KR101300777B1 - Lung injury model mouse exposed hyperoxia, and a kit for diagnosis of lung injury model mouse exposed hyperoxia using TAZ marker - Google Patents

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Abstract

본 발명은 과산소 노출에 의한 폐손상 모델 동물, 및 TAZ 마커를 이용한 과산소 노출에 의한 폐손상 진단용 키트에 관한 것으로서, TAZ 유전자가 결핍된(TAZ-/-) 마우스는 심각한 폐섬유증 증상이 유도되었고, 이는 과산소 노출된 정상군 마우스 폐에서 유발된 폐섬유증과 유사하였으며, TAZ는 산화적 스트레스 관련 신호 경로에 작용하여 신호분자들을 억제함으로써, 폐의 항상성 조절에 기능하므로, 상기 TAZ-/- 마우스는 과산소 노출에 의한 폐섬유증 모델 마우스로서 유용하게 사용할 수 있을 뿐 아니라, 과산소 노출에 의한 폐섬유증 모델 마우스의 제조, 및 이를 이용한 치료제 후보물질의 스크리닝에 유용하게 이용할 수 있고, TAZ 유전자 또는 단백질의 발현을 확인함으로써 과산소 노출에 의한 폐섬유증 진단 및 진단용 키트에 유용하게 이용할 수 있다.The present invention relates to a lung injury model animal due to peroxygen exposure, and a kit for diagnosing lung injury by peroxygen exposure using a TAZ marker, wherein (TAZ -/- ) mice lacking TAZ genes induce severe pulmonary fibrosis symptoms. were, which as was similar to the pulmonary fibrosis induced in mice with oxygen-exposed control group lungs, TAZ is by inhibiting the signaling molecules act on the relevant signal path oxidative stress, since the function in homeostasis of the lung, the TAZ - / - Mice can be usefully used as pulmonary fibrosis model mice by exposure to peroxygen, as well as the production of pulmonary fibrosis model mice by exposure to peroxygen, and useful for screening therapeutic candidates using the TAZ gene or By confirming the expression of the protein, it can be usefully used for the diagnosis and diagnosis kit for pulmonary fibrosis due to peroxygen exposure.

Description

과산소 노출에 의한 폐손상 모델 동물, 및 ＴＡＺ 마커를 이용한 과산소 노출에 의한 폐손상 진단용 키트{Lung injury model mouse exposed hyperoxia, and a kit for diagnosis of lung injury model mouse exposed hyperoxia using TAZ marker}Lung injury model mouse exposed hyperoxia, and a kit for diagnosis of lung injury model mouse exposed hyperoxia using TAZ marker}

본 발명은 과산소 노출에 의한 폐손상 모델 동물, 및 TAZ 마커를 이용한 과산소 노출에 의한 폐손상 진단용 키트에 관한 것이다.
The present invention relates to a lung injury model animal by peroxygen exposure, and a kit for diagnosing lung injury by peroxygen exposure using a TAZ marker.

전사 조절자 1을 포함하는 WW-도메인(WW-domain containing transcription regulator 1, Wwtr1)으로 알려진, TAZ(transcriptional coactivator with PDZ-binding motif)는 14-3-3 및 PDZ 도메인 단백질의 상호작용에 의해 중간엽 줄기세포에서 전사 조절제로서의 기능을 담당한다(Kanai, F. et al., The EMBO Journal, 19(24): 6778-6791, 2000; Hong, J. et al., Science 309(5737): 1074, 2005). 특히, TAZ 단백질은 뼈세포의 생성을 증가시키는 역할을 하고, Cbfa1(core-binding factor-1)/Runx2(runt-related transcription factor-2), TTF-1(thyroid transcription factor-1), Ctgf(connective tissue growth factor), smad2/3 및 Pax3(paired box gene-3)와 같은 다양한 전사인자의 조절자로서도 기능하는 것으로 알려져 있다.Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif (TAZ), known as WW-domain containing transcription regulator 1 (Wwtr1), is mediated by the interaction of 14-3-3 and PDZ domain proteins. It functions as a transcriptional regulator in mesenchymal stem cells (Kanai, F. et al., The EMBO Journal, 19 (24) : 6778-6791, 2000; Hong, J. et al., Science 309 (5737) : 1074). , 2005). In particular, the TAZ protein increases the production of bone cells, and the core-binding factor-1 (Cbfa1) / runt-related transcription factor-2 (Runx2), thyroid transcription factor-1 (TTF-1) and Ctgf ( It is also known to function as a regulator of various transcription factors such as connective tissue growth factor (SMA), smad2 / 3 and paired box gene-3 (Pax3).

TAZ의 C 말단은 유전자 발현을 조절하기 위한 코어 전사 기구(core transcriptional machinery)를 통해 다양한 상호작용을 수행한다. TAZ는 세포막에 위치하며, 이는 TAZ가 세포막 및 액틴 세포골격(actin cytoskeleton)으로부터 핵으로의 신호전달과 관련되어 있음을 나타낸다(Hong, J. et al., Cell cycle (Georgetown, Tex.) 5(2): 176, 2006). 또한, TAZ는 smad 핵-세포질 셔틀링(nucleocytoplasmic shuttling)과 연관되어 있다고 보고되었다.The C terminus of TAZ performs a variety of interactions through the core transcriptional machinery for regulating gene expression. TAZ is located in the cell membrane, indicating that TAZ is involved in signaling from the cell membrane and the actin cytoskeleton to the nucleus (Hong, J. et al., Cell cycle (Georgetown, Tex.) 5 ( 2) : 176, 2006). In addition, TAZ has been reported to be associated with smad nuclear-cytoplasmic shuttling.

마우스에서 TAZ 유전자의 결핍은 다양한 신체 기관의 비정상적인 형태 및 병리적 증상을 유도하는 것으로 알려지고 있다. TAZ 녹아웃 마우스의 신장에서는 피층 수질 다낭 형성(corticomedullary multicystic formation)이 나타났고, 인간 다낭성신질환(polycystic kidney disease)과 다소 유사한 증상이 유도되었다(Makita, R. et al., American Journal of Physiology- Renal Physiology: 00201.02007, 2008). 또한, 이전 연구에서는 TAZ 결핍이 폐 발생의 기형을 유발하고, 성체에서는 인간 폐기종(emphysema)과 유사한 표현형이 나타났음을 보고하였다. 그러나, 아직까지 활성산소에 의한 기관의 손상과 TAZ와의 관련성을 확인한 연구는 거의 없을 뿐만 아니라, 산소에 직접적으로 노출되어 산소의 영향을 많이 받는 호흡기관인 폐의 산화적 스트레스로 인한 손상에 대한 TAZ의 연관성은 보고된 바 없다. Deficiency of the TAZ gene in mice is known to induce abnormal morphology and pathological symptoms of various body organs. In the kidneys of TAZ knockout mice, corticomedullary multicystic formation was observed and symptoms similar to those of human polycystic kidney disease were induced (Makita, R. et al., American Journal of Physiology- Renal Physiology). : 00201.02007, 2008). In addition, previous studies have reported that TAZ deficiency causes malformations of lung development and adult phenotypes similar to human emphysema. However, few studies have confirmed the association between organ damage caused by free radicals and TAZ as well as the damage caused by oxidative stress in the lungs, which is a respiratory organ that is directly affected by oxygen. Associations have not been reported.

폐섬유증(pulmonary fibrosis)은 폐에서의 과도한 섬유상 연결조직 발달 또는 형성을 말하는 것으로서, 폐의 손상을 의미한다. 이러한 폐섬유증은 호흡곤란, 피로, 쇠약함, 가슴 통증, 식욕감퇴, 체중감소와 같은 전형적인 증상을 나타낸다(Crouch, E, American Journal of Physiology- Lung Cellular and Molecular Physiology 259(4): L159, 1990). 폐섬유증은 TGF-β 신호, 실리카에 대한 노출, 사이토카인 조사 후의 계속되는 케스케이드, 흡연, 항암제 주사 및 과도한 산소 노출과 같은, 다양한 원인에 의해 발생한다. 특히, 폐섬유증이 다른 질환의 이차적 영향인 것으로 밝혀짐에 따라, 폐섬유증의 대부분은 바이러스 감염, 다른 미세한 상처, 자가면역질환과 같은, 간질성폐질환(interstitial lung disease)로서 분류된다. 그러나, 원인을 알 수 없이 발명하는 특발성 폐섬유증(idiopathic pulmonary fibrosis)도 있다.
Pulmonary fibrosis refers to excessive fibrous connective tissue development or formation in the lungs, which means damage to the lungs. Such pulmonary fibrosis has typical symptoms such as dyspnea, fatigue, weakness, chest pain, loss of appetite, and weight loss (Crouch, E, American Journal of Physiology- Lung Cellular and Molecular Physiology 259 (4) : L159, 1990). Pulmonary fibrosis is caused by a variety of causes, such as TGF-β signaling, exposure to silica, continued cascade after cytokine irradiation, smoking, anticancer injections, and excessive oxygen exposure. In particular, as pulmonary fibrosis is found to be a secondary effect of other diseases, most of the pulmonary fibrosis is classified as interstitial lung disease, such as viral infections, other minor wounds, autoimmune diseases. However, there are also idiopathic pulmonary fibrosis invented without knowing the cause.

폐섬유증을 유발하는 다양한 원인 중에서, 폐는 호흡기관이라는 것에서 산화적 스트레스가 가장 중요한 원인이 된다(Thet, L. et al., Experimental lung research 11(3): 209-228, 1986; Oreffo, V. et al., Environmental Health Perspectives 85: 51, 1990). 고농도의 산소(90% 이상)에 노출되면 마우스의 폐는 점진적인 손상을 입게 되고 3 내지 7일 뒤 사망에까지 이른다는 보고가 있고(Crapo, J. et al., The American review of respiratory disease 122(1): 123, 1980; O'Reilly, M, American Journal of Physiology- Lung Cellular and Molecular Physiology 281(2): 291, 2001; Olivera, W. et al., American journal of respiratory and critical care medicine 152(4): 1229, 1995), 이러한 폐의 손상은 활성산소종(ROS)의 증가에 의한 결과인 것으로 여겨진다(Barazzone, C. et al., American journal of respiratory cell and molecular biology 19(4): 573, 1998; Boveris, A. et al., Biochemical Journal 134(3): 707, 1973; Lakshminrusimha, S. et al., American journal of respiratory and critical care medicine 174(12): 1370, 2006; Freeman, B. et al., The Journal of biological chemistry 256(21): 10986, 1981).Among the various causes of pulmonary fibrosis, the oxidative stress is the most important cause in the lungs of the respiratory tract (Thet, L. et al., Experimental lung research 11 (3) : 209-228, 1986; Oreffo, V). et al., E nvironmental Health Perspectives 85 : 51, 1990). Exposure to high levels of oxygen (more than 90%) leads to gradual damage to the lungs of mice and to death after three to seven days (Crapo, J. et al., The American review of respiratory disease 122 (1). ) : 123, 1980; O'Reilly, M, American Journal of Physiology- Lung Cellular and Molecular Physiology 281 (2) : 291, 2001; Olivera, W. et al., American journal of respiratory and critical care medicine 152 (4 ): 1229, 1995), such damage to the lungs is thought to be the result of the increase in reactive oxygen species (ROS) (Barazzone, C. et al, American journal of respiratory cell and molecular biology 19 (4):. 573, 1998; Boveris, A. et al., Biochemical Journal 134 (3) : 707, 1973; Lakshminrusimha, S. et al., American journal of respiratory and critical care medicine 174 (12) : 1370, 2006; Freeman, B. et al., The Journal of biological chemistry 256 (21) : 10986, 1981).

따라서, 과산소에 의해 유도되는 폐섬유증과 같은 폐손상에 대한 근본적인 치료를 위하여, 효과적으로 과산소 조건하에서 발병되는 폐손상을 치료할 수 있는 신규한 치료제의 개발이 요구된다. 이에 따라, 신규한 치료제의 개발을 위해서는 과산소에 의한 폐섬유증을 치료할 수 있는 효과적인 약물을 발굴하기 위한 전략이 필요하다. 이를 위해서는 과산소 상태에 노출된 인간의 폐섬유증과 유사한 모델 동물의 개발이 필수적이다. 고농도의 산소 조건하의 산화적 스트레스에 의해 발병되는 폐손상의 병인 기전을 규명하고, 이를 치료하기 위한 약물의 발굴 및 효능을 검증하는데, 과산소 노출에 의한 폐섬유증에 대한 모델 동물이 유용하게 활용될 것이다.
Thus, for the fundamental treatment of lung injury such as pulmonary fibrosis induced by peroxygen, there is a need for the development of a novel therapeutic agent that can effectively treat pulmonary damage that develops under peroxygen conditions. Accordingly, in order to develop a new therapeutic agent, a strategy for discovering an effective drug for treating pulmonary fibrosis caused by peroxygen is necessary. To this end, the development of a model animal similar to pulmonary fibrosis in humans exposed to peroxygen is essential. To investigate the pathogenesis of lung injury caused by oxidative stress under high oxygen conditions, and to identify the efficacy and efficacy of drugs to treat it. will be.

이에, 본 발명자들은 TAZ 유전자가 결핍된 형질전환 모델 마우스를 제조하였고, 상기 마우스의 폐는 과산소에 의해 유도되는 폐섬유증의 증상과 유사함을 최초로 확인하였으며, TAZ와 과산소 노출에 의한 산화적 스트레스 기전의 관련성을 규명함으로써, 상기 TAZ-/- 마우스는 과산소 노출에 의한 폐섬유증 모델 마우스로서 유용하게 사용할 수 있고, 이를 이용하여 치료제 후보물질의 스크리닝에 유용하게 이용할 수 있을 뿐만 아니라, TAZ의 발현 수준을 확인함으로써 과산소 노출에 의한 폐섬유증 진단 및 진단용 키트에 유용하게 이용할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
Therefore, the present inventors prepared a transgenic model mouse lacking the TAZ gene, and the lung of the mouse was confirmed for the first time similar to the symptoms of peroxygen-induced pulmonary fibrosis, and oxidative by TAZ and peroxygen exposure By determining the relationship of the stress mechanism, the TAZ -/- mice can be usefully used as a model of pulmonary fibrosis due to peroxygen exposure, and can be usefully used for the screening of therapeutic candidates. The present invention has been completed by revealing that the expression level can be usefully used for diagnosing and diagnosing pulmonary fibrosis due to peroxygen exposure.

