 두 결합부위를 갖는 압타머를 찾기 어렵다는 단점이 있다. 또한 두 번째 압타머 끝에 효소나 동위원소, 형광 물질 등의 표지를 접합하는 데에도 어려움이 크며, 실험 단계가 복잡하고 측정시간이 오래 걸린다는 단점이 있다.

복잡한 실험단계에서 초래되는 오차, 측정기기를 다루는데 미숙함이 있는 부분에서 오는 오차 등 여러 가지 측면에서 실험적 오차를 발생할 확률이 높다.

이상의 기존 기술에서 보듯이 종래의 방법들은 복잡한 실험단계를 필요로 하거나, 큰 기기의 사용으로 인한 복잡성, 숙련된 측정자가 필요하다는 문제점이 있다. 따라서 실험과정이 간단하면서도 민감도가 높고, 전문적으로 숙련된 측정자 없이도 측정할 수 있는 전기화학적 압타머 바이오센서들이 요구된다.

본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위하여 두 개의 압타머를 사용하지 않고, 한 개의 압타머 사용만으로도 측정할 수 있도록 비표지 방식의 전기적 활성을 갖는 나노입자를 압타머 바이오센서에 적용하고자 한다.

본 발명에 의한 압타머 바이오센서는 두 번째 압타머 끝에 표지를 달지 않고 측정하는 방법으로써, 비표지 방식의 모델을 이용하여 이에 전기화학적 활성을 갖는 나노입자를 합성하여 전기화학적 신호를 얻을 수 있으며, 실험과정이 복잡하지 않고 간편하여 빠른 시간 내에 측정할 수 있으므로, 이를 통해 분석물질의 농도를 기존의 센서보다 민감하고, 정확하게 측정할 수 있다.

본 발명에 의한 센서는 금 전극 위에 고정화된 압타머와 특이적으로 결합하는 단백질(분석물질)간에 상호작용을 이용하여 전기화학적인 활성물질에 의한 전극과의 전자전달을 측정하여 단백질(분석물질)을 정량하는 것이다. 본 센서는 하나의 골격체로 일정한 크기를 가지는 나노입자를 전기화학적 물질로서 사용하여 단백질-압타머 결합물질에 의해 발생하는 가리움 효과를 더욱 증가시키고 이를 이용하여 센서의 감도와 재현성, 정확성을 향상시켰고, 검출한계를 10^-14 M까지 더욱 낮추어 특정 단백질과 결합하는 압타머의 염기서열을 연구하는 생물학 분야에 도움이 될 수 있다. 보통 압타머와 특정 단백질과의 결합을 측정하는 수정미세저울(quartz crystal microbalance(QCM)), 표면 플라즈몬 공명(surface plasmonresonance (SPR)), 원자 힘 현미경(atomic force microscopy (AFM)) 등의 장비들은 값 비싼 비용을 요구하고, 장비들을 다루는데 어려움이 있어 검출하는데 문제점이 있지만, 상기 압타머 바이오센서를 이용한 측정은 빠르고 경제적이며 신뢰성 있는 결과를 도출해 낼 수 있다.

