KR101298219B1 - 포접효율이 좋은 미립구의 신규한 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규한 미립구 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 이온화 가능한 양친매성 고분자를 물에 용해시켜 전하를 띈 고분자 용액을 제조하는 단계; 상기 고분자 용액을 고전압의 전기장 하에서 방사시켜 미립구(microsphere)를 제조하는 단계; 및 상기 제조된 미립구를 미립구의 전하를 중화시킬 수 있는 용액과 반응시키는 단계를 포함하는 미립구의 제조방법에 관한 것이다. 상기 고분자 용액에는 미립구 내에 포접시키려는 물질을 더 포함할 수 있다.

Description

포접효율이 좋은 미립구의 신규한 제조방법{A novel preparation method of a microsphere with high entrapment efficiency}
본 발명은 이온화 가능한 양친매성 고분자를 이용하여 간편하게 미립구를 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 포접(entrapment) 효율이 높은 미립구(microsphere)를 제조하는 방법에 관한 것이다. 나아가, 본 발명은 미립구를 이용하는 활성물질, 약물, 유전자 등의 물질 전달시스템에 관한 것이다.
본 발명을 위한 연구는 광역경제권 선도산업 인재양성사업 [과제고유번호: 신규15, 과제명: 전기방사 기술을 이용한 고효율 의료용 단백질 전달 제제화 기술에 관한 연구 ]에 의하여 지원되었다.
활성물질, 약물, 유전자 등을 전달체를 이용해 효율적으로 전달함으로써 그 효과를 높이는 기술은 의약, 화장품, 농업, 바이오, 환경, 건축, 건설 분야 등 다양한 분야에서의 관심사이다. 이러한 전달체의 하나로써 고분자에 의해 형성되는 나노파티클, 나노스피어/마이크로스피어, 나노섬유 등의 다양한 형태가 개발되고 있다.
그 중 마이크로스피어(microsphere 미립구)는 약물 전달시스템으로 사용할 경우 높은 약물 안전성과 적은 부작용 등의 특징을 가져 많은 연구가 이루어지고 있다. 미립구를 용매증발건조법, 상분리법, 분무건조법, 저온용매추출법 등으로 제조하는 방법이 개발되었으나, 대부분 인체에 유해한 용매를 사용한다는 단점이 있다. 또한, 특허 공개번호 제10-2011-22096호에서는 고분자 용액을 분사하여 제조한 액적을 액화기체와 접촉시켜 동결건조시켜 마이크로스피어를 제조하는 방법을 개시하고 있으나, 수용성 고분자의 경우 생체 내에서 즉시 분해가 일어나 지속적인 방출거동을 나타낼 수 없다는 단점이 있다.
미립구를 물질전달체로 사용할 때 문제가 되는 것은 포접효율(entrapment efficiency)이 낮다는 점, 물질이 초기에 대량으로 방출되어 지속적인 방출패턴을 가지기 어렵다는 점, 제조방법이 간단하지 않고 제조장치의 규모가 크며 비싸다는 점, 공정 중에 유기용매를 사용하는 경우 포접되는 물질이 변성이 된다든지 유기용매가 잔류할 경우 인체에 해롭다는 점, 미립구를 구성하는 물질이 생체내에서 쉽게 분해되거나 또는 분해되지 않는 특징을 나타내어 약물의 방출이 용이하지 않은 문제점 등으로서, 이러한 문제점을 해결할 수 있는 미립구의 제조방법의 개발이 필요하다.
본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 포접효율이 높고, 안전하며 물질전달 효과가 우수한 미립구를 간단하게 제조하는 방법을 개발하는 것이다.
위의 과제를 해결하기 위해서, 이온화 가능한 고분자를 용해시켜 전하를 띈 고분자 수용액을 제조하는 단계; 상기 고분자 용액을 고전압의 전기장 하에서 분사시켜 미립구를 제조하는 단계; 및 제조된 미립구의 전하를 중화시킬 수 있는 용액과 미립구를 반응시키는 단계를 포함하는 미립구의 제조방법을 제공한다.
상기 고분자 수용액에는 활성물질, 약물, 유전자 등 미립구에 포접시키고자 하는 물질을 포함할 수 있으며, 상기 고분자는 생체적합성, 생분해성 고분자를 사용할 수 있다. 포접시키려는 물질이 용매에 용해되었을 때 고분자와 반대되는 전하를 띄게 되면 포접효율이 더 높아질 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 미립구를 제공한다.
