KR101314206B1 - 병원균 비브리오 콜레라 검출을 위한 탄수화물 칩 및 이의 제조 방법 - Google Patents

병원균 비브리오 콜레라 검출을 위한 탄수화물 칩 및 이의 제조 방법 Download PDF

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차형준
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Abstract

본 발명은 비브리오 콜레라를 검출하기 위한 당류 기반의 콜레라 톡신 검출 센서 및 이의 이용에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 지엠원 펜타사카라이드(GM1 pentasaccharide), 지엠투 테트라사카라이드 (GM2 tetrasaccharide), 아시알로 지엠원 테트라사카라이드 (asialo GM1 tetrasaccharide), 지엠쓰리 트라이사카라이드 (GM3 trisaccharide), 갈락토오즈 베타1-3 엔-아세틸갈락토사민 (Galactose-β1,3 N-acetylgalactosamin), 락토오즈 (lactose) 및 시알산 (sialic acid)이 고체 기재의 표면에 고정된 비브리오 콜레라 검출용 탄수화물 칩, 이를 이용한 비브리오 콜레라 검출 방법, 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

병원균 비브리오 콜레라 검출을 위한 탄수화물 칩 및 이의 제조 방법 {A carbohydrate chip for detection of a pathogen Vibrio cholera and a method of preparing the same}
본 발명은 비브리오 콜레라 검출 마커인 콜레라 톡신을 검출함으로써 시료 내 비브리오 콜레라의 존재를 검출하기 위한 당류 기반의 검출 센서 및 이의 이용에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 지엠원 펜타사카라이드(GM1 pentasaccharide), 지엠투 테트라사카라이드 (GM2 tetrasaccharide), 아시알로 지엠원 테트라사카라이드 (asialo GM1 tetrasaccharide), 지엠쓰리 트라이사카라이드 (GM3 trisaccharide), 갈락토오즈 베타1-3 엔-아세틸갈락토사민 (Galactose-β1,3 N-acetylgalactosamin), 락토오즈 (lactose) 및 시알산 (sialic acid)이 고체 기재의 표면에 고정된 비브리오 콜레라 검출용 탄수화물 칩, 이를 이용한 비브리오 콜레라 검출 방법, 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명은 적은 양의 샘플을 이용하여 다양한 생체분자들 간의 상호작용을 동시다발적으로 분석 및 검출할 수 있는 마이크로어레이 (칩)의 장점을 이용하여 콜레라의 원인인 병원균 비브리오 콜레라를 검출하는 기술에 관한 것에 관한 것이다.
대표적인 병원균인 비브리오 콜레라는 하나의 편모를 가지는 그람 음성균 (Gram negative bacteria)으로 분류학적으로는 프로테오박테리아 (proteobacteria) 중 감마 그룹에 속하는 세균이다. 비브리오 콜레라는 현재도 지구상에 만연하는 콜레라를 일으키는 세균으로, 콜레라는 인간에게 치명적인 질병으로 적절히 치료하지 않으면 40-50%의 높은 치사율을 보인다. 이러한 이유로 병원성 미생물인 비브리오 콜레라의 검출 및 진단은 인류의 복지를 위한 중요한 분야로 현재 이를 위한 노력이 많이 이루어지고 있다.
비브리오 콜레라는 콜레라 톡신이라는 물질을 분비해서 콜레라 질병을 일으키므로(De Haan, L, Hirst, TR, 2004. Mol. Membr. Biol. 21: 77-92), 비브리오 콜레라를 검출하는 시스템에서는 콜레라 톡신을 비브리오 콜레라의 검출 마커로 사용하고 있다.
구체적으로, 콜레라 톡신은 병원균 비브리오 콜레라에 의해서 생산되어 분비되는 단백질 장독소로서 콜레라의 주요 원인인자이며, 비브리오 콜레라의 검출 마커로 사용된다. 콜레라 톡신은 한 개의 A 서브유닛과 다섯 개의 동일한 B 서브유닛으로 구성되어 있다. B 서브유닛은 내피세포 표면에 존재하는 지엠원 강글리오사이드과 결합함으로써 A 서브 유닛의 유입을 도와주는 역할을 하며, A 서브유닛은 그 세포 내의 cAMP 축적을 이끄는 ADP ribosyltransferase로 작용한다 (Fukuta, S, Magnani, JL, Twiddy, EM, Holmes, RK, Ginburg, V, 1998. Infect. Immun. 56: 1748-1753).
현재 비브리오 콜레라를 검출하기 위한 다양한 검출 방법들이 개발되어 왔으나, 대부분의 방법들은 항체 또는 DNA를 기반으로 한다. 항체를 기반으로 한 비브리오 콜레라 검출 기술은 효소결합면역흡착측정법(ELISA, enzyme-linked immunoassorbent assay), 표면 플라즈마 공명(SPR, surface plasma resonance), 수동 진동자 저울(QCM, quartz crystal microbalance), 마이크로캔틸리버 기반의 면역센서(microcantilever-based immunosensors), 그리고 전기화학적 면역센서(electrochemical immunosensor) 등이 있다. DNA를 기반으로 한 비브리오 콜레라 검출 기술은 중합효소 연쇄 반응(PCR, polymerase chain reaction), 실시간 유전자증폭 검사 시스템(RT-PCR, real time PCR), 다중 유전자증폭 검사 시스템(multiplex PCR), 그리고 DNA 프로브 혼성화 (DNA probe hybridization) 등이 있다. 이 기술들은 비브리오 콜레라를 검출하기 위한 높은 민감도를 보이지만, 항체의 변성에 의한 활성 감소 및 DNA 분해효소에 의한 DNA의 분해로 인하여, 비브리오 콜레라 검출을 위한 센서로써의 안정성에 문제점을 가지고 있다. 그리고 항체를 기반으로 한 비브리오 콜레라를 검출하는 센서의 경우, 항체를 방향성 있게 고정화시켜야 하는 고도의 기술이 필요하다는 단점이 있다.
이에, 최근에는 비브리오 콜레라에서 생산되는 콜레라 톡신이 내피세포 표면에 존재하는 강글리오사이드 지엠원과 결합한다는 점을 이용한 당류 기반의 비브리오 콜레라 검출 센서의 개발이 이루어지고 있으며, 당류를 기반으로 한 비브리오 콜레라 검출 센서는 기존의 항체 또는 DNA 를 기반으로 한 비브리오 콜레라 검출 센서에 비하여 몇 가지 장점을 가진다고 알려져 있다 (Chen, H, Zheng, Y, Jiang, J-H, Wu, H-L, Shen, G-L, Yu, R-Q, 2008. Biosens. Bioelectron. 24: 684-689). 첫째, 항체보다 지엠원 펜타사카라이드는 구조적인 면에서 안정성이 높기 때문에 이것을 이용한 비브리오 콜레라 센서를 개발하였을 때 센서의 안정성 면에서 항체를 기반으로 한 비브리오 콜레라 센서보다 뛰어나다. 둘째, 지엠원 강글리오사이드와 콜레라 톡신간의 상호작용은 강한 친화력 (affinity) 을 가진다. 셋째, 지엠원 강글리오사이드와 콜레라 톡신간의 결합과정이 매우 빠르다.