본 발명의 목적은 과산소 노출에 의한 폐손상 모델 동물, 및 TAZ 마커를 이용한 과산소 노출에 의한 폐손상 진단용 키트를 제공하기 위한 것이다.
It is an object of the present invention to provide a lung injury model animal by peroxygen exposure, and a kit for diagnosing lung injury by peroxygen exposure using a TAZ marker.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 TAZ(transcriptional coactivator with PDZ-binding motif) 유전자가 녹아웃(TAZ-/-)된, 과산소 노출에 의한 폐손상 모델 마우스를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a model of lung injury by peroxygen exposure, knocked out (TAZ -/- ) TAZ (transcriptional coactivator with PDZ-binding motif) gene.

또한, 본 발명은 상기 TAZ 유전자가 녹아웃된 마우스의 제조방법을 제공한다. The present invention also provides a method for producing a mouse knocked out of the TAZ gene.

또한, 본 발명은 상기 과산소 노출에 의한 폐손상 모델 마우스를 사용한 과산소 노출에 의한 폐손상 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for screening a candidate drug for treating lung damage due to peroxygen exposure using the mouse model of lung injury due to peroxygen exposure.

또한, 본 발명은 TAZ 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 상기 TAZ 단백질를 암호화하는 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 과산소 노출에 의한 폐손상 진단용 키트를 제공한다.In another aspect, the present invention provides a kit for diagnosing lung damage by peroxygen exposure comprising an antibody that specifically binds to a TAZ protein, or a primer or probe that specifically binds to a nucleic acid encoding the TAZ protein.

아울러, 본 발명은 과산소 노출에 의한 폐손상 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법을 제공한다.
In addition, the present invention provides a protein detection method for providing information of the diagnosis of lung damage due to peroxygen exposure.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 TAZ 유전자를 녹아웃(TAZ-/-)시킨 형질전환 마우스는 과산소 노출에 의해 유발되는 폐산화증과 유사한 폐손상이 유도되고 상기 TAZ-/- 마우스에서 유도된 폐손상은 활성산소에 의한 폐손상 기작과 관련되어 있으므로, 상기 형질전환 마우스는 과산소 노출에 의한 폐손상의 모델 동물로서 이용하여 새로운 치료 후보물질의 스크리닝이 가능할 뿐만 아니라, TAZ의 과산소 노출에 의한 폐손상 억제(suppressor) 유전자로서의 생리적 기능을 밝히는 데도 효과적으로 이용될 수 있으며, 상기 TAZ의 발현수준을 통해 과산소 노출에 의한 폐손상의 진단 또는 예후 예측용 마커로서 이용가능하다.
As described above, transgenic mice knocked out (TAZ − / − ) of the TAZ gene of the present invention induce lung injury similar to pulmonary oxidosis induced by peroxygen exposure and lung induced in the TAZ − / − mice. Since the damage is related to the mechanism of lung damage caused by free radicals, the transgenic mice can be used as a model animal of lung injury due to peroxygen exposure, to screen for new therapeutic candidates, and to It can be effectively used to identify the physiological function as a lung injury suppressor gene, and can be used as a marker for diagnosing or prognostic lung damage due to peroxygen exposure through the expression level of the TAZ.

도 1은 TAZ 유전자(A). 및 TAZ-/- 마우스를 제조하기 위한 TAZ 유전자 녹아웃 카세트(B)의 개열지도를 나타내는 그림이다.
도 2는 TAZ-/- 마우스에서 유도된 폐섬유화증을 나타내는 그림이다:
A: 정상군(WT) 및 TAZ-/- 마우스의 폐 조직;
B: 정상군 및 TAZ-/- 마우스 폐에서 TAZ 유전자의 발현;
C: 정상군 및 TAZ-/- 마우스 폐에서 TAZ 단백질의 발현; 및
D: H&E 염색을 통한 정상군 및 TAZ-/- 마우스 폐 조직 분석.
도 3은 정상군 및 TAZ-/- 마우스 폐에서의 다양한 외피 계면활성제 단백질 및 염증성 사이토카인 유전자의 발현을 확인한 그림이다:
A: 상피세포 발생 관련 유전자(SP-A, B, C 및 D, CCSP)의 발현;
B: 세포 발생 인자(VEGF, FGF2, 베타-카테닌, HNF3-α, FOXA2, HIF-1α 및 HIF-2α)의 발현; 및
C: 염증성 사이토카인(IL-6, TNFα 및 MCP-1)의 발현.
도 4는 과산소 노출에 의해 폐섬유화증이 유도된 정상군 마우스의 조직학적 분석(A) 및 유전자 발현 변화(B)를 나타낸 그림이다.
도 5는 과산소 노출에 의한 TAZ의 발현 변화를 나타낸 그림이다:
A: TAZ 단백질의 발현;
B: 과산소에 72시간 동안 노출된 정상군 마우스 폐에서의 TAZ 유전자 발현; 및
C: 과산소에 48시간 동안 노출된 A549 세포에서의 TAZ 단백질 발현.
도 6은 정상군 마우스, TAZ-/- 마우스, 및 과산소에 노출된 정상군 또는 TAZ-/- 마우스 폐에서의 외피 계면활성제 단백질(A 및 B) 및 염증성 사이토카인(C 및 D) 유전자의 발현량을 확인한 그림이다:
도 7은 과산소에 노출된 A549 세포의 형태(A) 및 이의 세포수 측정(B)을 나타낸 그림이다.
도 8은 과산소에 노출된 정상군 또는 TAZ-/- 세포의 세포증식을 나타낸 그래프이다:
A: 과산소 또는 정상 상태에 노출된 A549 세포;
B: 정상 상태에서의 A549 대조군(BP) 세포 및 Ti 세포(TAZ가 녹다운된 A549 세포); 및
C: 정상 상태에서의 정상군 마우스의 MEF(MEFs WT) 및 TAZ-/- 마우스의 MEF(MEFs TAZ-/-).
도 9는 TAZ-/- 마우스 폐에서 술피레독신(sulfiredoxin, Srx) 발현 및 Prx 술피닐화(sulfinylation)를 나타낸 그림이다.
A: 과산소에 노출된 정상군 마우스 및 정상상태에서의 정상군 마우스 폐의 Srx 및 Prx-PO3 단백질의 발현;
B: TAZ-/- 마우스 또는 정상군 마우스 폐에서의 Nrf2 및 Srx 유전자의 발현; 및
C: TAZ-/- 마우스 또는 정상군 마우스 폐에서의 Nrf2 및 Srx 단백질의 발현.1 is the TAZ gene (A). And a cleavage map of the TAZ gene knockout cassette (B) for producing TAZ − / − mice.
2 is a diagram showing pulmonary fibrosis induced in TAZ − / − mice:
A: lung tissue of normal group (WT) and TAZ -/- mice;
B: expression of TAZ gene in normal and TAZ − / − mouse lungs;
C: expression of TAZ protein in normal and TAZ − / − mouse lungs; And
D: Normal and TAZ -/- mouse lung tissue analysis via H & E staining.
Figure 3 shows the expression of various envelope surfactant proteins and inflammatory cytokine genes in normal and TAZ -/- mouse lungs:
A: expression of epithelial cell development related genes (SP-A, B, C and D, CCSP);
B: expression of cell development factors (VEGF, FGF2, beta-catenin, HNF3-α, FOXA2, HIF-1α and HIF-2α); And
C: expression of inflammatory cytokines (IL-6, TNFα and MCP-1).
Figure 4 is a diagram showing the histological analysis (A) and gene expression changes (B) of the normal group mice induced pulmonary fibrosis due to peroxygen exposure.
5 is a diagram showing the change in expression of TAZ by peroxygen exposure:
A: expression of TAZ protein;
B: TAZ gene expression in normal mouse lungs exposed to peroxygen for 72 hours; And
C: TAZ protein expression in A549 cells exposed to peroxygen for 48 hours.
Figure 6 shows the expression of envelope surfactant proteins (A and B) and inflammatory cytokines (C and D) genes in normal mice, TAZ -/- mice, and normal or TAZ -/- mouse lungs exposed to peroxygen The figure confirms the expression level:
Figure 7 is a diagram showing the shape (A) and cell number measurement (B) of A549 cells exposed to peroxygen.
8 is a graph showing cell proliferation of normal or TAZ − / − cells exposed to peroxia:
A: A549 cells exposed to peroxygen or steady state;
B: A549 control (BP) cells and Ti cells (TA549 knocked down A549 cells) at steady state; And
C: MEF of normal group mice at normal state (MEFs WT) and MEF of TAZ − / − mice (MEFs TAZ − / − ).
FIG. 9 is a diagram showing sulfidodoxin (Srx) expression and Prx sulfinylation in TAZ − / − mouse lungs.
A: expression of Srx and Prx-PO 3 proteins in normal mice and normal mouse lungs exposed to peroxia;
B: expression of Nrf2 and Srx genes in TAZ − / − mice or normal mouse lungs; And
C: Expression of Nrf2 and Srx proteins in TAZ − / − mice or normal mouse lungs.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 TAZ(transcriptional coactivator with PDZ-binding motif) 유전자가 녹아웃(TAZ-/-)된, 과산소 노출에 의한 폐손상 모델 마우스를 제공한다.The present invention provides a model of lung injury by peroxygen exposure, in which a transcriptional coactivator with PDZ-binding motif (TAZ) gene is knocked out (TAZ -/- ).

상기 TAZ 유전자는 서열번호 1의 핵산 서열로 기재되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.The TAZ gene is preferably described as a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.

상기 과산소 노출에 의한 폐손상은 폐섬유증(fibrosis), 기관지폐이형성증(bronchopulmonary dysplasia) 및 만성폐쇄성폐질환(chronic obstructive pulmonary disease)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않고, 과산소 노출에 의한 산화적 스트레스로 인해 발병되는 모든 폐손상은 이에 포함된다.
Pulmonary injury due to the exposure to oxygen is preferably one selected from the group consisting of pulmonary fibrosis, bronchopulmonary dysplasia and chronic obstructive pulmonary disease, but not always limited thereto. This includes any lung damage caused by oxidative stress from peroxygen exposure.

또한, 본 발명은 상기 폐손상 모델 마우스의 제조방법을 제공한다.The present invention also provides a method for producing the lung injury model mouse.

상기 제조방법은 하기의 단계를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:The preparation method preferably includes but is not limited to the following steps:

1) TAZ 유전자 녹아웃 카세트를 제조하는 단계;1) preparing a TAZ gene knockout cassette;

2) 단계 1)의 TAZ 유전자 녹아웃 카세트를 배아줄기세포에 형질감염시키는 단계;2) transfecting embryonic stem cells with the TAZ gene knockout cassette of step 1);

3) 단계 2)의 배아줄기세포를 포배아의 포배강에 주입하여 키메라 마우스를 얻는 단계, 3) injecting embryonic stem cells of step 2) into the blastocyst of the blastocyst to obtain a chimeric mouse,

4) 단계 3)의 키메라 마우스로부터 TAZ+/- 유전형질을 갖는 이형접합체 마우스를 얻는 단계; 및4) obtaining a heterozygous mouse having a TAZ +/- genotype from the chimeric mouse of step 3); And

5) 상기 단계 4)의 이형접합체 마우스를 상호교배시켜 TAZ-/- 유전형질을 갖는 동형접합체 마우스를 얻는 단계.5) cross-crossing the heterozygous mice of step 4) to obtain homozygous mice having the TAZ − / − genotype.

상기 TAZ 유전자는 서열번호 1의 핵산 서열로 기재되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.The TAZ gene is preferably described as a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.

상기 TAZ 유전자가 녹아웃된 마우스는 TAZ 유전자의 결손이 상동 염색체 1쌍에서 모두 일어난 것으로서, TAZ-/-의 유전형질을 갖는 동형접합체(homozygote)이며, 정상적으로 출생하지만, 과산소 노출에 의해 유도되는 폐손상을 갖는 특징이 있다.Mice knocked out of the TAZ gene are all homozygous chromosomal defects of the TAZ gene, and are homozygotes (homozygotes) having a genotype of TAZ − / − and are normally born but are induced by peroxygen exposure. It is characterized by having damage.

상기 제조방법에 있어서, 단계 1)의 TAZ 유전자 녹아웃 카세트는 도 1의 B에 도시된 개열지도를 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.In the above production method, the TAZ gene knockout cassette of step 1) preferably has a cleavage map shown in B of FIG. 1, but is not limited thereto.

상기 단계 1)에서 제조한 TAZ 유전자 녹아웃 카세트를 배아줄기세포에 형질감염하기 위하여 전기천공법(electroporation), 미세주사법(microinjection) 또는 칼슘포스페이트법(calcium phosphate treatment)을 이용하여 마우스의 배아줄기세포에 도입시킬 수 있다. In order to transfect the TAZ gene knockout cassette prepared in step 1) into embryonic stem cells, embryonic stem cells of mouse are subjected to electroporation, microinjection, or calcium phosphate treatment. Can be introduced.

상기 단계 3)에 있어서, 상기 형질전환된 배아줄기세포를 포배아의 포배강에 주입하기 위하여, 배아줄기세포 클론을 도너(donor) 마우스의 배반포(blastocyst)에 주사하고 이를 추후 자궁으로 옮길 수 있다. In step 3), in order to inject the transformed embryonic stem cells into the blastocyst of the blastocyst, an embryonic stem cell clone may be injected into the blastocyst of a donor mouse and later transferred to the uterus. .

상기 단계 4)에 있어서, 상기 키메라 마우스로부터 생식계열전달을 가지는 이형접합체를 유도하고 이를 상호교배시켜 동형접합체인 TAZ 녹아웃(TAZ-/-) 마우스를 제조할 수 있다.In step 4), a heterozygote having germline transmission from the chimeric mouse can be induced and intercrossed to prepare a TAZ knockout (TAZ -/- ) mouse which is a homozygous conjugate.

