KR101304772B1

KR101304772B1 - ＮｅｃｒｏＸ―５를 유효성분으로 포함하는 미토콘드리아 기능 조절용 조성물

Info

Publication number: KR101304772B1
Application number: KR1020110033260A
Authority: KR
Inventors: 김형규; 한진; 김나리; 부티투
Original assignee: 인제대학교 산학협력단
Priority date: 2011-04-11
Filing date: 2011-04-11
Publication date: 2013-09-05
Also published as: KR20120116520A

Abstract

본 발명은 NecroX-5를 유효성분으로 포함하는 미토콘드리아 기능 조절용 조성물로서, 상기 NecroX-5는 미토콘드리아 칼슘통로를 차단함으로써 미토콘드리아의 기능을 조절하므로 부정맥, 심실세동, 심부전 및 허혈성 심장손상 등을 치료하는 효과가 있다.

Description

ＮｅｃｒｏＸ―５를 유효성분으로 포함하는 미토콘드리아 기능 조절용 조성물{Composition for controlling the function of mitochondria comprising NecroX-5}

본 발명은 NecroX-5를 유효성분으로 포함하는 미토콘드리아 기능 조절용 조성물에 관한 발명으로서, 미토콘드리아 칼슘통로를 차단함으로써 미토콘드리아의 기능을 조절하는 NecroX-5를 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것이다.

장기적인 허혈에 따른 재관류는 나중에 세포내 Na⁺ 농도의 증가와 세포질내로 Ca²⁺의 유입으로 이온의 흐름을 바꿀 수 있고 pH를 재조정한다. 높은 세포내 Ca²⁺의 농도는 근세포 수축을 증가시킬 뿐만 아니라 세포사멸(apoptosis)를 촉진한다. 재관류시, 특히 재관류의 처음 몇분에, 수많은 반응성 산소종(ROS, reactive oxygen spices, 활성산소) 생산은 미토콘드리아 단백질의 변성을 유도하며, 이를 통해 미토콘드리아 기능의 장애와 심근세포 사멸을 야기한다. 결국, 허혈재관류 (ischemia-reperfusion, IR)시, 심장은 부정맥과 비가역적인 허혈후 수축 기능장애를 갖는다.

미토콘드리아는 IR(Ischemia-reperfusion) 손상의 중심 타겟이라고 여겨진다. 미토콘드리아 기능의 손실시 미토콘드리아에서 생성되는 ATP 결핍이 야기되며, 이를 통해 심장은 수축이 필요한 충분한 에너지를 획득하지 못하게된다. IR은 심장 미토콘드리아의 구조와 생화학적인 기능변화를 유도한다. IR동안, 미토콘드리아의 칼슘수송체(Ca²⁺-uniporter)를 통한 미토콘드리아의 Ca²⁺ 과부하는 mPTP(mitochondrial permeability transition pore)를 개방시켜 미토콘드리아 기능손상의 원인이 된다. 미토콘드리아의 기능 손상은 호흡사슬 복합체의 활성저하, NADH 탈수소효소 활성저하, 막전위 소실, ATP 합성의 손실 및 ATP 가수분해의 증가, 이온의 항상성 장애, ROS 형성 등으로 특징 되어진다. IR 시에 증가된 미토콘드리아의 ROS 생산은 전자 전달계에 대규모의 기능장애를 초래한다. 이것은 다시 더 많은 ROS의 생성을 유도하는 악순환을 야기한다. 미토콘드리아의 산화적 스트레스는 TCA 회로의 효소들을 억제, 미토콘드리아 단백질을 변성, mPTP의 개방을 유도하고, 미토콘드리아의 기능손상을 유도하며, 세포사멸 촉진 단백질의 미토콘드리아 외부 유출을 증가시켜, 결국 세포사멸 또는 세포괴사의 형태로 세포의 죽음을 유도한다.