도 1은 표지방식과 비표지 방식의 센싱시스템 비교.
도 2는 본 발명에서 제시한 비표지 방식의 압타머 바이오센서의 개념도.
도 3은 본 발명에 따른 산화-환원 매개체역할을 하는 나노입자를 이용한 압타머 바이오센서에서의 검정곡선.
도 4는 7 nm와 14 nm의 크기를 갖는 페로센이 도입된 실리카 나노입자의 합성과정.
도 5는 7 nm와 14 nm의 크기를 갖는 페로센이 도입된 음전하성 실리카 나노입자의 합성과정.
도 6은 페로센이 도입된 실리카 나노입자의 주사 속도 변화에 따른 순환전압전류도.
도 7은 나노입자의 TEM 이미지.
도 8은 전기화학적 활성을 갖는 단분자를 이용한 압타머 바이오센서의 개념도.
도 9는 전기화학적 활성을 갖는 단분자를 이용하여 측정한 순환전압전류도.
도 10은 페로센이 도입된 7 nm의 실리카 나노입자를 이용하여 측정한 트롬빈의 네모파전압
도 11은 페로센이 도입된 14 nm의 실리카 나노입자를 이용하여 측정한 트롬빈의 네모파전압전류도와 검정곡선.
도 12는 페로센이 도입된 14 nm의 음전하성 실리카 나노입자를 이용하여 측정한 트롬빈의 네모파전압전류도와 검정곡선.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 나노입자를 이용한 비표지방식의 전기화학적 압타머 바이오센서는 압타머-단백질(분석물질) 결합물질이 고정된 작업전극 및 기준전극와 보조전극을 포함하는 전기화학적 압타머 바이오센서로써, 전기화학적 활성을 갖는 나노입자를 이용하여 단백질(분석물질) 농도에 따른 산화-환원 전류를 얻는다.

본 발명에 따른 작동 전극 위에 형성되는 각각의 반응 시약층은 시약용액 약 40㎕양을 도포함으로써 형성된다. 이러한 시약층은 압타머, 단층을 형성시키기 위한 블로킹용액과 단백질(분석물질)을 포함한다.

본 발명에 따른 5'-GGT TGG TGT GGT TGG-3'의 서열을 갖는 단일가닥핵산 압타머는 금 전극과의 결합을 위해 5' 끝에 티올기(thiol group)를 도입하였고, 분석물질과의 결합을 위한 삼차원적 구조를 유지시키기 위해 티민(thymine), 시토신(cytosine), 메틸기(methyl group)등 공간자를 도입하는 것이 바람직하다.

본 발명에 사용된 전기화학적 활성을 갖는 나노입자는 본래의 특성이 산화-환원 매개체 역할을 하는 전도성(conductivity) 나노입자를 사용하는 것과 나노입자 겉표면 또는 나노입자 내부에 전기화학적 활성을 갖는 물질을 도입하는 방법으로 나뉠 수 있다.

상기 본래의 특성이 산화-환원 매개체 역할을 하는 나노입자로서 은(Ag), 금(Au), 백금(Pt), 구리(Cu), 주석(Sn), 철(Fe), 니켈(Ni), 루테늄(Ru), 타이타늄 (Ti), 탄탈럼(Ta), 니오비움(Nb), 하프늄(Hf), 텅스텐(W), 이트륨(Y), 아연(Zn), 지르코늄(Zr), 알루미늄(Al), 란탄눔(La), 세슘(Ce), 프라세오디뮴(Pr), 네오디뮴 (Nd), 사마륨(Sm), 안티모니(Sb), 비스무트(Bi), 납(Pb), 탈륨(Tl), 인듐(In), 텔루륨(Te), 크롬(Cr), 바나듐(V), 망간(Mn), 몰리브데넘(Mo), 코발트(Co), 로듐 (Rh), 팔라듐(Pd), 오스뮴(Os), 레륨(Re), 이리듐(Ir) 등과 같은 전도성 금속원소 또는 이들의 금속산화물이 하나 또는 그 이상의 배합으로 합성된 그룹으로부터 나노입자를 선택한다.

상기 전자전달 산화-환원 매개체를 도입할 수 있는 나노입자로서 실리카(Si), 은(Ag), 금(Au), 백금 (Pt), 구리(Cu), 주석(Sn), 철(Fe), 니켈(Ni), 루테늄(Ru), 타이타늄(Ti), 탄탈럼(Ta), 니오비움(Nb), 하프늄(Hf), 텅스텐(W), 이트륨(Y), 아연(Zn), 지르코늄(Zr), 알루미늄(Al), 란탄눔(La), 세슘(Ce), 프라세오디뮴(Pr), 네오디뮴(Nd), 사마륨(Sm), 안티모니(Sb), 비스무트(Bi), 납(Pb), 탈륨(Tl), 인듐(In), 텔루륨(Te), 크롬(Cr), 바나듐(V), 망간(Mn), 몰리브데넘(Mo), 코발트(Co), 로듐(Rh), 팔라듐(Pd), 오스뮴(Os), 레륨(Re), 이리듐(Ir) 등과 같은 원소 또는 이와 같은 금속산화물이나 무기산화물의 하나 또는 그 이상의 배합으로 합성된 나노입자를 선택한다.