본 발명의 구체적인 실시예에 있어서, TAZ 유전자를 결손시키기 위하여, TAZ 유전자의 일부를 네오(neo) 유전자로 치환시킨 TAZ 유전자 녹아웃 카세트(도 1 참조)를 벡터 내에 포함시켜 TAZ 유전자 결손 벡터를 제작하였다. 상기 벡터로 배아줄기세포에 존재하는 TAZ 유전자를 결손시키고, 유전자 결손이 확인된 배아줄기세포를 정상적으로 발생중인 배반포의 포배강 내에 주입하여 키메라(chimera) 생쥐를 생산하였다. 생산된 키메라 생쥐는 정상 마우스와의 역교배를 통하여 배아줄기세포 유래의 F1 마우스가 출생하였고, 한쪽 유전자가 결손된 이형접합체(TAZ+/-) 마우스 간의 교배에 의하여 TAZ 유전자가 녹아웃된 동형접합체TAZ-/-) 마우스를 제조하였다.In a specific embodiment of the present invention, in order to delete the TAZ gene, a TAZ gene deletion vector was prepared by including a TAZ gene knockout cassette (see FIG. 1) in which a part of the TAZ gene was substituted with a neo gene (see FIG. 1). . The TAZ gene present in the embryonic stem cells was deleted with the vector, and the embryonic stem cells identified with the gene deletion were injected into the blastocyst of the normally developing blastocyst to produce chimera mice. The produced chimeric mice were born with embryonic stem cell-derived F1 mice through backcrossing with normal mice, and homozygotes TAZ knocked out by TAZ gene knockout by cross-linking between heterozygous (TAZ +/- ) mice lacking one gene. -/- ) Mice were prepared.

본 발명자들은 본 발명에서 제조한 TAZ-/- 마우스의 폐 조직을 확인한 결과, 과산소 노출에 의한 산화적 스트레스로 인하여 심각한 폐섬유증이 유도되는 것을 확인하였고, 나이가 증가할수록 증상이 악화되는 것으로 나타남으로써(도 2 참조), 노화에 의해 폐섬유증이 심화되는 것을 확인하였다. 또한, 과산소 노출에 의해 폐손상 발생시 감소하는 것으로 잘 알려져 있는 폐 상피세포 마커인, 계면활성제 단백질(surfactant protein, SP), 클라라세포 분비 단백질(Clara cell secretory protein, CCSP), 여러 성장 인자 단백질과, 염증시 발현이 증가하는 사이토카인 유전자의 발현량을 TAZ-/- 마우스 폐에서 측정한 결과, SP-C, 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF) 및 CCAP 유전자의 발현량이 정상군에 비해 현저히 감소하는 것으로 나타났고, 염증성 사이토카인의 발현을 증가하였다(도 3 참조). 한편, 과산소에 노출된 정상군의 마우스에서도 TAZ-/- 마우스의 폐 조직과 유사한 폐섬유증이 유도되는 것으로 나타났고, SP-C, VEGF, FGF-2 및 CCAP 유전자의 발현량도 감소하였으며(도 4 참조), TAZ 유전자 및 단백질의 발현량이 과산소에 노출되지 않은 대조군에 비해 현저히 감소되는 것을 확인하였다(도 5 참조). 또한, TAZ-/- 마우스를 과산소 상태에 노출한 경우 폐섬유증이 가장 현저하게 유도되는 것으로 나타났다(도 6 참조). 이에, 상기의 결과들을 종합하면, 과산소 노출로 인해 유도되는 폐손상과 TAZ의 결핍으로 인해 일어나는 폐손상 사이에는 유사한 관계가 있음을 알 수 있었다.The inventors of the present invention confirmed the lung tissue of the TAZ -/- mice prepared in the present invention. As a result, it was confirmed that severe pulmonary fibrosis was induced due to oxidative stress caused by peroxygen exposure, and the symptoms worsened with age. As a result (see FIG. 2), it was confirmed that pulmonary fibrosis was intensified by aging. In addition, surfactant protein (SP), Clara cell secretory protein (CCSP), several growth factor proteins, which are well known to be reduced in lung injury by peroxygen exposure, , The expression level of cytokine genes increased during inflammation in the TAZ -/- mouse lungs, and the expression levels of SP-C, vascular endothelial growth factor (VEGF) and CCAP genes in normal group It was found to be markedly reduced compared to, and increased the expression of inflammatory cytokines (see Figure 3). On the other hand, in normal mice exposed to hyperoxia, lung fibrosis similar to lung tissue of TAZ -/- mice was induced, and the expression levels of SP-C, VEGF, FGF-2 and CCAP genes were also reduced ( 4), it was confirmed that the expression level of the TAZ gene and protein is significantly reduced compared to the control group not exposed to the peroxygen (see Fig. 5). In addition, pulmonary fibrosis was most significantly induced when TAZ − / − mice were exposed to peroxygen state (see FIG. 6). Thus, combining the above results, it can be seen that there is a similar relationship between the lung damage caused by the exposure to peroxygen and lung damage caused by the deficiency of TAZ.

본 발명자들은 시험관 내(in vitro) 실험을 통해 과산소 노출에 대한 상피세포의 세포생존률 및 세포증식을 확인한 결과, 과산소에 노출된 선암 인간 폐포 기저 상피세포(A549)에서는 TAZ 단백질 발현이 감소하였고(도 5의 C 참조), 세포생존률 및 세포증식 또한 대조군에 비해 현저히 감소하였다(도 7 참조). 반면에, TAZ 유전자가 녹다운된 A549 세포(Ti 세포)는 세포증식에 유의적인 변화가 나타나지 않았는데, 이는 TAZ가 녹아웃된 것이 아닌 녹다운(knock-down)된 것이므로, TAZ 단백질이 낮은 수준으로도 발현되었기 때문이다. TAZ-/- 마우스 유래의 마우스배아섬유아세포(mouse embryonic fibroblast, MEF)를 정상 상태에 노출시긴 경우에는, 정상군 마우스 유래의 MEF에서보다 세포증식이 감소된 것으로 나타났다(도 8 참조).The present inventors confirmed the cell viability and cell proliferation of epithelial cells with respect to peroxygen exposure through in vitro experiments. As a result, TAZ protein expression was decreased in adenocarcinoma basal epithelial cells (A549) exposed to peroxal. (See FIG. 5C), cell viability and cell proliferation were also significantly reduced compared to the control (see FIG. 7). On the other hand, A549 cells knocked down by the TAZ gene (Ti cells) did not show significant changes in cell proliferation, since the TAZ protein was knocked down rather than knocked out. Because. When mouse embryonic fibroblasts (MEFs) derived from TAZ -/- mice were exposed to normal conditions, cell proliferation was reduced compared to that of MEFs from normal mice (see FIG. 8).

본 발명자들은, 과산소 노출로 인해 술포닐화(sulfonylation)된 퍼록시레독신(peroxiredoxin, Prx)이 증가하고, 핵 인자 적혈구 2-관련 인자 2(Nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)에 의존하는 술피레독신(sulfiredoxin, Srx)의 양도 증가한다는 최근 연구 결과에 착안하여, TAZ-/- 마우스 폐에서의 Srx 및 Nrf2 발현량, 및 Prx의 술포닐화에 대하여 분석하였다. 산화적 스트레스에 노출된 세포는 하이드로퍼록사이드(hydroperoxide)를 제거함으로써 상기 Prx를 보고하는 것으로 알려져 있고, Prx는 가역적으로 시스테인 술핀산(cystein sulfinic acid)에 과산화된다. 이러한 상황에서 상기 Srx는 과산화를 전환하기위한 효소로서 작용하므로, 실제 과산소에 노출된 폐에서는 Srx 수준이 증가하게 된다. Srx, Nrf2, 및 Prx-PO3 분석 결과, TAZ-/- 마우스는 과산소 자극이 없는 상황에서도 정상군에 비해 폐에서의 Srx 및 술포닐화된 Prx가 증가되어 있음을 알 수 있었다(도 9 참조). 이러한 결과는 TAZ가 산화적 스트레스를 증가시키는 신호 분자를 억제한다는 것을 나타낸다. The inventors have found that sulfonylated peroxiredoxin (Prx) increases due to peroxygen exposure and relies on Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2). Focusing on the recent results of the increase in the amount of sulfidodoxin (sulfiredoxin (Srx), we analyzed the amount of Srx and Nrf2 expression in TAZ -/- mouse lungs, and sulfonylation of Prx. Cells exposed to oxidative stress remove hydroperoxide It is known to report the Prx, and Prx is reversibly peroxidated to cystein sulfinic acid. In this situation, since the Srx acts as an enzyme for converting peroxidation, the level of Srx is increased in the lungs actually exposed to peroxygen. As a result of Srx, Nrf2, and Prx-PO 3 analysis, it was found that TAZ -/- mice increased Srx and sulfonylated Prx in the lung compared to the normal group even in the absence of peroxygen stimulation (see FIG. 9). ). These results indicate that TAZ inhibits signal molecules that increase oxidative stress.

따라서, 상기 결과를 통해 TAZ가 정상 상태에서 산화적 스트레스에 관계되는 신호분자의 발현을 조절하고, 폐의 항상성을 조절하는데 기능한다는 것을 알 수 있으며, 이러한 TAZ 유전자를 결핍시킴으로써 과산소에 의해 유도되는 폐손상과 유사한 표현형을 유발한다는 것을 확인하였다.Therefore, the above results indicate that TAZ functions in regulating the expression of signal molecules related to oxidative stress in a normal state and in controlling the homeostasis of the lungs. It was confirmed that it causes a phenotype similar to lung injury.

이에, TAZ-/- 마우스는 과산소 노출에 의한 폐손상 기전연구 및 치료제 개발을 위한 모델 마우스로서 유용하게 사용될 수 있고, 이러한 모델 마우스의 제조에 유용하게 활용될 수 있다.
Thus, TAZ -/- mice can be usefully used as a model mouse for the study of lung damage mechanism and the development of therapeutic agents by exposure to peroxygen, and can be usefully used for the production of such model mice.

또한, 본 발명은 In addition,

1) 실험군으로서, 상기 과산소 노출에 의한 폐손상 모델 마우스에 피검화합물 또는 조성물을 처리하는 단계;1) treating the test compound or composition in the lung injury model mouse caused by exposure to peroxygen as an experimental group;

2) 단계 1)의 피검화합물 또는 조성물이 처리된 실험군 마우스, 및 피검화합물 또는 조성물이 처리되지 않은 대조군 마우스로부터 각각 과산소 노출에 의한 폐손상의 증상을 측정하는 단계; 및2) measuring the symptoms of lung injury due to peroxygen exposure from the experimental group mice to which the test compound or composition of step 1) was treated, and the control mouse not to the test compound or composition; And

3) 대조군에 비하여 실험군에서 과산소 노출에 의한 폐손상의 증상이 감소된 피검화합물 또는 조성물을 선별하는 단계를 포함하는, 과산소 노출에 의한 폐손상 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다. 3) The present invention provides a method for screening a candidate drug for treating pulmonary injury by peroxygen exposure, comprising the step of selecting a test compound or composition in which the symptoms of lung injury due to peroxygen exposure are reduced in the experimental group compared to the control group.

상기 방법에 있어서, 상기 과산소 노출에 의한 폐손상은 폐섬유증(fibrosis), 기관지폐이형성증(bronchopulmonary dysplasia) 및 만성폐쇄성폐질환(chronic obstructive pulmonary disease)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. In the method, the lung injury due to the exposure to peroxygen is preferably any one selected from the group consisting of pulmonary fibrosis, bronchopulmonary dysplasia and chronic obstructive pulmonary disease. It is not limited to this.

상기 단계 1)의 피검화합물 또는 조성물은 천연화합물, 합성화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아 또는 진균의 대사산물 및 생활성 분자일 수 있다.The test compound or composition of step 1) may be a natural compound, synthetic compound, RNA, DNA, polypeptide, enzyme, protein, ligand, antibody, antigen, metabolite of bacteria or fungus and bioactive molecule.

상기 단계 1)의 투여 방법은 경구 투여 또는 비경구 투여를 통해 수행될 수 있으며, 상기 비경구 투여시 피내주사, 피하주사, 정맥주사, 복강주사, 근육주사로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 주사 투여; 직장 투여; 국소도포; 첩포; 및 이온토포레시스(Iontophoresis)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 수행될 수 있다.The above-mentioned step 1) may be carried out by oral administration or parenteral administration. In the case of parenteral administration, any one of injections selected from the group consisting of intradermal injection, subcutaneous injection, intravenous injection, intraperitoneal injection, administration; Rectal administration; Topical application; Patch; And iontophoresis. The method of the present invention can be carried out by a method selected from the group consisting of iontophoresis and iontophoresis.

상기 단계 2)의 과산소 노출에 의한 폐손상 증상의 측정은 조직병리학적 방법, ELISA, 유세포분석법 또는 중합효소연쇄반응 방법을 사용할 수 있고, 계면활성제 단백질-A(surfactant protein-A), SP-B, SP-C, SP-D, 클라라세포 분비 단백질(clara cell secretory protein, CCSP), β-카테닌, VEGF, FGF-2, HNF3, FOXA2, HIF2-α, IL-6, TNF-α, MCP-1, 세포증식, 세포생존률, 술피레독신(sulfiredoxin, Srx) 및 퍼록시레독신 술피닐화로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 측정하는 것이 바람직하나, 과산소 노출에 의한 폐손상을 측정할 수 있는 지표라면 무엇이든 측정가능하다.Pulmonary injury symptoms due to exposure to peroxygen of step 2) can be used histopathological method, ELISA, flow cytometry or polymerase chain reaction method, surfactant protein-A (SP), SP- B, SP-C, SP-D, clara cell secretory protein (CCSP), β-catenin, VEGF, FGF-2, HNF3, FOXA2, HIF2-α, IL-6, TNF-α, MCP -1, cell proliferation, cell viability, sulfiredoxin (Srx) and peroxyredoxin sulfinylation is preferably measured at least one selected from the group consisting of, but lung damage due to peroxygen exposure is to be measured Any indicator that can be measured is measurable.