종합하면, 이런 현상들은 미토콘드리아가 IR에서 세포의 죽음의 모든 형태에 대한 중요한 매개자이면서 조절자이며, 미토콘드리아가 허혈후 재관류에 따른 심장의 기능손상을 방지하기 위한 치료요법에 대한 중대한 타켓이라는 것을 설명해 준다.

허혈재관류 손상에서 심장을 보호하는 기전으로 허혈후 처치IPost(ischemic postconditioning)가 효과를 나타낸다고 보고되고 있다. 허혈 재관류시의 생리적 혹은 약물에 의한 처치를 수행할 경우 심장에서 초기 재관류시 pH 변화에 의한 mPTP 개방을 억제하며, 미토콘드리아의 Ca²⁺ 과부하 및 미토콘드리아의 ROS 증가 등을 제한할수 있으며. ATP-의존성 미토콘드리아의 칼륨(mitoKatp)의 활성은 IPost에서 재관류 손상을 제한하는 보호적인 역할을 한다고 믿어진다.

최근 NecroX 화합물이 미토콘드리아의 ROS와 ONOO^- 의 제거재로 새롭게 보고되었다. IR 손상된 비글개(Beagle dogs)에서 NecroX-7의 처치는 ALT(alanine transferase), AST(aspartate transferase)와 LDH(lactate dehydrogenase)를 감소시키므로서 대조군에 비해 간장의 괴사를 감소시켰다.

한편, 본 발명자는 저산소-재관류 모델의 쥐의 심장 미토콘드리아에서 NecroX-5의 보호 효과와 기전을 검토하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 미토콘드리아 기능을 조절하고 미토콘드리아 칼슘채널 차단제로서 작용하는 NecroX-5의 새로운 용도를 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 NecroX-5를 유효성분으로 포함하는 미토콘드리아 기능 조절용 조성물을 제공한다.

상기 NecroX-5는 [5-(1,1-디옥소-티오모르폴린-4-일메틸)-2-페닐-1H-인돌-7-일]-(테트라하이드로-피란-4-일메틸)-아민 {[5-(1,1-Dioxo-thiomorpholin-4-ylmethyl)-2-phenyl-1H-indol-7-yl]-(tetrahydro-pyran-4-ylmethyl)-amine}을 의미하며, 화학식 1로 표시된다.

또한, 본 발명은 상기 NecroX-5가 심장에서 미토콘드리아 칼슘통로를 차단하는 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 미토콘드리아 기능 조절용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물이 부정맥, 심실세동, 심부전 및 허혈성 심장손상으로 이루어진 군중에서 선택되는 하나를 치료하기 위한 것을 특징으로 하는 미토콘드리아 기능 조절용 조성물을 제공한다.

본 발명자는 NecroX-5의 사후 처치가 허혈재관류 손상에 의한 경색 크기를 감소시킨다는 것을 발견했다. NecroX-5는 미토콘드리아 막전위의 충격을 줄이고, 미토콘드리아의 산소 소모량을 향상시키고, 미토콘드리아 칼슘 과부하를 희석시키고, 미토콘드리아의 산화적 스트레스를 감소시키므로서 재관류 기능손상에 대응하여 미토콘드리아를 보호한다. 더욱이, 본 발명에 의하면 NecroX-5는 재관류에서 심장 근육세포의 팽창을 억제하는 효과를 나타낸다. 흥미롭게도, NecroX-5는 와베인(ouabain)에 의해 유도된 미토콘드리아의 칼슘 과부하를 감소시키는 강력한 효과를 갖는다. 이는 NecroX-5가 미토콘드리아의 칼슘 수송체를 억제하는 역할을 한다는 것을 암시한다.

본 발명에 따르면, NecroX-5를 유효성분으로 포함하는 조성물은 미토콘드리아 기능을 조절하며, 심장 미토콘드리아의 칼슘통로를 차단하므로써 부정맥, 심실세동, 심부전 및 허혈성 심장손상 등을 치료하는 효과가 있다.