상기 나노입자에 도입할 산화-환원 매개체로서 페로센(ferrocene), 페로센 유도체(ferrocene derivatives), 퀴논(quinones), 퀴논 유도체(quinone derivatives), 루세늄 아민 복합체(ruthenium ammine complexes), 오스뮴(II), 오스뮴(III), 오스뮴(IV) 복합체 (osmium complex), 메탈로센(metallocene), 메탈로센 유도체(metallocene derivatives), 포타슘헥사시아노페레이트(II)(Potassium hexa-cyanoferrate (II)), 멜돌라 블루(Melola's blue), 프루시안 블루(Prussian blue) 디클로로페놀인도피놀 (dichlorophenolindophenol(DCPIP)), o-페닐렌다이아민(o-phenylenediamine(o-PDA), 3,4-디하이드록시벤즈알데하이드(3,4-hydroxybenzaldehyde(3,4-DHB)), 비오로겐(viologen), 7,7,8,8-테트라시아노퀴노디메탄(7,7,8,8-tetracyanoquinodimethane(TCNQ)), 테트라티아풀발렌(tetrathiafulvalene(TTF)), N-메틸아시디니움(N-methylacidinium(NMA+)), 테트라티아테트라센(tetrathiatetracene(TTT)), N-메틸페나지니움(N-methylphenazinium(NMP+)), 3-메틸-2-벤조티오조리논히드라존(3-methyl-2-benzothiozolinonehydrazone), 2-메톡시-4-아릴페놀(2-methoxy-4-allylphenol), 4-아미노안티피린(4-aminoantipyrin (AAP)), 디메틸아닐린(dimethylaniline), 4-아미노안티피렌(4-aminoantipyrene), 4-메톡시나프톨 (4-methylnaphthol), 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(3,3‘,5,5-tetramethylbenzidine(TMB)), 2,2-아지노-디-[3-에틸-벤즈티아졸린술포네이트] (2,2-azinodi-[3-ethylbenzthiazolinesulfonate]), o-디아지니딘(o-dianisidine), o-톨루이딘 (o-toluidine), 2,4-디클로로페놀(2,4-dichlorophenol), 4-아미노페나존(4-aminophenazone), 벤지딘 (benzidine)으로 이루어진 그룹 중 하나 또는 그 이상을 선택하여 나노입자에 도입, 합성한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

도 4는 본 발명에 따른 산화-환원 매개체가 도입된 실리카 나노입자 제조방법에 관한 절차도이다. 이를 참조하여 산화-환원매개체가 도입된 실리카 나노입자를 제조하는 공정에 대하여 상세하게 설명한다.

실시예 1. 전기화학적 활성을 갖는 실리카나노입자 합성

<단계 1> 아민기(amine group)가 도입된 실리카 나노입자 합성

상용화된 7 nm 또는 14 nm 크기의 훈증된 실리카 나노입자(fumed silica nanoparticle) 2g(1g 실리카 나노입자 당 7 nm 크기의 나노입자는 3.01 mmol, 14 nm 크기의 나노입자는 1.99 mmol의 silanol group)을 톨루엔(toluene) 55 mL에 넣고 reflux를 시작한다. 5분 후에 톨루엔 5 ml에 3-아미노프로필트라이메톡시실레인(3-aminopropyltrimethoxysilane(APTMS)) 적당과량, 6 mL(7 nm 나노입자) 또는 3 mL(14 nm 나노입자)를 혼합한 용액을 한 방울씩 매우 천천히 적가한 후 reflux를 유지하며 24시간 동안 반응시킨다. 원심분리기를 이용해 4000 rpm에서 나노입자와 용액을 분리하였으며, 그 후 톨루엔을 다시 넣고 분산시켜 세척해준다. 같은 과정을 3회 더 거친 후 원심분리기로 나노입자를 분리하고 오븐에서 130℃로 24시간 건조시킨다.