상기 스크리닝 방법을 통해 수득한, 과산소 노출에 의한 폐손상 억제 활성을 나타내는 피검화합물 또는 조성물은 과산소 노출에 의한 폐손상 치료제 후보물질이 될 수 있다. 이와 같은 후보물질은 이후의 과산소 노출에 의한 폐섬유증과 같은 폐손상 치료제 개발 과정에서 선도물질로서 작용하게 되며, 선도물질이 과산소 노출에 의한 폐손상 억제 효과를 나타낼 수 있도록 그 구조를 변형시키고 최적화함으로써 산화적 스트레스로 인해 기인하는 폐손상을 위한 신규한 치료제를 개발할 수 있다.The test compound or composition obtained through the screening method and exhibiting inhibitory activity on lung injury due to peroxygen exposure may be a candidate drug for treating lung injury due to peroxygen exposure. Such candidates will act as a leader in the development of a pulmonary injury treatment drug such as pulmonary fibrosis due to the subsequent exposure to peroxygen, and the structure will be modified so that the leader can exhibit the effect of inhibiting lung damage from peroxygen exposure. Optimization can lead to the development of novel therapeutics for lung damage due to oxidative stress.

본 발명의 TAZ-/- 마우스의 폐 조직에서 유도된 폐섬유증(lung fibrosis) 증상은 과산소 노출에 의해 발생하는 폐섬유증과 매우 유사한 것으로 나타났고, 과산소 노출에 따른 폐손상시 발현이 변화한다고 알려진 상피 발생 관련 유전자, 성장 인자 및 염증성 사이토카인의 발현 또한 변화하였다. 이는 과산소 노출에 의해 폐손상이 유발된 정상군 마우스 폐에서의 경향과 유사하였으므로, TAZ의 결핍은 과산소 노출 효과와 같은 산화적 스트레스 관련 신호에 영향을 주는 것을 알 수 있다. 또한, TAZ가 Prx의 과산화와 관련되어 산화적 스트레스를 증가시키는 신호 경로에 작용하여 신호 분자들을 억제시킴으로써, 폐의 항상성 조절 기능을 갖는 것을 확인하였으므로, TAZ-/- 마우스는 과산소 노출에 의한 폐손상 치료제의 탐색 및 개발을 위해 유용하게 사용될 수 있다.
Pulmonary fibrosis symptoms induced in lung tissue of TAZ -/- mice of the present invention were found to be very similar to pulmonary fibrosis caused by peroxygen exposure, and the expression of pulmonary injury following peroxygen exposure changes. The expression of known epithelial development related genes, growth factors and inflammatory cytokines also changed. This is similar to the tendency in the lungs of normal mice in which lung damage was induced by peroxygen exposure, and thus, deficiency of TAZ affects oxidative stress related signals such as peroxygen exposure effects. In addition, since TAZ acts on a signal pathway that increases oxidative stress associated with peroxidation of Prx and inhibits signal molecules, it is confirmed that TAZ -/- mice have a lung homeostasis effect due to peroxygen exposure. It can be usefully used for the search and development of therapeutic agents for damage.

또한, 본 발명은 TAZ 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 상기 TAZ 단백질를 암호화하는 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 과산소 노출에 의한 폐손상 진단용 키트를 제공한다.In another aspect, the present invention provides a kit for diagnosing lung damage by peroxygen exposure comprising an antibody that specifically binds to a TAZ protein, or a primer or probe that specifically binds to a nucleic acid encoding the TAZ protein.

상기 TAZ 단백질은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.The TAZ protein preferably has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto.

상기 TAZ 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 TAZ 단백질의 주입을 통해 제조된 것 또는 시판되어 구입한 것이 모두 사용 가능하고, 상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 에피토프(epitope)와 결합할 수 있는 단편 등을 포함할 수 있다.Antibodies that specifically bind to the TAZ protein may be prepared by injecting the TAZ protein or purchased commercially, and the antibody may bind to polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, and epitopes. Fragments and the like.

상기 다클론 항체는 상기 TAZ 단백질을 동물에 주사하고 해당 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 종래의 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 당업계에 알려진 어떠한 방법에 의해서든 정제될 수 있고, 염소, 토끼, 쥐, 래트, 닭, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 만들어질 수 있고, 토끼를 숙주로 하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.The polyclonal antibody may be produced by a conventional method of injecting the TAZ protein into an animal and collecting blood from the animal to obtain a serum containing the antibody. Such polyclonal antibodies can be purified by any method known in the art and can be made from any animal species host such as goat, rabbit, rat, rat, chicken, sheep, monkey, horse, pig, cow, dog, and the like. It is possible to use a rabbit as a host, but is not limited thereto.

상기 단클론 항체는 연속 세포주의 배양을 통한 항체분자의 생성을 제공하는 어떠한 기술을 사용하여도 제조할 수 있다. 이러한 기술로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 하이브리도마 기술, 사람 및 쥐 B-세포 하이브리도마 기술 및 EBV-하이브리도마 기술이 포함된다(Kohler G et al., Nature 256:495-497, 1975; Kozbor D et al., J Immunol Methods 81:31-42, 1985; Cote RJ et al ., Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030, 1983; 및 Cole SP et al., Mol Cell Biol 62:109-120, 1984).The monoclonal antibodies can be prepared using any technique that provides for the production of antibody molecules through the culture of continuous cell lines. Such techniques include, but are not limited to, hybridoma technology, human and murine B-cell hybridoma technology, and EBV-hybridoma technology (Kohler G et. al ., Nature 256: 495-497, 1975; Kozbor D et al. , J Immunol Methods 81: 31-42, 1985; Cote RJ et al . , Proc Natl Acad Sci 80: 2026-2030, 1983; And Cole SP et al ., Mol Cell Biol 62: 109-120, 1984).

또한, 상기 TAZ 단백질에 대한 특정 결합 부위를 함유한 항체 단편이 제조될 수 있다. 예를 들면 이들로 한정되는 것은 아니지만 F(ab')2 단편은 항체분자를 펩신으로 분해시켜 제조할 수 있으며, Fab 단편은 F(ab')2 단편의 디설파이드 브릿지를 환원시킴으로써 제조할 수 있다. 다른 방법으로서, Fab 발현 라이브러리를 작게하여 원하는 특이성을 갖는 단클론 Fab 단편을 신속하고 간편하게 동정할 수 있다(Huse WD et al ., Science 254: 1275-1281, 1989). In addition, antibody fragments containing specific binding sites for the TAZ protein can be prepared. For example, but not limited to, F (ab ') 2 fragments can be prepared by digesting antibody molecules with pepsin, and Fab fragments can be prepared by reducing the disulfide bridges of F (ab') 2 fragments. Alternatively, the Fab expression library can be made smaller to quickly and easily identify monoclonal Fab fragments with the desired specificity (Huse WD et. al . , Science 254: 1275-1281, 1989).

상기 항체는 세척이나 복합체의 분리 등 그 이후의 단계를 용이하게 하기 위해 고형 기질(solid substrate)에 결합될 수 있다. 고형 기질은 예를 들어 합성수지, 니트로셀룰로오스, 유리기판, 금속기판, 유리섬유, 미세구체 및 미세비드 등이 있다. 또한, 상기 합성수지에는 폴리에스터, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, PVDF 및 나일론 등이 있다.The antibody can be bound to a solid substrate to facilitate subsequent steps such as washing or separation of the complex. Solid substrates include synthetic resins, nitrocellulose, glass substrates, metal substrates, glass fibers, microspheres and microbeads. In addition, the synthetic resins include polyester, polyvinyl chloride, polystyrene, polypropylene, PVDF and nylon.

상기 키트는 항원-항체 결합반응, 또는 단백질-리간드 결합반응을 통하여 결합 반응을 정량 또는 정성적으로 분석함으로써 폐암을 진단할 수 있으며, 상기 결합 반응은 통상의 효소면역분석법(ELISA), 방사능면역분석법(radioimmunoassay, RIA), 샌드위치 측정법(sandwich assay), 웨스턴 블랏, 면역침강법, 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 형광면역법, 효소기질발색법, 항원-항체 응집법 등의 방법을 이용하여 측정할 수 있다.The kit can diagnose lung cancer by quantitatively or qualitatively analyzing the binding reaction through an antigen-antibody binding reaction, or a protein-ligand binding reaction, and the binding reaction is conventional enzyme-linked immunoassay (ELISA), radioimmunoassay. (radioimmunoassay, RIA), sandwich assay, western blot, immunoprecipitation, immunohistochemical staining, fluorescence immunoassay, enzyme substrate coloration, antigen-antibody aggregation, etc. have.

상기 TAZ 단백질를 암호화하는 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머를 TAZ 유전자 검출 시, PCR 증폭반응에 적용하는 경우, 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermusfiliformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.When a primer specifically binding to the nucleic acid encoding the TAZ protein is applied to a PCR amplification reaction upon detection of the TAZ gene, optionally, reagents necessary for PCR amplification, such as buffers and DNA polymerases (eg, Thermus aquaticus (Taq) ), Thermus thermophilus (Tth), Thermusfiliformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis or thermally stable DNA polymerase obtained from Pyrococcus furiosus (Pfu)), DNA polymerase cofactors and dNTPs. The kit of the present invention may be manufactured in a number of separate packaging or compartments containing the reagent components described above.

상기 키트의 프로브는 엄격한 혼성화 조건하에서 TAZ 핵산 서열에 특이적으로 결합하도록 제작된 것이 바람직하며, 연속적인 15 내지 25 핵산 길이의 센스 및/또는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 바람직하게는 15 내지 30 핵산 길이의 길이, 더욱 바람직하게는 18 내지 25 핵산 길이의 센스 및/또는 안티센스 올리고뉴클레오티드인 것은 모두 사용 가능하다.Probes of the kits are preferably designed to specifically bind to TAZ nucleic acid sequences under stringent hybridization conditions, and are contiguous 15-25 nucleic acid long sense and / or antisense oligonucleotides, preferably 15-30 nucleic acid long More preferably 18 and 25 nucleic acid long sense and / or antisense oligonucleotides.

상기 특이적 결합은 비특이적인 혼성체가 형성되지 않고, 특이적인 혼성체가 형성되는 것을 의미하고, 상기 엄격한 혼성화 조건은 통상적인 방법에 따라 혼성체를 형성하는 핵산의 융해 온도(Tm) 등에 기초하여 결정할 수 있다. 구체적인 혼성화 상태를 유지할 수 있는 세정 조건으로는 통상 「1× SSC, 0.1% SDS, 37℃」정도의 조건, 더욱 엄격하게는 「0.5× SSC, 0.1% SDS, 42℃」정도의 조건, 더욱더 엄격하게는 「0.1× SSC, 0.1% SDS, 65℃」정도의 조건을 들 수 있다.The specific binding means that non-specific hybrids are not formed, but specific hybrids are formed, and the strict hybridization conditions can be determined based on the melting temperature (Tm) of the nucleic acid forming the hybrids according to a conventional method. have. As a washing condition that can maintain a specific hybridization state, it is usually a condition of about 1 × SSC, 0.1% SDS, 37 ° C., more strictly, a condition of about 0.5 × SSC, 0.1% SDS, 42 ° C., and more stringent For example, the conditions of "0.1x SSC, 0.1% SDS, 65 degreeC" are mentioned.

상기 프로브는 임의의 고형 기질에 고정화해 이용할 수도 있다. 상기 고형기질로는 유전자 칩 cDNA 마이크로 어레이, 올리고 DNA 어레이, 멤브레인 필터(membrane filter) 등이 포함된다.The probe can also be used by immobilization on any solid substrate. The solid substrates include gene chip cDNA micro array, oligo DNA array, membrane filter and the like.

상기 키트의 프라이머는 서열번호 4로 기재되는 센스 프라이머 및 서열번호 5로 기재되는 안티센스 프라이머로 구성된 프라이머쌍인 것이 바람직하나, 서열번호 1로 기재되는 핵산 서열을 증폭할 수 있는 15 내지 50 핵산 길이, 바람직하게는 15 내지 30 핵산 길이, 더욱 바람직하게는 18 내지 25 핵산 길이의 센스 및 안티센스 올리고뉴클레오티드는 모두 사용 가능하다:Primer of the kit is preferably a primer pair consisting of a sense primer described in SEQ ID NO: 4 and an antisense primer described in SEQ ID NO: 5, 15 to 50 nucleic acids in length that can amplify the nucleic acid sequence described in SEQ ID NO: 1, Preferably both sense and antisense oligonucleotides of 15 to 30 nucleic acids in length, more preferably 18 to 25 nucleic acids in length are available:

이때, 상기 키트는 PCR 반응의 요소로써 디옥시뉴클레오티드 혼합물(dNTP mixture) 및 완충용액을 추가로 포함할 수 있으며, Taq DNA 중합효소와 같은 열안정성 DNA 중합효소를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트에는 PCR 결과를 확인하는데 필요한 6-FAM, NED 또는 HEX 등의 형광물질, 아가로스와 전기영동 완충용액 등이 추가로 포함될 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 상기 증폭반응 요소가 상기 프라이머와의 사전혼합물(premix) 형태로 제공될 수 있다.In this case, the kit may further include a deoxynucleotide mixture (dNTP mixture) and a buffer as an element of a PCR reaction, and may further include a thermostable DNA polymerase such as Taq DNA polymerase. In addition, the kit of the present invention may further include a fluorescent material such as 6-FAM, NED or HEX, agarose and electrophoresis buffer solution required to confirm the PCR results. In addition, the kit of the present invention may be provided in the form of a premix of the amplification reaction element with the primer.

상기 키트는 추가로 정상 폐 세포를 포함할 수 있다.The kit may further comprise normal lung cells.