도1은 심장의 허혈성 손상 처치시 NecroX-5의 심장 보호효과를 나타낸 것이다.
도2는 심장의 저산소 손상시 NecroX-5의 미토콘드리아 막전압을 유지하는 효과를 나타낸 것이다.
도3은 또다른 심장의 저산소 손상후 NecroX-5의 미토콘드리아 막전압을 유지하는 효과를 나타낸 것이다.
도4는 심장의 허혈손상후 NecroX-5의 미토콘드리아 산소 소모량을 향상시키는 효과를 나타낸 것이다.
도5는 심장의 허혈손상후 NecroX-5의 미토콘드리아 칼슘의 과적(overload)을 억제하는 효과를 나타낸 것이다.
도6은 심장의 허혈손상후 와베인(ouabain)에 의해 유도된 미토콘드리아 칼슘의 과적(overload)을 억제하는 NecroX-5의 효과를 나타낸 것이다.
도7은 와베인 처리의 전후에 NecroX-5를 처치한 결과 NecroX-5는 전처리시 미토콘드리아 칼슘 증가를 억제하지 않고, 후처리시에만 효과를 나타낸다는 결과이다.
도8은 심장의 허혈손상시 NecroX-5의 심장세포 팽창을 억제하는 효과를 나타낸 것이다.
도9은 허혈손상시 미토콘드리아 산화적 스트레스를 감소시키는 NecroX-5의 효과를 나타낸 것이다.

이하, 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

<제조예 1> 심장, 심장 근세포, 미토콘드리아 준비

NecroX-5의 효과 실험을 위해 공통적으로 다음과 같은 프로토콜로 준비한 심장, 심장 근세포, 미토콘드리아 등을 사용하여 수행하였다.

심장의 분리는 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 8주령 수컷 SD 랫트(25-31g)를 페노바르비탈 1mg/kg 와 헤파린 300 IU/mL/kg 로 마취시켰다. 흉곽을 노출시키고, 대동맥에 글래스 캐뉼라(glass cannula)를 삽입했다. 심장은 빠르게 개흉술(thoracotomy)로 잘라내어 정상 타이로드 용액(normal Tyrode's solution)으로 비순환 장치(Langendorff system)에서 관류시켰고, 혈액을 모두 제거하기 위해 10분동안 37℃에서 95% 산소와 5% 이산화탄소로 평형을 유지했다. 각 심장들은 경색크기를 조사하였고 근세포와 미토콘드리아를 분리하였다.

심장은 정상 타이로드 용액과 허혈성 용액(NaOH로 조절하여 pH 6.0, 135-140mmHg에서 100% N₂로 평형을 유지함)에 연속으로 관류시킨후, 정상 타이로드 용액 또는, 정상 타이로드 용액으로 희석한 10μM의 NecroX-5 또는 5μM의 DIDS로 재관류 시켰다.

심장 근세포의 분리는 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 상기 방법으로 분리한 심장을 정상 타이로드 용액에서 20분동안 관류하여 안정시킨후, 8분동안 Ca²⁺을 제거한 타이로드 용액으로 관류하고, 그 후 10분동안 Ca²⁺을 제거한 타이로드 용액에 0.01% 콜라겐분해효소(collagenase)를 넣은 용액으로 관류시켰다. 그 다음, 심장을 15분동안 산소가 공급된 Kraft-Bruhe 용액(pH 7.4)으로 씻었다. 심방은 폐기하였고, 좌심실 벽과 격막은 작은 조각으로 자른 후 심장 근세포를 분리하기 위해 Kraft-Bruhe 용액에서 교반하였다. 그 후, 심장 근세포는 미토콘드리아 과산화물, 미토콘드리아의 Ca²⁺, ΔΨm 및 세포부피를 측정하는데 사용하였다.