본 발명에 따른 제조방법은 간단·간편하게 미립구를 제조할 수 있도록 하여 경제적으로 유익하다. 또한, 본 발명에 따른 방법에 의하여 제조된 미립구는 물질의 포접 효율이 높고 이를 지속적으로 방출시킬 수 있어 물질 전달효과가 높다. 또한 유기용매를 사용하지 않고 미립구의 제조가 가능하여 안전하며, 미립구에 포접되는 물질의 변성을 최소화할 수 있다.
도 1은 일 구체예에 따른 고분자(키토산) 용액을 주사기에 넣고 고전압 전기장을 걸어 고분자 용액을 분사시킨 후, 전하를 중화시킬 수 있는 물질과 반응시켜 미립구를 제조하는 과정의 모식도이다.
도 2는 키토산 용액으로 제조한 미립구를 중화 물질을 이용하여 탈수소화(deprotonation)시킬 때의 화학적 결합 모식도이다.
도 3은 일 구체예로 제조된 미립구를 건조시키지 않은 상태에서 광학현미경으로 형상을 관찰한 것이다 (미립구의 광학현미경 사진을 40배로 확대한 것임). 키토산 용액의 농도 및 적용된 전압에 따른 미립구의 사진을 보여준다.
도 4는 일 구체예로 제조된 미립구를 건조시킨 상태에서 키토산 용액의 농도와 적용된 전압의 세기에 따른 미립구의 SEM 사진의 형상을 보여준다 (미립구의 SEM사진을 30배로 확대한 것임).
도 5는 키토산용액의 농도(X 축), 적용된 전압의 세기(Y 축)에 따라 생성된 미립구의 크기를 (Z 축)를 나타낸 그래프이다.
도 6은 미립구의 키토산 용액의 농도, 적용전압의 세기에 따른 이론적인 회수율에 대한 실제 회수율의 퍼센트를 나타낸 것이다. 회수율은 (실제의 회수율)/(이론적인 회수율)X100으로 계산하였다.
도 7은 키토산 미립구에 포접된 음이온 단백질의 pH에 따른 방출 %을 나타낸 것이다.
본 발명은, 일 측면에서, 이온화 가능한 양친매성 고분자를 물에 용해시켜 전하를 띈 고분자 용액을 제조하는 단계; 상기 고분자 용액을 고전압의 전기장 하에서 방사시켜 미립구(microsphere)를 제조하는 단계; 및 상기 제조된 미립구를 미립구의 전하를 중화시킬 수 있는 용액과 반응시키는 단계를 포함하는 미립구의 제조방법에 관한 것이다. 상기 고분자 용액에는 미립구 내에 포접시키려는 물질을 더 포함할 수 있다. 포접시키려는 물질이 용매에 용해되었을 때 고분자와 반대되는 전하를 띄게 되면 포접 효율이 더 높아질 수 있다. (도 1).
본 명세서에서 '양친매성 고분자 (amphiphilic polymer)'는 친수성 (hydrophilic) 부분 및 소수성 (hydrophobic) 부분을 모두 가진 고분자를 말한다. 양친매성 고분자로는 예를 들어 키토산(chitosan), 폴록사머 ((폴리에틸렌옥사이드)-(폴리프로필렌옥사이드)-(폴리에틸렌옥사이드)), 폴리비닐알콜, tween 20, triton X-100, 폴리락타이드, 폴리-ε-카프로락톤, 폴리락타이드-co-글리코리드, 폴리(락타이드-co-ε-카프로락톤), 폴리-ε-카프로락톤-co-글리코리드 및 폴리-ε-카프로락톤-co-글리코리드-co-락타이드로 이루어진 폴리에스터군과 더불어 폴리카보네이트군, 폴리오쏘에스터군이 포함되나 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 양친매성 고분자는 장기간에 걸쳐 생체에 악영향을 나타내지 않고 원래의 기능을 다하면서 생체와 공존할 수 있는 '생체적합성 고분자'일 수 있다. 생체 적합성 물질로는 예를 들어 키토산, 폴리락틱코글라이콜릭산, 폴리락틱산, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 폴리옥시에틸렌, 폴리트리메틸렌 글리콜, 폴리락트산 및 이들의 유도체, 폴리아크릴산 및 이의 유도체, 폴리(아미노산), 폴리우레탄, 폴리포스파진, 폴리(L-라이신), 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리비닐 알콜 및 폴리아크릴 아마이드 및 이들의 둘 이상의 공중합체로 이루어진 그룹 등이 포함되며 이로 제한되는 것은 아니다. 키토산은 서서히 분해됨으로써 지속적인 방출을 나타낼 수 있다는 장점을 가진다.