<단계 2> 페로센(ferrocene)이 도입된 실리카나노입자의 합성

페로센카르복실산(ferrocenecarboxylic acid) 2.06 g(9 mmol, 7 nm의 나노입자) 또는 1.4g(9 mmol, 14 nm의 나노입자)과 하이드록시벤조트리아졸 (hydroxybenzo-triazole(HOBt)) 1.3 g (9.6 mmol, 7 nm의 나노입자) 또는 0.86 g (6.2 mmol)을 디메틸포름아마이드(dimethylformamide(DMF))에 녹인다. 이 용액에 합성을 통해 얻은 아민기를 가지는 실리카나노입자(7 nm인 경우 약 6.02 mmol의 아민기, 14 nm인 경우 약 3.98 mmol의 아민기)를 첨가한다. 이 용액을 초음파분쇄기를 통해 완전히 분산시킨 후, 아민과 카르복실산의 반응 유도체인 N,N-다이이소프로필카보다이아마이드(N,N-diisopropylcarbodiimide)를 1.5 mL(9.6 mmol, 7 nm의 나노입자) 또는 1 mL(3.2 mmol, 14nm의 나노입자)천천히 첨가한 후 상온에서 24시간 동안 격렬히 반응시킨다. 원심분리기를 이용해 9000 rpm에서 나노입자와 용액을 분리하며, 그 후 디메틸포름아마이드를 다시 넣고 5분간 초음파분쇄기(ultrasonicator)를 이용해 나노입자를 분산시켜 세척해 준다. 같은 과정을 3회 더 거친 후, 전기화학적 측정에 사용될 완충용액(pH 7.0 PBS 0.1M (NaCl 10 mM))을 이용하여 2회 세척한 후, 에탄올(ethanol)을 이용하여 2회 세척한다. 완전히 세척된 합성된 나노입자는 진공건조를 위해 둥근바닥플라스크에 완전히 분산시킨 후 진공 하에서 24시간 건조시킨다.

도 5는 본 발명에 따른 전기화학적 활성을 갖는 음전하성 실리카 나노입자 제조방법에 관한 절차도이다. 이를 참조하여 전기화학적 활성을 갖는 음전하성 실리카 나노입자를 제조하는 공정에 대하여 상세하게 설명한다.

실시예 2. 전기화학적 활성을 갖는 음전하성 실리카 나노입자합성

<단계 1> 페로센이도입된 실리카 나노입자 합성

상기 실시예 1의 과정을 실시하여 전기화학적 활성을 갖는 분자, 페로센이 도입된 실리카 나노입자를 합성한다.

<단계 2> 페로센이 도입된 음전하성 실리카 나노입자 합성

합성된 페로센이 도입된 실리카나노입자를 0.2M의 포타슘터트-뷰톡사이드 (potassium tert -butoxide)를 정제된 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran(THF)) 100 mL를 넣어준다. 합성된 페로센이 도입된 실리카 나노입자를 용액에 첨가한 후 초음파분쇄기를 이용하여 완전히 분산시킨 후, 1,3-프로페인술톤(1,3-propanesultone) 2.22 g(18 mmol, 7 nm의 나노입자) 또는 1.46 g(12 mmol, 14 nm의 나노입자)을 테트라하이드로퓨란 20mL에 묽힌 후, additional funnel을 이용하여 한 방울씩 첨가한 후 50 ℃에서 24시간 동안 반응시킨다. 원심분리기를 이용해 9000 rpm에서 나노입자와 용액을 분리한다. 테트라하이드로퓨란을 다시 넣고 5분간 초음파분쇄기를 이용해 나노입자를 분산시켜 세척해 주었다. 같은 과정을 2회 더 세척한 후 완충용액(pH 7.0 PBS 0.1 M (NaCl 10mM))을 이용해 3회 더 세척, 에탄올(ethanol)을 이용해 3회 세척한 후 진공건조를 나노입자를 완전히 건조 시킨다.