당류를 기반으로 한 비브리오 콜레라를 검출하기 위한 센서는 현재 몇 가지가 보고되어 있다. 멤브레인과 같은 지질 필름이 처리된 표면에 GM1 강글리오사이드와 그 유사체들이 고정화된 표면과 그 당류들이 기능적으로 표면에 처리된 리포좀(liposome)을 기반으로 하여 표면 플라즈마 공명을 이용한 기술 (Phillips, KS, Han, JH, Martinez, M, Wang, ZZ, Carter, D, Cheng, Q, 2006. Anal. Chem. 78: 596-603), 형광 소광(fluorescent quenching)(Song, X, Swanson, BI, 1999. Direct, Anal. Chem. 71: 2097-2107), 공명 에너지 전송(resonant energy transfer) (Ma, GY, Cheng, Q, 2006. Langmuir 22: 6743-6745) 등 다양한 분석방법들이 이용되었다. 그러나 이 방법들은 검출 민감도가 좋지 않다는 문제점이 있다.
또한, 지엠원 강글리오사이드와 그 유사체들이 표면에 처리된 리포좀에 형광물질(fluorescent reagents)(Ho, JA, Wu, LC, Huang, MR, Lin, YJ, Baeumner, AJ, Durst, RA, 2007. Anal. Chem. 79: 246-250), 비색마커(colorimetric markers)(Ahn-Yoon, S, DeCory, TR, Baeumner, AJ, Durst, RA, 2003. Anal. Chem. 75: 2256-2261), 효소(enzyme)(Alfonta, L, Singh, AK, Willner, I, 2001. Anal. Chem. 73: 91-102), 전극활성물질(electroactive species)(Viswanathan, S, Wu, LC, Huang, MR, Ho, JA, 2006. Anal. Chem. 78: 1115-1121) 등을 포함시키는 방법이 보고 되었다. 이 경우, 앞선 방법보다 상대적으로 더 나은 민감도를 보였지만, 리포좀을 기반으로 한 비브리오 콜레라 검출 센서는 센서 제작에 있어서 복잡한 단계로 인해 시간 소모적이고, 재연성이 떨어지며 안정성 또한 좋지 않다는 문제점을 보인다.
지엠원 강글리오사이드를 기반으로 마이크로어레이를 개발하여 지엠원 강글리오사이드와 콜레라 톡신 간의 상호작용을 분석한 연구도 보고 되었다 (Fang, Y, Frutos, AG, Lahiri, J, 2003. Langmuir 19: 1500-1505; Ngundi, MM, Taitt, CR, McMurry, SA, Kahne, D, Ligler, FS, 2006Biosens. Bioelectron. 21: 1195-1201; Zhang, J, Zhou, X, 2011. Biosens. Bioelectron. 28: 355-361). 그러나 상기 연구들은 지엠원 강글리오사이드 및 유사체들의 탄수화물 부분이 아니라 그 자체를 탐지 프로브 (capture probe)로 이용하였으며, 상기 강글리오사이드를 고정화하기 위해 사용된 리포좀은 구조의 변화, 균일하지 못한 입자 사이즈, 집합 (aggregation)과 혼합 (fusion), 화학적인 불안전성과 같은 문제점들을 가지고 있어 고정화 과정이 쉽지 않고 재연성이 떨어지는 단점이 있다. 즉, 고정화되는 과정에 재연성이 좋지 않다는 것은 비브리오 콜레라를 검출하기 위한 센서로써 큰 단점으로 작용될 수 있다.
이에, 본 발명에서는 강글리오사이드를 고정화하기 위하여 사용된 리포좀의 문제점을 해결하기 위해, 상기 강글리오사이드의 화학적인 변성과 공유 결합을 통해 고체 기재에 고정화시킨 탄수화물 칩이 콜레라 톡신과 강글리오사이드를 구성하는 탄수화물들 간의 상호작용 분석 및 콜레라 톡신을 통한 비브리오 콜레라의 검출에 적용될 수 있다는 것을 증명하였다. 또한, 기존에 당류 기반의 비브리오 콜레라 검출 센서에 주로 사용되던 지엠원 강글리오사이드 외에, 지엠투 테트라사카라이드, 아시알로 지엠원 테트라사카라이드, 지엠쓰리 트라이사카라이드, 갈락토오즈 베타1-3 엔-아세틸갈락토사민, 락토오즈 및 시알산을 함께 사용함으로써, 비브리오 콜레라 검출 마커인 콜레라 톡신을 낮은 농도까지 검출할 수 있을 뿐만 아니라 실제 비브리오 콜레라에서 생산된 콜레라 톡신 또한 검출할 수 있다는 것을 확인하였다.
본 발명의 하나의 목적은 지엠원 펜타사카라이드, 지엠투 테트라사카라이드, 아시알로 지엠원 테트라사카라이드, 지엠쓰리 트라이사카라이드, 갈락토오즈 베타1-3 엔-아세틸갈락토사민, 락오토즈 및 시알산이 표면에 고정된 고체 기재를 포함하는, 비브리오 콜레라 검출용 탄수화물 칩을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 탄수화물 칩을 이용하여 비브리오 콜레라 검출 마커인 콜레라 톡신을 검출함으로써 비브리오 콜레라를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 탄수화물 칩의 제조 방법을 제공하는 것이다.
마이크로어레이 기반의 기술은 많은 수의 샘플들을 빠르고 동시다발적으로 분석할 수 있다는 장점으로 인해, 다양한 분자들 간의 상호작용을 분석하기 위한 툴로써 이용되어 왔다. 특히, 본 발명에 따른 탄수화물 칩은 콜레라 톡신과 지엠원 강글리오사이드 및 그 유사체들 간의 상호작용을 분석하고 비브리오 콜레라 검출 마커인 콜레라 톡신을 검출 하는데 있어서 다른 보고된 분석도구들보다 뛰어난 장점들을 가지고 있다. 첫째, 콜레라 톡신과 상기 탄수화물들 간의 상호작용을 적은 양의 샘플을 이용하여 동시다발적으로 분석할 수 있다. 둘째, 적당한 공간과 기능적인 방향성을 가진 채 고정화된 탄수화물은 세포 표면에 존재하는 탄수화물들을 모방할 수 있고 그 고정화된 탄수화물은 콜레라 톡신과 상기 탄수화물들 간의 상호작용을 향상시킬 수 있는 다가 상호작용 (multivalent interaction)을 용이하게 한다.