본 발명의 키트의 분석대상이 되는 임상시료는 생검시료 또는 혈액시료일 수 있고, 상기 생검시료는 과산소 노출에 의한 폐손상 진단의 경우 외과적 수술 도중 개체로부터 적취된 폐 조직일 수 있고, 과산소 노출에 의한 폐손상 진단의 경우 상기 폐손상이 의심되는 개체의 폐로부터 적취된 조직일 수 있다.The clinical sample to be analyzed of the kit of the present invention may be a biopsy sample or a blood sample, the biopsy sample may be lung tissue collected from the subject during surgical operation in the case of lung injury diagnosis due to the exposure to hyperoxia, and Diagnosis of lung injury by exposure to oxygen may be tissue collected from the lungs of the individual in whom the lung injury is suspected.

본 발명의 TAZ-/- 마우스의 폐 조직에서 유도된 폐섬유증(lung fibrosis) 증상은 과산소 노출에 의해 발생하는 폐섬유증과 매우 유사한 것으로 나타났고, 과산소 노출에 따른 폐손상시 발현이 변화한다고 알려진 상피 발생 관련 유전자, 성장 인자 및 염증성 사이토카인의 발현 또한 변화하며, 이는 과산소 노출에 의해 폐손상이 유발된 정상군 마우스 폐에서의 경향과 유사하였다. 또한, TAZ가 산화적 스트레스를 증가시키는 신호 경로에 작용하여 신호 분자들을 억제시킴으로써, 폐의 항상성 조절 기능을 갖는 것을 확인하였으므로, TAZ 유전자 또는 단백질은 과산소 노출에 의한 폐손상 진단 및 예후 예측용 키트에 유용하게 사용될 수 있다.
Pulmonary fibrosis symptoms induced in lung tissue of TAZ -/- mice of the present invention were found to be very similar to pulmonary fibrosis caused by peroxygen exposure, and the expression of pulmonary injury following peroxygen exposure changes. The expression of known epithelial development related genes, growth factors and inflammatory cytokines also changed, which was similar to the trend in normal mouse lungs where lung injury was induced by peroxygen exposure. In addition, since TAZ acts on a signal pathway that increases oxidative stress and inhibits signal molecules, it has been confirmed that TAZ gene or protein has a function of regulating lung homeostasis. It can be usefully used.

아울러, 본 발명은 과산소 노출에 의한 폐손상 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a protein detection method for providing information of the diagnosis of lung damage due to peroxygen exposure.

상기 검출 방법은 하기 단계를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:The detection method preferably includes, but is not limited to:

1) 실험군인 과산소 노출에 의한 폐손상이 의심되는 개체와 대조군인 과산소 노출에 의한 폐손상에 걸리지 않은 개체로부터 유래한 각각의 임상시료에서 TAZ 유전자 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및1) measuring the expression level of the TAZ gene or protein in each clinical sample derived from a subject suspected of pulmonary injury due to exposure to peroxygen in the experimental group and a subject not to lung injury from exposure to peroxygen in the control group; And

2) 단계 1)의 실험군과 대조군의 TAZ 발현수준을 비교하여 실험군의 TAZ 발현수준이 대조군에 비해 감소하는 경우 과산소 노출에 의한 폐손상 발병가능성이 있는 것으로 판정하는 단계.2) comparing the TAZ expression level of the experimental group and the control group of step 1) and determining that there is a possibility of developing lung damage due to peroxygen exposure when the TAZ expression level of the experimental group is decreased compared to the control group.

상기 방법에 있어서, 상기 과산소 노출에 의한 폐손상은 폐섬유증(fibrosis), 기관지폐이형성증(bronchopulmonary dysplasia) 및 만성폐쇄성폐질환(chronic obstructive pulmonary disease)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. In the method, the lung injury due to the exposure to peroxygen is preferably any one selected from the group consisting of pulmonary fibrosis, bronchopulmonary dysplasia and chronic obstructive pulmonary disease. It is not limited to this.

상기 방법에 있어서, 상기 단계 1)의 TAZ 유전자의 발현수준은 RT-PCR법, 실시간 RT-PCR법, 마이크로어레이법, 노던블랏(northern blotting), 유전자 발현의 연속 분석법(SAGE, serial Analysis of Gene Expression) 또는 RNase 보호분석법(RNase protection assay)을 통해 측정할 수 있고, 상기 TAZ 단백질의 발현수준은 웨스턴블랏(Western blotting), 효소-면역화학 검출법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 면역조직화학 염색법(immunohistochemical staining), 면역침강(immunoprecipitation) 또는 면역형광법(immunofluorescence)을 통해 측정할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.In the method, the expression level of the TAZ gene of step 1) is RT-PCR, real-time RT-PCR, microarray, northern blotting, continuous analysis of gene expression (SAGE, serial Analysis of Gene) Expression) or RNase protection assay (RNase protection assay), the expression level of the TAZ protein is Western blotting, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), immunohistochemistry It may be measured by staining (immunohistochemical staining), immunoprecipitation (immunoprecipitation) or immunofluorescence (immunofluorescence), but is not limited thereto.

본 발명이 적용가능한 개체는 인간을 포함한 척추동물이고 바람직하게는 포유동물이며, 그보다 바람직하게는 인간 또는, 쥐, 토끼, 기니아피그, 햄스터, 개, 고양이와 같은 실험동물이고, 가장 바람직하게는 인간 또는 침팬지, 고릴라와 같은 유인원류 동물이다.Subjects to which the invention is applicable are vertebrates, including humans, preferably mammals, more preferably humans or laboratory animals such as rats, rabbits, guinea pigs, hamsters, dogs, cats, most preferably humans Or anthropoid animals such as chimpanzees or gorillas.

상기 임상시료는 생검시료 또는 혈액시료일 수 있고, 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 또는 뇨일 수 있으며, 상기 생검시료는 과산소 노출에 의한 폐손상이 의심되는 개체의 폐으로부터 적취된 조직일 수 있다.The clinical sample may be a biopsy sample or a blood sample, and may be tissue, cells, whole blood, serum, plasma, saliva, cerebrospinal fluid or urine, and the biopsy sample is taken from the lungs of a subject suspected of pulmonary injury due to peroxygen exposure. It can be organized.

본 발명의 TAZ-/- 마우스의 폐 조직에서 유도된 폐섬유증(lung fibrosis) 증상은 과산소 노출에 의해 발생하는 폐섬유증과 매우 유사한 것으로 나타났고, 과산소 노출에 따른 폐손상시 발현이 변화한다고 알려진 상피 발생 관련 유전자, 성장 인자 및 염증성 사이토카인의 발현 또한 변화하며, 이는 과산소 노출에 의해 폐손상이 유발된 정상군 마우스 폐에서의 경향과 유사하였다. 또한, TAZ가 산화적 스트레스를 증가시키는 신호 경로에 작용하여 신호 분자들을 억제시킴으로써, 폐의 항상성 조절 기능을 갖는 것을 확인하였으므로, TAZ 유전자 또는 단백질은 과산소 노출에 의한 폐손상을 진단하고 예후를 예측하는데 유용하게 사용될 수 있다.
Pulmonary fibrosis symptoms induced in lung tissue of TAZ -/- mice of the present invention were found to be very similar to pulmonary fibrosis caused by peroxygen exposure, and the expression of pulmonary injury following peroxygen exposure changes. The expression of known epithelial development related genes, growth factors and inflammatory cytokines also changed, which was similar to the trend in normal mouse lungs where lung injury was induced by peroxygen exposure. In addition, since TAZ acts on a signal pathway that increases oxidative stress and inhibits signal molecules, it has been shown that TAZ genes or proteins have lung homeostatic control functions to diagnose lung damage and predict prognosis due to peroxygen exposure. It can be useful to

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
However, the following examples are illustrative of the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.

TAZTAZ -/- - / - 마우스 제조 및 유전자형 분석Mouse Preparation and Genotyping

<1-1> <1-1> TAZTAZ 유전자가 결핍된 마우스의 제조 Production of Gene Deficient Mice

TAZ 유전자가 녹아웃된 마우스를 제조하기 위해, 도 1에 나타낸 TAZ 유전자 녹아웃 카세트를 포함하는 TAZ 유전자 결손 벡터를 제조하여, 이를 전기천공법(electroporation)을 통해 C57BL/6j(Jackson Laboratory(Bar Harbor, ME) 마우스 유래의 배아줄기세포(ES)에 형질감염시켰다. 상기 ES 세포의 DNA에 대하여 서던 블랏(Southern blot) 분석을 실시하여 상기 벡터가 배아줄기 세포의 게놈(genome) 내에 삽입된 배아줄기세포만을 선별하였고, TAZ 유전자 녹아웃 카세트의 도입이 확인된 ES 세포 클론을 C57BL/6j 암컷 마우스로부터 수득한 배반포(blastocyst)의 포배강(blastocoel)에 미세주입(microinjection)하여 이를 대리모 자궁에 이식하였다. 대리모로부터 출생한 키메라 생쥐는 배아줄기세포가 생식선으로 이행(germ line transmission)되었는지 여부를 확인하기 위해 다시 정상 마우스와 역교배시켰다. 그런 다음, TAZ 유전자 결손이 확인된 마우스 간의 교배를 통하여 완전하게 양쪽 유전자가 모두 결손된 동형접합체(TAZ-/-) 마우스를 제조하였다.
In order to prepare a mouse knocked out of the TAZ gene, a TAZ gene deletion vector comprising the TAZ gene knockout cassette shown in FIG. 1 was prepared, which was then subjected to electroporation to C57BL / 6j (Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Embryonic stem cells (ES) derived from the mouse were transfected, Southern blot analysis was performed on the DNA of the ES cells, and only embryonic stem cells into which the vector was inserted into the genome of the embryonic stem cells. ES cell clones which were selected for introduction of the TAZ gene knockout cassette were microinjected into the blastocoel of the blastocyst obtained from C57BL / 6j female mice and transplanted into the surrogate mother's womb. Born chimeric mice were backcrossed with normal mice again to determine whether embryonic stem cells had germ line transmission. Then, homozygous (TAZ − / − ) mice were prepared in which both genes were completely deleted by crossing between mice in which the TAZ gene deletion was confirmed.

<1-2> 마우스의 유전자형 분석<1-2> Genotype Analysis of Mice

실험에 사용된 마우스의 유전자형을 분석하기 위해, 2.5 내지 3주령의 마우스로부터 수득한 꼬리를 55℃의 꼬리용해버퍼(tail lysis buffer)(Tris 100 mM, NaCl 200 m M, SDS 0.2%, EDTA 5 mM, 및 100 ㎍/㎖ proteinase K)에서 용해시켰다. 하룻 밤 뒤, 이를 원심분리하여(12000 rpm, 4℃, 10분) 상층액을 새로운 튜브에 옮기고, DNA 침전을 위해 여기에 동량의 아이소프로판올(isopropanol)을 첨가하였다. 그런 다음, 부드럽게 위아래로 뒤집어 섞어주었다. DNA 침전물을 70% 에탄올로 옮기고 혼합한 후, DNA를 TE로 용출하였다. 용출된 DNA는 55℃에서 2 내지 3시간 동안 방치한 뒤 유전자형 분석을 위한 PCR에 사용하였다. TAZ-/- 마우스를 확인하기 위해, PCR은 KS-Neo-R: 5'-GGAGAACCTGCGTGCAATCCATC-3'(서열번호 3), TAZ-GP2: 5'-ATGGGACAGTCCGGGAG-3'(서열번호 4), 및 TAZ-GP3: 5'-GTGCAAGTCAGAGGAGG-3'(서열번호 5) 프라이머를 사용하여, 94℃에서 3분 수행한 후, 94℃에서 30초, 59℃에서 1분 및 72℃에서 30초를 34 사이클 반복한 다음, 72℃에서 10분간 수행하였다. 증폭된 유전자 단편의 크기는 1× TAE 버퍼(Tris/Acetate/EDTA)에서 1% 아가로스 겔로 확인하였다(정상군: 510 bp, TAZ-/-: 800bp).
In order to analyze the genotype of mice used in the experiment, tails obtained from 2.5 to 3 week old mice were subjected to a tail lysis buffer (Tris 100 mM, NaCl 200 mM, SDS 0.2%, EDTA 5) at 55 ° C. mM, and 100 μg / ml proteinase K). After overnight, it was centrifuged (12000 rpm, 4 ° C., 10 minutes) and the supernatant was transferred to a new tube and an equal amount of isopropanol was added thereto for DNA precipitation. Then gently mix upside down. The DNA precipitate was transferred to 70% ethanol and mixed, after which the DNA was eluted with TE. The eluted DNA was left at 55 ° C. for 2-3 hours and then used for PCR for genotyping. To identify TAZ -/- mice, PCR was performed using KS-Neo-R: 5'-GGAGAACCTGCGTGCAATCCATC-3 '(SEQ ID NO: 3), TAZ-GP2: 5'-ATGGGACAGTCCGGGAG-3' (SEQ ID NO: 4), and TAZ -GP3: Using 5'-GTGCAAGTCAGAGGAGG-3 '(SEQ ID NO: 5) primer, perform 3 minutes at 94 ° C, then repeat 34 cycles of 30 seconds at 94 ° C, 1 minute at 59 ° C and 30 seconds at 72 ° C. Then, it was performed for 10 minutes at 72 ℃. The size of the amplified gene fragment was confirmed by 1% agarose gel in 1 × TAE buffer (Tris / Acetate / EDTA) (normal group: 510 bp, TAZ -/- : 800bp).

<1-3> 마우스 사육<1-3> mouse breeding

상기 실시예 <1-1>에서 제조한 TAZ 녹아웃 마우스(TAZ-/-), 및 정상군 마우스를 사료 및 물을 자유롭게 섭취하도록 하여 사육하였다. 모든 실험은 성별 및 나이가 일치하는 마우스를 이용하여 실시하였다.
TAZ knockout mice (TAZ -/- ) and normal mice prepared in Example <1-1> were reared to freely feed and water. All experiments were conducted using mice of matched gender and age.