미토콘드리아의 분리는 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 심장 조직을 중간크기로 맞춰진(medium fitting) 글라스-테프론 포터-엘베헴 균질기(glass-teflon Potter-Elvehjem homogenizer)를 사용하여, pH7.4 에서, 50 m㏖/L의 인산칼륨, 1 m㏖/L EGTA, 5 m㏖/L MOPS 및 0.1% BSA에 단백질분해효소억제제 혼합제를 넣은 액을 포함하는 미토콘드리아 분리 완충액에서, 수동으로 균질화하였다. 그 결과 생긴 균질 현탁액을 4℃에서 5분동안 1000g 로 원심분리하였다. 그 후, 상층액을 10분동안 10000g로 다시 원심분리하였다. 미토콘드리아 펠렛(pellet)을 모아서, 미토콘드리아 분리 완충액으로 세배 부피로 희석했다.

<실시예 1> 심장의 허혈성 손상 처치시 NecroX-5의 심장 보호효과

분리한 심장을 랑겐도르프 시스템(Langendorff system)으로 관류한 후, 심장을 20분동안 정상 타이로드 용액 50㎖에 TTC 용액 200㎕를 넣어서 계속 관류시켰다. 그리고 난 후, 심장을 방실의 홈과 평행되게 6조각으로 잘랐다. 살아있는 심근에서 TTC는 젖산 탈수소효소 동위효소에 의해 조직을 어두운 빨간색으로 염색하는 빨간색 포르마잔 색소로 전환되었다. 경색부분은 TTC 염색이 되지 않아 백색으로 남았다. 도1은 조각1(심장의 맨아래)로부터 조각6(심장의 꼭대기)까지 심장조각의 단면도와, 위험한 상태인 부분의 퍼센트로서 경색크기를 나타내는 그래프이다.

도1은 심장의 허혈성 손상처치시의 NecroX-5 의 심장 보호효과 실험의 결과로, 위쪽 그림에서 심장 내부의 백색 부위는 심장 손상의 부분이다. NecroX-5 처치시 이 부위가 현저히(-60% 이상) 감소되어 NecroX-5 의 심장 손상 억제 효과를 보여주었다.

도1의 그래프는 허혈재관류 손상과 허혈재관류시 NecroX-5 처치한 각 심장으로부터 6개 조각들 모두에 대한 경색 크기의 퍼센트를 나타내었다. NecroX-5의 후처치는 허혈재관류 그룹과 비교하여 현저히 경색 크기를 감소시켜, NecroX-5 후처치는 허혈재관류에 의해 유도된 경색 크기를 현저히 감소시키는 것으로 나타났다.

<실시예 2> 심장의 저산소 손상시 NecroX-5의 미토콘드리아 막전압을 유지하는 효과

근세포를 상온에서 30분동안 0.1 μ㏖/L TMRE(excitation/emission : 564/580 ㎚)으로 염색했다. 세척후, 세포를 관류실에 넣었다. 형광발광(fluorescence)을 400배의 확대율로 공초점 레이져 현미경(laser scanning confocal microscopy)으로 1분마다 검출하였다. 이미지를 LSM-510 META 소프트웨어(Carl Zeiss, Jena, Germany)로 분석하였다.

허혈시에 심장세포에 들어있는 미토콘드리아의 막전압이 떨어지게 되면, 결국 세포 사멸이 유도된다. 도2의 그래프에서 TMRE는 미토콘드리아의 막전압을 나타내는 형광 물질이다. 1 곡선은 저산소에 노출된 경우로, 저산소 노출후 TMRE 강도가 지속적으로 떨어졌다. 2 곡선은 저산소 이후에 NecroX-5를 처리한 경우이고, 3-1, 3-2 곡선은 저산소처리 전후에 NecroX-5를 처리한 경우인데, 이 경우에는 막전압이 잘 유지되었다. 따라서, 이 결과로 NecroX-5 의 처치가 미토콘드리아의 막전압 소실을 억제함으로써 심장 보호효과를 나타낸다는 것을 알 수 있다.

