KR101294598B1 - 4-alpha-Glucanotransferase-amylose complex and the applications of the same - Google Patents

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Abstract

본 발명은 4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈(4-alpha-glucanotransferase, EC 2.4.1.5)와 아밀로오스 복합체 형성에 관한 것으로 더욱 상세하게는 4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈가 가지는 아밀로오스에 대한 선택적 친화력을 바탕으로 4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈를 포함하는 조효소액에 불용성 아밀로오스를 첨가하여 알파-글루카노트랜스퍼레이즈와 아밀로오스가 결합된 4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈-아밀로오스 복합체를 제조하고, 비배당체, 배당체 및 올리고당을 당수용체로 하는 당전이산물의 제조 및 전분의 구조변형에 상기 복합체를 촉매제로 활용하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to the formation of 4-alpha-glucanotransferase (amylose complex) and 4-alpha-glucanotransferase (EC 2.4.1.5), and more particularly, to the selective affinity for amylose of 4-alpha-glucanotransferase. Insoluble amylose was added to the coenzyme solution containing 4-alpha-glucanotransferase to prepare 4-alpha-glucanotransferase-amylose complex in which alpha-glucanotransferase and amylose were combined, and a nonglycoside, The present invention relates to a method of using the complex as a catalyst for the production of sugar transition products containing glycosides and oligosaccharides as sugar acceptors and structural modification of starch.

Description

4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈와 아밀로오스의 복합체 및 이의 이용{4-alpha-Glucanotransferase-amylose complex and the applications of the same}4-alpha-Glucanotransferase-amylose complex and the applications of the same}

본 발명은 4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈(4-alpha-glucanotransferase, EC 2.4.1.5)와 아밀로오스 복합체 형성에 관한 것으로 더욱 상세하게는 4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈가 가지는 아밀로오스에 대한 선택적 친화력을 바탕으로 4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈를 포함하는 조효소액에 불용성 아밀로오스를 첨가하여 알파-글루카노트랜스퍼레이즈와 아밀로오스가 결합된 4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈-아밀로오스 복합체를 제조하고, 비배당체, 배당체 및 올리고당을 당수용체로 하는 당전이산물의 제조 및 전분의 구조변형에 상기 복합체를 촉매제로 활용하는 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to the formation of 4-alpha-glucanotransferase (amylose complex) and 4-alpha-glucanotransferase (EC 2.4.1.5), and more particularly, to the selective affinity for amylose of 4-alpha-glucanotransferase. Insoluble amylose was added to the coenzyme solution containing 4-alpha-glucanotransferase to prepare 4-alpha-glucanotransferase-amylose complex in which alpha-glucanotransferase and amylose were combined, and a nonglycoside, The present invention relates to a method of using the complex as a catalyst for the production of sugar transition products containing glycosides and oligosaccharides as sugar acceptors and structural modification of starch.

일반적으로 D-enzyme이라고도 알려진 4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈는 미생물과 식물체 내에서 말토올리고당의 대사에 관여하는 효소로서 효소가 가지는 당전이 활성을 이용하여 짧은 두 분자의 말토올리고당을 긴 말토올리고당으로 전환하는 disproportionation 반응을 촉매하며, phosphorylase에 의한 말토올리고당의 분해를 원활하기 하는 기능을 수행한다(Lin and Preiss. 1988. Plant Physiol.86, 260). 4-alpha-glucanotransferase, commonly known as D-enzyme, is an enzyme that is involved in the metabolism of maltooligosaccharides in microorganisms and plants. It catalyzes the conversion of disproportionation reactions and facilitates the degradation of maltooligosaccharides by phosphorylase (Lin and Preiss. 1988. Plant Physiol. 86, 260).

본 발명의 실시 양태에서 생산되는 4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈는 전분에 작용하여 전분의 구조 변형 및 배당체의 당쇄 변형 등에 사용되는 등 상업상 이용성이 높은 효소로서 전분을 당공여체(sugar donor)로 사용하여 소수성 배당체에 당쇄를 추가 부여하는 당전이 반응에 사용되어 수용성이 증가된 당전이 산물을 합성하거나, 아밀로오스를 기질로 사용하여 포도당의 중합도가 20이상인 환형아밀로스 (cycloamylose)를 생산하여 고분자물질과 환형아밀로스 간의 complex 형성을 통한 수용화 등에 사용되었다. 최근에는 아밀로펙틴을 클러스터 단위로 가수분해하는 4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈의 특이적 가수분해 활성과 당전이 활성의 복합 작용을 통해 가지의 길이가 변화된 아밀로펙틴 클러스터 형태의 전분 신소재를 제조하여 온도변화에 따라 가역적인 겔화(gelation) 성질을 가지는 전분신소재의 식품 적용 연구가 활발히 진행되고 있다.(Li et al. 2005. J. Agric. Food Chem. 53:6516-6524; Park et al. 2000. Biochim. Biophys. Acta. 1478:165-185; Choi et al. 2009. Regul Toxicol Pharmacol. 55:281-290).The 4-alpha-glucanotransferase produced in the embodiment of the present invention is a commercially available enzyme that acts on starch and is used for structural modification of starch and sugar chain modification of glycosides, and converts starch into sugar donor. It is used in sugar transfer reaction to add sugar chain to hydrophobic glycoside to synthesize glycotransfer products with increased water solubility, or to produce cyclic amylose (cycloamylose) with glucose polymerization degree of 20 or more using amylose as substrate. It was used for solubilization through complex formation between cyclic amylose. Recently, a new starch material in the form of amylopectin clusters of which eggplants were changed through the combined action of specific hydrolysis activity and sugar transfer activity of 4-alpha-glucanotransferase that hydrolyze amylopectin in cluster units was prepared. Accordingly, research on food application of starch material having reversible gelation properties has been actively conducted (Li et al. 2005. J. Agric. Food Chem. 53: 6516-6524; Park et al. 2000. Biochim. Biophys. Acta. 1478: 165-185; Choi et al. 2009. Regul Toxicol Pharmacol. 55: 281-290).

4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈는 일반적으로 상기 효소를 보유한 미생물 또는 식물체에서 직접 얻을 수 있으며, 보다 일반적으로는 상기 효소를 암호화하는 유전자를 클로닝하고 대장균 또는 transgenic plant 등을 이용한 재조합 기술에 의해서 생산될 수 있다. 4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈의 특이적 가수분해 또는 당전이활성을 이용하여 생산된 신규 고부가 탄수화물 소재를 의약 및 식품용으로 사용하기 위해서는 촉매제로 사용되는 4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈의 정제가 요구된다. 4-alpha-glucanotransferase can generally be obtained directly from microorganisms or plants containing the enzyme, and more generally can be produced by cloning a gene encoding the enzyme and by recombinant technology using an E. coli or transgenic plant. Can be. Purification of 4-alpha-glucanotransferase, which is used as a catalyst for the use of novel high value carbohydrate materials produced by specific hydrolysis or sugar transfer activity of 4-alpha-glucanotransferase for medicine and food, Required.

효소의 정제방법으로는 일반적으로 컬럼 크로마토그래피법을 이용한다. 이온교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography), 소수성 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography), 크기 배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography) 등의 다양한 크로마토그래피법을 연속적으로 사용하여 순수한 효소를 얻을 수 있다. 내열성 효소의 경우 열처리 공정을 통해서 내열성이 약한 기타 효소는 제거하고 대상효소(target enzyme)만을 회수하여 효소의 순도를 높일 수 있다. 최근에는 유전자조작을 통해 대상효소의 N-말단 또는 C-말단에 특정 크로마토그래피 수지(resin)과 특이적인 결합을 할 수 있는 아미노산 서열을 융합시켜 재조합 융합단백질(fusion protein)를 생산한 후, 융합단백질이 보유한 펩타이드와 resin의 선택적 결합력을 바탕으로 기타 단백질을 제거하고 대상효소만을 순수하게 정제하는 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)법이 다수 개발되어 상용화되어 있다. 친화성 크로마토그래피의 대표적인 예는 6개의 연속된 histidine 잔기(6xhistidine tag)를 대상효소에 유전자조작을 통해 융합시킨 융합단백질을 니켈과 같은 이가 금속양이온이 고정화된 resin을 이용하여 단일단계로 순수정제하는 방법이 있다(Wilchek and Bayer, 1999. Biomol. Eng. 16: 1-4.). In general, column chromatography is used for the purification of enzymes. Pure enzymes can be obtained by successively using various chromatographic methods such as ion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, and size-exclusion chromatography. In the case of heat resistant enzymes, other enzymes having low heat resistance may be removed through a heat treatment process, and only the target enzyme may be recovered to increase the purity of the enzyme. Recently, a recombinant fusion protein is produced by fusing an amino acid sequence capable of specific binding with a specific chromatography resin at the N-terminus or C-terminus of a target enzyme through genetic manipulation. Based on the selective binding of peptides and resins possessed by proteins, many affinity chromatography methods have been developed and commercialized that remove other proteins and purify only the target enzyme. A representative example of affinity chromatography is the purification of fusion proteins obtained by genetically fusion of six consecutive histidine residues (6xhistidine tag) to a target enzyme in a single step using a resin immobilized with divalent metal cations such as nickel. Method (Wilchek and Bayer, 1999. Biomol. Eng. 16: 1-4.).

일반적인 컬럼 크로마토그래피법을 이용하여 순수한 4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈를 얻기 위해서는 여러 단계의 크로마토그래피 공정을 거쳐야 하는 번거로움이 있으며, 이로 인해 효소의 회수율이 낮고 시간과 비용면에서 산업적으로 이용하는데 한계가 있다. 재조합기술을 통해 확보된 내열성 4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈의 경우 고온에서 열처리 공정을 통해 내열성이 낮은 숙주세균 또는 세포의 단백질은 열변성을 통해 제거하고 상기 내열성 4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈만을 회수할 수 있으나, 얻어진 효소의 정제도가 충분하지 못한 단점이 있다. In order to obtain pure 4-alpha-glucanotransferase using a conventional column chromatography method, it is difficult to undergo several steps of chromatographic processes, which results in low recovery of enzymes and industrial use in terms of time and cost. There is a limit. In the case of heat-resistant 4-alpha-glucanotransferase obtained through recombination technology, the protein of low heat resistance host bacteria or cells is removed through heat denaturation through heat treatment at high temperature, and only the heat-resistant 4-alpha-glucanotransferase Although recoverable, there is a disadvantage that the degree of purification of the obtained enzyme is not sufficient.