따라서, 하나의 양태로서, 본 발명은
지엠원 펜타사카라이드(GM1 pentasaccharide), 지엠투 테트라사카라이드 (GM2 tetrasaccharide), 아시알로 지엠원 테트라사카라이드 (asialo GM1 tetrasaccharide), 지엠쓰리 트라이사카라이드 (GM3 trisaccharide), 갈락토오즈 베타1-3 엔-아세틸갈락토사민 (Galactose-β1,3 N-acetylgalactosamin), 락토오즈 (lactose) 및 시알산 (sialic acid)이 표면에 고정된 고체 기재를 포함하는, 비브리오 콜레라 검출용 탄수화물 칩에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, "탄수화물 칩"이란 단당류, 이당류 또는 다당류의 탄수화물을 고밀도로 고체 기재 표면에 일정한 간격으로 고정화시킨 마이크로칩을 의미한다. 고체 기재로는 유리, 실리콘, 종이, 고분자 및 금속, 예를 들어 철, 강, 알루미늄, 구리, 아연, 주석, 납, 니켈, 주석, 금 및 은 등의 재질로 된 기재가 사용될 수 있으나, 본 발명에서 형광 기반의 검출 방법을 이용하기 때문에 바람직하게는 유리를 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어, "강글리오사이드 (ganglioside)"란 여러 개의 당 단위와 한 개 이상의 시알산을 포함하는 세라마이드(ceramide) 유도체로, 당사슬의 수와 시알산의 수에 의해서 일반적으로 GM1, GM2, GM3 등으로 불린다.
본 발명에서 용어, "지엠원 펜타사카라이드" 는 엔-아세틸갈락토사민, 글루코오즈, 두 개의 갈락토오즈, 그리고 한 개의 시알산, 즉 엔-아세틸뉴라민산으로 구성된, 총 다섯 개의 단당류로 구성된 강글리오사이드이다 (Gal-GalNAc[Neu5Ac]-Gal-Glc).
"지엠투 테트라사카라이드" 는 지엠원 펜타사카라이드에서 터미널 갈락토오즈가 제거된 형태이며 (GalNAc[Neu5Ac]-Gal-Glc), "아시알로 지엠원 테트라사카라이드"는 터미널 엔-아세틸뉴라민산이 제거된 형태이고 (Gal-GalNAc-Gal-Glc), "지엠쓰리 트라이사카라이드"는 터미널 갈락토오즈 베타1-3 엔-아세틸갈락토사민이 제거된 형태이다 (Neu5Ac-Gal-Glc). 그 외에 "갈락토오즈 베타1-3 엔-아세틸갈락토사민(Galβ1-3GalNAc)" "락토오즈(Gal-Glc)" 및 "시알산(Neu5Ac)"은 지엠원 펜타사카라이드를 구성하는 이당류 및 단당류이다.
본 발명에서 용어, "비브리오 콜레라 검출" 이란 대상 시료 내에 비브리오 콜레라가 존재하는지 여부를 알아내는 것 또는 시료 내 비브리오 콜레라가 존재할 가능성이 높다고 판정하는 것을 의미하며, 상기와 같은 의미에서 검색, 검사, 판정 또는 분석 등으로 대체될 수 있다. 본 발명의 목적상, 상기 검출은 검출 센서와 비브리오 콜레라의 직접적인 상호작용에 의한 검출 뿐만 아니라, 검출 센서가 비브리오 콜레라의 검출 표지(marker)와 상호작용을 하고 그 상호작용으로부터 발생한 신호에 의하여 비브리오 콜레라의 존재 여부를 판정할 수 있는 경우를 포함한다. 바람직하게, 본 발명은 비브리오 콜레라 검출 마커로 사용되는 콜레라 톡신과 검출 센서와의 상호작용을 형광 이미지 분석을 통하여 확인함으로써 시료 내 비브리오 콜레라의 존재를 검출할 수 있다.
따라서 바람직하게, 본 발명의 탄수화물 칩은, 비브리오 콜레라에서 생산되는 콜레라 톡신을 검출함으로써 시료 내 비브리오 콜레라의 존재를 검출함을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 탄수화물 칩은, 기존에 개발된 당류 기반의 비브리오 콜레라 검출 센서가 지엠원 펜타사카라이드만 사용했던 것과는 달리, 지엠원 펜타사카라이드 외에 지엠투 테트라사카라이드, 아시알로 지엠원 테트라사카라이드, 지엠쓰리 트라이사카라이드, 갈락토오즈 베타1-3 엔-아세틸갈락토사민, 락토오즈 및 시알산을 함께 사용함을 특징으로 한다.
지엠원 펜타사카라이드 이외의 당류들을 함께 사용함으로써, 비브리오 콜레라 검출 표지인 콜레라 톡신을 보다 민감하게 검출할 수 있고, 나아가 콜레라 톡신과 지엠원 펜타사카라이드의 상호작용시 지엠원 펜타사카라이드를 구성하는 다섯 가지의 단당류들과 지엠원 펜타사카라이드의 구조가 어떤 영향을 미치는지 확인할 수 있으며, 이를 통해 콜레라 톡신의 새로운 저해제(inhibitor)를 개발할 수 있는 효과도 얻을 수 있다.
또한 본 발명의 탄수화물 칩은, 기존에 개발된 당류 기반의 비브리오 콜레라 검출 센서가 강글리오사이드를 고정화하기 위하여 리포좀이나 지질을 사용했던 것과는 달리, 지엠원 펜타사카라이드, 지엠투 테트라사카라이드, 아시알로 지엠원 테트라사카라이드, 지엠쓰리 트라이사카라이드, 갈락토오즈 베타1-3 엔-아세틸갈락토사민, 락토오즈 및 시알산에 각각 아민기(-NH2)를 도입하고, 고체 기재를 상기 아민기가 도입된 당류의 아민기와 결합할 수 있는 작용기를 포함하도록 처리하여, 고체 기재 위에 당류를 직접 고정화시킴을 특징으로 한다.
이와 같이 강글리오사이드 상의 화학적인 변성과 공유 결합을 이용함으로써, 당류의 구조나 방향성에 변화를 주지 않고 당류를 고체 기재에 직접 고정화하여 당류와 콜레라 톡신 간의 상호작용을 용이하게 분석할 수 있으며 적은 양의 샘플로도 동시다발적으로 분석이 가능하다.
실제로, 본 발명에 따른 탄수화물 칩은, 콜레라 톡신의 검출 최저 농도를 콜레라 톡신 샘플이 없을 때의 형광 신호 세기의 표준 편차보다 3배 높은 형광 세기를 보이는 가장 낮은 농도라고 정의 했을 때, 용량-반응 곡선 (dose-reponse curve)을 통하여 확인된 검출 최저 농도가 2 ng/mL (23 pM) 로 나타났으며, 시각적인 검출 최저 농도는 5 ng/mL (57.5 pM)인 것으로 확인되었다 (도 3 참조).
이러한 검출 최저 농도는, 본 발명의 탄수화물 칩이 기존에 보고된 단당류 기반의 마이크로어레이(Ngundi, MM, Taitt, CR, McMurry, SA, Kahne, D, Ligler, FS, 2006. Biosens. Bioelectron. 21: 1195-1201) 나 이당류 기반의 색변화 분석(Schofield, CL, Field, RA, Russell, DA, 2007. Anal. Chem. 79: 1356-1361)에 의한 검출 민감도를 상회하는 우수한 효과를 가진다는 것을 뒷받침하는 것이다.
이와 같이 본 발명의 탄수화물 칩은 7 가지의 탄수화물을 직접 고정화시켜 탐지 프로브로 사용함으로써, 시각적인 검출 최저 농도 5 ng/mL (57.5 pM) 로 콜레라 톡신을 보다 민감하게 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 각 탄수화물 프로브의 검출 한계가 다양하므로 시료 내 콜레라 톡신의 농도까지 예상이 가능하며, 다중적인 프로브의 사용으로 인하여 보다 정확한 결과와 판단이 가능한 장점이 있다.