<실시예 3> 또다른 심장의 저산소 손상후 NecroX-5의 후처치시 미토콘드리아 막전압을 유지하는 효과

실시예2와 같은 방법으로 TMRE로 염색한 근세포를 이용하였다.

허혈재관류 또는 NecroX-5 후처치로 유도된 TMRE가 감소되는 정도로 ΔΨm 변화를 증명하는데, NecroX-5를 후처치한 경우에는 TMRE의 강도가 허혈재관류보다 상대적으로 덜 감소하였다.(도3 A) 심근세포 사진은 (a)저산소 노출전 (b)저산소 노출후 및 (c)재관류 동안 비처치군과 NecroX 후처치군의 그림(도3 B)

또한, 미토콘드리아의 막전위(ΔΨm)를 580㎚에서 TMRE 형광발광의 변화로서 유세포분석기(flow cytometry)에 의해 평가하였다(FL2). 그리고, 평균값을 산출했다.(CellQuest)

도3 C는 유세포 분석장치를 이용한 미토콘드리아 막전압 측정결과로서, 도3 C의 좌측은 분리된 미토콘드리아 중 막전압 형광 측정에 이용된 순수 미토콘드리아 분획을 나타내며, 가운데는 염색하지 않은 대조군, 우측의 세가지 히스토그램은 염색하지 않은 대조군 (청색), 막전압 염색된 허혈손상처치군 (녹색), 막전압 염색된 허혈손상처치 + NecroX-5 (적색)을 각각 나타내었다. 도3 D에 따르면, 미토콘드리아에 NecroX-5를 후처치한 경우에는 IR의 경우에 비해 TMRE 형광 강도가 더 높았다. 따라서, 저산소 노출이후 NecroX-5의 처치는 미토콘드리아 막전압 소실을 억제시키는 것을 확인되었다.

<실시예 4> 심장의 허혈손상후 NecroX-5의 미토콘드리아 산소 소모량을 향상시키는 효과

미토콘드리아에 의한 산소소모량은 Optical-fiber (형광감지 섬유) 산소전극(oxygen electrode)(Instech)으로 측정하였다. 3 단계 및 4 단계 산소 소모량은 n㏖ O₂/min/㎎ 미토콘드리아 단백질로서 표현되었다.

허혈손상이후 NecroX-5 처치에 의한 미토콘드리아 기능 유지 실험으로서, 미토콘드리아 기능을 평가하는 기준으로 사용하는 미토콘드리아의 산소소모량을 정상, 허혈재관류 처치(IR) 및 NecroX-5 처리 군에서 진행한 결과, 허혈 재관류에 NecroX-5 를 처리한 군에서는 미토콘드리아 산소 소모량이 잘 유지되었다. 도4는 대조군과 비교할 때 허혈재관류, NecroX-5 후처치 그룹에서 미토콘드리아의 state 3과 4 산소소모량이 잘 유지됨을 나타내었다. 따라서, NecroX-5 가 허혈재관류시에 미토콘드리아 기능을 보호하는 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 5> 심장의 허혈손상후 NecroX-5의 미토콘드리아 칼슘의 과부하(overload)를 억제하는 효과

미토콘드리아에서 미토콘드리아의 칼슘 변화를 검출하기 위해 Rhod 2am(5 μ㏖/L; excitation/emission:533/576 ㎚)을 사용하였다. Rhod 2am 은 미토콘드리아의 칼슘이온 농도를 측정하는 염색제이다. 염색(cool-warm)후 세포는 Kraft-Bruhe 용액으로 두번 세척했다. 형광발광 강도는 공초점 현미경(confocal microscope)을 사용하여 측정했다.