본 발명에 사용되는 양친매성 고분자는 적어도 분해의 한 과정에서 생물의 대사가 관여하여 저분자량 화합물로 변하는 '생분해성 고분자'일 수 있다. 생분해성 고분자로는 예를 들어 키토산, 탄수화물, 단백질, 셀룰로오스, 폴리아미노산, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 폴리옥시에틸렌, 폴리트리메틸렌 글리콜, 폴리락트산 및 이들의 유도체, 폴리아크릴산 및 이의 유도체, 폴리(아미노산), 폴리우레탄, 폴리포스파진, 폴리(L-라이신), 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리비닐 알콜 및 폴리아크릴 아마이드 및 이들의 둘 이상의 공중합체로 이루어진 그룹 등이 포함되나 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 양친매성 고분자 용액은 물에 용해시켜 제조하며, 용해도를 높이기 위하여 아세트산, 인산, 염산, 시트르산, 질산, 등의 산 또는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 탄산칼슘, 탄산수소나트륨, 암모니아 등의 알칼리를 첨가할 수 있다. 예를 들어, 키토산을 사용할 경우 아세트산과 같은 약산에 용해시킬 수 있으며, 이때 키토산은 양전하를 띄게 된다. 양이온성 고분자로는 예를 들어 키토산, 폴리에틸렌이민, 폴리아닐아민하이드로클로라이드, 폴리아크릴로니트릴, 폴리트랜스-4-하이드록시-프롤린 에스테르, 폴리리신, 폴리락티드-코-리신, 폴리 세린 에스테르 및 폴리α-4-아미노부틸-글리콜산을 들 수 있으며 이로 제한되는 것은 아니다. 수용액 중 음전하를 띄게 되는 음이온성 고분자로는 예를 들어 아카시아(acacia), 알지네이트(alginate), 카라기난(carrageenan), 콘드로이친 설페이트(chondroitin sulfate), 카르복실메틸셀룰로즈(carboxylmethylcellulose), 덱스트란 설페이트(dextran sulfate), 푸코이단(fucoidan), 젤란검(gellan gum), 헤파린(heparin), 하이알루론산(hyaluronic acid), 펙틴(pectin), 잔탄(xanthane), 자일란(xylan), 폴리 스티렌 설포네이트(poly styrene sulfonate), 콜라겐(collagen), 폴리 아크릴산(poly acrylic acid), 폴리포스포산(polyphosphoric acid), 폴리포스페이트(polyphosphate), 폴리(락타이드)(poly(lactide)) 및 폴리(락타이드-코-글리콜산)(poly(lactide-co-glycolic acid))를 들 수 있으며 이로 제한되는 것은 아니다.
미립구에 포접시키기 위하여 고분자 용액에 포함시킬 수 있는 물질로는 예를 들어, DNA, mRNA, iRNA, 올리고뉴클레오티드 등의 유전물질, 단백질, 펩티드, 호르몬, 비타민, 무기질 등의 생리활성물질, 진통제, 항염증제, 항암제, 구충제, 항바이러스제, 항생제, 항우울제, 항응고제, 항당뇨병제, 항히스타민제 등의 약물, 생장촉진제, 살충제 등의 농축산용제 등 제한이 없으며 필요에 따라 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 항암 및 항염증 약물은 독소루비신, 파클리탁셀, 알데스루킨, 미토마이신 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있지만, 이들에 제한되는 것은 아니다. 또한, 고분자 용액에 포함시킬 수 있는 물질로 예를 들어, bovine serum albumin(BSA), recombinant human epidermal growth factor (rhEGF), Ovalbumin, Human chorionic gonadotropin(hCG), human serum albumie(HAS), recombinant human erythropoietin(rhEPO), Protein-C, lysozyme, Orntide acetate (LHRH antagonist), Vascular endothelial growth factor(VEGF), Recombinant human morphogenetic protein-2(rhBMP), Calcitonin, Ribozymes, Vapreotide(somatostatin analogue), Insulin like growth factor-1(IGF-1) 등을 들 수 있으며, 이들로 제한되는 것은 아니다.