실시예 3. 순환전압전류법을 이용한 전기화학적 활성 측정

일정 양의 전기화학적 활성을 갖는 실리카 나노입자를 완충용액(pH 7.0 PBS 0.1M(NaCl 10mM))에 초음파분쇄기를 이용하여 완전히 분산시킨다. 분산시킨 용액을 전기화학 측정장비인 CH Instrument 사의 Electrochemical analyzer workstation 760D 장비를 이용하여 측정하였다. 순환전압전류법의 주사속도는 100 mV/sec. 이다. 측정 결과는 도 9의 감응곡선을 통해 볼 수 있으며, 도 6은 주사속도 증가에 따른 전기화학적 신호의 변화 그래프를 나타낸다. 100 ~ 500 mV/sec. 의 주사속도로 증가시켰으며, 각각 100 mV ~ 700 mV의 전위 영역에서 순환 전압전류법을 2 cycle 실시하였다. 주사 속도의 증가에 따라 전기화학적 신호가 증가하는 것을 볼 수 있었으며 일정하게 증가하였음을 450 mV의 인가전위에서 전류값의 감응 곡선을 통해 알 수 있었다. 도 6을 통해 나노입자에 형성된 페로센의 전기화학적 신호가 가역적이다(reversible)는 것을 확인하였으며, 전기화학적 신호에 문제가 없음을 확인하였다.

실시예 4. 전기화학적 활성을 갖는 단분자를 이용한 트롬빈의 측정

실험방법은 상기에서 제시한 방법 및 원리를 이용하였으며, 실험 조건은 다음과 같다. 완충용액은 pH 7.0, 0.1 M phosphate buffer를 바탕용액으로 사용하였으며, 전기화학적 활성을 갖는 단분자는 페로센카르복실산(ferrocenecarboxylic acid)이고, 1 mM을 사용하였다. 순환전압전류법의 주사속도는 100 mV/sec. 이다.

측정 결과는 도 9의 감응곡선을 통해 볼 수 있으며, 각각의 전위에 따른 산화-환원 전류값을 측정하여 시료의 농도에 따른 신호를 측정할 수 있다. 도 9는 전기화학적 활성을 갖는 단분자를 본 발명에 적용하여 순환전압전류법(cyclic voltammetry)을 측정한 것으로, 트롬빈 농도에 따른 신호차이를 볼 수 없었다. 본 발명에서 제시한 가리움 효과가 작은 분자에 의해서는 나타나지 않음을 알 수 있다. 작은 분자의 경우, 트롬빈이 농도에 상관없이 트롬빈의 가리움 효과가 없어 전기화학적 활성물질이 전극에 도달하여 전자전달을 함을 볼 수 있다. 그러므로 입자의 크기가 커야 가리움 효과가 적용됨을 알 수 있다.

실시예 5. 7 nm 의 실리카 나노입자를 이용한 트롬빈의 측정

상기 실시예 4를 통해 작은 분자가 가리움 효과에 적용되지 않음을 확인하였으므로, 일정 이상의 크기를 갖는 나노입자를 합성하여 트롬빈의 농도에 따른 신호를 측정하였다.

실험방법은 상기에서 제시한 방법 및 원리를 이용하였으며, 실험 조건은 다음과 같다. 완충용액은 pH 7.0, 0.1 M phosphate buffer를 바탕용액으로 사용하였으며, 페로센이 도입된 7 nm의 크기를 갖는 실리카 나노입자는 1.5 mg/mL의 농도로 측정하였고, 측정기술은 높은 민감도를 가지면서 빠른 분석법으로 충전전류보다 산화/환원반응에 기인되는 패러데이(Faraday) 전류가 더 큰 네모파전압전류법(square wave voltammtetry)을 이용하여 산화전류를 측정하였다.

