KR101314168B1 - 콩 품종판별을 위한 유전자 특이적 분자마커의 개발 방법 - Google Patents

콩 품종판별을 위한 유전자 특이적 분자마커의 개발 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101314168B1
KR101314168B1 KR1020100120865A KR20100120865A KR101314168B1 KR 101314168 B1 KR101314168 B1 KR 101314168B1 KR 1020100120865 A KR1020100120865 A KR 1020100120865A KR 20100120865 A KR20100120865 A KR 20100120865A KR 101314168 B1 KR101314168 B1 KR 101314168B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
gene
molecular marker
soybean
amplifying
Prior art date
Application number
KR1020100120865A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20120059212A (ko
Inventor
정우석
정종일
박나영
김진만
Original Assignee
건국대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 건국대학교 산학협력단 filed Critical 건국대학교 산학협력단
Priority to KR1020100120865A priority Critical patent/KR101314168B1/ko
Publication of KR20120059212A publication Critical patent/KR20120059212A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101314168B1 publication Critical patent/KR101314168B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6865—Promoter-based amplification, e.g. nucleic acid sequence amplification [NASBA], self-sustained sequence replication [3SR] or transcription-based amplification system [TAS]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 콩 품종판별을 위한 유전자 특이전 분자마커의 개발 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 애기장대(Arabidopsis)의 MYB 유전자 염기서열을 이용하여 콩의 MYB 유사 유전자를 발굴하고, 이를 이용하여 Medicago truncatula의 게놈 유전자에서 콩 MYB 유사 유전자들의 염기서열과 유사한 유전자를 발굴하고, 이들 유전자의 프로모터 부위에서 다형성을 관찰, 분석하여 콩의 품종 간 근연관계를 판별할 수 있는 유전자 특이전 분자마커를 개발하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 애기장대(Arabidopsis)의 MYB 전자조절단백질(transcription factor) 유전자들을 이용하여 결국 여러 콩 품종이 갖는 유전체수준에서의 특이성을 확인할 수 있는 유전자 특이적 분자마커를 개발하는 방법을 제공하며, 본 발명에 따르면 PCR을 통해 증폭된 밴드 패턴으로 콩 품종별 다형성의 차이점을 발굴하고 이를 분자마커로 이용하는 것이 가능하다. 본 발명에 의하여 발굴된 분자마커는 분자생물학적인 관점에서 콩 품종 판별에 이용할 수 있다.