상기 고분자 용액은, 전기방사(electrospinning) 즉, 예를 들어, 고전압(2.5~ 10 kV)과, 주입속도(0.5~ 2ml/h) 및 주사기 바늘과 접지부분과의 거리(3~10cm, 바람직하게는 5~6cm) 조건에 의하여 주사기 또는 노즐 등을 통하여 분사된다. 또는 통상적으로 사용되는 전기방사장치를 사용할 수도 있다.
분사된 고분자용액은 미립구를 형성한다. 고분자 용액은 나노섬유가 아닌 비드의 형태가 나타날 수 있도록 조건을 최적화 시킨 후에 접지되는 부분을 용액으로 처리함으로써 방사된 고분자 용액을 구의 형태를 나타내도록 유도한다. 기존에 나노섬유를 제조하기 위해 사용 되었던 판 형의 접지부분 대신에 용액을, 예를 들어, sodium carbonate(소듐 카보네이트)를 사용하여, 분사된 고분자 용액의 양이온(NH3 +)이 소듐 카보네이트의 음이온(CH3COO-)과 만나 이온이 아닌 형태(NH2)로 변화되어 비드의 형태 그대로 경화되어 나노섬유의 형태가 아닌 미립구의 형태를 유지시킬 수 있다.
형성된 미립구는 미립구가 띄고 있는 전하를 중화시킬 수 있는 용액으로 받아 반응시킴으로써 미립구의 전하를 중화시킨다. 중화반응은 미립구를 경화시킴으로써 미립구의 형태를 유지하도록 한다. 미립구가 양전하를 띌 경우 탄산나트륨용액, 수산화나트륨 용액, 암모니아수 등의 알칼리성 용액과 반응시키고, 미립구가 음전하를 띌 경우 산성용액과 반응시킬 수 있다. 예를 들어, 아세트산에 용해시킨 키토산 용액은 양전하를 띄므로 키토산용액으로 제조된 미립구를 중화시키기 위하여 탄산나트륨용액, 수산화나트륨 용액, 암모니아수 등의 알칼리성 용액과 반응시킬 수 있다 (도 2).
본 발명의 방법에 의하여 형성된 미립구는 대략 직경 10 ~ 4000μm의 크기를 가지나 이로 제한되는 것은 아니다. 미립구의 크기는 고분자의 종류, 고분자 용액의 농도, 전압의 세기, 분사속도, 분사거리 등에 따라 달라지며, 필요에 따라 각각의 조건을 적절하게 조절할 수 있다.
중화과정을 거친 미립구를 수집한 후, 미립구를 세척하는 과정을 추가로 실시할 수 있다. 예를 들어 거름망으로 미립구를 걸러 낸 후 증류수를 사용하여 세척할 수 있다. 제조된 미립구는 그대로 사용하거나 또는 건조시킨 후 사용될 수 있다. 예를 들어 자연건조, 온풍건조, 동결건조 등을 사용할 수 있으며, 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 다른 일 측면에서, 본 발명에서 제공하는 제조방법으로 제조된 미립구 또는 물질이 포접된 미립구를 제공한다.
또한, 본 발명은 다른 일 측면에서, 본 발명에서 제공하는 제조방법으로 제조된 미립구 또는 물질이 포접된 미립구를 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 조성물에는 첨가제 또는 부가제 등이 추가로 포함될 수 있다. 본 발명의 미립구를 인체에 적용하기 위해서는 약학적으로 허용된 부형제, 담체 등을 함께 사용할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 미립구 제조 방법에 의하면, 미립구를 간단한 방법으로 제조할 수 있으며 미립구의 크기를 목적에 따라 조절하여 생산할 수 있다. 제조된 미립구는 물질의 포접효율이 커서 물질을 효과적, 경제적으로 전달할 수 있을 뿐만 아니라 지속적으로 방출할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 미립구의 제조
1.1 키토산 용액의 제조
키토산 (분자량 : 50,000)을 하기 표1에 기재된 농도로 0.2M의 아세트산 용액에 완전히 용해시켜 키토산용액을 제조하였다. 충분히 반응이 완료된 용액을 상온에서 3시간 동안 유지하였다.