따라서, 바람직한 양태로서, 본 발명은, 지엠원 펜타사카라이드, 지엠투 테트라사카라이드, 아시알로 지엠원 테트라사카라이드, 지엠쓰리 트라이사카라이드, 갈락토오즈 베타1-3 엔-아세틸갈락토사민, 락토오즈 및 시알산이 표면에 고정된 고체 기재를 포함하며, 콜레라 톡신의 검출 최저 농도가 5 ng/mL 인, 비브리오 콜레라 검출용 탄수화물 칩을 제공한다.
또한, 본 발명의 탄수화물 칩은 지엠원 펜타사카라이드를 250 내지 500 μM 의 농도 범위로 포함하는 것이 바람직하다.
또한 바람직하게, 본 발명의 탄수화물 칩은 고체 기재로서 고분자, 유리, 금, 종이 및 생체막(membrane)으로 이루어진 군에서 선택된 것을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 바람직하게, 본 발명의 탄수화물 칩에 포함된 지엠원 펜타사카라이드, 지엠투 테트라사카라이드, 아시알로 지엠원 테트라사카라이드, 지엠쓰리 트라이사카라이드, 갈락토오즈 베타1-3 엔-아세틸갈락토사민, 락토오즈 및 시알산은 아민기(-NH2)가 도입된 것일 수 있다.
또한 바람직하게, 본 발명의 탄수화물 칩에 포함된 고체 기재는 알데하이드(aldehyde), 케톤(keton), N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide), 에폭시드(epoxide), 이미도에스터(imidoester), 무수물(anhydride) 및 카보네이트(carbonate)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 작용기가 도입된 것일 수 있다.
또한 바람직하게, 본 발명의 탄수화물 칩은
지엠원 펜타사카라이드, 지엠투 테트라사카라이드, 아시알로 지엠원 테트라사카라이드, 지엠쓰리 트라이사카라이드, 갈락토오즈 베타1-3 엔-아세틸갈락토사민, 락토오즈 및 시알산에 아민기(-NH2)를 도입하는 단계;
고체 기재에 알데하이드, 케톤, N-하이드록시숙신이미드, 에폭시드, 이미도에스터, 무수물 및 카보네이트로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 작용기를 도입하는 단계; 및
상기 지엠원 펜타사카라이드, 지엠투 테트라사카라이드, 아시알로 지엠원 테트라사카라이드, 지엠쓰리 트라이사카라이드, 갈락토오즈 베타1-3 엔-아세틸갈락토사민, 락토오즈 및 시알산을 상기 고체 기재에 고정화하는 단계에 의하여 제조된 것일 수 있다.
따라서, 또 하나의 양태로서, 본 발명은
(a) 지엠원 펜타사카라이드, 지엠투 테트라사카라이드, 아시알로 지엠원 테트라사카라이드, 지엠쓰리 트라이사카라이드, 갈락토오즈 베타1-3 엔-아세틸갈락토사민, 락토오즈 및 시알산에 아민기(-NH2)를 도입하는 단계;
(b) 고체 기재에 알데하이드, 케톤, N-하이드록시숙신이미드, 에폭시드, 이미도에스터, 무수물 및 카보네이트로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 작용기를 도입하는 단계; 및
(c) 상기 지엠원 펜타사카라이드, 지엠투 테트라사카라이드, 아시알로 지엠원 테트라사카라이드, 지엠쓰리 트라이사카라이드, 갈락토오즈 베타1-3 엔-아세틸갈락토사민, 락토오즈 및 시알산을 상기 고체 기재에 고정화하는 단계를 포함하는,
비브리오 콜레라 검출용 탄수화물 칩의 제조 방법에 관한 것이다.
상기 단계 (a) 에서, 당류에 아민기를 도입하기 위하여 아민기를 가지는 화합물, 바람직하게는 아미노에틸 아닐린 또는 아미노벤질아민을 당류에 반응시킬 수 있다. 이 경우 상기 당류에 포함된 알데하이드기가 쉬프 베이스 반응을 통하여 상기 아민 화합물의 아민기의 질소 원자로부터 전자를 받아 -CH=N- 결합을 형성하게 된다. 상기 반응을 위하여 아민 화합물은 용매에 녹여 사용할 수도 있으며, 상기 용매는 아민 화합물의 종류에 따라 당업자가 용이하게 결정할 수 있다. 예를 들어, 아미노에틸 아닐린의 경우 아세트산 (acetic acid), 아세톤(acetone), 아세토니트릴(acetonitrile) 등에 녹여 사용될 수 있다. 상기 당류와 아민 화합물은 바람직하게는 당류 1몰에 대하여 아민 화합물 1몰을 반응시키는 것이 바람직하며, 반응 온도 및 반응 시간은 20℃ 내지 90℃에서 30분 내지 2시간이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는 40℃에서 1시간 동안 반응시킬 수 있다.
또한 상기 당류(saccharide)와 아민 화합물을 반응하여 생성된 -CH=N- 결합을 안정화시킴으로써 당류를 더욱 강하게 고정시키기 위해, 상기 아민기가 도입된 당류를 환원시킬 수 있다. 상기 환원 과정을 통하여 상기 아민기가 도입된 당류는 -CH2-NH- 결합을 가질 수 있다. 상기 환원 과정에 사용될 수 있는 환원제는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 디메틸아민 보란(dimethylamine borane), 소듐 보로하이드라이드(sodium borohydride) 및 시아노보로하이드라이드(cyanoborohydride)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다. 상기 환원제는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 아민기가 도입된 당류 1몰에 대하여 환원제를 1 내지 10몰로 사용할 수 있으며, 상기 환원제는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 20℃ 내지 80℃에서 1시간 내지 2 동안 처리할 수 있다.
상기 단계 (b) 에서, 탄수화물 칩 기판으로 사용될 고체 기재는 상기 아민기가 도입된 당류의 아민기와 결합할 수 있는 작용기를 포함하도록 처리하는 것이 바람직하다. 상기 작용기는 이에 한정되지 않지만 알데하이드(aldehyde), 케톤(keton), 엔-하이드록실석신이미드 (N-hydroxysuccinimide), 에폭시드(epoxide), 이미도에스터(imidoester), 무수물(anhydride) 또는 카보네이트(carbonate) 를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 엔-하이드록실석신이미드를 사용할 수 있다. 상기 고체 기재에 작용기를 처리하기 위해서 당업자에게 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 상기 작용기가 처리된 고체 기재를 구입하여 사용할 수도 있다. 예컨대, 엔-하이드록실석신이미드가 처리된 상업화된 글라스 슬라이드를 구입하여 사용할 수 있다.
상기 단계 (c) 에서, 상기 아민기가 도입된 당류를 고체 기재 표면에 고정화시키기 위하여, 당업자에게 공지된 코팅기술을 사용할 수 있으며, 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 상기 당류를 고체 기재 표면에 분무, 분사, 페인팅, 침지, 점적(spotting), 롤코팅 또는 플로우 코팅 방법을 사용할 수 있다. 가장 바람직하게는 상기 아민기가 도입된 당류를 핀을 이용하여 점적(spotting)하는 방법을 사용할 수 있다.