Description

콩 품종판별을 위한 유전자 특이적 분자마커의 개발 방법{METHOD FOR DEVELOPING GENE SPECIFIC MOLECULAR MARKERS FOR DISCRIMINATINIG SOYBEAN CULTIVARS}
본 발명은 콩 품종판별을 위한 유전자 특이전 분자마커의 개발 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 애기장대(Arabidopsis)의 MYB 유전자 염기서열을 이용하여 콩의 MYB 유사 유전자를 발굴하고, 이를 이용하여 Medicago truncatula의 게놈 유전자에서 콩 MYB 유사 유전자들의 염기서열과 유사한 유전자를 발굴하고, 이들 유전자의 프로모터 부위에서 다형성을 관찰, 분석하여 콩의 품종 간 근연관계를 판별할 수 있는 유전자 특이전 분자마커를 개발하는 방법에 관한 것이다.
서로 다른 유전계통 간의 분자마커 개발은 육종과정에 있어 선발을 보다 효과적이고 정확하게 할 수 있는 매우 중요한 방법을 제공한다.
육종에 사용되는 기존의 분자마커로는 RFLP(restriction fragment length polymorphism), RAPD(random amplified polymorphic DNA), SSR(simple sequence repeats), AFLP(amplified fragment length polymorphism) 등이 있다. 이들 마커들은 대부분 게놈상의 DNA 염기서열간의 다형성(polymorphism)을 PCR을 통해 증폭된 DNA 단편을 통해 쉽게 확인할 수 있다는 기술적 공통성을 가지고 있으나 실제 이러한 다형성이 특정 형질의 발현에 관여하는 유전자와 관계된 것은 아니다.
위에서 언급한 바와 같이 육종과정 중 특정형질의 유무 또는 정도를 구분할 수 있는 분자마커를 이용한 선발(MAS: marker assistant selection)(Yuejin et al. 2002)은 육종의 과정을 보다 간편하게 하여 모든 육종가들이 선호하는 방법이나 이미 언급한 RFLP, RAPD, SSR, AFLP등의 방법으로는 특정형질과 관계된 분자마커를 찾는 과정이 기술적으로 상당부분 우연에 의존하고 있으며 설령 성공적으로 발견하였다 하더라도 분자표지가 생리학적으로 어떤 과정을 통해 특정형질과 관계되었는지 알 수 없는 중대한 단점이 있다.
MYB 전사조절요소(transcription factor)는 식물체2차대사, 내재해저항성, 발달과 분화, 신호전달에 관여하는 전사조절단백질로서 DNA 결합(binding) 부위에서는 MYB 유전자 간 변이가 적은(conserved) 단일 또는 복수(R2R3)의 반복되는 염기서열이 관찰된다. 애기장대(Arabidopsis)의 경우 약 130여개의 MYB 유전자가 복수(R2R3)의 반복되는 염기서열을 가지고 있으며 24개의 하위 그룹(sub group)으로 분류되기도 한다(Allan 등 2008 Trends in Plant Science 13(3):99-102).
이에, 본 발명자들은 비교유전체학의 기법을 이용하여 애기장대(Arabidopsis)의 MYB 유전자들과 유사한 염기서열을 가진 유전자들을 Medicago truncatula의 염기서열 데이터베이스(sequencing database)로부터 발굴하고 이 유전자들로부터 우리나라와 외국의 여러 콩 품종이 갖는 유전체수준의 특이성을 확인하여 품종판별을 할 수 있는 유전자 특이적 분자마커를 개발하였다.
본 발명은 상기의 필요성에 의해 안출된 것으로서, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 콩의 MYB 유사 유전자의 프로모터 부위의 유전적 다형성을 발굴함으로써 다양한 콩 품종의 유전체 수준에서의 특이성을 비교하고 콩 품종을 판별할 수 잇는 유전자 특이적 분자마커로 활용하는 데 있다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 콩 품종 판별을 위한 유전자 특이전 분자마커의 개발 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 분자마커의 개발 방법은 (1) 콩의 품종별 게놈 DNA(genomic DNA)를 추출하는 단계; (2) 콩(Gycine max)의 DNA 염기서열 데이터베이스로부터 서열번호 41로 기재되는 애기장대(Arabidopsis)의 MYB R2R3 반복서열과 유사한 염기서열을 갖는 콩의 유사 MYB 유전자를 발굴하는 단계; (3) Medicago truncatula의 DNA 염기서열 데이터베이스로부터 상기 (2) 단계에서 발굴한 콩의 MYB 유전자와 유사한 염기서열을 갖는 유전자를 찾아내는 단계; (4) 상기 Medicago truncatula의 DNA 염기서열 데이터베이스로부터 상기 (3) 단계에서 찾아낸 유전자의 프로모터 부위를 발굴하는 단계; (5) 상기 프로모터의 특정 부위를 증폭할 수 있는 PCR 프라이머(primer)를 제작하는 단계; (6) 상기 (1) 단계의 게놈 DNA(genomic DNA)를 주형으로 하고, (5) 단계의 프라이머를 이용하여 특정 유전자의 프로모터 부위를 증폭하는 단계; 및 (7) 상기 증폭된 특정 유전자의 프로모터 부위에서 다형성을 관찰, 분석하여 계통 간 분자마커로 사용될 수 있는 패턴을 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 애기장대(Arabidopsis)의 MYB 전자조절단백질(transcription factor) 유전자들을 이용하여 결국 여러 콩 품종이 갖는 유전체수준에서의 특이성을 확인할 수 있는 유전자 특이적 분자마커를 개발하는 방법을 제공하며, 본 발명에 따르면 PCR을 통해 증폭된 밴드 패턴으로 콩 품종별 다형성의 차이점을 발굴하고 이를 분자마커로 이용하는 것이 가능하다. 본 발명에 의하여 발굴된 분자마커는 분자생물학적인 관점에서 콩 품종 판별에 이용할 수 있다.
도 1은 본 발명에 일실시예에 따른 콩 품종 및 유전자원계통을 종피색에 의해 분류한 표이다.
도 2는 본 발명에 일실시예에 따른 콩 품종 및 유전자원계통을 입형(종자의 크기)에 의해 분류한 표이다.
도 3은 서열번호 1로 기재되는 콩 MYB 유사 유전자 염기서열을 이용하여 Medicago truncatula sequencing database에서 발굴한 고도의 유사성을 갖는 염기서열이다.