아세트산 : 키토산 = 1:X (중량비) 키토산 함유량 (w/v,%)
X= 0.83 1
X= 1.67 2
X= 2.50 3
1.2. 미립구의 제조
상기 제조한 키토산 용액을 주사기에 넣고 고전압 전기장을 걸어 키토산 용액을 분사시켰다. 이 때 사용된 장치는 power supply (model No. RLPS50-150P, DEL ELECTRONICS CORP. (NEW YORK))으로 2.5kV~10.0kV의 전압을 공급하였으며, 키토산 용액은 2ml/h로 주입하였다. 또한 collecter는 물중탕으로 하여 ground 용액인 소듐 카보네이트의 결정화를 예방하였다. 위의 분사된 키토산 용액을 4M 탄산나트륨 용액에 담금으로서 미립구의 형태를 유지시켜주었다. 밤새 담금한 후에 거름망을 이용하여 미립구만 걸러내었다. 걸러진 미립구는 DW(distilled water)로 5회 세척하여 탄산나트륨을 완전히 제거하였다.
세척된 미립구를 광학현미경(optical microscope)를 관찰하였다. 미립구는 구형의 형태를 가지고 있었다. 도 3는 미립구의 표면을 40배로 확대한 광학현미경 사진이다. 키토산 용액의 농도와 적용한 전압의 세기에 따라 미립구의 크기가 차이나 나는 것이 확인되었다.
제조된 미립구를 -80oC에서 밤새 얼린 후에 동결건조기를 이용하여 3일간 건조시켰다. 건조된 미립구를 시료로 하여 주사 전자 현미경(Scanning electron microscope, SEM) 사진의 형상을 관찰하였다. SEM 측정은 통상의 방법으로 수행하였다. 도 4는 미립구의 표면을 30배로 확대한 SEM 사진이다. 키토산 용액의 농도와 적용한 전압의 세기에 따라 미립구의 크기가 차이가 나는 것이 확인되었다.
키토산 용액의 농도와 적용한 전압의 세기에 따른 미립구의 크기는 표 2 및 도 5와 같다.
키토산 농도(w/v, %) Positive Voltage ( kV ) 미립구의 평균 직경
(μm,마이크로미터)

1.0
 2.5 2244.7 ±18.4
5.0 1770.3 ± 45.4
10.0 -

2.0
 2.5 1862.8 ±38.7
5.0 1369.8 ±85.5
10.0 699.3 ±92.7

3.0
 2.5 1248.6 ±15.3
5.0 947.0 ± 35.2
10.0 482.8 ±02.2
표 2와 도 5에서 나타난 바와 같이 키토산 용액의 농도가 높을수록, 적용된 전압의 세기가 높을수록 미립구의 크기가 줄어드는 것을 확인 하였다.
< 실시예 2> 미립구의 수율
실시예 1의 미립구 제조방법으로 제조된 미립구의 회수율을 결정하였다. 미립구를 같은 조건에서 3개의 샘플(sample)을 제조하여 무게를 측정하여 (실제 회수량)/(이론적 회수량)*100으로 회수율을 계산하였다(표 3 및 도 6). 총 미립구의 이론적 회수량을 20mg으로 고정한 후 실제 회수량으로 나누어 퍼센트(percentage,%)로 나타낸 것이다. 실제 회수량은 생성된 미립구를 완전 건조시킨 후, 무게를 측정한 값이다. 마이크로 스피어를 중성화 과정 중에 4M의 소듐 카보네이트와의 이온반응이 일어나는 데, 4M의 소듐 카보네이트의 이온이 줄어들며 이로 인해서 마이크로 스피어가 영향을 받는 것을 막도록 최소의 양의 마이크로 스피어를 제조하기 위하여 20mg으로 사용하였다. 키토산 용액의 농도가 높을수록 미립구의 회수율이 낮아짐을 확인할 수 있다.