도 10에서 알 수 있듯이, 실시예 5에서 트롬빈의 농도에 따른 신호차이가 없는 것과는 달리 트롬빈의 농도에 따른 신호차이가 뚜렷이 나타남을 알 수 있다. 즉, 트롬빈에 의한 나노입자의 가리움 효과를 확인할 수 있고, 이에 따른 트롬빈을 효과적으로 검출 할 수 있음을 알 수 있다.

실시예 6. 14 nm 의 실리카나노입자를 이용한 트롬빈의 측정

상기 실시예 5을 통해 7 nm의 실리카 나노입자가 트롬빈의 농도에 따른 신호가 뚜렷이 나타남을 확인할 수 있었으므로, 더 큰 크기를 갖는 실리카 나노입자를 합성하여 트롬빈 농도에 따른 신호를 측정하였다. 실험 방법과 측정기술은 상기 실시예 5와 같다.

도 11 에서 알 수 있듯이, 7 nm의 실리카 나노입자를 사용하여 측정했을 때보다 신호가 더 크고, 트롬빈 농도 간의 신호 격차가 더 큰 것을 알 수 있었다. 또한 검출한계가 10^-12 M 임을 확인하였다.

실시예 7. 전기화학적 활성을 갖는 음전하성 실리카 나노입자를 이용한 트롬빈의 측정

전체적으로 음전하를 띄는 트롬빈의 특성을 이용하여, 가리움 효과를 더 향상시키기 위해서 음전하를 띄는 것과 동시에 페로센이 도입된 14 nm의 크기를 갖는 실리카 나노입자를 합성하여 트롬빈 농도에 따른 전류값을 측정하였다. 실험 방법과 측정 기술은 상기 실시예 5,6과 같다.

도 12에서 알 수 있듯이, 일반 페로센이 도입된 나노 입자보다 10^-14 M의 더 낮은 검출한계를 얻었다. 그럼으로써, 더 효율적인 가리움 효과를 볼 수 있었다.

11: 전극 12: 블로킹용액
13: 일차압타머 14: 단백질
15: 이차압타머 16: 효소
21: 나노입자 22: 전자
23: 페로센 24: 페로세늄
25: 검정곡선 31: 페로센카르복실산