일 구체예로, 상기 엔-하이드록실석신이미드가 처리된 칩기판에 마이크로피펫이나 마이크로어레이어 등을 사용하여 본 발명의 당류를 녹인 용액을 점적할 수 있다. 점적이 끝나면 기판을 75% 정도의 습도 하에서 12시간 이상 반응시킨 후 기판을 세척하고, 세척된 기판은 아르곤 가스 등의 불활성 가스를 이용하여 건조시켜 탄수화물 칩을 제조할 수 있다. 또한 추가적으로, 상기 제조한 탄수화물 칩에서 반응하지 않은 엔-하이드록실석신이미드를 불활성시키기 위해 소정의 워싱 공정을 수행할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은
상기 탄수화물 칩 상에 콜레라 톡신이 포함된 시료를 처리하는 단계; 및
형광 이미지 분석을 통하여 콜레라 톡신을 검출하는 단계를 포함하는,
비브리오 콜레라를 검출하는 방법에 관한 것이다.
상기에서, 탄수화물 칩 상에서 비브리오 콜레라에서 분비된 콜레라 톡신을 검출하기 위하여 전체 콜레라 톡신을 적용할 수 있다. 비브리오 콜레라에서 생산되어 분비되는 것은 콜레라 톡신 B 서브유닛이 아니라 전체 콜레라 톡신이기 때문에, 본 발명의 탄수화물 칩은 전체 콜레라 톡신을 검출함으로써 비브리오 콜레라 여부를 진단할 수 있다.
따라서 상기에서 콜레라 톡신이란, 한 개의 A 서브유닛과 다섯 개의 B 서브유닛으로 구성된 전체 콜레라 톡신을 의미하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에서 콜레라 톡신이 포함된 시료란 병원성 비브리오 콜레라가 존재할 것으로 의심되는 물 또는 음식물 시료 또는 혈액, 소변, 타액 등의 생체 시료 등을 의미하는 것이 바람직하다.
상기에서, 형광 이미지 분석을 통하여 콜레라 톡신을 검출하는 단계는, 형광물질이 표지된 항체를 처리하여 형광 이미지 분석을 수행할 수 있다.
상기 당류와 콜레라 톡신 간의 결합 여부는, 이에 한정되지 않지만, 콜레라 톡신을 검출할 수 있는 1차 항체를 처리하여 당류에 결합한 콜레라 톡신과 반응시킨 후, 상기 1차 항체에 결합할 수 있는 형광물질이 표지된 2차 항체를 사용하여 수행되는 것이 바람직하다. 상기 형광물질은 Cy3(그린), Cy5(레드), FITC(그린), 알렉사(Alexa), 보디피(BODIPY), 로다민(Rhodamine), 또는 Q-도트(dot) 등을 사용할 수 있으며 이에 한정되지 아니한다. 여러 2차 항체가 1차 항체 상의 상이한 에피토프들과 반응할 수 있기 때문에 신호 증폭이 발생하여 당류와 콜레라 톡신 간의 상호작용 유무에 대한 가시적인 확인이 용이하며, 당업자에게 공지된 형광이미지 분석방법을 이용함으로써 이를 확인할 수 있다.
본 발명은 탄수화물 칩 상에서 지엠원 펜타사카라이드, 지엠투 테트라사카라이드, 아시알로 지엠원 테트라사카라이드, 지엠쓰리 트라이사카라이드, 갈락토오즈 베타1-3 엔-아세틸갈락토사민, 락토오즈 및 시알산의 형광세기를 비교함으로써 비브리오 콜레라에서 분비된 콜레라 톡신의 검출 및 콜레라 톡신을 검출하기 위한 탐지 프로브를 분석할 수 있다 (도 3 내지 도 5).
따라서, 본 발명의 탄수화물 칩을 토대로 하여 비브리오 콜레라에서 분비된 콜레라 톡신의 검출이 가능하며 더 나아가 음식물 내의 비브리오 콜레라 검출에의 응용 등이 가능하다.
본 발명은 지엠원 펜타사카라이드, 지엠투 테트라사카라이드, 아시알로 지엠원 테트라사카라이드, 지엠쓰리 트라이사카라이드, 갈락토오즈 베타1-3 엔-아세틸갈락토사민, 락오토즈 및 시알산이 고정화된 탄수화물 칩을 이용하여 비브리오 콜레라에서 분비된 콜레라 톡신을 낮은 농도 범위까지 검출할 수 있으며, 상기 방법은 칩을 기반으로 하기 때문에 적은 양의 샘플을 이용하여 동시다발적으로 콜레라 톡신을 검출할 수 있고, 이를 통하여 시료 내 비브리오 콜레라의 존재 여부를 용이하게 알 수 있다.
도 1은 지엠원 펜타사카라이드, 지엠투 테트라사카라이드, 아시알로 지엠원 테트라사카라이드, 지엠쓰리 트라이사카라이드, 갈락토오즈 베타1-3 엔-아세틸갈락토사민, 락토오즈 및 시알산로 구성된 탄수화물 칩의 플랫폼과 콜레라 톡신을 검출하기 위한 모식도이다.
도 2는 탄수화물 칩에 사용된 탄수화물인 지엠원 펜타사카라이드, 지엠투 테트라사카라이드, 아시알로 지엠원 테트라사카라이드, 지엠쓰리 트라이사카라이드, 갈락토오즈 베타1-3 엔-아세틸갈락토사민, 락토오즈 및 시알산이다.
도 3a은 본 발명의 7가지 탄수화물들 (지엠원 펜타사카라이드, 지엠투 테트라사카라이드, 아시알로 테트라사카라이드, 지엠쓰리 트라이사카라이드, 갈락토오즈 베타1-3 엔-아세틸갈락토사민, 락토오즈, 그리고 시알산)으로 구성된 탄수화물 칩을 이용하여 다양한 농도 전체 콜레라 톡신(ctxAB5) (750 ng/ml 에서 5 μg/ml)의 검출을 분석한 형광 그림이다.
도 3b는 본 발명의 7가지 탄수화물들로 구성된 탄수화물 칩 상에서 전체 콜레라 톡신 (ctxAB5)을 검출할 수 있는 최저 농도 (limitation of detection, LOD)를 형광 면역 방법을 이용하여 분석한 결과 중 지엠원 펜타사카라이드 부분만를 나타낸 형광 그림이다.
도 3c는 도 3b에 나타난 형광세기를 분석한 선그래프이다.
도 3d는 도 3c에 일부 구간을 분석한 선 그래프이다.
도 4a는 본 발명의 탄수화물 칩 상에서 전체 콜레라 톡신 (5, 10, 40 ng/ml)과 지엠원 펜타사카라이드 (50, 100, 250, 500 μg, 1, 2.5, 5 mg)의 농도에 따른 상호작용을 형광 면역 방법을 이용하여 분석한 전체적인 형광 그림이다.
도 4b는 도 4a에 나타난 형광 세기를 분석한 선 그래프이다.
도 5a은 비브리오 콜레라 배양액을 본 발명의 탄수화물 칩에 적용하여 콜레라 톡신의 검출여부를 형광 면역 방법을 이용하여 분석한 전체 형광 그림이다.