키토산 농도(w/v, %) Positive Voltage ( kV ) 회수율 (%, w/w)

1.0
 2.5 80.1±18.3
5.0 88.6±16.9
10.0 69.0±13.3

2.0
 2.5 91.2±4.6
5.0 97.2±1.3
10.0 70.8±7.7

3.0
 2.5 47.6±5.8
5.0 53.6±9.1
10.0 68.6±12.3
< 실시예 3> 약물의 포접율
2%의 키토산용액과 10kv의 전압을 이용하여 실시예1과 같이 제조한 마이크로스피어의 약물 포접율을 확인하였다. 이때 사용한 약물은 대표적인 약물로서 FITC-BSA(Bovine Serum Albumin)를 사용하였다. BSA는 일반적인 모델 단백질로 많이 사용되며, 단백질의 방출여부를 형광으로 확인 하는 것이 용이하도록 FITC를 라벨링하였다.
2%의 키토산용액과 10kV의 전압을 이용하여 마이크로 스피어를 제조하는 경우, 제조되는 미립구의 크기가 작아 인체에 적용할 때 분해되는 속도가 빨라 약물의 방출이 용이하며, 오럴(oral) 전달체로 이용을 할 때 먹을 때 거부감이 덜 느껴지는 장점이 있다.
제조한 마이크로스피어를 1M의 HCl 1ml에 24 시간 동안 볼텍스 믹서를 이용하여 mixing해주었다. 그리고 원심분리(10,000rpm, 15min)을 하여 분해된 키토산을 침전시킨 후에, BSA에 라벨링된 FITC를 이용하여 Fluorescence Spectrophotometr(F-2500, HITACHI)로 형광측정을 하였다.
하기 표 4에 표기한 실제 포접량과 이론적 포접량은 2%의 키토산 용액에 형광표식된 1%의 음이온 단백질 (Bovine serum albumin)으로 전기방사방법을 이용하여 제조한 마이크로스피어를 5mg 당 1%의 BSA(bovine serum albumin)가 100% 들어있다는 가정하에 계산된 이론적인 값을 나타낸 것이다. 따라서 마이크로스피어 내의 BSA의 이론적인 포접량은 아래의 식으로 표현한다.
(이론적 포접량, 5mg) = (마이크로스피어의 무게(5mg)) * 1/100
포접 효율은 (실제 포접량)/(이론적인 포접량) * 100으로 계산하였다. 음이온 단백질을 포접한 마이크로스피어의 포접 효율이 약 90%이상의 값이 나오는 것을 확인할 수 있다.
이론적 포접량 ( mg ) 실제 포접량 ( mg ) 포접효율 (%, w/w)
50 45.6±1.7 91.2±3.4
< 실시예 4> 미립구로부터 약물의 방출 프로파일
2%의 키토산용액과 10kv의 전압을 이용하여 실시예 1과 같이 제조한 마이크로스피어의 약물의 방출 프로파일을 확인하였다. 이때 FITC를 라벨링 시킨 BSA(Bovine Serum Albumin)를 사용하였다. BSA는 등전점이 4.9인 단백질로, pH가 4.9보다 낮을 경우 양이온의 성격을 가지며, pH가 4.9보다 높을 경우 음이온의 성격을 갖는다. 키토산의 경우에는 acetic acid에 녹인 상태이기 때문에 양이온의 성격을 갖는데, BSA와 키토산의 이온특성을 이용하여 pH가 낮을 경우에는 이온적 반발력으로 인해 방출이 빨리 되고, pH가 높은 경우에는 이온적 결합력으로 인해 방출이 서서히 되는 이론적 가정하에 pH에 따른 약물 방출 프로파일을 확인하였다.
제조한 마이크로스피어를 pH에 대한 약물 방출 프로파일은 확인 하기 위해 pH 8.4, pH 7.0, pH 5.5, pH 3.0의 5ml 용액에서 5mg의 마이크로스피어를 넣어 24h 동안 shaking incubator(JSSI-100T, JSR)에서 38oC와 250rpm 을 유지시켰으며, 0,3,6,9,12,24시간의 간격으로 40ml로 샘플링하여 10배로 희석한 후 Fluorescence Spectrophotometr(F-2500, HITACHI)로 형광측정을 하였다.