<1-4> 마우스의 <1-4> of mouse 과산소And oxygen 노출 exposure

TAZ 녹아웃 마우스(TAZ-/-) 또는 정상군 마우스를, 충분한 유속의 95% O2로 포화된 챔버에서 24, 48 또는 72시간 동안 등압의 과산소에 노출시켰고, 대조군 마우스는 실내공기에 노출시켰다. 모든 동물 실험은 이화여자대학교의 이화 실험동물유전체센터의 가이드라인에 따라 실시되었고, IACUC의 승인을 받았다.
TAZ knockout mice (TAZ -/- ) or normal mice were exposed to isostatic peroxygen for 24, 48 or 72 hours in a chamber saturated with 95% O 2 at sufficient flow rate, and control mice were exposed to indoor air. . All animal experiments were conducted in accordance with the guidelines of the Ewha Womans University Animal Genetic Center and approved by IACUC.

TAZTAZ -/-- / - 마우스 폐에서  Mouse in the lungs TAZTAZ 발현의 확인 Confirmation of expression

<2-1> <2-1> TAZTAZ 유전자의 발현 확인 Identification of gene expression

TAZ-/- 마우스 폐에서의 TAZ 유전자의 발현을 확인하기 위해, 실시간 중합효소연쇄반응(real time polymerase chain reaction)을 실시하였다. TAZ-/- 마우스 또는 정상군 마우스의 폐 조직으로부터 TRIzol 시약을 사용하여 총 RNA를 분리하였고, 이를 superscriptⅡ reverse transcriptase(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용한 cDNA 합성에 사용하였다. 합성된 cDNA 및 TAZ 유전자에 대한 프라이머쌍(TAZ-F: 5'-GTCACCAACAGTAGCTCAGATC-3'(서열번호 6) 및 TAZ-R: 5'-AGTGATTACAGCCAGGTTAGAAAG-3'(서열번호 7)을 사용하여 ABI 7000 amplification system(Applide Biosystems)을 통해 실시간 PCR을 실시하였다. 각각의 mRNA의 상대적인 발현량은 β-엑틴의 발현 정도로 표준화한 후 측정하였다.To confirm the expression of the TAZ gene in the TAZ − / − mouse lungs, a real time polymerase chain reaction was performed. Total RNA was isolated from lung tissue of TAZ − / − mice or normal mice using TRIzol reagent and used for cDNA synthesis using superscriptII reverse transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA). ABI 7000 amplification using primer pairs for synthesized cDNA and TAZ genes (TAZ-F: 5'-GTCACCAACAGTAGCTCAGATC-3 '(SEQ ID NO: 6) and TAZ-R: 5'-AGTGATTACAGCCAGGTTAGAAAG-3' (SEQ ID NO: 7)) Real-time PCR was performed through the system (Applide Biosystems) The relative expression level of each mRNA was measured after normalizing the expression level of β-actin.

그 결과, 도 2의 B에 나타낸 바와 같이, TAZ-/- 마우스 폐에서 TAZ 유전자의 발현량은 정상군 마우스 폐에서의 발현량보다 현저히 감소한 것으로 나타났다(도 2의 B)
As a result, as shown in FIG. 2B, the expression level of the TAZ gene in the TAZ − / − mouse lungs was significantly reduced than that in the normal group lungs (FIG. 2B).

<2-2> <2-2> TAZTAZ 단백질의 발현 확인 Confirmation of Protein Expression

TAZ-/- 마우스 폐에서의 TAZ 단백질의 발현을 확인하기 위해, 웨스턴 블랏팅을 실시하였다. TAZ-/- 마우스 또는 정상군 마우스의 폐 조직으로부터 분리한 세포 용해물은 10% 글리세롤(glycerol), 50 mM 헤페스(Hepes)(pH 7.5), 0.1% 트리톤 X-100, 150 mM NaCl, 50 mM β-글리세롤 포스페이트(β-glycerol phosphate), 25 mM NaF, 20 mM EGTA(pH 8.0), 15 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1 mM Na3VO4, 1 mM PMSF, 및 프로테아제 억제제(protease inhibitor)가 포함된 버퍼에서 제조하였다. 단백질 함량은 브래드포드 분석(Bradford assay)을 통해 측정하였다. 하나의 레인당 30 ㎍의 동일한 양의 단백질을 7.5% 및 15% SDS-PAGE 젤에 로딩하였고, 나이트로셀룰로스 막(nitrocellulose membranes)(whatman international)으로 단백질을 옮긴 후, 3% 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA)-TBST(1 M Tris (pH 7.4), 4 M NaCl 및 20% 트윈 20)으로 1시간 동안 상온에서 블로킹하였다. TAZ 단백질에 대한 항체는 1% BSA-TBST에 희석하여 사용하였고, 상기 막은 4℃ 조건에서 하룻밤 동안 일차 항체와 함께 방치하였다. 막을 배양한 후 TBST로 3회 세척한 다음, 1시간 동안 상온에서 이차 항체(TBST에 1:10,000으로 희석)와 함께 방치하였다. 그런 다음, ECL 용액(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)을 사용하여 단백질 밴드를 현상하였다.Western blotting was performed to confirm expression of TAZ protein in TAZ − / − mouse lungs. Cell lysates isolated from lung tissue of TAZ -/- mice or normal mice were 10% glycerol, 50 mM Hepes (pH 7.5), 0.1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 50 mM β-glycerol phosphate, 25 mM NaF, 20 mM EGTA, pH 8.0, 15 mM MgCl 2 , 1 mM DTT, 1 mM Na 3 VO 4 , 1 mM PMSF, and protease inhibitors ) Was prepared in the buffer containing. Protein content was determined by Bradford assay. 30 μg of the same amount of protein per lane was loaded into 7.5% and 15% SDS-PAGE gels, and the protein was transferred to nitrocellulose membranes (whatman international), followed by 3% bovine albumin (bovine). Blocking was performed at room temperature for 1 hour with serum albumin, BSA) -TBST (1 M Tris (pH 7.4), 4 M NaCl and 20% Tween 20). Antibodies against TAZ protein were used diluted in 1% BSA-TBST and the membrane was left with primary antibody overnight at 4 ° C. The membrane was incubated three times with TBST, and then left with secondary antibody (diluted 1: 10,000 in TBST) at room temperature for 1 hour. The protein bands were then developed using ECL solution (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ).

그 결과, 도 2의 C에 나타낸 바와 같이, 정상군 마우스 폐에서는 TAZ 단백질이 발현되는 것으로 나타났으나, TAZ-/- 마우스 폐에서는 TAZ 단백질의 발현이 거의 확인되지 않았다(도 2의 C).
As a result, as shown in FIG. 2C, it was shown that the TAZ protein was expressed in the normal mouse lung, but the expression of the TAZ protein was hardly confirmed in the TAZ − / − mouse lung (FIG. 2C).

TAZTAZ -/-- / - 마우스 폐의 폐섬유화증 분석 Pulmonary Fibrosis Analysis in Mouse Lungs

<3-1> <3-1> TAZTAZ -/-- / - 마우스 폐 조직 슬라이드의 제작 Fabrication of Mouse Lung Tissue Slides

상기 실시예 <1-1>의 TAZ-/- 마우스, 및 정상군 마우스로부터 각각 폐를 분리하여, 폐 조직을 4℃에서 18시간 (또는 하룻밤) 동안 4% 파라포름알데하이드 용액에 고정하였다. 그런 다음, 폐 조직을 카세트에 옮기고, 5시간 동안 수돗물로 세척하여 건조한 후, 자일렌으로 교체하고 파라핀으로 교체하는 단계를 거친 다음, 폐 조직을 파라민에 포매하여 5 ㎛의 절편 슬라이드를 제작하였다.
Lungs were isolated from TAZ − / − mice, and normal mice of Example <1-1>, respectively, and lung tissue was fixed in 4% paraformaldehyde solution at 4 ° C. for 18 hours (or overnight). Then, the lung tissue was transferred to a cassette, washed with tap water for 5 hours, dried, and then replaced with xylene and paraffin, and then the lung tissue was embedded in paramin to prepare a slice of 5 μm. .

<3-2> 헤마톡실린 및 에오신 염색(<3-2> hematoxylin and eosin staining ( HematoxylinHematoxylin andand eosineosin stainingstaining )을 통한 폐 조직의 분석Analysis of lung tissue

상기 실시예 <2-1>에서 제작한, 폐 조직이 고정된 슬라이드를 60℃에서 20분간 배양하였다. 그런 다음, 파라민을 제거하기 위해 각각 10분씩 3회에 걸쳐 상기 슬라이드를 자일렌에 담가 두었다. 그 후, 100% 에탄올에 5분, 90% 에탄올에 5분, 80% 에탄올에 5분, 및 증류수에 5분간 방치하여 재수화 단계를 실시하였다. 염색은 헤마톡실린에서 10분간 수행한 후, 10분간 수돗물에서 세척하였고, 몇 초간 1% 염화수소가 담긴 70% 에탄올에 방치한 후, 5분간 수돗물에서 다시 세척한 다음, 1분간 에오신을 처리하였다. 그 후, 80% 에탄올에 2분, 90% 에탄올에 2분, 100% 에탄올에 2분, 및 자일렌에 3분간 3회 방치하여 탈수 단계를 실시하였다. 그런 다음, 마운팅 용액(mounting solution) 및 캐나다 발삼(Canada valsam)(Fluka chemika, Buchs, Switzerland)을 사용하여 20분 이상 공기 중에 건조시키고, 커버 글라스로 덮어주었다.The slide prepared in Example <2-1>, to which lung tissue was fixed, was incubated at 60 ° C. for 20 minutes. The slides were then soaked in xylene three times for 10 minutes each to remove paramin. Thereafter, 5 minutes in 100% ethanol, 5 minutes in 90% ethanol, 5 minutes in 80% ethanol, and 5 minutes in distilled water to perform a rehydration step. Staining was performed in hematoxylin for 10 minutes, washed in tap water for 10 minutes, left in 70% ethanol containing 1% hydrogen chloride for a few seconds, washed again in tap water for 5 minutes, and then treated with eosin for 1 minute. Thereafter, 2 minutes in 80% ethanol, 2 minutes in 90% ethanol, 2 minutes in 100% ethanol, and 3 minutes in xylene were left three times to perform a dehydration step. It was then dried in air for at least 20 minutes using a mounting solution and Canada valsam (Fluka chemika, Buchs, Switzerland) and covered with a cover glass.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, TAZ-/- 마우스의 폐는 정상군 마우스에 비해 부피가 크고 표면 및 조직구성의 손상이 나타나는 폐섬유화증의 증상이 확인되었다(도 2의 A). 또한, H&E 염색을 통해 폐 조직을 확인한 결과, 기도 상피세포에 염색된 정도는 TAZ-/- 마우스와 정상군 마우스에서 유의적인 차이가 나타나지 않았으나, TAZ-/- 마우스 폐의 폐포벽(alveolar walls)은 심하게 파괴된 것으로 나타났다. 이때, 24주령 TAZ-/- 마우스의 폐는 9주령 마우스의 폐에서보다 염증이 더욱 심하게 나타난 것으로 확인되어 나이가 많을수록 폐섬유화증이 심화되는 경향을 나타냈다(도 2의 D).
As a result, as shown in Fig. 2, the lungs of TAZ -/- mice were confirmed to have symptoms of pulmonary fibrosis in which the lungs of the TAZ -/- mice were larger in volume and damaged in surface and tissue composition (Fig. 2A). In addition, as a result of confirming lung tissue through H & E staining, the degree of staining on airway epithelial cells was not significantly different between TAZ -/- mice and normal mice, but the alveolar walls of TAZ -/- mouse lungs were It appeared to be badly destroyed. At this time, the lungs of 24-week - old TAZ -/- mice were found to be more severely inflamed than the lungs of 9-week-old mice, indicating that pulmonary fibrosis was intensified with age (FIG. 2D).

<3-3> 상피 구조 관련 <3-3> Epithelial Structure Related 마커Marker 유전자 및 염증성 사이토카인 발현의 확인 Identification of gene and inflammatory cytokine expression

상기와 같이, TAZ-/- 마우스 폐의 표현형에 기초하여, 인간의 말단부 전달기도(distal conducting airway)의 정상 상피의 유지에 결정적인 역할을 하는 것으로 알려진 다양한 상피 구조 관련 마커 유전자들의 발현과 염증성 사이토카인의 발현을 확인하기 위해, 정량적 실시간 PCR을 실시하였다. 9주령의 TAZ-/- 마우스 또는 정상군 마우스 폐 조직으로부터 TRIzol 시약을 사용하여 총 RNA를 분리하였고, 올리고(dT) 프라이머를 사용하여 역전사를 실시하여 상기 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. SYBR Green PCR Master Mix를 사용하여 ABI 7000 amplification system(Applide Biosystems)을 통해 정량적 실시간 PCR은 실시하였다. 이때, 하기 표 1에 기재된 상피 계면활성제 단백질 및 염증성 사이토카인에 대한 프라이머쌍을 사용하였다.As described above, based on the phenotype of the TAZ -/- mouse lungs, the expression of inflammatory cytokines and the expression of various epithelial structure-related marker genes known to play a critical role in the maintenance of normal epithelium of the human terminal conducting airway. In order to confirm the expression of quantitative real-time PCR was performed. Total RNA was isolated from 9-week-old TAZ -/- or normal mouse lung tissue using TRIzol reagent, and cDNA was synthesized from the RNA by reverse transcription using oligo (dT) primers. Quantitative real-time PCR was performed using AY 7000 amplification system (Applide Biosystems) using SYBR Green PCR Master Mix. At this time, primer pairs for epithelial surfactant proteins and inflammatory cytokines described in Table 1 were used.