도 4는 서열번호 2로 기재되는 콩 MYB 유사 유전자 염기서열을 이용하여 Medicago truncatula sequencing database에서 발굴한 고도의 유사성을 갖는 염기서열이다.
도 5는 서열번호 3로 기재되는 콩 MYB 유사 유전자 염기서열을 이용하여 Medicago truncatula sequencing database에서 발굴한 고도의 유사성을 갖는 염기서열이다.
도 6은 서열번호 4로 기재되는 콩 MYB 유사 유전자 염기서열을 이용하여 Medicago truncatula sequencing database에서 발굴한 고도의 유사성을 갖는 염기서열이다.
도 7은 서열번호 5로 기재되는 콩 MYB 유사 유전자 염기서열을 이용하여 Medicago truncatula sequencing database에서 발굴한 고도의 유사성을 갖는 염기서열이다.
도 8은 서열번호 6로 기재되는 콩 MYB 유사 유전자 염기서열을 이용하여 Medicago truncatula sequencing database에서 발굴한 고도의 유사성을 갖는 염기서열이다.
도 9는 서열번호 7로 기재되는 콩 MYB 유사 유전자 염기서열을 이용하여 Medicago truncatula sequencing database에서 발굴한 고도의 유사성을 갖는 염기서열이다.
도 10는 서열번호 8로 기재되는 콩 MYB 유사 유전자 염기서열을 이용하여 Medicago truncatula sequencing database에서 발굴한 고도의 유사성을 갖는 염기서열이다.
도 11은 서열번호 9로 기재되는 염기서열의 5’ 말단 상위 2Kb 프로모터 부위를 포함하는 염기서열이다.
도 12는 서열번호 10로 기재되는 염기서열의 5’ 말단 상위 2Kb 프로모터부위를 포함하는 염기서열이다.
도 13은 서열번호 11로 기재되는 염기서열의 5’ 말단 상위 2Kb 프로모터부위를 포함하는 염기서열이다.
도 14는 서열번호 12로 기재되는 염기서열의 5’ 말단 상위 2Kb 프로모터부위를 포함하는 염기서열이다.
도 15는 서열번호 13로 기재되는 염기서열의 5’ 말단 상위 2Kb 프로모터부위를 포함하는 염기서열이다.
도 16은 서열번호 14로 기재되는 염기서열의 5’ 말단 상위 2Kb 프로모터부위를 포함하는 염기서열이다.
도 17은 서열번호 15로 기재되는 염기서열의 5’ 말단 상위 2Kb 프로모터부위를 포함하는 염기서열이다.
도 18은 서열번호 16로 기재되는 염기서열의 5’ 말단 상위 2Kb 프로모터부위를 포함하는 염기서열 이다.
도 19는 서열번호 17(도 11)로 기재되는 프로모터의 특정부위를 증폭할 수 있도록 제작된 프라이머(서열번호 25, 26)와 각각의 콩 품종 게놈 DNA(genomic DNA)를 주형으로 하여 증폭된 DNA 밴드 패턴이다. A1은 NTSYS 분석에 사용된 밴드의 위치를 표시한다. (도 19 내지 도 26에서, M:Standard marker, lane 1:남해콩, lane 2:황금콩, lane 3:보광콩, lane 4:검정콩1호, lane 5:광두, lane 6:동북태, lane 7:진품콩2호, lane 8:함안콩, lane 9:부광콩, lane 10:백운콩, lane 11:은하콩, lane 12:방사콩, lane 13:한남콩, lane 14:강림콩, lane 15:푸른콩, lane 16:신팔달콩2호, lane 17:큰올콩, lane 18:동산콩69호, lane 19:동산콩127호, lane 20:만리콩, lane 21:신농흑콩, lane 22:광안콩, lane 23:다원콩, lane 24:개척콩1호, lane 25:소명콩, lane 26:다올콩, lane 27:새올콩, lane 28:소백콩, lane 29:청자콩, lane 30:화엄풋콩, lane 31:검정콩4호, lane 32:검정올콩, lane 33:대원콩, lane 34:대풍콩, lane 35:소록콩, lane 36:태광콩, lane 37:대황콩, lane 38:삼남콩, lane 39:청두콩, lane 40:청서리태, lane 41:흑청콩, lane 42:갈미콩, lane 43:검정콩3호, lane 44:장미콩, lane 45:장원콩, lane 46:진품콩, lane 47:풍산콩, lane 48:흑서리태).
도 20은 서열번호 18(도 12)로 기재되는 프로모터의 특정부위를 증폭할 수 있도록 제작된 프라이머(서열번호 27, 28)와 각각의 콩 품종 게놈 DNA(genomic DNA)를 주형으로 하여 증폭된 DNA 밴드 패턴이다. B1, B2는 NTSYS 분석에 사용된 밴드의 위치를 표시한다.
도 21은 서열번호 19(도 13)로 기재되는 프로모터의 특정부위를 증폭할 수 있도록 제작된 프라이머(서열번호 29, 30)와 각각의 콩 품종 게놈 DNA(genomic DNA)를 주형으로 하여 증폭된 DNA 밴드 패턴이다. C1, C2는 NTSYS 분석에 사용된 밴드의 위치를 표시한다.
도 22는 서열번호 20(도 14)으로 기재되는 프로모터의 특정부위를 증폭할 수 있도록 제작된 프라이머(서열번호 31, 32)와 각각의 콩 품종 게놈 DNA(genomic DNA)를 주형으로 하여 증폭된 DNA 밴드 패턴이다. D1, D2는 NTSYS 분석에 사용된 밴드의 위치를 표시한다.
도 23은 서열번호 21(도 15)로 기재되는 프로모터의 특정부위를 증폭할 수 있도록 제작된 프라이머(서열번호 33, 34)와 각각의 콩 품종 게놈 DNA(genomic DNA)를 주형으로 하여 증폭된 DNA 밴드 패턴이다. F1, F2는 NTSYS 분석에 사용된 밴드의 위치를 표시한다.
도 24는 서열번호 22(도 16)으로 기재되는 프로모터의 특정부위를 증폭할 수 있도록 제작된 프라이머(서열번호 35, 36)와 각각의 콩 품종 게놈 DNA(genomic DNA)를 주형으로 하여 증폭된 DNA 밴드 패턴이다. E1, E2는 NTSYS 분석에 사용된 밴드의 위치를 표시한다.
도 25는 서열번호 23(도 17)로 기재되는 프로모터의 특정부위를 증폭할 수 있도록 제작된 프라이머(서열번호 37, 38)와 각각의 콩 품종 게놈 DNA(genomic DNA)를 주형으로 하여 증폭된 DNA 밴드 패턴이다. G1, G2는 NTSYS 분석에 사용된 밴드의 위치를 표시한다.