도 7의 pH에 따른 방출 %은 키토산 용액에 형광을 염색한 1%의 음이온 단백질(Bovine serum albumin)을 첨가하여 실시예 1의 전기방사방법을 이용하여 제조한 마이크로스피어에서 표 4의 평균 포접효율에 대해 들어있는 음이온 단백질의 양을 계산하고, 방출된 음이온 단백질의 양과 함께 마이크로스피어 내의 BSA의 방출 %를 아래의 식으로 계산하였다.
(방출된 음이온 단백질의 양)/(실제 포접량) * 100
pH 8.4와 pH 7.0의 경우 큰 차이를 보이지 않았으나, 전체적으로 pH가 증가할수록 방출이 많이 되며, pH가 낮을수록 지속적으로 방출되는 방출양상을 가지고 있는 것을 확인할 수 있다.

Claims (9)

  1. 이온화 가능한 양친매성 고분자를 용해시켜 전하를 띈 고분자 수용액을 제조하는 단계; 상기 고분자 수용액을 고전압의 전기장 하에서 방사시켜 미립구(microsphere)를 제조하는 단계; 및 상기 미립구를 미립구의 전하를 중화시킬 수 있는 용액과 반응시키는 단계를 포함하는 미립구의 제조방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 고분자 수용액에 미립구 내에 포접시키려는 물질을 더 포함하는 것인 미립구의 제조방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 미립구 내에 포접시키려는 물질이 유전자, 생리활성성분 및 약물로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 미립구의 제조방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 미립구 내에 포접시키려는 물질이 DNA, mRNA, iRNA, 올리고뉴클레오티드, 단백질, 펩티드, 호르몬, 비타민, 무기질, 진통제, 항염증제, 항암제, 구충제, 항바이러스제, 항생제, 항우울제, 항응고제, 항당뇨병제, 항히스타민제, 생장촉진제, 살충제, 농축산용제로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 미립구의 제조방법.
  5. 제 3 항에 있어서, 상기 미립구 내에 포접시키려는 물질이 bovine serum albumin(BSA), recombinant human epidermal growth factor (rhEGF), Ovalbumin, Human chorionic gonadotropin(hCG), human serum albumie(HAS), recombinant human erythropoietin(rhEPO), Protein-C, lysozyme, Orntide acetate (LHRH antagonist), Vascular endothelial growth factor(VEGF), Recombinant human morphogenetic protein-2(rhBMP), Calcitonin, Ribozymes, Vapreotide(somatostatin analogue), Insulin like growth factor-1(IGF-1), 독소루비신, 파클리탁셀, 알데스루킨 및 미토마이신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 미립구의 제조방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양친매성 고분자가 키토산(chitosan), 폴록사머 ((폴리에틸렌옥사이드)-(폴리프로필렌옥사이드)-(폴리에틸렌옥사이드)), 폴리비닐알콜, tween 20, triton X-100, 폴리락타이드, 폴리-ε-카프로락톤, 폴리락타이드-co-글리코리드, 폴리(락타이드-co-ε-카프로락톤), 폴리-ε-카프로락톤-co-글리코리드 및 폴리-ε-카프로락톤-co-글리코리드-co-락타이드로 이루어진 폴리에스터, 폴리카보네이트 및 폴리오쏘에스터로 구성된 군으로부터 선택되는 양이온성 고분자이며, 상기 미립구의 전하를 중화시킬 수 있는 용액이 수산화나트륨, 수산화칼륨, 탄산칼슘, 탄산수소나트륨 및 암모니아로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 미립구의 제조방법.
  7. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고분자가 키토산, 폴리에틸렌이민, 폴리아닐아민하이드로클로라이드, 폴리아크릴로니트릴, 폴리트랜스-4-하이드록시-프롤린 에스테르, 폴리리신, 폴리락티드-코-리신, 폴리 세린 에스테르 및 폴리α-4-아미노부틸-글리콜산으로 구성된 군으로부터 선택되는 양이온성 고분자이며, 상기 미립구의 전하를 중화시킬 수 있는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 탄산칼슘, 탄산수소나트륨 및 암모니아로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 것인 미립구의 제조방법.
  8. 제 2 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포접시키려는 물질이 상기 고분자와 반대 전하를 띄는 것을 특징으로 하는 미립구의 제조 방법.
  9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 의하여 제조된 미립구.
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