도5는 허혈재관류 또는 NecroX-5 후처치에 의해 Rhod 2am 강도 변화로서 미토콘드리아의 칼슘에 역학적인 변화를 나타내었다. NecroX-5를 후처치한 경우, 허혈재관류의 경우에 비해 염색강도가 약하므로, NecroX-5 후처치는 재산소화하는 동안에 미토콘드리아의 Ca²⁺ 과부하를 방지함을 알 수 있었다. 허혈손상시의 미토콘드리아 손상은 미토콘드리아 내의 칼슘이온이 과량 유입됨으로서 진행되는데, 도5의 결과는 NecroX-5에 의한 미토콘드리아 보호기전이 칼슘이온 유입억제를 통해서 나타남을 보여주는 것이다. 심장 사진은 (a)저산소화 전 (b)저산소화 후 및 (c)재관류동안에 허혈재관류과 NecroX-5 처치 그룹에서 포착하였다.

<실시예 6> 심장의 허혈손상후 와베인(ouabain)에 의해 유도된 미토콘드리아 칼슘의 과적(overload)을 억제하는 NecroX-5의 효과

미토콘드리아의 칼슘변화는 실시예5와 같은 방법으로 측정하였다.

도6은 와베인(ouabain) 또는 NecroX-5 또는 미토콘드리아 칼슘 이온통로 억제제인 루테늄 레드 (Ruthenium red, RuR) 처치에 의해 Rhod 2am 강도 변화로서 미토콘드리아의 칼슘에 역학적인 변화를 나타내었다. 미토콘드리아의 칼슘 유입억제는 세포질의 칼슘 이온통로, 미토콘드리아의 칼슘이온통로, 세포질의 근형질 세망 (sarcoplasmic reticulum) 의 칼슘 조절 등의 인자들에 의해 조절된다.

와베인(ouabain)은 세포질 칼슘 농도 증가제, RuR 은 미토콘드리아 칼슘 이온통로 (Calcium uniporter) 억제제이며, 본 실험은 미토콘드리아 칼슘이온통로를 억제하는 RuR 과의 비교실험을 통해 NecroX-5가 미토콘드리아 칼슘 이온통로 억제를 통한 칼슘이온 유입을 억제함을 증명하였다. 즉, NecroX-5 는 미토콘드리아 칼슘 과다유입을 억제하였다. 심장 사진은 (a)와베인 처치전 (b)와베인 처치동안 및 (c)와베인 또는 NecroX-5 또는 RuR 처치 그룹에서 포착하였다.

<실시예 7> 와베인 처리의 전후 NecroX-5를 처리에 따른 효과

와베인을 처치하기 전, 후 및, 전과 후 모두 NecroX-5를 처치하여 와베인에 의한 칼슘의 과부하에 대한 NecroX-5의 효과를 시험하였다. 그 결과, NecroX-5는 전처리시 미토콘드리아 칼슘 증가를 억제하지 않고, 후처리시에만 효과를 나타내었다.

도7은 NecroX-5를 와베인 전과 후처치, 또는 후에만 처치했을 때의 Rhod 2am 강도 변화로서, 두 경우의 미토콘드리아의 칼슘에 역학적인 변화를 나타내었다. 또한, 전후 처리를 진행한 붉은색 선과 후처리만 진행한 검정색의 차이가 없었다. 따라서, NecroX-5는 전처리시 Ouabain 에 의한 칼슘 증가를 억제하지 못하므로, 세포질의 나트륨/칼슘 교환 통로(cytosol Na/Ca exchanger) 에는 영향을 미치지 않음을 알 수 있다. 심장 사진은 NecroX-5를 와베인 처치 전후 및 후 처치시, (a)와베인 처치전 (b)와베인 처치동안 및 (c)와베인 처치후 그룹에서 포착하였다.