도 26은 서열번호 24(도 18)로 기재되는 프로모터의 특정부위를 증폭할 수 있도록 제작된 프라이머(서열번호 39, 40)와 각각의 콩 품종 게놈 DNA(genomic DNA)를 주형으로 하여 증폭된 DNA 밴드 패턴이다. H1, H2는 NTSYS 분석에 사용된 밴드의 위치를 표시한다.
도 27은 상기 도 19 내지 26의 밴드 패턴을 NTSYS 분석하여 얻은 콩 품종 간 근연관계를 나타내는 계통수(phylogenetic tree)이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 콩의 품종 판별을 위한 유전자 특이적 분자마커의 개발 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 분자마커의 개발방법은 (1) 콩의 품종별 게놈 DNA(genomic DNA)를 추출하는 단계; (2) 콩(Gycine max)의 DNA 염기서열 데이터베이스로부터 서열번호 41로 기재되는 애기장대(Arabidopsis)의 MYB R2R3 반복서열과 유사한 염기서열을 갖는 콩의 유사 MYB 유전자를 발굴하는 단계; (3) Medicago truncatula의 DNA 염기서열 데이터베이스로부터 상기 (2) 단계에서 발굴한 콩의 MYB 유전자와 유사한 염기서열을 갖는 유전자를 찾아내는 단계; (4) 상기 Medicago truncatula의 DNA 염기서열 데이터베이스로부터 상기 (3) 단계에서 찾아낸 유전자의 프로모터 부위를 발굴하는 단계; (5) 상기 프로모터의 특정 부위를 증폭할 수 있는 PCR 프라이머(primer)를 제작하는 단계; (6) 상기 (1) 단계의 게놈 DNA(genomic DNA)를 주형으로 하고, (5) 단계의 프라이머를 이용하여 특정 유전자의 프로모터 부위를 증폭하는 단계; 및 (7) 상기 증폭된 특정 유전자의 프로모터 부위에서 다형성을 관찰, 분석하여 계통 간 분자마커로 사용될 수 있는 패턴을 확인하는 단계를 포함한다.
본 발명에 있어서, 프로모터를 발굴하는 단계는 상기 (3) 단계에서 찾아낸 유전자 염기서열의 5' 방향 상위 1.5 ~ 3 Kb 부위에서 발굴하는 것을 특징으로 하며, 프라이머를 제작하는 단계는 특정 유전자의 프로모터가 포함되는 개시코돈으로부터 5' 방향으로 10 Kb 내부에서 복수의 프라이머를 제작하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 발굴한 콩(Glycine max)의 MYB 유사 유전자는 서열번호 1 내지 8로 기재되는 염기서열 중에서 선택되는 1 이상인 것을 특징으로 하고, Medicago truncatula의 DNA 염기서열 데이터베이스로부터 찾아낸 상기 콩의 MYB 유사 유전자와 유사한 염기서열은 서열번호 9 내지 16(도3 내지 10)으로 기재된다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 9 내지 16(도3 내지 10)으로 기재되는 콩 MYB 전사조절유전자 유사 염기서열로부터 발굴한 프로모터 부위는 서열번호 17 내지 24(도11 내지 18)로 기재되는 것이며, 각각의 프로모터 부위를 증폭할 수 있는 프라이머는 서열번호 9 내지 24로 기재되는 염기서열이다.
또한, 본 발명은 상기 분자마커의 개발 방법에 의하여 제작된 콩 품종판별을 위한 유전자 특이적 분자마커를 제공한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 콩의 품종별 DNA 추출
공시재료는 우리나라 콩 품종 및 유전자원 48개를 사용하였으며, 구체적으로는 남해, 황금, 보광, 검정1호, 광두, 동북태, 진품2호, 함안, 부광, 백운, 은하, 방사, 한남, 강림, 푸른, 신팔달2호, 큰올, 동산69호, 동산127호, 만리, 신농흑, 광안, 다원, 개척1호, 소콩, 다올, 새올, 소백, 청자, 화엄풋, 검정4호, 검정올, 대원, 대풍, 소록, 태광, 대황, 삼남, 청두, 청서리태, 흑청, 갈미, 검정3호, 장미, 장원콩, 진품, 풍산, 흑서리태이고, 이들의 종자형질 특성인 종피색, 입형(종자의 크기) 등은 도 1 및 도 2에 정리하였다. 공시재료 중 종피색이 황색이 아닌 콩 품종 및 유전자원계통은 검정색 종피를 갖는 것이 검정1호 등 9개, 그리고 녹색, 갈색 등 기타 종피색을 갖는 것이 6개 포함되어 있다(도 1). 또한, 종자의 크기에 의한 콩 품종 및 유전자원계통의 분류는 도 2에 제시 되었다.
DNA를 추출하기 위하여 콩을 멸균조건에서 7일간 발아 시킨 후 시료를 채취하였다. 종자 멸균처리를 위해 각 종자는 95% 알코올에 1분 간 잘 흔들어 준 후 멸균수를 이용해 3번 헹구고, 다시 50% 하이포아염소산나트륨에 5분 간 잘 흔들어 준 후 멸균수를 이용해 3번 헹구었다. 이렇게 멸균처리 된 종자는 클린벤치에서 1% Bacto agar 배지가 들어있는 페트리 접시(petri dish)에 넣고 밀봉한 뒤 빛이 차단된 생육상(growth chamber)에서 30℃ 조건으로 발아시켰다.
발아시킨 콩 종자의 DNA 추출은 GENEALL사(한국)의 Plant SV mini DNA 추출 키트(kit)를 이용하였다. 발아시킨 콩 종자를 액화질소와 함께 갈아 준 후 100 mg을 취하여 마이크로 튜브(micro tube)에 넣고 여기에 키트에 있는 400 ㎕ PL buffer와 4 ㎕ RNase를 넣고 교반(vortexing)한다. 그 후 65℃로 맞춘 heating block에서 15분 간 배양(incubating)한 후 140 ㎕ PD buffer를 넣고 얼음에 5분 간 둔다. 다음으로 상기 혼합물을 13,000× g로 5분 간 원심분리(centrifuge)한 후 분리된 상징액을 Easy sep filtert column에 넣고 다시 13,000× g로 2분 간 원심분리(centrifuge)하여 컬럼(column)에 걸러져 나온 액체를 새로운 튜브에 옮겨 담는다. 걸러진 액체의 1.5배에 해당하는 BD buffer를 넣고 교반(vortexing)한 후 SV column에 옮겨 13,000× g에서 30초 간 원심분리(centrifuge)한다. 밑에 나오는 액체는 버리고 SV column에 700 ㎕의 CW buffer를 넣고 13,000× g에서 30초 간 원심분리(centrifuge)한 후, 다시 300 ㎕의 CW buffer를 넣고 13,000× g에서 2분 간 원심분리(centrifuge)한다. 그 후 SV Column의 필터 부분만 빼서 새로운 튜브에 넣고 50 ㎕ AE buffer를 넣어 실온에서 5분 간 반응시킨 후 13,000× g에서 1분 간 원심분리(centrifuge)하는 과정을 두 번 반복하여 콩 게놈 DNA(genomic DNA)를 추출하였다.