유전자 조작을 통해 4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈에 부여된 펩타이드 (예를 들어 6xhistidine tag 또는 말토오스 결합단백질 등)를 이용하는 친화성 크로마토그래피의 경우 상기 효소에 아미노산 서열의 추가로 인해 식품용 효소로의 허가에 어려움이 있으며, 특히 6xhistidine tag 융합단백질의 경우 크로마토그래피과정에서 고정화된 니켈이온의 유출 및 융합단백질과의 결합 가능성 때문에 식품용 효소 정제공정에 이용될 수 없다. For affinity chromatography using peptides (eg, 6xhistidine tags or maltose binding proteins, etc.) assigned to 4-alpha-glucanotransferases through genetic engineering, the addition of amino acid sequences to the enzymes leads to food enzymes. In particular, the 6xhistidine tag fusion protein cannot be used for food enzyme purification due to the release of immobilized nickel ions and the possibility of binding to the fusion protein.

따라서 4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈를 의약용 및 식품용 효소로서 활용하기 위해서는 전통적인 컬럼 크로마트그래피에 비해 간단하고 효율적이며, 추가적인 펩타이드와의 융합을 전제로 하는 기존의 친화성 크로마토그래피에 비해 안전성이 담보된 새로운 4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈 정제 기술 개발이 요구된다.
Therefore, the use of 4-alpha-glucanotransferase as a medical and food enzyme is simpler and more efficient than traditional column chromatography, and safer than conventional affinity chromatography, which is based on fusion with additional peptides. There is a need for the development of this secured new 4-alpha-glucanotransferase purification technology.

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈를 포함하는 조효소액으로부터 간단하고 효율적인 4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈 정제공정을 제공하는 것이다.The present invention solves the above problems, and the object of the present invention, which was devised by the necessity of the above is a simple and efficient 4-alpha-glucanotransferase purification process from a crude enzyme solution containing 4-alpha-glucanotransferase. To provide.

본 발명의 다른 목적은 4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈를 추가적인 당공여체의 첨가 없이 소당류 또는 배당체의 당쇄를 가공할 수 있는 4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈-아밀로오스 복합체를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a 4-alpha-glucanotransferase-amylose complex capable of processing a 4-alpha-glucanotransferase to a sugar chain of a small sugar or glycoside without the addition of an additional sugar donor.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈-아밀로오스 복합체를 이용하여 원하는 당전이산물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
Still another object of the present invention is to provide a method for preparing a desired sugar transition product using the 4-alpha-glucanotransferase-amylose complex.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈를 포함하는 조효소 혼합물을 불용성 아밀로오스 또는 불용성 전분 또는 이들의 화학적 또는 효소적 변형물과 혼합하는 단계를 포함하는 조효소 혼합물로부터 순수한 4-알파-글루카노트렌스퍼레이즈만을 선택적으로 분리하는 방법을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a pure 4 from the coenzyme mixture comprising mixing a coenzyme mixture comprising 4-alpha-glucanotransferase with insoluble amylose or insoluble starch or chemical or enzymatic modifications thereof. Provides a method for selectively separating only alpha-glucanotransferases.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈는 서열번호 1 또는 서열번호 2인 것이 바람직하나 이들 서열에 하나 이상의 치환, 결손, 전좌, 역위를 통하여 얻어진 돌연변이체 중에서 본 발명의 목적하고자 하는 효소 활성을 가지는 모든 돌연변이체도 본 발명의 범위에 포함된다.In one embodiment of the present invention, the 4-alpha-glucanotransferase is preferably SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, but the present invention among the mutants obtained through one or more substitutions, deletions, translocations, and inversions thereof All mutants having the enzymatic activity of interest are also included in the scope of the present invention.

본 발명의 4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈는 하기의 활성을 가지는 것을 특징으로 한다;4-alpha-glucanotransferase of the present invention is characterized by having the following activity;

1) 말토올리고당 또는 전분을 당공여체로 사용하고 비배당체, 배당체, 또는 말토올리고당 등의 당수용체에 추가적인 말토올리고당을 전이시키는 활성;1) an activity of using maltooligosaccharide or starch as a sugar donor and transferring additional maltooligosaccharides to sugar receptors such as nonglycosides, glycosides, or maltooligosaccharides;

2) 말토올리고당 또는 전분을 당공여체로 사용하고 전분의 가지에 추가적인 말토올리고당을 전이시키는 활성;및 2) using maltooligosaccharides or starch as sugar donors and transferring additional maltooligosaccharides to the branches of starch; and

3) 아밀로오스 또는 이를 포함하는 전분을 기질로 사용하여 사이클로아밀로오스를 제조하는 활성.3) Activity to prepare cycloamylose using amylose or starch comprising the same as a substrate.

또 본 발명은 당 수용체 없이 불용성 당 공여체와 4-알파-글루카노트렌스퍼레이즈 만을 혼합하는 단계를 포함하는 4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈와 불용성 당공여체 복합체 제조 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for producing 4-alpha-glucanotransferase and insoluble sugar donor complex, comprising mixing only an insoluble sugar donor with 4-alpha-glucanotransferase without a sugar acceptor.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 불용성 당공여체는 불용성 아밀로오스 또는 불용성 전분 또는 이들의 화학적 또는 효소적 변형물인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.In one embodiment of the present invention, the insoluble sugar donor is preferably insoluble amylose or insoluble starch or chemical or enzymatic modifications thereof, but is not limited thereto.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 제조방법에 의하여 제조된 4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈-불용성 당공여체 복합체를 제공한다.In another aspect, the present invention provides a 4-alpha-glucanotransferase-insoluble sugar donor complex prepared by the method of the present invention.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 복합체를 이용하여 비배당체, 배당체, 또는 말토올리고당에 추가적인 말토올리고당을 전이시키는 것을 특징으로 하는 당 전이산물의 제조 방법을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a method for producing a sugar transition product, characterized in that the transfer of additional malto oligosaccharides to non-glycosides, glycosides, or maltooligosaccharides using the complex of the present invention.

이하 본 발명을 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described.

본 발명은 친화성 크로마토그래피를 위한 추가적인 펩타이드서열 제공을 위한 유전자 조작 없이 4-알파-글루카노트렌스퍼레이즈와 아밀로오스의 선택적 결합을 이용하여 4-알파-글루카노트렌스퍼레이즈를 간편하게 분리하여 4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈-아밀로오스 복합체를 제공한다.The present invention utilizes the selective binding of 4-alpha-glucanotransferase and amylose without genetic engineering to provide additional peptide sequences for affinity chromatography, thus allowing 4-alpha-glucanotransferases to be easily isolated. Alpha-glucanotransferase-amylose complexes are provided.

본 발명의 명세서에 기재된 4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈 유전자는 서열 번호 3 또는 4에 따른 핵산서열을 갖는 DNA 절편 또는 그 일부에 대하여 서열 동일성, 특히 약 70%, 바람직하게는 약 80%, 특히 약 90%, 특히 약 95%, 가장 바람직하게는 약 98% 이상의 서열동일성을 갖는 유전자를 지칭한다. 이러한 유전자는 천연 산출 또는 합성 돌연변이, 특히 특정위치 변이 또는 무작위 변이를 통해 얻어진 유전자를 포함한다. 또한 목적하는 유전자 분절의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 폴리뉴클레오타이드는 문헌에서 기술되어 있는 공지된 기법에 의해 합성할 수 있다(문헌[Carruthers et al, Cold Spring Harbor Symp.Quant. Biol. 47: 411-418(1982)] 및 문헌[Adams et al., J. Am. Chem. Soc. 105: 661(1983)] 참고). 그 다음, 상보적인 가닥을 합성하고 적당한 조건하에서 가닥을 함께 어닐링하거나 적당한 프라이머 서열과 함께 DNA 폴리머레이즈를 사용하여 상보적인 가닥을 첨가함으로써 이중 가닥 DNA 분절을 수득할 수 있다.The 4-alpha-glucanotransferase gene described herein has sequence identity, in particular about 70%, preferably about 80%, particularly for DNA fragments or portions thereof having a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 3 or 4 It refers to a gene having sequence identity of about 90%, in particular about 95%, most preferably about 98% or more. Such genes include genes obtained through naturally occurring or synthetic mutations, in particular through site variation or random variation. Polynucleotides having the nucleotide sequence of the gene segment of interest can also be synthesized by known techniques described in the literature (Carruthers et al, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47: 411-418 (1982). ) And Adams et al., J. Am. Chem. Soc. 105: 661 (1983). Double stranded DNA segments can then be obtained by synthesizing the complementary strands and annealing the strands together under appropriate conditions or adding complementary strands using DNA polymerase with the appropriate primer sequence.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈는 상기 효소를 보유한 미생물, 식물, 동물에서 분리하거나, 4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈 유전자를 함유한 재조합 대장균 또는 바실러스균에서 얻는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다. 본 발명의 바람직한 예에서는 Thermus thermophilus에서 유래한 4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈와 Thermus scotoducus에서 유래한 4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈 유전자를 함유한 재조합 대장균과 재조합 바실러스균을 사용하였다.In one embodiment of the invention, the 4-alpha-glucanotransferase is isolated from the microorganism, plant, animal carrying the enzyme, or in recombinant E. coli or Bacillus containing the 4-alpha-glucanotransferase gene It is preferable to obtain, but is not limited thereto. In a preferred embodiment of the invention thermus 4-alpha-glucanotransferase and Thermus from thermophilus Recombinant Escherichia coli and recombinant Bacillus bacterium containing 4-alpha-glucanotransferase genes derived from scotoducus were used.

사용된 숙주 세포에 따라, 이러한 세포에 적절한 표준기법을 이용하여 형질전환이 실시된다. 적합한 기법은 염화칼슘을 비롯한 칼슘 처리, 폴리에틸렌 글리콜또는 전기천공을 포함한다.Depending on the host cell used, transformation is carried out using standard techniques appropriate for these cells. Suitable techniques include calcium treatment, including calcium chloride, polyethylene glycol or electroporation.