도 5b는 장염 비브리오균 배양액을 본 발명의 탄수화물 칩에 적용하여 콜레라 톡신의 검출여부를 형광 면역 방법을 이용하여 분석한 전체 형광 그림이다.
도 5c는 포도상구균 배양액을 본 발명의 탄수화물 칩에 적용하여 콜레라 톡신의 검출여부를 형광 면역 방법을 이용하여 분석한 전체 형광 그림이다.
도 5d는 도 5a, 5b, 그리고 5c에서 보였던 형광 그림을 정리한 그림이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 탄수화물 칩의 제조
물에 녹인 당(지엠원 펜타사카라이드, 지엠투 테트라사카라이드, 아시알로 지엠원 테트라사카라이드, 지엠쓰리 트라이사카라이드, 갈락토오즈 베타1-3 엔-아세틸갈락토사민, 락토오즈 및 시알산) 100 mM과 100 % 아세트산으로 녹인 아미노에틸 아닐린 100 mM 를 부피비 1:1로 섞은 다음, 쉬프 베이스 반응(schiff base reaction)을 이용하여, 상기 당의 알데하이드기와 아미노에틸 아닐린의 아민기와 40℃에서 1시간 동안 반응시켜 당류에 아민기를 도입하였다. 상기 반응이 완료된 다음, 100 mM 디메틸아민 보란을 첨가하여 1시간 정도 환원반응을 시켰다.
상기 아민기가 도입된 당류들을 150mM 인산염(phosphate), 0.04% 트윈 20(Tween 20), 5% 글리세롤(glycerol), 0.1mg/ml 보비인 세룸 알부민(bovine serum albumin: BSA)으로 구성된 pH 8.5의 프린트 용액(print buffer)에 녹인 다음 Chip Maker 2 핀(pin)과 Microssys 5100 microarrayer를 이용해서 75% 습도 하에 엔-하이드록실석신이미드로 처리된 글라스 슬라이드(Schott Nexterion, 독일)에 점적한 다음 같은 습도 조건 하에서 12시간 이상 반응시켜 고정화함으로써 탄수화물 칩을 제작하였다. 도 1은 탄수화물 칩 플랫폼을 나타낸다.
실시예 2. 탄수화물 칩을 이용한 콜레라 톡신 검출
상기 실시예 1에서 제조한 탄수화물 칩에서 반응하지 않은 엔-하이드록실석신이미드를 불활성시키기 위해, 50mM 붕산 나트륨(sodium borate)에 50mM 에탄올아민(ethanolamine)을 녹인 pH 8.0의 블로킹 용액과 한 시간 동안 반응시켰다. 상기 반응 후 블로킹 용액을 제거하고 137mM 염화나트륨(NaCl), 2.7mM 염화칼륨, 4.3mM 인산이수소나트륨(Na2HPO4), 1.4mM 인산이수소칼륨(KH2PO4) 그리고 0.5% 트윈-20(Tween 20)으로 구성된 pH 7.5의 워싱 용액 I (washing buffer I)과 워싱 용액 I에서 0.5% 트윈-20(Tween 20)을 제외한 pH 7.5의 워싱 용액 II(washing buffer II)로 반응하지 않고 남아있는 블로킹 용액을 씻어내고 원심분리기(centrifugal machine)을 이용해서 건조시켰다.
콜레라 톡신은 지엠원 강글리오사이드의 당류 부분과 특이적으로 강하게 결합한다고 잘 알려져 있지만, 본 발명에서는 지엠원 펜타사카라이드 뿐만 아니라 지엠투 테트라사카라이드, 아시알로 지엠원 테트라사카라이드, 지엠쓰리 트라이사카라이드, 갈락토오즈 베타1-3 엔-아세틸갈락토사민, 락토오즈, 그리고 엔-아세틸뉴라민산이 콜레라 톡신을 검출 하기 위한 탐지 프로브로 사용되었다. 또한 본 발명의 탄수화물 칩으로 콜레라 톡신을 검출할 수 있는 지 여부를 판단하기 위해서 사용된 콜레라 톡신은 콜레라 톡신 B 서브 유닛이 아니라 전체 콜레라 톡신이다. 이는 비브리오 콜레라에서 생산되어 분비되는 것이 콜레라 톡신 B 서브 유닛이 아니라 전체 콜레라 톡신이기 때문이다.
정량적인 분석을 위해, 다양한 농도 (0 ~ 10 μg/mL)의 전체 콜레라 톡신을 본 발명의 탄수화물 칩에 적용하였고 검출은 토끼에서 생산된 콜레라 톡신 B 서브 유닛에 대한 항체와 형광 염료 알렉사 플루어 546이 결합된 2차 항체를 이용한 형광 면역 방법을 통해서 확인하였다.
2-1. 콜레라 톡신의 검출 최저 농도 확인
상기 방법으로 본 발명의 탄수화물 칩의 민감도 및 검출 최저 농도를 알아보기 위하여, 10 mM 의 7가지 탄수화물들 (지엠원 펜타사카라이드, 지엠투 테트라사카라이드, 아시알로 지엠원 테트라사카라이드, 지엠쓰리 트라이사카라이드, 갈락토오즈 베타1-3 엔-아세틸갈락토사민, 락토오즈, 그리고 시알산)을 탐지 프로브로 사용하여 조사하였다. 그 민감도와 검출 최저 농도는 용량-반응 곡선 (dose-reponse curve)에서 결정하였다. 검출 최저 농도는 샘플이 없을 때의 형광 신호 세기의 표준 편차보다 3배 높은 형광 세기를 보이는 가장 낮은 농도를 말하는 것이다.
이 정의에 의할 때, 도 3b 내지 도 3d에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 탄수화물 칩은 지엠원 펜카사카라이드를 탐지 프로브로 사용하였을 경우 2 ng/mL (23 pM)의 검출 최저 농도를 보이지만, 시각적인 검출 최저 농도는 5 ng/mL (57.5 pM)로 나타났다. 이러한 검출 최저 농도는, 본 발명의 탄수화물 칩이 기존에 보고된 단당류 기반의 마이크로어레이(Ngundi, MM, Taitt, CR, McMurry, SA, Kahne, D, Ligler, FS, 2006. Biosens. Bioelectron. 21: 1195-1201) 나 이당류 기반의 색변화 분석(Schofield, CL, Field, RA, Russell, DA, 2007. Anal. Chem. 79: 1356-1361)에 의한 검출 민감도를 상회하는 우수한 효과를 나타내는 것이다. 또한, 1 μg/mL에서 5 ng/mL의 전체 콜레라 톡신 농도 범위에서 형광 신호 세기는 전체 콜레라 톡신의 농도가 증가함에 따라 증가하였다. 10~200 ng/mL의 전체 콜레라 톡신 농도 범위에서 형광 신호 세기와 전체 콜레라 톡신 농도는 0.9935의 높은 결정 계수를 가진 선형적인 관계를 가지는 것으로 나타났다. 전체 콜레라 톡신의 농도가 1 μg/mL 이상 일 때에는 그 형광 세기는 포화되었다.