실시예 2. 콩( Glycine max )의 MYB 전사조절유전자와 유사한 염기서열을 갖는 Medicago truncatula 의 유사 유전자 발굴
애기장대(Arabidopsis thaliana)의 MYB 전사조절단백질(transcription factor) 유전자들의 암호화 부위(coding region)에서 공통적으로 발견된다고 알려진 R2, R3 반복서열(repetitive sequence)(서열번호 41, cttcg atgga ccaat tatct aagac cggac atcaa gagag gaaga ttctc gttcg aggaa gaaga aacta tcat tcagc tacac agtgt tatgg gaaac aa: Marin C and Paz-Ares J. 1998 MYB transcription factors in plant, Trends Genet 13(2):67-73)을 쿼리(query)로 하여 BLAST 탐색함으로써 이와 유사한 서열을 갖는 콩(Glycine max)의 염기서열을 GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 발굴하고, 콩의 MYB 유사 유전자로 사용하였다(서열번호 1 내지 8).
상기 염기서열을 쿼리로 하여 Medicago truncatula 서열 데이터베이스(sequencing database, GenBankk, www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 BLAST 하여 콩(Glycine max)의 MYB 전사조절유전자와 e-20 이상 수준의 유사성을 갖는 Medicago truncatula의 염기서열은 서열번호 9 내지 16(도 3 내지 도 10)으로 기재된다. 서열번호 9 내지 16(도3 내지 도10)으로 기재되는 염기서열은 각각 Medicago truncatula 서열 데이터베이스의 BAC sequencing library의 AC137831, AC153128, AC124961, AC166313, AC140544, AC140524, AC122724, AC148762에서 발굴된 것이다.
실시예 3. 콩의 MYB 유전자와 유사한 Medicago truncatula 유전자로부터 프로모터 염기서열의 발굴
상기 실시예 2에서 발굴한 콩의 MYB 전사조절유전자와 고도의 유의성을 갖는 Medicago truncatula의 염기서열 서열번호 9 내지 16(도 3 내지 도 10)을 이용하여, 각각 일치하는 염기가 시작되는 5' 말단으로부터 상부(5' 방향) 약 2 Kb 가량의 염기서열을 동일한 Medicago truncatula 게놈 서열 데이터베이스에서 추출하였으며, 염기서열 추출을 위한 프로그램은 C 언어로 프로그래밍 한, 프로그램 get_seq2를 자체 개발하여 사용하였다.
서열번호 17 내지 24(도11 내지 18)로 기재된 염기서열은 이러한 방법으로 발굴한 각각의 Medicago truncatula의 MYB 유사 유전자의 프로모터 부위를 포함하는 염기서열이다. 예를 들어 도 3 내지 10의 염기서열 중 5' 말단의 밑줄 친 부분은 각각의 프로모터 부위 염기서열인 도 11 내지 18의 3' 말단의 밑줄 친 염기서열과 일치하는 부분을 표시한 것이다.
실시예 4. 콩의 품종판별을 위한 분자마커의 개발
4-1) Medicago truncatula 의 유사 MYB 유전자 프로모터 부위를 증폭할 수 있는 프라이머 제작
두과작물(荳科作物)의 모델 식물체인 Medicago truncatula의 게놈 DNA 서열 데이터베이스(genomic DNA sequencing database)의 염기서열을 이용하여 프라이머를 만들고, 콩의 게놈 DNA를 주형으로 하여 콩 품종 간 다형성을 발굴하는 이유는 다음과 같다. 현재, NCBI GenBank 와 Phytozome(www.phytozome.net)에 제시된 콩의 게놈 DNA 서열은 미국 에너지부(US DOE)의 Joint Genome Institute에서 수행되었던 게놈 프로젝트(genome sequencing project)의 결과로서 미국 콩 품종인 Williams82(PI518671)의 게놈 DNA 염기서열이다. 따라서 이 문헌의 게놈 DNA 서열 데이터베이스의 염기서열은 하나의 특정 콩 품종의 염기서열로서, 이를 기반으로 프라이머를 발굴하고 다른 콩 품종들과 비교하여 다양한 양적, 질적 형질과 관련된 유전체 수준에서의 다형성을 발굴하는데 활용하기에는 한계가 존재한다.
만약 Williams82의 게놈 DNA 서열 데이터베이스로부터 본 실험에서 수행한 것과 같이 특정 유전자의 염기서열에 근거하여 프로모터 염기서열을 발굴하고 그 프로모터 부위를 증폭할 수 있는 프라이머를 작성하여 증폭된 패턴을 비교함으로써 다형성을 발굴하고자 한다면 Williams82라는 특정 콩 품종을 표준으로 여러 다양한 콩 품종을 비교하여야 한다. 이러한 방법으로는 콩 품종 간의 특정형질(표현형)과 유전체 수준에서의 다형성(유전자형)의 비교에 많은 제약과 한계를 가지게 된다.
따라서 본 발명에서는 동일한 글리신(Glycine)속이며 콩(Glycine max)과는 유전적으로 매우 유사하다고 알려진 Medicago truncatula로부터 유사 유전자의 염기서열을 발굴하고, 그것에 근거한 프로모터 염기서열을 추출하고 프라이머를 작성한 후, 비교 유전체학의 기법을 통해 Medicago truncatula의 염기서열을 기준으로 콩 품종 간 다양성을 특정유전자의 프로모터부위의 다형성으로 비교하고자 하였다.
상기 이유로 애기장대(Arabidopsis)의 R2R3 염기서열을 이용하여 발굴한 콩의 MYB 전사조절유전자와 고도의 유사성을 갖는 염기서열을 Medicago truncatula의 게놈 DNA 데이터베이스에서 발굴하고, 이들 유전자들의 프로모터 부위를 증폭할 수 있는 프라이머를 각각 작성한 후, 이를 이용하여 여러 콩 품종의 게놈 DNA를 주형으로 하였을 때 증폭되는 밴드 패턴에서 관찰되는 다형성을 NT SYS 분석하여 콩 품종 간 근연관계를 조사하였다.