단백질의 순도 또는 균질성은 당 분야에 공지되어 있는 다수의 방법, 예를 들어 단백질 샘플을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동시키고, 착색시킴으로써 가시화함으로써 밝힐 수 있다. 특정 목적을 위해서는 높은 해상도가 필요하고 정제를 위해서는 HPLC 또는 유사한 수단이 사용된다.The purity or homogeneity of the protein can be revealed by a number of methods known in the art, for example by visualizing the protein sample by polyacrylamide gel electrophoresis and coloring. High resolution is required for certain purposes and HPLC or similar means is used for purification.

본 발명의 수행은 재조합 핵산의 구축 및 형질감염된 박테리아 세포내의 유전자 발현을 포함한다. 이러한 목적을 달성시킬 수 있는 분자의 클로닝 기법은 당 분야에 공지되어 있다. 다수의 클로닝, 및 재조합 핵산, 예를 들어 발현 벡터의 구축을 위해 적당한 시험관내 증폭 방법은 당 분야에 공지되어 있다. 다수의 클로닝 시험을 통해 당 분야의 직접적인 숙련자들을 지도하기에 충분한 이러한 기법 및 기구의 예는 버거(Berger) 및 킴멜(Kimmel)의 문헌[Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA(버거)] 및 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley Sons, Inc., (1994 Supplement)(Ausubel)]에서 발견할 수 있다.The practice of the present invention involves the construction of recombinant nucleic acids and gene expression in transfected bacterial cells. Cloning techniques of molecules that can achieve this goal are known in the art. Many in vitro cloning and in vitro amplification methods suitable for the construction of recombinant nucleic acids such as expression vectors are known in the art. Examples of such techniques and instruments sufficient to direct a person skilled in the art through a number of cloning tests are described in Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc. , San Diego, CA (burger) and Current Protocols in Molecular Biology, FM Ausubel et al., Eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley Sons, Inc., (1994 Supplement) (Ausubel).

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 본 발명의 원하는 4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈-아밀로오스 복합체를 제조하는 방법은 배양 후 원하는 폴리펩타이드 생성물을 배양액 또는 균체 내에서 생산하는 단계를 더욱 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.In one embodiment of the present invention, the method for preparing the desired 4-alpha-glucanotransferase-amylose complex of the present invention further comprises the step of producing a desired polypeptide product in culture or cells after the culture. Preferred but not limited to this.

본 발명의 아밀로오스를 이용하여 4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈를 회수하는 방법은 친화성 크로마토 그래피를 이용하기 위해 유전공학을 통해 추가적인 펩타이드 서열과 대상 효소의 융합없이 높은 수율로 고순도의 4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈의 정제에 유용하다. 4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈는 박테리아 숙주 세포와 동종일 수 있거나, 바람직하게는 숙주 세포와 이종이다. 예컨대, 4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈의 유전자를 클로닝하여 다양한 발현 벡터를 사용하여 효모, 진균, 포유동물 및 식물을 숙주 세균으로 이용하여 4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈을 발현시킬 수 있다. 청구된 4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈-아밀로오스 복합체는 4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈의 효소적 활성을 갖는다. The method for recovering 4-alpha-glucanotransferase using amylose of the present invention is a high-purity 4-alpha- with high yield without fusion of additional peptide sequence and target enzyme through genetic engineering to use affinity chromatography. It is useful for the purification of glucanotransferase. The 4-alpha-glucanotransferase may be homologous to the bacterial host cell or is preferably heterologous to the host cell. For example, genes of 4-alpha-glucanotransferase can be cloned to express 4-alpha-glucanotransferase using various expression vectors using yeast, fungi, mammals and plants as host bacteria. The claimed 4-alpha-glucanotransferase-amylose complex has the enzymatic activity of 4-alpha-glucanotransferase.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명자는 4-알파-글루카노트렌스퍼레이즈가 아밀로오스, 아밀로펙틴 또는 말토올리고당을 당공여체 (sugar donor)로 사용하여 이들이 가지는 알파-1,4-결합을 잘라내어 얻어진 알파-글루칸을 다른 말토올리고당(당수용체, sugar acceptor)의 비환원성 말단의 포도당 4-OH기에 전이하면서 alpha-1,4-결합을 합성하는 활성을 가지지만, 반응액 내 적절한 당수용체가 존재하지 않으면 당공여체로 사용된 기질의 분해가 이루어지지 않는다. 따라서 당수용체 없이 불용성 당공여체 기질과 4-알파-글루카노트렌스퍼레이즈만을 혼합하면 효소가 기질인 아밀로오스에 결합하지만 분해는 이루어지지 않고, 효소-기질 복합체 형태로 반응액 내에 잔존할 것으로 예상되었다. 이러한 점에 착안하여 4-알파-글루카노트렌스퍼레이즈와 불용성 아밀로오스간의 선택적 결합에 의해 4-알파-글루카노트렌스퍼레이즈-아밀로오스 복합체가 형성됨을 확인하였으며, 복합체 형성을 통해 조효소액 또는 부분정제된 효소액으로부터 순수한 4-알파-글루카노트렌스퍼레이즈만을 선택적으로 회수할 수 있으며, 복합체를 이용하여 다양한 4-알파-글루카노트렌스퍼레이즈의 반응을 촉매할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
The present inventors use alpha-glucan obtained by cutting alpha-1,4-linkages of 4-alpha-glucanotransferase using amylose, amylopectin, or malto oligosaccharide as a sugar donor to other malto oligosaccharides (sugars). It has the activity of synthesizing alpha-1,4-linkages by transferring glucose 4-OH groups at the non-reducing end of the sugar acceptor), but without the appropriate sugar receptor in the reaction solution, degradation of the substrate used as a sugar donor Is not made. Therefore, when only the insoluble sugar donor substrate and 4-alpha-glucanotransferase were mixed without the sugar acceptor, the enzyme binds to amylose as a substrate, but was not degraded, and remained in the reaction solution in the form of an enzyme-substrate complex. With this in mind, it was confirmed that 4-alpha-glucanotransferase-amylose complex was formed by selective binding between 4-alpha-glucanotransferase and insoluble amylose, and coenzyme solution or partially purified through complex formation. Only pure 4-alpha-glucanotransferase can be selectively recovered from the enzyme solution, and the complex can be used to catalyze the reaction of various 4-alpha-glucanotransferases, thereby completing the present invention. It became.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에서는 4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈를 포함하는 조효소액으로부터 상기 4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈와 아밀로오스간의 친화성을 기반으로 하는 4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈 정제공정을 제공한다. 또한 본 발명에서 제공하는 정제공정을 통해 얻어지는 정제된 4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈를 상기 효소의 당공여체인 아밀로오스와의 복합체 형태로 회수하여 추가적인 당공여체의 첨가 없이 소당류 또는 배당체의 당쇄를 가공할 수 있는 4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈-아밀로오스 복합체를 제공한다. 상기 4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈-아밀로오스 복합체를 이용하여 원하는 당전이산물을 제조 및 상기 복합체를 이용하여 변성전분을 제조하는 등에 널리 사용될 수 있다.
As described above, in the present invention, 4-alpha-glucanotransferase purification process based on the affinity between the 4-alpha-glucanotransferase and amylose from the coenzyme solution containing 4-alpha-glucanotransferase. To provide. In addition, the purified 4-alpha-glucanotransferase obtained through the purification process provided in the present invention is recovered in the form of a complex with amylose, a sugar donor of the enzyme, to process sugar chains of a small sugar or glycoside without the addition of a further sugar donor. 4-alpha-glucanotransferase-amylose complexes are provided. The 4-alpha-glucanotransferase-amylose complex may be widely used for preparing a desired sugar transition product and for producing modified starch using the complex.

도 1은 pTKTTaGT 벡터 개열지도이다.
도 2는 pTKTTaGT-P4CCG 벡터 개열지도이며 코돈최적화된 Pro4의 코돈을 나타낸다.
도 3은 pTKTTaGT-6M 벡터 개열지도이며 코돈최적화된 6개의 아미노산에 대한 코돈을 나타낸다.
도 4는 야생형 및 코돈최적화된 재조합 TTaGT의 조효소액 내 발현양 비교를 위한 SDS-PAGE 결과사진으로 WT, wild type TTaGT의 조효소액, TTaGT; P4CCG, Pro4에 대한 코돈최적화된 TTaGT-P4CCG의 조효소액; 6M, 총 6개의 아미노산에 대한 코돈최적화된 TTaGT-6M의 조효소액을 나타낸다.
도 5는 TTaGT-6M 조효소액, 복합체 형성 후 회수된 상등액, 복합체 내 TTaGT의 SDS-PAGE 결과사진으로 C, TTaGT6M 조효소액; S, 15 mg 아밀로오스와 결합 후 회수된 상등액 내 잔존 TTaGT6M; P, 15 mg 아밀로오스와 결합된 TTaGT-6M을 각각 나타낸다.
도 6은 TTaGT 조효소액을 열처리 후 TTaGT 조효소액, 열처리 후 2배, 4배, 6배, 및 8배 농축한 농축 조효소액을 이용하여 복합체 형성 효율을 분석한 SDS-PAGE 결과사진으로 H, 열처리된 TTaGT-6M 효소액; S, 15 mg 아밀로오스와 결합 후 상등액 내 TTaGT-6M; P, 15 mg 아밀로오스와 결합된 TTaGT-6M을 각각 나타낸다.
도 7은 pUBRTA-TTaGT6M의 벡터의 개열지도를 나타낸다.
도 8은 TTaGT-아밀로오스 복합체를 이용한 당전이 반응을 나타낸 그림으로, STD, 글루코오스, 말토오스, 말토트리오스; C, 순수 정제된 TTaGT 효소액을 사용하고 0.1% 아밀로오스와 0.2% 말토오스를 기질로 사용한 당전이 반응산물; R, TTaGT-아밀로오스 복합체를 사용하고 0.2% 말토오스만을 기질로 사용한 당전이 반응산물을 나타낸다.
도 9는 동결건조한 TTaGT-아밀로오스 복합체의 당전이 반응을 나타낸 그림으로, STD, 글루코오스(G1), 말토오스(G2), 말토트리오스(G3), 말토테트라오스(G4), 말토펜타오스(G5), 말토헥사오스(G6), 말토헵타오스(G7); C, 조효소액을 사용한 당전이 반응산물; R1, TTaGT-아밀로오스 복합체를 사용한 당전이 반응산물; R2, 동결건조된 TTaGT-아밀로오스 복합체를 사용한 당전이 반응산물을 각각 나타낸다.1 is a pTKTTaGT vector cleavage map.
Figure 2 is a pTKTTaGT-P4CCG vector cleavage map and shows the codons of codon optimized Pro4.
Figure 3 is a pTKTTaGT-6M vector cleavage map showing the codons for the six codon optimized amino acids.
Figure 4 is a SDS-PAGE results for comparing the expression in the coenzyme solution of wild-type and codon-optimized recombinant TTaGT coenzyme solution of WT, wild type TTaGT, TTaGT; Coenzyme solution of codon-optimized TTaGT-P4CCG for P4CCG, Pro4; The coenzyme solution of codon optimized TTaGT-6M for 6M and a total of 6 amino acids is shown.
5 is TTaGT-6M coenzyme solution, supernatant recovered after complex formation, C, TTaGT6M coenzyme solution as a result of SDS-PAGE of TTaGT in the complex; S, remaining TTaGT6M in supernatant recovered after binding to 15 mg amylose; P, TTaGT-6M bound with 15 mg amylose, respectively.
FIG. 6 is a SDS-PAGE photograph showing the efficiency of complex formation using TTaGT coenzyme solution after heat treatment, TTaGT coenzyme solution, concentrated coenzyme solution concentrated 2, 4, 6, and 8 times after heat treatment. TTaGT-6M enzyme solution; S, TTaGT-6M in supernatant after binding to 15 mg amylose; P, TTaGT-6M bound with 15 mg amylose, respectively.
7 shows a cleavage map of the vector of pUBRTA-TTaGT6M.
8 is a diagram showing a sugar transfer reaction using the TTaGT-amylose complex, STD, glucose, maltose, maltotriose; C, a sugar transition reaction product using pure purified TTaGT enzyme solution and using 0.1% amylose and 0.2% maltose as a substrate; The sugar transition reaction product using R, TTaGT-amylose complex and using only 0.2% maltose as substrate is shown.
9 is a diagram showing the sugar transfer reaction of the lyophilized TTaGT-amylose complex, STD, glucose (G1), maltose (G2), maltotriose (G3), maltotetraose (G4), maltopentaose (G5) , Maltohexaose (G6), maltoheptaose (G7); C, sugar transfer reaction product using the crude enzyme solution; Sugar transition reaction products using R1, TTaGT-amylose complex; The sugar transition reaction products using R2, lyophilized TTaGT-amylose complex are shown respectively.