Claims

작업전극 위에 압타머를 고정시킨 뒤 이와 특이적으로 결합하는 단백질(분석물질)의 농도를 전기화학적 활성을 갖는 나노입자를 이용하여, 단백질의 농도에 따른 나노입자의 작업전극에 대한 접근성의 차이 또는 단백질 농도에 따른 가리움 효과에 의해 나타나는 전기화학적 신호를 얻어, 표지를 쓰지 않고 단백질을 정량하며, 상기 전기화학적 활성을 갖는 나노입자의 크기를 조절하여 작업전극 위에 고정된 압타머와 특이적으로 결합한 단백질에 대한 나노입자의 접근성을 다르게 함으로써 단백질의 농도 격간의 신호차이를 증폭시키는 것을 특징으로 하는 압타머 바이오센서.
제1항에 있어서, 전기화학적 신호를 얻는 방법으로 순환전압전류법(cyclic voltammetry), 네모파전압전류법(square wave voltammetry), 정상펄스전압전류법 (normal pulse voltammetry), 펄스차이전압전류법(differential pulse voltammetry) 또는 임피던스(impedance)를 이용하는 것을 특징으로 하는 압타머 바이오센서.
제2항에 있어서, 전기화학적 신호를 얻는 방법에 사용되는 전극계는 작업전극, 보조전극 및 기준전극으로 구성되는 제3전극계 또는 작업전극 및 기준전극으로 구성되는 제2전극계인 것을 특징으로 하는 압타머 바이오센서.
제1항에 있어서, 상기 전기화학적 활성을 갖는 나노입자는, 전자에 의해서 산화 또는 환원을 일으키는 나노입자인 것을 특징으로 하는 압타머 바이오센서.
제1항에 있어서, 상기 전기화학적 활성을 갖는 나노입자는, 본래의 성질이 전기화학적 활성을 갖는 나노입자 또는 전기화학적 활성을 갖는 분자를 도입한 나노입자인 것을 특징으로 하는 압타머 바이오센서.
삭제
제1항에 있어서, 압타머와 결합된 단백질이 갖는 음전하성질과 전기화학적 활성을 갖는 음전하성 나노입자를 이용하여 압타머와 결합된 단백질과 나노입자의 척력현상을 통해 단백질의 농도 격간의 신호차이를 증폭시키는 것을 특징으로 하는 압타머 바이오센서.
제1항에 있어서, 압타머와 결합된 단백질이 갖는 음전하성질과 전기화학적 활성을 갖는 양전하성 나노입자를 이용하여 압타머와 결합된 단백질과 나노입자의 인력현상을 통해 단백질의 농도 격간의 신호차이를 증폭시키는 것을 특징으로 하는 압타머 바이오센서.
제3항에 있어서, 작업전극으로 금(Au) 또는 탄소(C)를 사용하는 것을 특징으로 하는 압타머 바이오센서.
제9항에 있어서, 작업전극은 금 디스크 전극(disk electrode) 또는 금 증착법(sputter)을 이용한 작동전극을 포함한 스크린 프린팅 전극(screen printing electrode)인 것을 특징으로 하는 압타머 바이오센서.
제9항에 있어서, 작업전극은 탄소 디스크 전극(disk electrode) 또는 탄소반죽(carbon paste)을 이용한 스크린 프린팅 전극(screen printing electrode)인 것을 특징으로 하는 압타머 바이오센서.
제5항에 있어서, 전기화학적 활성을 갖는 분자를 도입할 나노입자는, 테트라에틸 오르소실리케이트(TEOS) 또는 테트라메틸 오르소실리케이트(TMOS)를 스토버(Stober)방법을 이용해 합성된 실리카 나노입자 또는 훈증된(fumed) 실리카 나노입자인 것을 특징으로 하는 압타머 바이오센서.
제12항에 있어서, 상기 실리카 나노입자에는 일차 아민기(primary amine) 또는 이차 아민기(secondary amine)를 갖는 유기실레인(organo silane)을 무수조건인 톨루엔(toluene)하에서 축합 중합시켜 도입한 뒤, 카르복실기(carboxyl group)를 갖는 페로센인 또는 페로센카르복실산(ferrocenecarboxylic acid)과 아민기간의 커플링반응(coupling reaction)을 통해 전기화학적 활성을 갖는 분자가 도입되는 것을 특징으로 하는 압타머 바이오센서.
제13항에 있어서, 상기 전기화학적 활성을 갖는 분자가 도입된 실리카 나노입자는 반응하지 않은 실라노기(silanol)와 1,3-프로페인 술톤간의 고리열림반응(ring opening reaction)을 통해 합성된 술폰산기(sulfonic acid)를 가짐으로써 전기화학적 활성을 갖는 음전하성 나노입자가 되는 것을 특징으로 하는 압타머 바이오센서.