상기 실시예 3에 의하여 Medicago truncatula의 게놈 서열 데이터베이스에서 찾아낸 가상의 프로모터 염기서열 서열번호 17 내지 24(도11 내지 18)의 특정 부위를 증폭할 수 있는 PCR 프라이머를 제작하였으며, 서열번호 25 내지 40으로 나타내었다. 서열번호 17(도 11)의 특정부위를 증폭하기 위해 제작된 프라이머 쌍은 서열번호 25와 26이며, 이하 서열번호 27과 28은 서열번호 18(도 12), 서열번호 29와 30은 서열번호 19(도 13), 서열번호 31과 32는 서열번호 20(도 14), 서열번호 33과 34는 서열번호 21(도 15), 서열번호 35와 36은 서열번호 22(도 16), 서열번호 37과 38은 서열번호 23(도 17), 서열번호 39와 40은 서열번호 24(도 18)의 특정부위를 증폭하기 위해 제작된 프라이머 쌍이다.
4-2) PCR 및 다형성( polymorphism or polymorphic pattern )의 발굴
PCR(polymerase chain reaction)은 Bioneer(Seoul, Korea)의 PCR premix를 이용하였다. 한 시료 당 반응용액 20 ㎕에 premixture와 게놈 DNA(genomic DNA) 5 ng, dH2O 16㎕, forward primer 및 reverse primer 각각 10 pmole(1 ㎕)을 첨가하였고, 상기 premixture는 Taq DNA polymerase 1 U(unit), dNTP 0.25 mM, Tris-HCL(pH9.0) 10 mM, KCl 30 mM, MgCl2 1.5 mM, 안정제(Stabilizer) 및 염료(tracking dye)로 구성되었다.
DNA의 증폭은 Veriti 96-well thermal cycler (Applied Biosystesm, USA)를 사용하였다. PCR 조건은 최초 94℃에서 5분 동안 변성(denaturing)한 후, 94℃에서 30초 동안 변성(denaturing), 각 프라이머의 어닐링(annealing) 온도에서 30초 동안 어닐링(annealing), 72℃에서 1분 동안 증폭(amplifying) 과정을 35회(cycle) 거친 후, 마지막으로 72℃에서 5분 동안 DNA 연장(DNA extension)을 수행하였다. PCR을 통해 증폭된 산물은 0.5× TBE buffer(45 mM tris-borate, 1 mM EDTA)와 브롬화 에티듐(ethidium bromide)이 포함된 1.0% 아가로스 겔(agarose gel)을 사용하여 70 V에서 2시간 동안 전기영동 하였다. 아가로스 겔은 UV 광선 하에서 사진 촬영하여 밴드의 분석에 사용하였다. 상기 전기영동 실험 결과는 도 19 내지 26에 나타내었다.
4-3) 서로 다른 콩 계통 간 유전체수준의 다형성 발굴
상기 실시예 1에서 찾아낸 R2R3 염기서열을 가진 콩의 MYB 유전자와 높은 유사성을 갖는 Medicago truncatula의 염기서열(도3 내지 10)을 근거로 하여, 이 염기서열의 5' 말단으로부터 상위(upstream) 방향으로 약 2 Kb 부위의 일정부분을 증폭할 수 있는 프라이머 쌍(서열번호 25 내지 40)을 제작하고, 이를 이용하여 콩의 품종별 게놈 DNA를 PCR로 증폭한 후 아가로스 겔(agarose gel) 상에서 전기영동에 의해 분리하여 여러 콩 품종 간에 나타나는 밴드의 크기와 증폭여부에 따른 다형성을 살펴보았다. 증폭된 유전자들의 프로모터에서 품종 간 다형성이 관찰되었으며, 실험 결과는 도 19 내지 26에 나타내었다. 또한 NT SYS 프로그램을 이용하여 품종 간의 유전적 근연관계를 분석한 계통수(phylogenetic tree)를 도 27에 나타내었다.
4-4) 콩 계통간 유전체수준의 다형성에 의한 콩 품종판별
본 발명에서는 유사 MYB 유전자들의 전사 및 발현에 관여하는 프로모터 부위 염기서열의 다형성을 이용하여, 여러 콩 품종이 갖는 유전체 수준에서의 고유한 특이성을 발굴함으로써 이를 마커로 활용하고자 하였다. MYB 전사조절유전자의 암호화 부위(coding region)는 크게 5' 말단 방향(N-terminal)에 위치한 DNA 결합(binding) 부위와 3' 말단 방향(C-terminal)에 위치한 다양한 기능을 갖는 부위로 나뉜다. 이 중 5' 방향 DNA 결합 부위의 염기서열은 MYB 유전자 간에 매우 유사하며, 이 부위에 위치한 3개의 반복되는 염기서열 R1, R2, R3(repeated sequence)의 존재여부에 의해 MYB 유전자 계열(gene family)에 속하는 많은 유전자들이 분류되고 있다.
본 실험에 사용된 콩의 유사 MYB 유전자들은 식물체에 많이 존재한다고 알려진 R2R3 MYB 유전자들이다. 이들 MYB 전사조절유전자에 의해 만들어지는 단백질들의 구체적인 기능에 관해서는 최근까지 소수의 기능만 보고되었다. 그러나 이들 중 본 실험에 사용된 8개의 콩 유사 MYB 전사조절유전자와 고도의 유사성을 갖는 Medicago truncatula의 유사 MYB 전사조절유전자의 프로모터 부위를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍에 의해 48개의 콩 품종 및 유전자원계통의 근연관계가 계통수(phylogenetic tree) 상에서 독립적으로 분리되는 것이 관찰되었다(도 27). 이는 상기 8개의 유전자들의 프로모터 부위를 증폭 시키는 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 PCR 밴드 패턴을 통계분석하면 48개의 우리나라 콩 품종들이 갖는 유전체 수준에서의 특이성을 판별 할 수 있음을 증명하는 결과라 할 수 있다.
이러한 결과는 위의 프로모터 부위의 다형성이 발견된 유전자들이 구체적으로 어떠한 기능을 갖는지에 대해 설명하는 것은 불가능하다 하더라도 이들 유전자들의 프로모터에서 발견되는 다형성은 각각의 콩 품종 및 유전자원들이 갖는 유전체 수준에서의 특이성은 증명해 낼 수 있다는 것을 의미한다.
이상으로 본 발명 내용의 특정부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 것은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (15)