이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.The present invention will now be described in more detail by way of non-limiting examples. The following examples are intended to illustrate the invention and the scope of the invention is not to be construed as being limited by the following examples.

실시예 1: E. coli 형질전환Example 1 E. coli Transformation

형질전환을 위하여, 5 ml LB 액체 배지에 숙주 세포인 E. coli MC1016(New England Biolab(NEB), USA)를 접종하여 37℃에서 12시간 배양하고, 배양액 1.0 ml을 새로운 LB 액체 배지 50 ml에 접종하여 600 nm에서 흡광도가 0.5가 될 때까지 배양하였다. For transformation, 5 ml LB liquid medium was inoculated with host cell E. coli MC1016 (New England Biolab (NEB), USA) and incubated at 37 ° C. for 12 hours, and 1.0 ml of the culture was added to 50 ml of fresh LB liquid medium. Inoculation was incubated at 600 nm until the absorbance became 0.5.

상기 흡광도를 확인한 배양액 1.5 ml를 4℃에서 7000 x g의 조건으로 5분간 원심분리하여 균체를 회수한 뒤, 0.75 ml의 형질전환용액I(50 mM CaCl2)으로 현탁하고 얼음 속에서 30분간 방치하였다. 이후 4℃에서 6000 x g의 조건으로 2분간 원심분리하여 균체를 회수하고, 회수된 균체를 0.15 ml의 형질전환용액II(100 mM CaCl2)로 현탁하여 얼음 속에서 30분간 방치하였다. 형질전환할 DNA 시료를 상기 형질전환용 E. coli MC1061 0.2 ml과 혼합하고, 1시간 방치한 후 42℃에서 2분간 열 충격을 주었다. 상기 열 충격을 준 혼합액에 0.8 ml의 LB 액체 배지를 혼합한 후, 37℃에서 1시간 배양시켰다. 상기 1시간 동안 배양한 배양액을 암피실린(최종농도 20 ㎍/ml)을 함유한 LB 한천 배지에 평판 도말하여 내성을 보이는 균주를 1차 선별하였다.
The cells were recovered by centrifuging 1.5 ml of the culture medium for which the absorbance was confirmed at 4 ° C. under 7000 × g for 5 minutes, and then suspended with 0.75 ml of transformation solution I (50 mM CaCl 2 ) and left for 30 minutes in ice. . Thereafter, the cells were recovered by centrifugation at 4 ° C. under 6000 × g for 2 minutes, and the recovered cells were suspended in 0.15 ml of Transfection Solution II (100 mM CaCl 2 ) and left in ice for 30 minutes. The DNA sample to be transformed was mixed with 0.2 ml of the E. coli MC1061 for transformation, and left to stand for 1 hour, followed by heat shock at 42 ° C. for 2 minutes. 0.8 ml of the LB liquid medium was mixed with the heat shocked mixed solution, followed by incubation at 37 占 폚 for 1 hour. The cultures incubated for 1 hour were plated on LB agar medium containing ampicillin (final concentration 20 μg / ml), and strains showing resistance were first selected.

실시예 2: Thermus thermophilus 4-alpha-glucanotransferase(TTaGT) 발현Example 2: Thermus thermophilus 4-alpha-glucanotransferase (TTaGT) Expression

2-1. 중합효소 연쇄반응(PCR)을 통한 TTaGT의 증폭2-1. Amplification of TTaGT by Polymerase Chain Reaction (PCR)

TTaGT 유전자를 가지는 TTHA1261 유전자를 증폭하기 위하여 NdeI 제한효소 자리를 가지는 정방향 프라이머 TTHA1261-Nd-fw primer(서열번호 5)와 NotI 제한효소 자리를 가지는 역방향 프라이머 TTHA1261-Nt-rv primer(서열번호 6)를 각각 제작 하였으며, 상기 프라이머는 하기 표 1과 같다.To amplify the TTHA1261 gene with TTaGT gene, the forward primer TTHA1261-Nd-fw primer (SEQ ID NO: 5) and the reverse primer TTHA1261-Nt-rv primer (SEQ ID NO: 6) with NotI restriction enzyme site were identified. Each was prepared, the primers are shown in Table 1 below.

서열order 서열번호SEQ ID NO: 정방향 프라이머
TTHA1261-Nd-fw Forward primer
TTHA1261-Nd-fw 5-GGGTATAATGGGCATATGGAGCTTCCCCGC-35-GGGTATAATGGGCATATGGAGCTTCCCCGC-3 55 역방향 프라이머
TTHA1261-Nt-rvReverse primer
TTHA1261-Nt-rv 5-CCCGGTCTGTGCGGCCGCGAGCCGTTCCGTGGC-35-CCCGGTCTGTGCGGCCGCGAGCCGTTCCGTGGC-3 66

상기 NdeI과 NotI제한효소 자리를 가지는 aGT 유전자를 증폭하기 위하여 TTHA1261에 대해 상기 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하여 PCR 산물을 획득하였으며, 전기영동을 통하여 상기 PCR 산물의 크기가 1.5 kb임을 확인하였다. 상기 PCR의 조건은 하기 표 2에 기재된 바와 같다.In order to amplify the aGT gene having the NdeI and NotI restriction enzyme sites, PCR products were obtained by PCR using the forward and reverse primers on TTHA1261, and PCR products were obtained by electrophoresis. It was confirmed that the size of 1.5 kb. The conditions of the PCR are as described in Table 2 below.

단계step 온도Temperature 반응시간Reaction time First denaturationFirst denaturation 94 94 5 min5 min Cycle
(30 cycles)Cycle
(30 cycles) DenaturationDenaturation 94 94 1 min1 min AnnealingAnnealing 55 55 2 min2 min ExtensionExtension 72 72 1 min1 min Final extensionFinal extension 72 72 7 min7 min

2-2. 2-2. TTaGTTTaGT 유전자의 Gene 클로닝Cloning

상기 TTaGT 유전자를 포함하는 PCR 산물과 pTKNd6xHT119 벡터를 동일 제한효소 NdeI과 NotI으로 각각 절단한 뒤 라이게이션 하고, 라이게이션 혼합물을 상기 실시예 1에 따라 E. coli에 형질전환하여 가나마이신(최종농도 20 ㎍/ml)을 함유한 LB 한천 배지에 평판 도말하여 내성을 보이는 균주를 1차 선별하였다. 1차 선발된 재조합 E. coli를 가나마이신(최종농도 20 ㎍/ml)을 함유한 [1% (w/v) Bacto tryptone, 0.5% (w/v) Bacto yeast extract, 0.5% (w/v) NaCl]에 접종하고 37℃에서 15시간 배양하고 10,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 균체를 회수하였다. 플라스미드 분리 키트를 이용하여 회수된 균체로 재조합 플라스미드를 얻고, NdeI과 NotI으로 절단하고 아가로스 겔 전기영동을 통해 TTaGT 유전자에 해당하는 1.5 kb의 유전자 절편을 포함하는 제조합 플라스미드를 확인하였다. 상기 TTaGT 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드를 pTKTTaGT로 명명하였다. 상기 재조합 벡터 pTKTTaGT의 벡터 개열지도를 도 1에 나타내었다.
The PCR product containing the TTaGT gene and the pTKNd6xHT119 vector were digested with the same restriction enzymes NdeI and NotI, respectively, and ligated, and the ligation mixture was transformed into E. coli according to Example 1 to kanamycin (final concentration 20). Strains were plated on LB agar medium containing μg / ml) and the strains showing resistance were first selected. The first selected recombinant E. coli was [1% (w / v) Bacto tryptone, 0.5% (w / v) Bacto yeast extract, 0.5% (w / v) containing kanamycin (final concentration 20 μg / ml). ) And incubated for 15 hours at 37 ℃ and centrifuged for 5 minutes at 10,000 rpm to recover the cells. Recombinant plasmids were obtained from the recovered cells using the plasmid separation kit, digested with NdeI and NotI, and agarose gel electrophoresis was performed to identify a pre-assembled plasmid including a 1.5 kb gene fragment corresponding to the TTaGT gene. The recombinant plasmid containing the TTaGT gene was named pTKTTaGT. A vector cleavage map of the recombinant vector pTKTTaGT is shown in FIG. 1.