프라이머primer 서열(5'-3')The sequence (5'-3 ') 서열번호SEQ ID NO: TAZ forward TAZ forward GTCACCAACAGTAGCTCAGATC GTCACCAACAGTAGCTCAGATC 66 TAZ reverse TAZ reverse AGTGATTACAGCCAGGTTAGAAAGAGTGATTACAGCCAGGTTAGAAAG 77 SP-A forwardSP-A forward GCTGTCAGTGGGGGATAAAGGCTGTCAGTGGGGGATAAAG 88 SP-A reverse SP-A reverse CTTTGTAATGCTTGCGATGGCTTTGTAATGCTTGCGATGG 99 SP-B forwardSP-B forward CTTGTCCTCCGATGTTCCACCTTGTCCTCCGATGTTCCAC 1010 SP-B reverseSP-B reverse GGCCTGGTTGATCACAGACTGGCCTGGTTGATCACAGACT 1111 SP-C forwardSP-C forward CAGCTCCAGGAACCTACTGCCAGCTCCAGGAACCTACTGC 1212 SP-C reverseSP-C reverse GCTTAGAGGTGGGTGTGGAGGCTTAGAGGTGGGTGTGGAG 1313 SP-D forwardSP-D forward GAGGTTGCCTTCTCCCACTAGAGGTTGCCTTCTCCCACTA 1414 SP-D reverseSP-D reverse AGCCTGTTTGCACATCTCCTAGCCTGTTTGCACATCTCCT 1515 CCSP forwardCCSP forward CATCATGAAGCTCACGGAGACATCATGAAGCTCACGGAGA 1616 CCSP reverseCCSP reverse GAGACACAGGGCAGTGACAAGAGACACAGGGCAGTGACAA 1717 VEGF forwardVEGF forward TCACCAAAGCCAGCACATAGTCACCAAAGCCAGCACATAG 1818 VEGF reverseVEGF reverse AATGCTTTCTCCGCTCTGAAAATGCTTTCTCCGCTCTGAA 1919 FGF2 forwardFGF2 forward CCAACCGGTACCTTGCTATGACCAACCGGTACCTTGCTATGA 2020 FGF2 reverseFgf2 reverse TTCGTTTCAGTGCCACATACCATTCGTTTCAGTGCCACATACCA 2121 beta-catenin forward beta-catenin forward GGCAGCAGCAGTCTTACTTGGGCAGCAGCAGTCTTACTTG 2222 beta-catenin reverse beta-catenin reverse AAGGACTGGGAAAAGCCTTGAAGGACTGGGAAAAGCCTTG 2323 HNF3a forward HNF3a forward CCCTTTCTCCCTTTCACTCCCCCTTTCTCCCTTTCACTCC 2424 HNF3a reverseHNF3a reverse GTGGTGGGCCTAACAACAACGTGGTGGGCCTAACAACAAC 2525 FoxA2 forwardFoxA2 forward GCCAGCGAGTTAAAGTATGCGCCAGCGAGTTAAAGTATGC 2626 FoxA2 reverseFoxa2 reverse TCATGTTGCTCACGGAAGAGTCATGTTGCTCACGGAAGAG 2727 HIF-1a forwardHIF-1a forward GTTTACTAAAGGACAAGTCACC GTTTACTAAAGGACAAGTCACC 2828 HIF-1a reverseHIF-1a reverse TTCTGTTTGTTGAAGGGAGTTCTGTTTGTTGAAGGGAG 2929 HIF-2a forwardHIF-2a forward GTCACCAGAACTTGTGCGTCACCAGAACTTGTGC 3030 HIF-2a reverseHIF-2a reverse CAAAGATGCTGTTCATGGCAAAGATGCTGTTCATGG 3131 IL-6 forwardIL-6 forward GAGGATACCACTCCCAACAGACCGAGGATACCACTCCCAACAGACC 3232 IL-6 reverseIL-6 reverse AAGTGCATCATCGTTGTTCATACAAAGTGCATCATCGTTGTTCATACA 3333 TNFa forwardTNFa forward CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAACATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA 3434 TNFa reverseTNFa reverse TGGGAGTAGACAAGGTACAACCCTGGGAGTAGACAAGGTACAACCC 3535 MCP1 forwardMCP1 forward CTTCTGGGCCTGCTGTTCACTTCTGGGCCTGCTGTTCA 3636 MCP1 reverseMCP1 reverse CCAGCCTACTCATTGGGATCACCAGCCTACTCATTGGGATCA 3737 Nrf2 forwardNrf2 forward CTCCCAGGTTGCCCACATTCCTCCCAGGTTGCCCACATTC 3838 Nrf2 reverseNrf2 reverse CCTGCCAAACTTGCTCCATGCCTGCCAAACTTGCTCCATG 3939 Srx forwardSrx forward TCACCATTGTGGCAAGTGTTTCACCATTGTGGCAAGTGTT 4040 Srx reverseSrx reverse GTGCCCACAGAGCCTAGAAGGTGCCCACAGAGCCTAGAAG 4141 beta-actin forward beta-actin forward AGAGGGAAATCGTGCGTGACAGAGGGAAATCGTGCGTGAC 4242 beta-actin reversebeta-actin reverse CAATAGTGATGACCTGGCCGTCAATAGTGATGACCTGGCCGT 4343

그 결과, 도 3a, b, 및 c에 나타낸 바와 같이, TAZ-/- 마우스 폐에서의 대부분의 상피 구조 관련 마커 유전자들은 정상군에 비해 발현이 감소되는 것으로 나타났다. 계면활성제 단백질 A, B, C, 및 D, 클라라 세포 분비 단백질(clara cell secretory protein)의 발현량은 정상군 마우스 폐에 비해 TAZ-/- 마우스 폐에서 감소하는 것으로 나타났고(도 3a), TAZ-/- 마우스 폐에서의 혈관내피성장인자(Vascular Endothelial growth factor, VEGF), 섬유아세포 성장인자-2(Fibroblast growth Factor-2, FGF-2), 베타-카테닌(β-catenine), 간세포핵인자 3(Hepatocyte Nuclear Factor 3, HNF3), 포크헤드 박스 A2(Forkhead box A2, FOXA2) 및 저산소증 유도성 인자(Hypoxia inducible factor 2-a, HIF2-a)의 발현도 정상군에서보다 감소하였다(도 3b). 한편, TAZ-/- 마우스 폐에서의 염증성 사이토카인인 인터루킨-6(interleukin-6, IL-6), 종양괴사인자-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α) 및 인간 단핵구 화학주성 단백질-1(monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)의 발현량은 정상군에 비해 유의적으로 감소하였다(도 3c).
As a result, as shown in Figures 3a, b, and c, it was shown that most epidermal structure-related marker genes in TAZ -/- mouse lungs were reduced in expression compared to the normal group. The expression levels of surfactant proteins A, B, C, and D, and clara cell secretory protein were found to decrease in TAZ − / − mouse lungs compared to normal mouse lungs (FIG. 3A), and TAZ - / - mice vascular endothelial growth factor (vascular endothelial growth factor, VEGF) , fibroblast growth factor -2 (fibroblast growth factor-2, FGF-2), in the closed beta-catenin (β-catenine), hepatocyte nuclear factor The expression of Hepatocyte Nuclear Factor 3 (HNF3), Forkhead box A2 (FOXA2) and Hypoxia inducible factor 2-a (HIF2-a) were also reduced than in the normal group (Figure 3b). ). On the other hand, TAZ -/- inflammatory cytokines, interleukin-6 (IL-6), tumor necrosis factor-α (TNF-α) and human monocyte chemotactic proteins in mouse lungs- Expression level of 1 (monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1) was significantly reduced compared to the normal group (Fig. 3c).

과산소And oxygen 노출된 마우스의 폐섬유화증과  Pulmonary fibrosis in exposed mice TAZTAZ 와의 관련성 확인Confirm relevance with

<4-1> <4-1> 과산소And oxygen 노출된 정상군 마우스 폐의 조직학적 분석 Histological Analysis of Exposed Mouse Lungs

상기 실시예 <1-4>의 방법에 따라 과산소가 노출된 정상군 마우스의 폐 조직을 상기 실시예 <3-2>의 H&E 염색을 실시하여 조직학적으로 분석하였다.According to the method of Example <1-4>, the lung tissue of the normal group mice exposed to the peroxygen was subjected to H & E staining of Example <3-2> and analyzed histologically.

그 결과, 도 4의 A에 나타낸 바와 같이, 과산소에 72시간 동안 노출됨으로써, 9주령의 정상군 마우스는 폐섬유화증의 표현형을 나타내는 것으로 확인되었다(도 4의 A).
As a result, as shown in FIG. 4A, by exposure to peroxygen for 72 hours, it was confirmed that 9-week-old mice exhibited a phenotype of pulmonary fibrosis (FIG. 4A).

<4-2> <4-2> 과산소And oxygen 노출에 의한 상피 구조 관련  Epithelial structure related to exposure 마커Marker 유전자 및 염증성 사이토카인 발현 변화의 확인 Identification of Gene and Inflammatory Cytokine Expression Changes

상기 실시예 <3-3>의 방법에 따라, 72시간 동안 과산소에 노출된 TAZ-/- 마우스 또는 정상군 마우스 폐에서의 외피세포 발생 단백질(CCSP 및 SP-C), 및 세포 발생 인자(FGF-2 및 VEGF)의 유전자 발현을 확인하였다. According to the method of Example <3-3>, the envelope cell development proteins (CCSP and SP-C), and cell development factors in the lungs of TAZ -/- or normal group mice exposed to peroxygen for 72 hours Gene expression of FGF-2 and VEGF) was confirmed.

그 결과, 도 4의 B 및 도 5에 나타낸 바와 같이, 과산소 노출되지 않은 대조군에 비해 과산소에 노출되어 폐섬유화증이 유도된 정상군 마우스에서 CCSP, SP-C, FGF-2 및 VEGF의 발현이 감소된 것으로 나타났고(도 4의 B), 과산소에 노출된 TAZ-/- 마우스 폐에서의 CCSP, SP-C, FGF-2 및 VEGF의 발현량은 과산소에 노출되지 않은 TAZ-/- 마우스 또는 과산소에 노출된 정상군 마우스의 폐에서보다 현저히 낮은 것을 확인하였다(도 6).
As a result, as shown in FIG. 4B and FIG. 5, CCSP, SP-C, FGF-2 and VEGF were detected in the normal group mice exposed to peroxygen and induced pulmonary fibrosis compared to the control group that was not exposed to peroxygen. Expression was reduced (FIG. 4B), and TAZ − / − exposed to peroxygen and the expression levels of CCSP, SP-C, FGF-2 and VEGF in mouse lungs were not affected by TAZ − It was confirmed that /-or significantly lower than the lungs of the normal group mice exposed to peroxygen (Fig. 6).

<4-3><4-3> 과산소And oxygen 노출된 정상군 마우스 폐에서  In exposed normal mouse lungs TAZTAZ 발현의 확인 Confirmation of expression

과산소 노출된 정상군 마우스 폐에서의 TAZ의 발현을 확인하기 위해, 상기 <실시예 2>의 방법에 따라, 실시간 PCR 및 웨스턴 블랏을 실시하였다.Normal mice exposed to peroxygen In order to confirm the expression of TAZ in the lung, real-time PCR and western blot were performed according to the method of <Example 2>.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 과산소 노출된 정상군 마우스 폐에서는 TAZ 단백질 및 유전자의 발현이 감소한 것을 확인하였다. 이때, 단시간(24 또는 48시간) 동안 과산소에 노출된 경우에는 TAZ 단백질의 발현이 대조군 마우스와 유의적인 차이가 없었으나, 과산소에 72시간 동안 노출된 경우에는 TAZ 단백질의 발현이 대조군 마우스에 비해 유의적으로 감소하는 것으로 확인되었다(도 5의 A 및 B).As a result, as shown in FIG. 5, it was confirmed that the expression of TAZ protein and genes was decreased in the normal group lungs exposed to the oxygen. At this time, the expression of TAZ protein was not significantly different from that of control mice when exposed to peroxygen for a short time (24 or 48 hours). It was found to decrease significantly compared to (A and B of Figure 5).

과산소And oxygen 노출된 세포와  Exposed cells TAZTAZ 의 관련성 확인Relevance of

<5-1> 세포 배양<5-1> cell culture

폐섬유화증과 같은 폐 상피 병원체 연구에 사용되는, 선암 인간 폐포 기저 상피세포인(adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cell) A549 세포를 미국 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection, ATCC, Rockville, MD, U.S.A.)으로부터 구입하여, 100 U/㎖ 페닐실린(penicillin), 100 ㎎/㎖ 스트렙토마이신(streptomycin) 및 10% 우태아혈청이 첨가된 RPBI 1640(GIBCO, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 배양하였다. TAZ가 녹다운된 A549 세포(Ti)는 TAZ를 녹다운시키기 위해 설계된 siRNA 올리고뉴클레오티드를 형질도입하여 제작하였다. 마우스 배아 섬유아세포(Mouse embryo fibroblasts, MEFs)는 TAZ-/- 마우스 또는 정상군 마우스로부터 분리한 일차 MEF를 불멸화하여 제작하였고(MEFs TAZ-/-, MEFs WT), 100 U/㎖ 페닐실린, 100 ㎎/㎖ 스트렙토마이신 및 10% 우태아혈청이 첨가된 DMEM(Dulbeco's modified Eagles medium, GIBCO)에서 배양하였다.
Adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells, A549 cells, used for the study of pulmonary epithelial pathogens such as pulmonary fibrosis, were obtained from the American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). It was purchased and cultured in RPBI 1640 (GIBCO, Invitrogen, Carlsbad, Calif., USA) to which 100 U / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin and 10% fetal calf serum were added. T549 knocked down A549 cells (Ti) were constructed by transducing siRNA oligonucleotides designed to knock down TAZ. Mouse embryo fibroblasts (MEFs) were prepared by immortalizing primary MEFs isolated from TAZ − / − mice or normal mice (MEFs TAZ − / − , MEFs WT), 100 U / ml phenylsilin, 100 Cultured in DMEM (Dulbeco's modified Eagles medium, GIBCO) with mg / ml streptomycin and 10% fetal calf serum.