  1. (1) 콩의 품종별 게놈 DNA(genomic DNA)를 추출하는 단계;
    (2) 콩(Gycine max)의 DNA 염기서열 데이터베이스로부터 서열번호 41로 기재되는 애기장대(Arabidopsis)의 MYB R2R3 반복서열과 유사한 염기서열인 서열번호 1 내지 8로 기재되는 염기서열 중에서 선택되는 1 이상의 염기서열을 갖는 콩의 MYB 유전자를 발굴하는 단계;
    (3) Medicago truncatula의 DNA 염기서열 데이터베이스로부터 상기 (2) 단계에서 발굴한 콩의 MYB 유전자와 유사한 염기서열을 갖는 유전자를 찾아내는 단계;
    (4) 상기 Medicago truncatula의 DNA 염기서열 데이터베이스로부터 상기 (3) 단계에서 찾아낸 유전자의 프로모터 부위를 발굴하는 단계;
    (5) 상기 프로모터의 특정 부위를 증폭할 수 있는 PCR 프라이머(primer)를 제작하는 단계;
    (6) 상기 (1) 단계의 게놈 DNA(genomic DNA)를 주형으로 하고, (5) 단계의 프라이머를 이용하여 특정 유전자의 프로모터 부위를 증폭하는 단계; 및
    (7) 상기 증폭된 특정 유전자의 프로모터 부위에서 다형성을 관찰, 분석하여 계통 간 분자마커로 사용될 수 있는 패턴을 확인하는 단계;
    를 포함하되, 상기 (3) 단계에서 콩의 MYB 유전자와 유사한 염기서열을 갖는 유전자는 서열번호 9 내지 16으로 기재된 염기서열 중에서 선택된 1 이상인 것을 특징으로 하는 분자마커 개발 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 (4) 단계는 (3) 단계에서 찾아낸 유전자 염기서열의 5' 방향 상위 1.5 ~ 3 Kb 부위에서 프로모터를 발굴하는 것을 특징으로 하는 분자마커 개발 방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 (5) 단계는 특정 유전자의 프로모터가 포함되는 개시코돈으로부터 5' 방향으로 10 Kb 내부에서 복수의 프라이머를 제작하는 것을 특징으로 하는 분자마커 개발 방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 (4) 단계에서 발굴한 프로모터 부위는서열번호 17 내지 24로 기재되는 염기서열 중에서 선택된 1 이상인 것을 특징으로 하는 분자마커 개발 방법.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 서열번호 17로 기재되는 프로모터 부위를 증폭할 수 있는 프라이머는 서열번호 25 및 26으로 기재되는 프라이머 쌍인 것을 특징으로 하는 분자마커 개발방법.
  8. 제 6항에 있어서,
    상기 서열번호 18로 기재되는 프로모터 부위를 증폭할 수 있는 프라이머는 서열번호 27 및 28로 기재되는 프라이머 쌍인 것을 특징으로 하는 분자마커 개발방법.
  9. 제 6항에 있어서,
    상기 서열번호 19로 기재되는 프로모터 부위를 증폭할 수 있는 프라이머는 서열번호 29 및 30으로 기재되는 프라이머 쌍인 것을 특징으로 하는 분자마커 개발방법.
  10. 제 6항에 있어서,
    상기 서열번호 20으로 기재되는 프로모터 부위를 증폭할 수 있는 프라이머는 서열번호 31 및 32로 기재되는 프라이머 쌍인 것을 특징으로 하는 분자마커 개발방법.
  11. 제 6항에 있어서,
    상기 서열번호 21로 기재되는 프로모터 부위를 증폭할 수 있는 프라이머는 서열번호 33 및 34로 기재되는 프라이머 쌍인 것을 특징으로 하는 분자마커 개발방법.
  12. 제 6항에 있어서,
    상기 서열번호 22로 기재되는 프로모터 부위를 증폭할 수 있는 프라이머는 서열번호 35 및 36으로 기재되는 프라이머 쌍인 것을 특징으로 하는 분자마커 개발방법.
  13. 제 6항에 있어서,
    상기 서열번호 23으로 기재되는 프로모터 부위를 증폭할 수 있는 프라이머는 서열번호 37 및 38로 기재되는 프라이머 쌍인 것을 특징으로 하는 분자마커 개발방법.
  14. 제 6항에 있어서,
    상기 서열번호 24로 기재되는 프로모터 부위를 증폭할 수 있는 프라이머는 서열번호 39 및 40으로 기재되는 프라이머 쌍인 것을 특징으로 하는 분자마커 개발방법.
  15. 삭제
KR1020100120865A 2010-11-30 2010-11-30 콩 품종판별을 위한 유전자 특이적 분자마커의 개발 방법 KR101314168B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020100120865A KR101314168B1 (ko) 2010-11-30 2010-11-30 콩 품종판별을 위한 유전자 특이적 분자마커의 개발 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020100120865A KR101314168B1 (ko) 2010-11-30 2010-11-30 콩 품종판별을 위한 유전자 특이적 분자마커의 개발 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20120059212A KR20120059212A (ko) 2012-06-08
KR101314168B1 true KR101314168B1 (ko) 2013-10-04