2-3. 2-3. TTaGTTTaGT 유전자 내 1개 코돈 최적화 1 codon optimization in gene

발현율을 높이기 위해 상기 TTaGT 네 번째 Proline 잔기(Pro4)를 암호화하는 코돈 CCC를 E. coli와 B. subtilis에서 최적화된 CCG로 최적화하였다. 이를 위하여 정방향 프라이머 TTGT-P4CCG-F primer(5-AAGGGGGAAACCATATGATGGAGCTTCCGCGCGCT-3, 서열번호7)와 역방향프라이머 T7 terminator primer(5-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3, 서열번호 8)를 각각 제작하였으며, 상기 프라이머는 하기 표 3와 같다.Codon CCC encoding the TTaGT fourth Proline residue (Pro4) was optimized with optimized CCG in E. coli and B. subtilis to increase the expression rate. For this purpose, a forward primer TTGT-P4CCG-F primer (5-AAGGGGGAAACCATATGATGGAGCTTCCGCGCGCT-3, SEQ ID NO: 7) and a reverse primer T7 terminator primer (5-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3, SEQ ID NO: 8) were prepared, respectively. same.

서열order 서열번호SEQ ID NO: 정방향 프라이머
TTGT-P4CCG-FForward primer
TTGT-P4CCG-F 5-AAGGGGGAAACCATATGATGGAGCTTCCGCGCGCT-35-AAGGGGGAAACCATATGATGGAGCTTCCGCGCGCT-3 77 역방향 프라이머
T7 terminatorReverse primer
T7 terminator 5-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-35-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3 88

상기 2-2에서 얻어진 재조합 플라스미드 pTKTTaGT에 대하여 상기 정방향 프라이머(서열번호 7)및 역방향 프라이머(서열번호 8)를 이용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하여 PCR 산물을 획득하였으며, 전기영동을 통하여 상기 PCR 산물의 크기가 1.5 kb임을 확인하였다. 상기 PCR의 조건은 상기 표 2 에 기재된 바와 같다.The PCR plasmid pTKTTaGT obtained in 2-2 was subjected to polymerase chain reaction (PCR) using the forward primer (SEQ ID NO: 7) and the reverse primer (SEQ ID NO: 8) to obtain a PCR product, and was subjected to electrophoresis. The PCR product was confirmed to be 1.5 kb in size. The conditions of the PCR are as described in Table 2 above.

확보된 상기 PCR산물을 상기 실시예 2-2와 동일하게 라이게이션 하고 E. coli 형질전환하여 Pro4를 암호화하는 코돈이 최적화된 TTaGT 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 pTKTTaGT-P4CCG를 제조하였다. 상기 재조합 벡터 pTKTTaGT-P4CCG의 벡터 개열지도를 도 2에 나타내었다.
The PCR product thus obtained was ligated in the same manner as in Example 2-2, and the recombinant plasmid pTKTTaGT-P4CCG including the codon-optimized TTaGT gene encoding Pro4 was prepared by E. coli transformation. A vector cleavage map of the recombinant vector pTKTTaGT-P4CCG is shown in FIG. 2.

2-4. 2-4. TTaGTTTaGT 유전자 내 6개  6 in the gene 선택코돈Codon 최적화 optimization

상기 TTaGT의 Pro4, Leu11, Pro13, Leu16, Pro17, 및 Pro19을 암호화하는 코돈이 최적화된 TTaGT 유전자를 제조하기 위하여 상기 아미노산 잔기의 코돈이 E. coli와 B. subtilis에 대하여 최적화된 선택된 6개의 코돈중 나머지 5개의 코돈 최적화는 앞부분과 뒷부분을 나누어 PCR을 한 산물을 합쳐서 완성하는 방법을 사용하였고 앞부분의 PCR을 위해 정방향 프라이머 ATGseq primer(서열번호 9)와 역방향 프라이머 TTGT-mut6-R primer (서열번호 10)를 각각 제작하였고, 뒷부분의 PCR을 위해 정방향 프라이머 TTGT-mut6-F primer(서열번호 8)와 역방향 프라이머 T7 terminator primer(서열번호 11)를 각각 제작하였으며, 프라이머 서열은 하기 표 4와 같다. Of the six selected codons, the codons of the amino acid residues were optimized for E. coli and B. subtilis to produce TTaGT genes optimized for codons encoding Pro4, Leu11, Pro13, Leu16, Pro17, and Pro19 of the TTaGT. The remaining five codon optimizations were performed by dividing the PCR product by splitting the front part and the rear part.For forward PCR, the forward primer ATGseq primer (SEQ ID NO: 9) and the reverse primer TTGT-mut6-R primer (SEQ ID NO: 10 ) Were prepared, respectively, and a forward primer TTGT-mut6-F primer (SEQ ID NO: 8) and a reverse primer T7 terminator primer (SEQ ID NO: 11) were prepared for PCR at the back, and the primer sequences are shown in Table 4 below.

서열order 서열번호SEQ ID NO: 정방향 프라이머
ATGseqForward primer
ATGseq 5-ATCGACTTTGTAGGGT-35-ATCGACTTTGTAGGGT-3 99 역방향 프라이머
TTGT-mut6-RReverse primer
TTGT-mut6-R 3-CCAGACGAAGACGTGGGCTGCTCGGAGGGCCCGGGC-53-CCAGACGAAGACGTGGGCTGCTCGGAGGGCCCGGGC-5 1010 정방향 프라이머
TTGT-mut6-FForward primer
TTGT-mut6-F 5-CCGACGAGCCTGCCGGGCCCGTACGGCGTCGGC-35-CCGACGAGCCTGCCGGGCCCGTACGGCGTCGGC-3 1111

상기 2-3에서 얻어진 플라스미드 pTKTTaGT-P4CCG에 대해 상기 정방향 프라이머 ATGSseq(서열번호 9)및 역방향 프라이머 TTGT-mut6-R (서열번호 10)를 이용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하여 앞부분의 PCR 산물을 획득하였으며, 동일 플라스미드에 대해 상기 정방향 프라이머 TTGT-mut6-F(서열번호 11)및 역방향 프라이머 T7 terminator(서열번호 8)를 이용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하여 앞부분의 PCR 산물을 획득하였다. 상기 PCR 산물이 가지는 서로 상보적인 서열을 이용하여 두 산물을 다시 PCR을 통해 합친 후 전기영동을 통하여 상기 PCR 산물의 크기가 1.5 kb임을 확인하였다. 상기 PCR의 조건은 상기 표 2에 기재된 바와 같다. The plasmid pTKTTaGT-P4CCG obtained in the above 2-3 was subjected to a polymerase chain reaction (PCR) using the forward primer ATGSseq (SEQ ID NO: 9) and the reverse primer TTGT-mut6-R (SEQ ID NO: 10) to perform PCR of the previous part. The product was obtained, and the same PCR product was subjected to polymerase chain reaction (PCR) using the forward primer TTGT-mut6-F (SEQ ID NO: 11) and the reverse primer T7 terminator (SEQ ID NO: 8). Obtained. Using the complementary sequences of the PCR products, the two products were combined by PCR again, and the size of the PCR product was confirmed to be 1.5 kb through electrophoresis. The conditions of the PCR are as described in Table 2 above.

확보된 상기 PCR산물을 상기 실시예 2-2를 통해 라이게이션 하여 6개의 선택 코돈이 모두 최적화된 pTKTTaGT-6M를 제조하였다. 상기 재조합 벡터 pTKTTaGT-6M 의 벡터 개열지도를 도 3에 나타내었다.
The obtained PCR product was ligated through Example 2-2 to prepare pTKTTaGT-6M in which all six selection codons were optimized. The vector cleavage map of the recombinant vector pTKTTaGT-6M is shown in FIG. 3.

2-5. 재조합 E. 2-5. Recombinant E. colicoli 에서 in TTaGTTTaGT 의 생산Production of

상기 실시예 2-2, 2-3 및 2-4을 통해 얻어진 재조합 벡터 pTKTTaGT, pTKTTaGT-P4CCG, 및 pTKTTaGT-6M을 상기 실시예 1에 따라서 E. coli에 형질전환하고 형질전환체들 (E. coli MC1061/pTKTTaGT, E. coli MC1061/pTKTTaGT-P4CCG, E. coli MC1061/pTKTTaGT-6M)을 가나마이신(최종농도 20 ㎍/ml)을 함유하는 LB 배지 100 mL에 접종하고 37℃에서 15시간 배양하였다. Recombinant vectors pTKTTaGT, pTKTTaGT-P4CCG, and pTKTTaGT-6M obtained in Examples 2-2, 2-3, and 2-4 were transformed into E. coli according to Example 1, and transformants (E. coli MC1061 / pTKTTaGT, E. coli MC1061 / pTKTTaGT-P4CCG, E. coli MC1061 / pTKTTaGT-6M) were inoculated into 100 mL of LB medium containing kanamycin (final concentration 20 μg / ml) and incubated at 37 ° C. for 15 hours. It was.

배양액을 4℃에서 7,000 x g의 조건으로 15분간 원심분리하여 균체를 회수하였다. 상기 회수된 균체를 10 mL의 50 mM Tris-HCl 완충용액(pH 7.0)으로 현탁한 후, 상기 현탁한 균체를 초음파 분쇄하였다. 상기 초음파 분쇄를 수행한 배양액을 10,000 x g의 조건으로 20분간 원심분리하여 상등액을 취하여 각 형질전환체로부터 TTaGT 조효소액을 제조하였다.
The cells were centrifuged at 4 ° C. under 7,000 × g for 15 minutes to recover the cells. The recovered cells were suspended in 10 mL of 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0), and the suspended cells were ultrasonically ground. The supernatant was obtained by centrifuging the culture solution subjected to the ultrasonic grinding for 20 minutes under conditions of 10,000 xg to prepare a TTaGT coenzyme solution from each transformant.