또한, 도 3a 에서 나타난 바와 같이, 지엠투 테트라사카라이드를 탐지 프로브로 사용하였을 경우, 시각적인 검출 최저 농도는 750 ng/ml로 나타났다. 또한, 아시알로 지엠원 테트라사카라이드를 탐지 프로브로 사용하였을 경우, 시각적인 검출 최저 농도는 1 μg/ml로 나타났다. 그 이외의 탄수화물들 (지엠쓰리 트라이사카라이드, 갈락토오즈 베타1-3 엔-아세틸갈락토사민, 락토오즈, 그리고 시알산)의 경우, 5 μg/ml 이상의 콜레라 톡신을 검출할 수 있는 것으로 확인되었다.
이와 같이 본 발명의 탄수화물 칩은 7 가지의 탄수화물을 탐지 프로브로 사용함으로써, 시각적인 검출 최저 농도 5 ng/mL (57.5 pM) 로 콜레라 톡신을 보다 민감하게 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 각 탄수화물 프로브의 검출 한계가 다양하므로 시료 내 콜레라 톡신의 농도까지 예상이 가능하며, 다중적인 프로브의 사용으로 인하여 보다 정확한 결과와 판단이 가능한 장점이 있다.
2-2. 콜레라 톡신 검출을 위한 당류의 최적 농도 확인
다가 결합 시스템에서, 리간드 밀도는 리간드의 분포 및 리간드 사이의 거리를 결정하기 때문에 매우 중요한 요소로 알려져 있다 (Mammen, M, Choi, SK, Whitesides, GM, 1998. Angew. Chem. Int. Ed. 37: 2754-2794; Kiessling, LL, Gestwicki, JE, Strong, LE, 2006. Angew. Chem. Int. Ed. 45: 2348-2368; Smith, EA, Thomas, WD, Kiessling LL, Corn, RM, 2003. 125: 614-6148; Huskens, J, Mulder, A, Auletta, T, Nijhuis, CA, Ludden, MJW, Reinhoudt, DNJ, 2004. J. Am. Chem. Soc. 126: 6784-6797). Shi 그룹은 지엠원 클러스터링(GM1 clustering)을 통하여 지엠원의 밀도가 높아짐에 따라 결합 세기가 감소한다는 것을 확인하였고 (Shi J, Yang, T, Kataoka, S, Zhang, Y, Daiz, AJ, Cremer, PS, 2007. GM1 Clustering Inhibits Cholera Toxin Binding in Supported Phospholipid Membranes. J. Am. Chem. Soc. 129: 5954-5961), 다른 연구 그룹도 다른 지엠원 밀도를 가진 창자의 미세 융모 막에 콜레라 톡신의 결합 정도를 조사하여 지엠원의 농도가 낮아질수록 콜레라 톡신의 결합 정도가 강하다는 것을 보고한 바 있다(Lencer, WI; Chu, SH; Walker, WA, 1987. Differential Binding Kinetics of Cholera Toxin to Intestinal Microvillus Membrane during Development. Infect. Immunol. 55: 3126-3130). 이 연구결과들은 지엠원 펜타사카라이드의 밀도가 탄수화물 칩 상에서 콜레라 톡신을 검출하는 데에 영향을 미칠 것이고 본 발명의 탄수화물 칩의 민감도를 결정하는 데에 중요한 인자일 것임을 시사한다.
이에, 본 발명에서 콜레라 톡신 검출에 있어서 지엠원 펜타사카라이드 농도의 영향을 조사하기 위해 50 μM 내지 5 mM 지엠원 펜타사카라이드와 5 내지 40 ng/mL 전체 콜레라 톡신을 사용하여 분석하였다. 도 4에서 볼 수 있듯이, 250 μM 내지 1 mM 지엠원 펜타사카라이드 농도 범위에서, 지엠원 펜타사카라이드의 농도가 낮아짐에 따라 형광 신호 세기가 증가하였고, 콜레라 톡신을 검출하기 위한 최적의 지엠원 펜타사카라이드 농도는 250 내지 500 μM 로 나타났다. 따라서, 본 발명의 탄수화물 칩은 콜레라 톡신을 위한 최적의 지엠원 펜타사카라이드 농도 (250 ~ 500 μM)가 있으며 본 발명의 탄수화물 칩의 민감도는 최적의 지엠원 펜타사카라이드 농도를 사용함으로써 향상되어질 수 있다.
실시예 3. 탄수화물 칩을 이용한 비브리오 콜레라 배양액에서 생산되어 분비된 콜레라 톡신 검출
많은 사람들은 비브리오 콜레라에 의해서 오염된 물이나 음식들로 고통을 받고 있기 때문에 빠르고 민감한 분석 방법들이 크게 요구되어 왔다. 이러한 이유로 본 발명의 탄수화물 칩이 실제 비브리오 콜레라 배양액에서 콜레라 톡신을 검출 할 수 있는 지 여부를 확인하였다. 실시예 1에서 제조한, 7가지 탄수화물들 (지엠원 펜타사카라이드, 지엠투 테트라사카라이드, 아시알로 지엠원 테트라사카라이드, 지엠쓰리 트라이사카라이드, 갈락토오즈 베타1-3 엔-아세틸갈락토사민, 락토오즈, 그리고 시알산)로 구성된 탄수화물 칩을 사용하였고 실험 조건은 전체 콜레라 톡신을 이용하여 정량적인 분석을 하였을 때의 조건과 동일하다. 기존의 환경 위해 미생물 비브리오 콜레라의 검출시 문제되었던 긴 배양 시간의 단점을 극복할 수 있는지 여부를 판단하기 위해서 비브리오 콜레라는 3 시간 동안 37 도에서 AKI 배지에서 배양한 다음 실험을 진행하였다. 추가적인 처리들 없이, 비브리오 콜레라 배양액은 본 발명의 탄수화물 칩에 적용되었다. 또한, 대조군으로서 장염비브리오균 (Vibrio parahaemolyticus)과 포도상구균(Staphylococcus aureus)을 포도상구균은 LB 배지에서 12 시간 동안 37 도에서 배양한 후 본 발명의 탄수화물 칩에 적용하였다.
그 결과, 도 5a 에 나타난 바와 같이, 본 발명의 탄수화물 칩은 지엠원 펜타사카라이드와 지엠투 테트라사카라이드에서 강한 형광 신호 세기를 보였으므로, 콜레라 톡신을 검출함으로써 실제 비브리오 콜레라의 검출 가능성을 증명하였다. 이는 앞선 전체 콜레라 톡신의 최저 농도 분석 결과를 토대로 분석하였을 때, 지엠원 펜타사카라이드와 지엠투 테트라사카라이드만이 형광 신호를 보였기 때문에 5 μg/ml 이하의 콜레라 톡신이 존재한다는 것을 추측할 수 있다. 나아가, 본 발명의 탄수화물 칩의 특이성을 평가하기 위해 대조군으로 장염비브리오균과 포도상구균 배양액을 각각 본 발명의 탄수화물 칩에 적용한 결과, 도 5b 및 도 5c에서 보듯이 장염비브리오균과 포도상구균 배양액에서는 전혀 형광이 나타나지 않았으며, 본 발명의 탄수화물 칩은 오직 비브리오 콜레라 배양액에서 생산된 콜레라 톡신에 형광 신호 세기를 보였다. 이는 본 발명의 탄수화물 칩이 콜레라 톡신을 검출하는 데에 높은 특이성을 가진다는 것을 의미한다.