Family

ID=46610536

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020100120865A KR101314168B1 (ko) 2010-11-30 2010-11-30 콩 품종판별을 위한 유전자 특이적 분자마커의 개발 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101314168B1 (ko)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101493978B1 (ko) * 2013-10-08 2015-02-17 대한민국 콩 품종인식을 위한 Indel 마커
KR102298785B1 (ko) * 2019-11-14 2021-09-07 대한민국 나물용 콩 품종의 제색 개량을 위한 중간모본 및 이의 육종방법
KR102298786B1 (ko) * 2019-11-14 2021-09-07 대한민국 장류용 콩 품종의 제색 개량을 위한 중간모본 및 이의 육종방법

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20120056520A (ko) * 2010-11-25 2012-06-04 건국대학교 산학협력단 콩 점무늬병 저항성 유전자 특이적 분자마커의 개발 방법

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20120056520A (ko) * 2010-11-25 2012-06-04 건국대학교 산학협력단 콩 점무늬병 저항성 유전자 특이적 분자마커의 개발 방법

Also Published As

Publication number Publication date
KR20120059212A (ko) 2012-06-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101642771B1 (ko) 나리 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법
WO2007097574A1 (en) Molecular marker associated with tmv resistance and use thereof
CN110628945B (zh) 胡椒叶片中胡椒黄斑驳病毒和黄瓜花叶病毒的多重pcr检测方法及专用试剂盒
KR101314168B1 (ko) 콩 품종판별을 위한 유전자 특이적 분자마커의 개발 방법
KR100842432B1 (ko) 귤에서 유래된 ｓｓｒ 프라이머 및 이의 용도
Azhaguvel et al. Methodological advancement in molecular markers to delimit the gene (s) for crop improvement
Niu et al. Mapping resistance gene analogs (RGAs) in cultivated tetraploid cotton using RGA-AFLP analysis
CN1886521B (zh) Cmv抗性相关分子标志及其用途
KR100781206B1 (ko) 참깨 속 식물에서 분리한 ｓｓｒ 프라이머 및 이의 용도
CN112592995B (zh) 一种检测转基因植物中目的基因表达的通用引物及检测方法
CN113736866B (zh) 用于检测番茄黄化曲叶病毒病抗性的snp位点组合及其应用
Reflinur et al. The potential use of SSR markers to support the morphological identification of Indonesian mungbean varieties
CN114214448A (zh) 用于鉴定水稻抗褐飞虱基因Bph30的SNP标记及其应用
KR102096633B1 (ko) 검역 식물바이러스인 바나나 포엽 모자이크 바이러스를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도
KR100769367B1 (ko) 기장에서 유래한 ｓｓｒ 프라이머 및 이의 용도
KR102279798B1 (ko) 쌀 황반 바이러스를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도
Kim et al. Viral Metatranscriptomic Analysis to Reveal the Diversity of Viruses Infecting Satsuma Mandarin (Citrus unshiu) in Korea
KR102279787B1 (ko) ChiVMV를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도
KR102279783B1 (ko) 미국 플럼 라인 패턴 바이러스를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도
KR102667135B1 (ko) 신종 콩 제미니 바이러스의 진단을 위한 프라이머 세트 및 진단 방법
KR100974264B1 (ko) 벼 품종 식별용 프라이머 조합 및 이를 이용한 식별 방법
CN112094940B (zh) 与黄瓜长下胚轴基因lh1连锁的Indel标记及其引物、试剂盒与应用
KR101480155B1 (ko) 베치에서 유래한 ｓｓｒ 프라이머 및 이의 용도
KR102279791B1 (ko) Tev를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도
JP7174375B2 (ja) 茎枯病抵抗性クサスギカズラ属植物の作出方法、選抜マーカー及び選抜方法

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160922

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170925

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190213

Year of fee payment: 6