실시예Example 3: 코돈 최적화에 따른  3: codon optimization TTaGTTTaGT 효소 생산량 비교 Enzyme Production Comparison

상기 실시예 2-5에서 얻어진 조효소액을 적절하게 희석하고, 0.05% (w/v) maltose와 0.05% (w/v) 아밀로스가 함유된 기질용액 900 ㎕와 희석된 조효소액 100 ㎕를 섞고 70℃에서 10분간 반응시킨 후, 10분간 중탕가열하여 반응을 정지시켰다. 상기 반응액 100 ㎕에 0.02% I2, 0.2% KI를 물에 녹여 제조한 아이오다인 용액 1 mL을 첨가하고 스펙트로포토미터 (UV-160A, Shimazu, Japan)을 이용하여 620 nm에서 흡광도를 측정하여 분해된 amylose의 함량을 계산하였다. 1 유닛의 4-알파-글루카노트렌스퍼레이즈 활성은 분당 1㎍/mL의 아밀로스를 분해하는 효소량으로 결정하였다. TTaGT의 효소활성 측정결과는 하기 표 5와 같다.Dilute the coenzyme solution obtained in Example 2-5 appropriately, mix 900 μl of substrate solution containing 0.05% (w / v) maltose and 0.05% (w / v) amylose, and 100 μl of the diluted coenzyme solution. After reacting at 10C for 10 minutes, the reaction was stopped by heating in a bath for 10 minutes. To 100 μl of the reaction solution, add 1 mL of an iodide solution prepared by dissolving 0.02% I 2 and 0.2% KI in water, and measure absorbance at 620 nm using a spectrophotometer (UV-160A, Shimazu, Japan). The content of digested amylose was calculated. One unit of 4-alpha-glucanotransferase activity was determined by the amount of enzyme that degrades 1 μg / mL amylose per minute. The results of enzyme activity of TTaGT are shown in Table 5 below.

형질전환체Transformant 부피
(ml)volume
(ml) 활성
(U/ml)activation
(U / ml) 총활성 (U)Total activity (U) 단백질
(mg/ml)protein
(mg / ml) 총단백질 (mg)Total protein (mg) 비효소활성
(U/mg)Non-enzymatic activity
(U / mg) E. coli /pTKTTaGTE. coli / pTKTTaGT 1010 0.490.49 4.94.9 2.652.65 26.526.5 0.180.18 E. coli /pTKTTaGT-P4CCGE. coli / pTKTTaGT-P4CCG 1010 4646 460460 2.942.94 29.429.4 15.6515.65 E. coli /pTKTTaGT-6ME. coli / pTKTTaGT-6M 1010 4848 480480 3.053.05 30.530.5 15.7415.74

상기 결과로부터 코돈최적화된 TTaGT 유전자로부터 발현된 TTaGT의 양이 최적화 이전에 비해 약 100배 증가하였음을 알 수 있다.From the above results, it can be seen that the amount of TTaGT expressed from the codon-optimized TTaGT gene is increased by about 100 times compared to before the optimization.

상기 실시예 2-5에서 얻어진 조효소액을 Acrylamide/Bis(33.5%,0.5%) 1.4 ml, 1M Tris-HCl(pH 9.1) 2.28 ml, D.W 2.08 ml, 10% SDS 0.06 ml, 3% APS 0.15 ml, TEMED 0.03 ml로 SDS-PAGE gel을 만들어 전기영동을 실시하였다. 상기 SDS-PAGE로 분석한 결과는 도 4에 나타내었다. SDS-PAGE 분석결과에서도 상기 효소활성 측정에서와 같이 TTaGT에 해당하는 단백질의 발현양이 코돈 최적화후 크게 증가하였음을 알 수 있다.
The crude enzyme solution obtained in Example 2-5 was 1.4 ml of Acrylamide / Bis (33.5%, 0.5%), 2.28 ml of 1M Tris-HCl (pH 9.1), DW 2.08 ml, 0.06 ml of 10% SDS, 0.15 ml of 3% APS. , TEMED 0.03 ml SDS-PAGE gel was made by electrophoresis. The result of analysis by SDS-PAGE is shown in FIG. 4. In the results of SDS-PAGE analysis, it can be seen that the expression level of the protein corresponding to TTaGT was significantly increased after codon optimization as in the enzyme activity measurement.

실시예Example 4:  4: TTaGTTTaGT -아밀로오스 복합체Amylose complex

4-1. 4-1. TTaGTTTaGT -아밀로오스 복합체의 제조Preparation of Amylose Complex

상기 실시예 2-5에서 제조된 조효소액 중 E. coli MC1061/pTKTTaGT-6M로부터 얻어진 조효소액을 이용하여 하기 실시예를 수행하였다. 상기 조효소액 0.1 mL (** Unit)를 15 mg 아밀로오스를 함유한 0.4 mL의 50 mM Tris-HCl 완충용액(pH 7.0)과 섞은 후, 4℃에서 매 15분마다 잘 섞어주면서 2시간 반응하였다. 반응이 완료되면 10,000 x g의 조건으로 5분간 원심분리하고, 상등액을 제거하여 TTaGT-아밀로오스 복합체를 제조하였다.
The following example was performed using the coenzyme solution obtained from E. coli MC1061 / pTKTTaGT-6M in the coenzyme solution prepared in Example 2-5. 0.1 mL (** Unit) of the coenzyme solution was mixed with 0.4 mL of 50 mM Tris-HCl buffer solution (pH 7.0) containing 15 mg amylose, and reacted for 2 hours while mixing well at 4 ° C. every 15 minutes. After the reaction was completed, centrifuged for 5 minutes under conditions of 10,000 xg, and the supernatant was removed to prepare a TTaGT-amylose complex.

4-2. 아밀로스에 4-2. Amylose 결합된Combined TTaGTTTaGT 의 효소활성 측정Enzyme activity

상기 실시예 6-1에서 얻어진 상등액을 일정비율 희석하여 상기 실시예 5에 따라서 TTaGT의 효소활성을 측정하였다. 측정된 효소활성 및 단백질양을 조효소액의 효소할성 및 단백질양에서 각각 감하여 복합체 내 효소활성과 단백질양을 결정하였다. 조효소액과 복합체 내 효소활성 및 단백질양에 따른 정제표를 하기 표 6에 나타내었다.The supernatant obtained in Example 6-1 was diluted by a certain ratio to measure the enzyme activity of TTaGT according to Example 5. The measured enzyme activity and protein amount were subtracted from the enzyme activity and protein amount of the crude enzyme solution, respectively, to determine the enzyme activity and protein amount in the complex. The purification table according to the enzyme activity and protein amount in the complex with the crude enzyme solution is shown in Table 6 below.

SampleSample 부피
(ml)volume
(ml) 활성
(U/ml)activation
(U / ml) 총활성
(U)Total activity
(U) 단백질양
(mg/ml)Protein amount
(mg / ml) 총단백질양 (mg)Total protein amount (mg) 비효소활성
(U/mg)Non-enzymatic activity
(U / mg) 수율
(%)yield
(%) 정제도Purification degree 조효소액Crude enzyme solution 0.50.5 10.83810.838 5.425.42 0.720.72 0.360.36 15.06415.064 100100 1One 상등액*Supernatant * 0.50.5 3.8163.816 1.9081.908 0.6320.632 0.3160.316 6.0316.031 -- -- 복합체**Complex ** -- -- 3.513.51 -- 0.040.04 81.0581.05 64.864.8 5.35.3

* 상등액 : 복합체 형성 후, 원심분리를 통해 얻어진 상등액 (복합체를 이루지 못한 효소액)* Supernatant: Supernatant obtained through centrifugation after complex formation (enzyme solution that did not form a complex)

** 복합체 : 조효소액의 총활성과 총단백질양에서 상등액의 총효소활성과 총단백질양을 각각 뺀 총효소활성 또는 총단백질양
** Complex: Total enzyme activity and total protein amount of superenzyme minus total enzyme activity and total protein amount of supernatant

상기 표 6에 따라 TTaGT가 아밀로오스에 결합하여 상등액 내 되는 것을 확인 하였고, 계산된 복합체 내 TTaGT의 비효소활성이 81.05 U/mg으로 조효소액의 비효소활성에 비해 5배 가량 증가하였으며, 총 효소활성을 비교한 결과 64%의 수율로 TTaGT가 아밀로오스에 결합한 복합체 형태로 회수되었음을 확인하였다. According to Table 6, it was confirmed that TTaGT binds to amylose and is in the supernatant. The calculated non-enzymatic activity of TTaGT in the complex was 81.05 U / mg. As a result, TTaGT was recovered in the form of a complex bound to amylose in a yield of 64%.

상기 실험을 통해 얻어진 조효소액, 상등액, 및 복합체 내 TTaGT를 상기 실시예 3에서와 같이 SDS-PAGE 전기영동을 실시하였고, 상기 SDS-PAGE 사진을 도 5에 나타내었다. 상기 도 5 결과로부터 TTaGT가 매우 선택적으로 아밀로오스와 결합하여 복합체 내에 존재함을 확인할 수 있다.
SDS-PAGE electrophoresis was performed on the coenzyme solution, the supernatant, and the complex TTaGT obtained in the above experiment as in Example 3, and the SDS-PAGE image is shown in FIG. 5. It can be seen from the results of FIG. 5 that TTaGT is present in the complex in combination with amylose very selectively.

실시예Example 5:  5: 열처리된Heat-treated TTaGTTTaGT 를 이용한 복합체 제조Composite Preparation Using

5-1. 5-1. TTaGTTTaGT 조효소액의Coenzyme 열처리 및 농축 Heat treatment and concentration

아밀로오스에 결합하는 TTaGT의 양을 늘리기 위해 반응액 내 TTaGT의 효소양을 늘리기 위해 효소액을 농축하였다. 농축하기 전에 먼저 조효소액을 열처리한 후, 4℃, 10,000 x g의 조건으로 20분간 원심분리하여 열변성된 E. coli의 단백질을 제거하였다. 상기 얻어진 열처리 효소액을 상기 실시예 3에 따라 TTaGT의 효소양을 측정하여 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다. In order to increase the amount of TTaGT binding to amylose, the enzyme solution was concentrated to increase the amount of TTaGT enzyme in the reaction solution. Before concentration, the crude enzyme solution was first heat-treated, and then centrifuged at 4 ° C. and 10,000 × g for 20 minutes to remove the denatured protein of E. coli. The obtained heat treatment enzyme solution was measured in accordance with Example 3 the amount of enzyme TTaGT and the results are shown in Table 7 below.