<5-2> <5-2> 과산소And oxygen 노출된 A549 세포의  Of exposed A549 cells TAZTAZ 단백질의 발현 확인 Confirmation of Protein Expression

A549 세포를 1.5×105 세포수/㎖의 농도로 6 웰 배양 접시에서 37℃의 95% O2 조건하에서 배양하였다. 세포를 37℃의 5% CO2 및 95% O2 환경하에서 48시간 동안 과산소에 노출시킨 뒤, 세포 용해물에 대해 TAZ 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 실시하여 TAZ 단백질 발현을 확인하였다. 이때, 대조군은, 세포를 37℃의 5% CO2 및 95% 대기 환경하에서 배양하였다.A549 cells were cultured under 95% O 2 conditions at 37 ° C. in 6 well culture dishes at a concentration of 1.5 × 10 5 cells / ml. Cells were exposed to peroxygen for 48 hours in a 37% 5% CO 2 and 95% 0 2 environment and then subjected to western blot using TAZ antibody to cell lysates to confirm TAZ protein expression. At this time, the control group, the cells were cultured in 37% 5% CO 2 and 95% atmospheric environment.

그 결과, 도 5의 C에 나타낸 바와 같이, 과산소 노출된 A549 세포는, 과산소에 노출되지 않은 대조군 세포에 비해 TAZ 단백질의 발현이 감소하는 것으로 나타났다(도 5의 C).
As a result, as shown in FIG. 5C, the expression of TAZ protein was decreased in A549 cells exposed to hyperoxia compared to control cells not exposed to hyperoxia (FIG. 5C).

<5-3> <5-3> 과산소And oxygen 노출된 세포의 세포증식 변화 확인 Confirmation of Cell Proliferation Changes in Exposed Cells

상기 실시예 <5-1>에서 배양한 A549, Ti, MEFs WT 또는 MEFs TAZ-/-세포를 3×105 세포수/웰의 농도로 6 웰 배양 접시의 10% 우태아혈청이 포함된 RPMI 배지에서 배양하여, 37℃의 95% O2 조건하에서 24 또는 48시간 동안 과산소에 노출시켰다. 그런 다음, 트립신/EDTA를 사용하여 A549 세포를 배양 접시로부터 수득하여 헤마토사이토미터(hematocytometer)로 세포수를 측정하였다. 또한, 세포증식을 분석하기 위해, CFSE 염색을 실시하였다. 0.1% BSA가 포함된 PBS에 A549 세포를 1×107 세포수/㎖의 농도로 준비하고, 이를 37℃에서 10분간 5 μM 카르복시플루어레세인 디아세테이트(carboxyfluorescein diacetate) 및 숙신이미딜 에스터(succinimidyl ester, CFSE)와 함께 배양하였다. 배양 후 반응을 종결하기 위해, PBS를 첨가하고 10% FBS가 포함된 RPMI로 세척하였다. 그런 다음, 세포를 과산소 또는 정상 상태하에서 배양하였다. 배양 후 24, 48 및 72시간 후, 세포를 수득하여 CFSE의 검출을 위해 유세포분석(flow cytometry)을 실시하였다. 형광 활성 세포분석(fluorescence activated cell sorting, FACS) 결과는 CellQuest software(Becton Dickinson, CA, USA)를 사용하여 분석하였다. RPMI containing 10% fetal bovine serum in a 6 well culture dish of A549, Ti, MEFs WT or MEFs TAZ -/- cells cultured in Example <5-1> at a concentration of 3 × 10 5 cells / well Cultured in media was exposed to peroxygen for 24 or 48 hours under 95% O 2 conditions at 37 ° C. Then, A549 cells were obtained from the culture dish using trypsin / EDTA and the cell number was measured by a hematocytometer. In addition, CFSE staining was performed to analyze cell proliferation. A549 cells were prepared in a PBS containing 0.1% BSA at a concentration of 1 × 10 7 cells / ml, and 5 μM carboxyfluorescein diacetate and succinimidyl ester at 37 ° C. for 10 minutes. ester, CFSE). To terminate the reaction after incubation, PBS was added and washed with RPMI with 10% FBS. The cells were then cultured under peroxygen or steady state. 24, 48 and 72 hours after incubation, cells were obtained and subjected to flow cytometry for detection of CFSE. Fluorescence activated cell sorting (FACS) results were analyzed using CellQuest software (Becton Dickinson, CA, USA).

그 결과, 도 7 및 8에 나타낸 바와 같이, A549 세포의 세포수 측정을 통해, 과산소에 노출된 A549 세포는 세포수가 급격히 감소한 것으로 확인되었고(도 7의 A 및 B), CFSE 염색을 통해, 과산소에 의해 유도된 폐섬유화증은 상피세포 증식을 감소시키는 것으로 확인되었다(도 8의 A). 한편, 과산소에 노출된 TAZ 녹다운 Ti 세포(도 8의 D)는 대조군인 BP 세포에 비해 유의적인 상피세포 증식 감소가 나타나지 않았으나(도 8의 B), 정상상태에 노출된 MEFs TAZ-/- 세포의 세포증식은 정상군의 MEF 세포에 비해 감소하였다(도 8의 C). 즉, TAZ 결핍에 의한 폐섬유증은 과산소에 노출되어 유도된 폐섬유증은 같이, 상피세포 증식이 억제됨을 확인하였다.
As a result, as shown in Figures 7 and 8, through the measurement of the number of A549 cells, A549 cells exposed to the peroxygen was confirmed that the number of cells sharply reduced (A and B in Figure 7), through CFSE staining, Pulmonary fibrosis induced by peroxygen was found to reduce epithelial cell proliferation (FIG. 8A). On the other hand, TAZ knocked down Ti cells exposed to peroxygen (D in FIG. 8) did not show a significant decrease in epithelial cell proliferation compared to control BP cells (FIG. 8B), but the MEFs TAZ − / − exposed to steady state. Cell proliferation was reduced compared to normal group MEF cells (FIG. 8C). In other words, pulmonary fibrosis due to TAZ deficiency was also confirmed that the pulmonary fibrosis induced by exposure to peroxine inhibits epithelial cell proliferation.

과산소And oxygen 노출된 정상군 마우스 및  Exposed normal mice and TAZTAZ -/-- / - 마우스의 폐섬유화증 비교 Comparison of Pulmonary Fibrosis in Mice

과산소는 퍼록사이드(peroxide)의 세포내 수준을 증가시킴으로써 Nrf-2 의존적인 술피레독신(sulfiredoxin, Srx) 발현 유도를 증가시킨다고 보고되었고, 이는 과산소 노출된 폐에서 퍼록시레독신 Ⅲ(PrxⅢ)가 분해되어 술포닉 형태로의 산화를 통한 것이라고 알려져 있으므로, TAZ-/- 마우스의 폐에서의 Srx 발현 및 Prx 술피닐화(sulfinylation)를 확인하고자 하였다. 먼저, 3일 동안 과산소에 노출된 정상군 마우스와 정상 상태의 정상군 마우스의 폐 조직으로부터 분리된 50 ㎍의 단백질과, Srx, 2-Cys Prx-SO3 및 β-엑틴에 특이적인 각각의 항체를 사용하여 면역블랏 분석을 실시하였다. 또한, TAZ-/- 마우스 또는 정상군 마우스의 폐로부터 총 RNA를 분리하여, Nrf2, Srx 및 β-엑틴 mRBA에 특이적인 각각의 프라이머쌍을 사용하여 실시간 PCR을 실시하였고, TAZ-/- 마우스 또는 정상군 마우스의 폐로부터 50 ㎍의 단백질을 분리하여 상기와 같이, 면역블랏 분석을 실시하여 Srx 및 Prx-SO3의 발현을 확인하고자하였다. Peroxide has been reported to increase the induction of Nrf-2 dependent sulfiredoxin (Srx) expression by increasing intracellular levels of peroxide, which is known as peroxyredoxin III (PrxIII) in peroxex-exposed lungs. ) Is known to be degraded through oxidation to a sulfonic form, and therefore, Srx expression and Prx sulfinylation in the lungs of TAZ − / − mice were examined. First, 50 μg of protein isolated from lung tissue of normal and normal mice exposed to peroxic acid for 3 days, and specific to Srx, 2-Cys Prx-SO 3 and β-actin, respectively. Immunoblot analysis was performed using the antibodies. In addition, total RNA was isolated from the lungs of TAZ − / − mice or normal mice, and real time PCR was performed using respective primer pairs specific for Nrf2, Srx and β-actin mRBA, and TAZ − / − mice or 50 μg of protein was isolated from the lungs of the normal group mice and immunoblot analysis was performed to confirm the expression of Srx and Prx-SO 3 .

그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 과산소 상태에서 유도된다고 알려진 Srx 및 Prx-SO3 발현 수준은, 대조군에 비해 과산소에 노출된 정상군 마우스 폐에서 증가한 것으로 나타났고(도 9의 A), 과산소에 노출되지 않은 TAZ -/- 마우스의 폐에서도 Srx 및 Prx-SO3 유전자 및 단백질의 발현이 정상군 마우스에서보다 증가하였으며,(도 9의 C 및 D), Nrf2의 발현 역시 정상군보다 TAZ -/- 마우스의 폐에서 증가하였다(도 9의 B).As a result, as shown in FIG. 9, Srx and Prx-SO 3 expression levels, which are known to be induced in the peroxygen state, were found to be increased in the normal group lungs exposed to peroxygen compared to the control group (FIG. 9A). The expression of Srx and Prx-SO 3 genes and proteins was increased in the lungs of TAZ -/- mice that were not exposed to hyperoxia than in normal mice (C and D in FIG. 9), and Nrf2 expression was also normal. More increased in the lungs of TAZ − / − mice (FIG. 9B).

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Claims (13)

삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 1) TAZ 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 상기 TAZ 단백질를 암호화하는 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브;
2) IL-6, TNF-α 또는 MCP-1 로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 상기 단백질들을 암호화하는 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브; 및
3) 설피레독신(Srx) 또는 퍼록시레독신-SO3(Prx-SO3) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 상기 단백질들을 암호화하는 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 과산소 노출에 의한 폐섬유증 진단용 키트.
1) an antibody that specifically binds to a TAZ protein, or a primer or probe that specifically binds to a nucleic acid encoding the TAZ protein;
2) an antibody that specifically binds to at least one protein selected from the group consisting of IL-6, TNF-α or MCP-1, or a primer or probe that specifically binds to a nucleic acid encoding the proteins; And
3) an antibody that specifically binds to sulfyredoxin (Srx) or peroxyredoxin-SO 3 (Prx-SO 3 ) protein, or a primer or probe that specifically binds to a nucleic acid encoding the proteins. Kit for diagnosing pulmonary fibrosis due to peroxygen exposure.
1) 실험군인 과산소 노출에 의한 폐섬유증이 의심되는 개체와 대조군인 과산소 노출에 의한 폐섬유증에 걸리지 않은 개체로부터 유래한 각각의 임상시료에서
ⅰ) TAZ 유전자 또는 단백질의 발현수준;
ⅱ) IL-6, TNF-α 또는 MCP-1 로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현수준; 및
ⅲ) 설피레독신 또는 퍼록시레독신 술피닐화를 측정하는 단계;
2) 단계 1)의 실험군과 대조군의 발현수준을 비교하여
ⅰ) 실험군의 TAZ 발현수준이 대조군에 비해 감소하는 경우;
ⅱ) 실험군의 IL-6, TNF-α 또는 MCP-1로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 발현수준이 대조군에 비해 감소하는 경우; 및
ⅲ) 실험군의 설피레독신 또는 퍼록시레독신 술피닐화가 대조군에 비해 증가하는 경우 과산소 노출에 의한 폐섬유증 발병가능성이 있는 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 과산소 노출에 의한 폐섬유증의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법.
1) In each clinical sample derived from individuals suspected of pulmonary fibrosis due to exposure to experimental oxygen and those not affected by pulmonary fibrosis following exposure to control
Iii) the expression level of the TAZ gene or protein;
Ii) the expression level of any one or more genes or proteins selected from the group consisting of IL-6, TNF-α or MCP-1; And
Iii) measuring sulfyredoxin or peroxredoxin sulfinylation;
2) by comparing the expression level of the experimental group and the control group of step 1)
Iii) the TAZ expression level in the experimental group is decreased compared to the control group;
Ii) the expression level of any one or more selected from the group consisting of IL-6, TNF-α or MCP-1 in the experimental group is decreased compared to the control group; And
Iii) determining that there is a possibility of developing pulmonary fibrosis due to peroxygen exposure when the sulfiredoxin or peroxredoxin sulfinylation of the experimental group is increased compared to the control group. Protein detection method for providing.
제 10항에 있어서, 단계 1)의 TAZ, IL-6, TNF-α 또는 MCP-1 유전자의 발현수준은 RT-PCR법, 실시간 RT-PCR법, 마이크로어레이법, 노던블랏(northern blotting), 유전자 발현의 연속 분석법(SAGE, serial Analysis of Gene Expression) 및 RNase 보호분석법(RNase protection assay)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
The method of claim 10, wherein the expression level of the TAZ, IL-6, TNF-α or MCP-1 gene of step 1) is RT-PCR method, real-time RT-PCR method, microarray method, northern blotting, Serial analysis of gene expression (SAGE) and RNase protection assay (RNase protection assay) characterized in that the method selected from the group consisting of.
제 10항에 있어서, 단계 1)의 TAZ, IL-6, TNF-α 또는 MCP-1 단백질의 발현수준 및 설피레독신 또는 퍼록시레독신 술피닐화는 웨스턴블랏(Western blotting), 효소-면역화학 검출법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 면역조직화학 염색법(immunohistochemical staining), 면역침강(immunoprecipitation) 및 면역형광법(immunofluorescence)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
The method according to claim 10, wherein the expression level and sulfyredoxin or peroxredoxin sulfinylation of the TAZ, IL-6, TNF-α or MCP-1 protein of step 1) is determined by Western blotting, enzyme-immunochemistry. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), immunohistochemical staining (immunohistochemical staining), immunoprecipitation (immunoprecipitation) and the method characterized in that it is selected from the group consisting of immunofluorescence (immunofluorescence).
제 10항에 있어서, 단계 1)의 임상시료는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 및 뇨로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 10, wherein the clinical sample of step 1) is selected from the group consisting of tissue, cells, whole blood, serum, plasma, saliva, cerebrospinal fluid and urine.
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