<실시예 8> 심장의 허혈손상시 NecroX-5의 심장세포 팽창을 억제하는 효과

재산소화후 근세포 부피를 유세포분석기로 분석하였다. 도8은 IR, NecroX-5 및 DIDS 처치에 따른 근세포 부피 감소이다. 평균값은 CellQuest로 계산했다. NecroX-5 처치는 허혈손상에 의한 심장세포의 팽창을 억제하였다. 허혈손상에 의한 세포 팽창과 파열은 심장 세포 손상의 주요인으로, NecroX-5 처치시는 이 세포 팽창을 억제하였고, 이 효과는 Cl^- 이온 통로의 억제(DIDS)와 유사하게 나타났다. 따라서, NecroX-5는 재산소화후에 근세포 부피를 팽창을 억제함

<실시예 9> 허혈손상시 미토콘드리아 산화적 스트레스를 감소시키는 NecroX-5의 효과(ROS 생산량의 측정)

미토콘드리아에서 미토콘드리아의 과산화물 변화를 조사하기 위해 미토콘드리아 과산화물 형광염색제인 MitoSOX Red(5 μ㏖/L; excitation/emission: 510/580 ㎚)를 사용하였다. 심근세포의 분리 및 염색후(37℃, 30분), 세포를 Kraft-Bruhe 용액으로 두번 세척했다. 형광발광 강도는 공초점 현미경(confocal microscope)을 사용하여 측정했다.

분리된 미토콘드리아에서 과산화수소와 미토콘드리아 과산화물의 생산량은 유세포분석기로 측정하였다. 분리된 미토콘드리아는 H₂DCFDA (dichlorodihydrofluorescein diacetate, 10μ㏖/L; excitation/emission : 488/535 ㎚) 와 Mitotracker Red(0.5 μ㏖/L; excitation/emission : 550/590 ㎚), 및 MtoSOX Red (5 μ㏖/L) 와 Mitotracker Green (0.5 μ㏖/L; excitation/emission:488/525 ㎚) 로 이중 염색되었다 (double-stained). 과산화수소와 초과산화물의 수준은 525 ㎚ DCF 형광발광(FL1)의 변화와 580㎚에서 MitoSOX red 형광발광(FL2)의 변화에 의해 검출되었다. 기하평균치를 계산하였다.(CellQuest)

도9의 A, B는 심장에서 증가된 미토콘드리아의 O₂ ^- 생산물을 측정한 그래프로서, 허혈재관류 (black line)와 NecroX-5(green line)에서 근세포에 미토콘드리아의 O₂ ^- 수준의 변화를 보여준다. NecroX-5 처치시 미토콘드리아 활성산소종 확인 염색제 mitosox 의 증가 속도가 감소하였다. 따라서, 미토콘드리아의 보호효과가 산화스트레스 감소에 의해서도 나타남을 알 수 있다. 심장 사진은 NecroX-5의 처치를 하거나 처치없이 (a)저산소화 전 (b)저산소화 동안 (c)저산소화 후에 포착한 것이다. 도10의 C, D는 미토콘드리아의 산소와 과산화수소 수준의 유세포분석 그래프로서, NecroX-5 후처치로 ROS 수준이 감소함을 보여주었다. 기하평균은 CellQuest로 계산했다. 결국, NecroX-5 처치에 의해 허혈손상시 미토콘드리아 산화적 스트레스가 감소하였다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 네크록스-5(NecroX-5)[5-(1,1-디옥소-티오모르폴린-4-일메틸)-2-페닐-1H-인돌-7-일]-(테트라하이드로-피란-4-일메틸)-아민 {[5-(1,1-Dioxo-thiomorpholin-4-ylmethyl)-2-phenyl-1H-indol-7-yl]-(tetrahydro-pyran-4-ylmethyl)-amine}를 유효성분으로 포함하는 부정맥, 심실세동, 심부전 및 허혈성 심장손상으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 질환 치료 또는 예방용 약학 조성물.
< 화학식 1 >
청구항 1에 있어서, 상기 네크록스-5(NecroX-5)는 미토콘드리아 칼슘통로를 차단함으로써 미토콘드리아의 기능을 조절하는 것을 특징으로 하는 부정맥, 심실세동, 심부전 및 허혈성 심장손상으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 질환 치료 또는 예방용 약학 조성물.
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