시료sample 부피
(ml)volume
(ml) 활성
(U/ml)activation
(U / ml) 총활성
(U)Total activity
(U) 단백질양
(mg/ml)Protein amount
(mg / ml) 총단백질양 (mg)Total protein amount (mg) 비효소활성
(U/mg)Non-enzymatic activity
(U / mg) 수율
(%)yield
(%) 정제도Purification degree 조효소액Crude enzyme solution 6.26.2 11.36611.366 70.46970.469 1.1711.171 7.267.26 9.7069.706 100100 1One 60, 20분60, 20 minutes 6.26.2 11.67411.674 72.37972.379 0.2950.295 1.8291.829 39.57339.573 102.7102.7 4.14.1 70, 10분70, 10 minutes 6.26.2 12.96612.966 80.38980.389 0.2260.226 1.4011.401 57.37257.372 114.1114.1 5.95.9 70, 20분70, 20 minutes 6.26.2 14.10414.104 87.44587.445 0.2160.216 1.3391.339 65.29665.296 124.1124.1 6.76.7

상기 표 6에 따라 열처리를 통해 내열성 TTaGT의 부분 정제가 이루어짐을 확인하였으며, 하기 실험은 pH 7.0, 온도는 70℃, 열처리시간은 20분의 조건에서 열처리되어 얻어진 TTaGT 시료를 사용하였다. It was confirmed that the partial purification of the heat-resistant TTaGT through the heat treatment according to Table 6, the following experiment was used a TTaGT sample obtained by heat treatment at the conditions of pH 7.0, temperature 70 ℃, heat treatment time 20 minutes.

5-2. 열처리 5-2. Heat treatment TTaGTTTaGT 를 이용한 복합체 제조Composite Preparation Using

상기 얻어진 열처리 TTaGT 효소액을 Ultrafiltration을 통해 농축하였다. 상기 농축된 효소액을 실시예 6에 따라 15 mg의 아밀로오스와 결합시킨 뒤, 상등액과 복합체를 원심분리를 통해 분리하고, 상기 실시예 3와 같이 열처리 효소액과 상등액의 효소 활성 및 단백질양을 측정하고, 이들의 차를 통해 복합체 내 TTaGT의 활성과 단백질양을 결정하였다. 결과를 하기 표8에 나타내었다. The obtained heat treatment TTaGT enzyme solution was concentrated through Ultrafiltration. After the concentrated enzyme solution was combined with 15 mg of amylose according to Example 6, the supernatant and the complex were separated by centrifugation, and the enzyme activity and protein amount of the heat treatment enzyme solution and the supernatant were measured as in Example 3, Through these differences, the activity and protein amount of TTaGT in the complex were determined. The results are shown in Table 8 below.

시료sample 부피
(ml)volume
(ml) 활성
(U/ml)activation
(U / ml) 총활성
(U)Total activity
(U) 단백질양
(mg/ml)Protein amount
(mg / ml) 총단백질양 (mg)Total protein amount (mg) 비효소활성
(U/mg)Non-enzymatic activity
(U / mg) 수율
(%)yield
(%) 정제도Purification degree 열처리효소액Heat treatment enzyme solution 효소액Enzyme solution 0.50.5 28.85428.854 14.42714.427 0.4250.425 0.2120.212 67.86767.867 100100 1One 상등액*Supernatant * 0.50.5 14.1114.11 7.2217.221 0.2710.271 0.1350.135 53.17353.173 -- -- 복합체**Complex ** -- -- 7.27.2 -- 0.0770.077 93.85893.858 49.949.9 1.381.38 2배 농축액2x concentrate 효소액Enzyme solution 0.50.5 53.70953.709 26.85426.854 0.7850.785 0.3920.392 68.37268.372 100100 1One 상등액Supernatant 0.50.5 26.39326.393 13.19613.196 0.5050.505 0.2520.252 52.24652.246 -- -- 복합체Complex -- -- 13.65813.658 -- 0.140.14 97.4297.42 50.850.8 1.421.42 4배 농축액4-fold concentrate 효소액Enzyme solution 0.50.5 106.29106.29 53.14553.145 1.5161.516 0.7580.758 70.1170.11 100100 1One 상등액Supernatant 0.50.5 53.05353.053 26.52626.526 0.9280.928 0.4640.464 57.1157.11 -- -- 복합체Complex -- -- 26.61926.619 -- 0.2940.294 90.68390.683 50.150.1 1.31.3 6배 농축액6-fold concentrate 효소액Enzyme solution 0.50.5 157.59157.59 78.79578.795 2.312.31 1.151.15 68.268.2 100100 1One 상등액Supernatant 0.50.5 81.33881.338 40.66940.669 1.4031.403 0.7010.701 57.96457.964 -- -- 복합체Complex -- -- 29.12629.126 -- 0.450.45 84.04784.047 48.348.3 1.231.23 8배 농축액8 times concentrate 효소액Enzyme solution 0.50.5 198.6198.6 99.399.3 33 1.51.5 66.0366.03 100100 1One 상등액Supernatant 0.50.5 101.3101.3 50.6550.65 1.8571.857 0.9280.928 54.52654.526 -- -- 복합체Complex -- -- 48.6548.65 -- 0.5720.572 84.6484.64 48.948.9 1.281.28

* 상등액 : 복합체 형성 후, 원심분리를 통해 얻어진 상등액 (복합체를 이루지 못한 효소액)* Supernatant: Supernatant obtained through centrifugation after complex formation (enzyme solution that did not form a complex)

** 복합체 : 조효소액의 총활성과 총단백질양에서 상등액의 총효소활성과 총단백질양을 각각 뺀 총효소활성 또는 총단백질양** Complex: Total enzyme activity and total protein amount of superenzyme minus total enzyme activity and total protein amount of supernatant

상기 표 8에 따라 열처리와 농축과정을 거친 TTaGT 효소액으로부터 아밀로오스와의 복합체 형성을 통해 비효소활성이 증가하는 것을 알 수 있다. 또한 수율은 45~50%를 유지하였으며, 아밀로오스와 반응하는 효소액 내 TTaGT의 양이 늘어날수록 아밀로오스에 결합하는 TTaGT의 효소양이 계속 증가함을 확인할 수 있다.It can be seen that the non-enzymatic activity increases through complex formation with amylose from the TTaGT enzyme solution subjected to heat treatment and concentration according to Table 8 above. In addition, the yield was maintained at 45 ~ 50%, as the amount of TTaGT in the enzyme solution reacted with amylose can be confirmed that the amount of enzyme TTaGT binding to amylose continues to increase.

상기 실험을 통해 얻어진 조효소액, 상등액, 및 복합체 내 TTaGT를 상기 실시예 3에서와 같이 SDS-PAGE 전기 영동을 실시하였고, 상기 SDS-PAGE 사진을 도 6에 나타내었다. 상기 도 6 결과로부터 열처리 후 TTaGT 효소액 내 존재하던 E. coli단백질은 상등액에 거의 그대로 남아있으며, TTaGT만이 매우 선택적으로 아밀로오스와 결합하여 복합체 내에 존재함을 확인할 수 있다.
The coenzyme solution, supernatant, and complex TTaGT obtained through the experiment were subjected to SDS-PAGE electrophoresis as in Example 3, and the SDS-PAGE picture is shown in FIG. 6. From the results of FIG. 6, the E. coli protein, which was present in the TTaGT enzyme solution after the heat treatment, remains almost intact in the supernatant, and it was confirmed that only TTaGT was present in the complex by binding selectively with amylose.

실시예Example 6: 재조합 B.  6: recombinant B. subtilissubtilis 에서 발현된 Expressed in TTaGTTTaGT 를 이용한 복합체 제조Composite Preparation Using

6-1. 6-1. TTaGTTTaGT -6M 유전자의 B. B of the -6M gene. subtilissubtilis 로의 형질전환Transformation to

B. subtilis와 E. coli에서 동시 사용가능한 셔틀벡터인 pUBRT29에 B. subtilis 알파-아밀레이즈 프로모터인 AmyR2 프로모터를 가지는 pUBRTA 벡터 (대학민국 특허 10-2010-0017071 출원번호)를 NdeI과 NotI로 절단하여 벡터를 제조하고, 상기 pUBRTA 벡터와 상기 실시예 2-#에서 얻어진 TTaGT-6M 유전자를 동일한 제한효소로 절단한 뒤, 상기 두 유전자 절편을 라이게이션 시킨 후, 상기 실시예 1에서와 같이 E. coli에 형질전환 하였다. 암피실린 저항성 형질전환체를 1차로 선발하였다. 1차 선발된 형질전환체를 암피실린을 함유한 3 mL LB 배지에 접종하고 12시간 배양하였다. 배양액을 원심분리 (7,000 x g, 10분)하여 균체를 회수한 후, QUAGEN 플라스미드 분리 kit를 이용하여 배양된 균체로부터 플라스미드를 분리한 후, 상기와 동일한 제한 효소 NdeI과 NotI을 이용, 절단하여 약 1.5kb의 크기의 TTaGT 유전자가 포함되어 있음을 확인하였다. 상기 라이게이션을 통하여 하여 pUBRTA-TTaGT6M을 제조하였으며, 상기 재조합 벡터는 pUBRT29 벡터가 함유하는 AmyR2 프로모터에 의해 코돈 최적화된 TTaGT-6M 유전자의 발현이 이루어진다. 상기 재조합 벡터 pUBRTA-TTaGT6M의 벡터의 개열지도를 도 7에 나타내었다.PUBRTA vector (Amin. 10-2010-0017071 application number) having a B. subtilis alpha-amylase promoter AmyR2 promoter in pUBRT29, a shuttle vector usable simultaneously in B. subtilis and E. coli, was cleaved with NdeI and NotI. A vector was prepared, the pUBRTA vector and the TTaGT-6M gene obtained in Example 2- # were digested with the same restriction enzyme, and the two gene fragments were ligated, followed by E. coli. Was transformed into. Ampicillin resistant transformants were selected first. The primary selected transformants were inoculated in 3 mL LB medium containing ampicillin and incubated for 12 hours. The cells were recovered by centrifuging the culture solution (7,000 xg, 10 minutes), and then plasmids were separated from the cultured cells using the QUAGEN plasmid separation kit. It was confirmed that TTaGT gene of kb size was included. Through the ligation, pUBRTA-TTaGT6M was prepared, and the recombinant vector was codon-optimized by the AmyR2 promoter contained in the pUBRT29 vector. A cleavage map of the vector of the recombinant vector pUBRTA-TTaGT6M is shown in FIG. 7.