Claims (16)

  1. 지엠원 펜타사카라이드(GM1 pentasaccharide), 지엠투 테트라사카라이드 (GM2 tetrasaccharide), 아시알로 지엠원 테트라사카라이드 (asialo GM1 tetrasaccharide), 지엠쓰리 트라이사카라이드 (GM3 trisaccharide), 갈락토오즈 베타1-3 엔-아세틸갈락토사민 (Galactose-β1,3 N-acetylgalactosamin), 락토오즈 (lactose) 및 시알산 (sialic acid)이 표면에 고정된 고체 기재를 포함하는, 비브리오 콜레라 검출용 탄수화물 칩.
  2. 제1항에 있어서, 상기 탄수화물 칩은 비브리오 콜레라에서 생산되는 콜레라 톡신을 검출함으로써 시료 내 비브리오 콜레라의 존재를 검출하는 것인, 비브리오 콜레라 검출용 탄수화물 칩.
  3. 제2항에 있어서, 상기 탄수화물 칩은 비브리오 콜레라에서 생산되는 콜레라 톡신의 검출 최저 농도가 5 ng/mL 인, 비브리오 콜레라 검출용 탄수화물 칩.
  4. 제1항에 있어서, 상기 탄수화물 칩은 지엠원 펜타사카라이드를 250 내지 500 μM 의 농도 범위로 포함하는 것인, 비브리오 콜레라 검출용 탄수화물 칩.
  5. 제1항에 있어서, 상기 고체 기재는 고분자, 유리, 금, 종이 및 생체막(membrane)으로 이루어진 군에서 선택된 것인, 비브리오 콜레라 검출용 탄수화물 칩.
  6. 제1항에 있어서, 상기 지엠원 펜타사카라이드, 지엠투 테트라사카라이드, 아시알로 지엠원 테트라사카라이드, 지엠쓰리 트라이사카라이드, 갈락토오즈 베타1-3 엔-아세틸갈락토사민, 락토오즈 및 시알산은 아민기(-NH2)가 도입된 것인, 비브리오 콜레라 검출용 탄수화물 칩.
  7. 제1항에 있어서, 상기 고체 기재는 알데하이드(aldehyde), 케톤(keton), N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide), 에폭시드(epoxide), 이미도에스터(imidoester), 무수물(anhydride) 및 카보네이트(carbonate)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 작용기가 도입된 것인, 비브리오 콜레라 검출용 탄수화물 칩.
  8. 제1항에 있어서, 상기 탄수화물 칩은
    지엠원 펜타사카라이드, 지엠투 테트라사카라이드, 아시알로 지엠원 테트라사카라이드, 지엠쓰리 트라이사카라이드, 갈락토오즈 베타1-3 엔-아세틸갈락토사민, 락토오즈 및 시알산에 아민기(-NH2)를 도입하는 단계;
    고체 기재에 알데하이드, 케톤, N-하이드록시숙신이미드, 에폭시드, 이미도에스터, 무수물 및 카보네이트로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 작용기를 도입하는 단계; 및
    상기 지엠원 펜타사카라이드, 지엠투 테트라사카라이드, 아시알로 지엠원 테트라사카라이드, 지엠쓰리 트라이사카라이드, 갈락토오즈 베타1-3 엔-아세틸갈락토사민, 락토오즈 및 시알산을 상기 고체 기재에 고정화하는 단계에 의하여 제조된 것인,
    비브리오 콜레라 검출용 탄수화물 칩.
  9. 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항의 탄수화물 칩 상에 콜레라 톡신이 포함된 시료를 처리하는 단계; 및
    형광 이미지 분석을 통하여 콜레라 톡신을 검출하는 단계를 포함하는,
    비브리오 콜레라를 검출하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 콜레라 톡신이 포함된 시료는 물 시료, 음식물 시료, 혈액 시료, 소변 시료, 또는 타액 시료인,
    비브리오 콜레라를 검출하는 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 콜레라 톡신은 한 개의 A 서브유닛과 다섯 개의 B 서브유닛으로 구성된 것인,
    비브리오 콜레라를 검출하는 방법.
  12. (a) 지엠원 펜타사카라이드, 지엠투 테트라사카라이드, 아시알로 지엠원 테트라사카라이드, 지엠쓰리 트라이사카라이드, 갈락토오즈 베타1-3 엔-아세틸갈락토사민, 락토오즈 및 시알산에 아민기(-NH2)를 도입하는 단계;
    (b) 고체 기재에 알데하이드, 케톤, N-하이드록시숙신이미드, 에폭시드, 이미도에스터, 무수물 및 카보네이트로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 작용기를 도입하는 단계; 및
    (c) 상기 지엠원 펜타사카라이드, 지엠투 테트라사카라이드, 아시알로 지엠원 테트라사카라이드, 지엠쓰리 트라이사카라이드, 갈락토오즈 베타1-3 엔-아세틸갈락토사민, 락토오즈 및 시알산을 상기 고체 기재에 고정화하는 단계를 포함하는,
    제1항의 비브리오 콜레라 검출용 탄수화물 칩의 제조 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 단계 (a) 는 지엠원 펜타사카라이드, 지엠투 테트라사카라이드, 아시알로 지엠원 테트라사카라이드, 지엠쓰리 트라이사카라이드, 갈락토오즈 베타1-3 엔-아세틸갈락토사민, 락토오즈 및 시알산을 각각 아미노에틸아닐린과 20℃ 내지 90℃에서 30분 내지 2시간 동안 반응시켜 아민기를 도입하는 것인,
    비브리오 콜레라 검출용 탄수화물 칩의 제조 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 단계 (a) 는 아민기가 도입된 지엠원 펜타사카라이드, 지엠투 테트라사카라이드, 아시알로 지엠원 테트라사카라이드, 지엠쓰리 트라이사카라이드, 갈락토오즈 베타1-3 엔-아세틸갈락토사민, 락토오즈 및 시알산을 환원시키는 단계를 추가적으로 포함하는 것인,
    비브리오 콜레라 검출용 탄수화물 칩의 제조 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 환원은 디메틸아민 보란(dimethylamine borane), 소듐보로하이드라이드(sodium borohydride) 및 시아노보로하이드라이드(cyanoborohydride)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 환원제를 처리하는 것인,
    비브리오 콜레라 검출용 탄수화물 칩의 제조 방법.
  16. 제12항에 있어서, 상기 단계 (c) 는 아민기가 도입된 지엠원 펜타사카라이드, 지엠투 테트라사카라이드, 아시알로 지엠원 테트라사카라이드, 지엠쓰리 트라이사카라이드, 갈락토오즈 베타1-3 엔-아세틸갈락토사민, 락토오즈 및 시알산을 고체 기재의 표면에 분무, 분사, 페인팅, 침지, 스포팅(spotting), 롤코팅 또는 플로우 코팅하여 고정화하는 것인,
    비브리오 콜레라 검출용 탄수화물 칩의 제조 방법.
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