제5항에 있어서, 상기 본래의 성질이 전기화학적 활성을 갖는 나노입자는 은(Ag), 금(Au), 백금(Pt), 구리(Cu), 주석(Sn), 철(Fe), 니켈(Ni), 루테늄(Ru), 타이타늄 (Ti), 탄탈럼(Ta), 니오비움(Nb), 지르코늄(Zr), 알루미늄(Al) 및 이들의 금속산화물로 이루어지는 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 압타머 바이오센서.
제5항에 있어서, 나노입자에 도입될 전기화학적 활성을 갖는 분자는 페로센 (ferrocene), 페로센 유도체(ferrocene derivatives), 퀴논(quinones), 퀴논 유도체(quinone derivatives), 루세늄 아민 복합체(ruthenium ammine complexes), 오스뮴(II), 오스뮴(III), 오스뮴(IV) 복합체(osmium complex), 메탈로센 (metallocene), 메탈로센 유도체(metallocene derivatives), 포타슘헥사시아노페레이트(II)(potassiumhexacyanoferrate), 멜돌라 블루(Melola's blue), 프루시안 블루(Prussian blue) 디클로로페놀인도피놀(dichlorophenolindophenol(DCPIP)), o-페닐렌다이아민(o-phenylenediamine(o-PDA)), 3,4-디하이드록시벤즈알데하이드(3,4-hydroxybenzaldehyde(3,4-DHB)), 비오로겐(viologen), 7,7,8,8-테트라시아노퀴노디메탄(7,7,8,8-tetra cyanoquino-dimethane (TCNQ)), 테트라티아풀발렌(tetrathiafulvalene (TTF)), N-메틸아시디니움(N-methylacidinium(NMA+)), 테트라티아테트라센(tetrathiatetracene(TTT)), N-메틸페나지니움(N-methylphenazinium(NMP+)), 3-메틸-2-벤조티오조리논히드라존(3-methyl-2-benzo-thiozolinone hydrazone), 2-메톡시-4-아릴페놀(2-methoxy-4-allylphenol), 4-아미노안티피린(4-aminoantipyrin(AAP)), 디메틸아닐린(dimethylaniline), 4-아미노안티피렌 (4-aminoantipyrene), 4-메톡시나프톨(4-methylnaphthol), 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(3,3‘,5,5’-tetramethylbenzidine(TMB)), 2,2-아지노-디-[3-에틸-벤즈티아졸린술포네이트] 2,2-azino-di-[3-ethyl-benzthiazoline sulfonate]), o-디아지니딘(o-dianisidine), o-톨루이딘(o-toluidine), 2,4-디클로로페놀(2,4-dichlorophenol), 4-아미노페나존(4-aminophenazone) 및 벤지딘(benzidine)으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 압타머 바이오센서.
제5항에 있어서, 전기화학적 활성을 갖는 분자를 도입할 나노입자는 실리카(Si), 은(Ag), 금(Au), 백금(Pt), 구리(Cu), 주석(Sn), 철(Fe), 니켈(Ni), 루테늄(Ru), 타이타늄(Ti), 탄탈럼(Ta), 니오비움(Nb), 하프늄(Hf), 텅스텐(W), 이트륨(Y), 아연(Zn), 지르코늄(Zr), 알루미늄(Al), 란탄눔(La), 세슘(Ce), 프라세오디뮴(Pr), 네오디뮴(Nd), 사마륨(Sm), 안티모니(Sb), 비스무트(Bi), 납(Pb), 탈륨(Tl), 인듐(In), 텔루륨(Te), 크롬(Cr), 바나듐(V), 망간(Mn), 몰리브데넘(Mo), 코발트(Co), 로듐(Rh), 팔라듐(Pd), 오스뮴(Os), 레륨(Re), 이리듐(Ir), 이들의 금속산화물 및 무기산화물로 이루어지는 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 압타머 바이오센서.
제7항에 있어서, 전기화학적 활성을 갖는 음전하성 나노입자는 인산기(phosphoric acid), 카르복실산(carboxylic acid), 아세톡시기(acetic acid)이 포함된 유기실레인 또는 작용기가 도입된 것을 특징으로 하는 압타머 바이오센서.
제8항에 있어서, 전기화학적 활성을 갖는 양전하성 나노입자는 사차아민(quaternary ammonium) 포함된 유기실레인 또는 작용기 도입된 것을 특징으로 하는 압타머 바이오센서.