상기 pUBRTA-TTaGT6M 플라스미드를 B. subtilis에 형질전환하기 위해서 하기의 방법으로 형질전환용 B. subtilis를 제조하였다. B. subtilis ISW1214(Takara. Co. 일본)를 5 ml의 LB배지에 접종하여 37에서 12시간 배양하고, 배양액 1.0 ml을 새로운 SP I 배지 (0.5% glucose, 0.02% casamino acid, 0.05% yeast extract, 0.2% (NH4)2SO4, 1.4% K2HPO4, 0.6% KH2PO4, 0.1% Na-citrate, 0.02% MgSO4, pH7.5) 50 ml에 접종하여 600 nm에서 흡광도를 측정하면서 균체의 성장이 대수기에 접어들 때까지 교반하며 배양하였다. 상기 배양액 1mL을 5mL의 SP II 배지(0.5 mM CaCl2, 1 mM MgCl2를 포함하는 SP I 배지)에 접종하고 다시 37℃에서 90분간 교반하며 배양하였다. 상기 배양액 1mL을 4℃에서 7000 x g의 조건으로 5분간 원심분리한 후, 0.8 ml의 상등액을 제거하고, 균체를 남은 0.2 ml에 현탁하여 형질전환용 B. subtilis를 제조하였다. 상기 형질전환용 B. subtilis 50 ㎕와 상기 실시예 6-1에서 얻은 pUBRTA-TTaGT-6M 플라스미드를 상기 혼합하고, 37℃에서 30분간 교반 배양하였다. 상기 준 혼합액에 0.8 ml의 LB 액체 배지를 혼합한 후, 37℃에서 1시간 배양시켰다. 상기 1시간 동안 배양한 배양액을 가나마이신(최종농도 20 ㎍/ml)을 함유한 LB 한천 배지에 평판 도말하여 내성을 보이는 균주를 1차 선별하였다. In order to transform the pUBRTA-TTaGT6M plasmid into B. subtilis, B. subtilis for transformation was prepared by the following method. B. subtilis ISW1214 (Takara. Co. Japan) was inoculated in 5 ml of LB medium and incubated for 12 to 37 hours, and 1.0 ml of the culture medium was fresh SP I medium (0.5% glucose, 0.02% casamino acid, 0.05% yeast extract, 0.2% (NH 4 ) 2 SO 4 , 1.4% K 2 HPO 4 , 0.6% KH 2 PO 4 , 0.1% Na-citrate, 0.02% MgSO 4 , pH7.5) inoculate in 50 ml and measure absorbance at 600 nm While incubating with stirring until the growth of the cell enters the log phase. 1 mL of the culture solution was inoculated in 5 mL of SP II medium (SP I medium containing 0.5 mM CaCl 2 , 1 mM MgCl 2 ) and incubated with stirring at 37 ° C. for 90 minutes. After centrifuging 1 mL of the culture solution at 4 ° C. at 7000 × g for 5 minutes, 0.8 ml of the supernatant was removed, and the cells were suspended in the remaining 0.2 ml to prepare B. subtilis for transformation. 50 μl of the transformed B. subtilis and the pUBRTA-TTaGT-6M plasmid obtained in Example 6-1 were mixed and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. 0.8 ml of LB liquid medium was mixed with the quasi-mixed liquid, followed by incubation at 37 ° C for 1 hour. The culture medium cultured for 1 hour was plated on LB agar medium containing kanamycin (final concentration 20 μg / ml), and strains showing resistance were first selected.

6-2. 재조합 B. 6-2. Recombinant B. subtilssubtils 를 이용한 Using TTaGTTTaGT 의 생산 및 복합체 형성Production and complex formation

실시예 6-1에 따라서 얻어진 B. subtilis 형질전환체 (B. subtilis/pUBRTA-TTaGT-6M)을 가나마이신(최종농도 20 ㎍/ml)을 함유하는 LB 배지 100 mL에 접종하고 37℃에서 30시간 배양하였다. B. subtilis transformant (B. subtilis / pUBRTA-TTaGT-6M) obtained according to Example 6-1 was inoculated into 100 mL of LB medium containing kanamycin (final concentration 20 µg / ml) and 30 at 37 ° C. Time incubation.

상기 배양액을 상기 실시예 2-5에 따라 조효소액을 제조하고, 상기 조효소액을 이용하여 상기 실시예 4-1과 같이 복합체를 형성하였다. 10,000 x g의 조건으로 20분간 원심분리를 통해서 상등액과 복합체를 분리한 후, 상기 실시예 5에 따라서 조효소액과 상등액의 효소활성 및 단백질양을 계산하고, 그 차이로부터 복합체 내 TTaGT의 효소활성 및 단백질 양을 결정하였다. 조효소액과 복합체 내 효소활성 및 단백질양에 따른 정제표를 하기 표 9에 나타내었다.The culture solution was prepared in the crude enzyme solution according to Example 2-5, using the crude enzyme solution to form a complex as in Example 4-1. After separating the supernatant and the complex by centrifugation for 20 minutes under the condition of 10,000 xg, the enzyme activity and protein amount of the coenzyme solution and the supernatant were calculated according to Example 5, and the enzyme activity and protein of the TTaGT in the complex from the difference. The amount was determined. The purification table according to the enzyme activity and protein amount in the complex with the crude enzyme solution is shown in Table 9 below.

SampleSample 부피
(ml)volume
(ml) 활성
(U/ml)activation
(U / ml) 총활성
(U)Total activity
(U) 단백질양
(mg/ml)Protein amount
(mg / ml) 총단백질양 (mg)Total protein amount (mg) 비효소활성
(U/mg)Non-enzymatic activity
(U / mg) 수율
(%)yield
(%) 정제도Purification degree 조효소액Crude enzyme solution 0.50.5 21.4521.45 10.7210.72 1.721.72 0.860.86 12.4712.47 100100 1One 상등액*Supernatant * 0.50.5 10.0710.07 5.0355.035 1.6261.626 0.8130.813 6.196.19 -- -- 복합체**Complex ** -- -- 5.695.69 -- 0.0470.047 121121 52.352.3 9.79.7

* 상등액 : 복합체 형성 후, 원심분리를 통해 얻어진 상등액 (복합체를 이루지 못한 효소액)* Supernatant: Supernatant obtained through centrifugation after complex formation (enzyme solution that did not form a complex)

** 복합체 : 조효소액의 총활성과 총단백질양에서 상등액의 총효소활성과 총단백질양을 각각 뺀 총효소활성 또는 총단백질양
** Complex: Total enzyme activity and total protein amount of superenzyme minus total enzyme activity and total protein amount of supernatant

상기 표 9에 따라 TTaGT가 아밀로오스에 결합하여 상등액 내 비효소활성이 감소되는 것을 확인하였고, 계산된 복합체 내 TTaGT의 비효소활성이 121 U/mg으로 조효소액의 비효소활성에 비해 10배 가량 증가하였으며, 총 효소활성을 비교한 결과 52%의 수율로 TTaGT가 아밀로오스에 결합한 복합체 형태로 회수되었음을 확인하였다.
According to Table 9, it was confirmed that the non-enzymatic activity in the supernatant was reduced by binding TTaGT to amylose, and the calculated non-enzymatic activity of the TTaGT in the complex was 121 U / mg, which was increased by about 10 times compared to the non-enzymatic activity of the crude enzyme solution. As a result of comparing the total enzyme activity, it was confirmed that TTaGT was recovered in the form of a complex bound to amylose in a yield of 52%.

실시예Example 7:  7: ThermusThermus scotoductusscotoductus 4-a- 4-a- glucanotransferaseglucanotransferase ( ( TSaGTTSaGT )-아밀로오스 복합체 제조) -Amylose complex preparation

상기 4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈-아밀로오스 복합체 형성이 가능한 4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈를 알아보기 위하여 TTaGT와 아미노산 서열 상동성이 85%인 Thermus scotoductus 4-a-glucanotransferase (TSaGT)를 이용한 복합체 형성 실험을 실시하였다. 상기 TSaGT 유전자를 포함하는 p6xHTSaGT 벡터 (Seo et al. 2007. J. Food Sci. 72:C331-C336)를 상기 실시예 1에 따라 E. coli에 형질전환하고, 암피실린(최종농도 100 ㎍/ml)을 함유한 LB 한천 배지에 평판 도말하여 내성을 보이는 균주를 1차 선별하였다. 1차 선발된 형질전환체를 암피실린(최종농도 100 ㎍/ml)을 함유한 3 mL LB 배지에 접종하고 12시간 배양하였다. 배양액을 원심분리 (7,000 x g, 10분)하여 균체를 회수한 후, QUAGEN 플라스미드 분리 kit를 이용하여 배양된 균체로부터 플라스미드를 분리한 후, 상기와 동일한 제한 효소 NdeI과 NotI을 이용, 절단하여 약 1.5kb의 크기의 TTaGT 유전자가 포함되어 있음을 확인하였다.In order to identify the 4-alpha-glucanotransferase capable of forming the 4-alpha-glucanotransferase-amylose complex, the complex using TTaGT and Thermus scotoductus 4-a-glucanotransferase (TSaGT) having an amino acid sequence homology of 85%. Formation experiments were conducted. P6xHTSaGT vector containing TSaGT gene (Seo et al. 2007. J. Food Sci. 72: C331-C336) was transformed into E. coli according to Example 1, and ampicillin (final concentration 100 μg / ml) Staining the plate in LB agar medium containing the strain was selected first. The primary selected transformants were inoculated in 3 mL LB medium containing ampicillin (final concentration 100 μg / ml) and incubated for 12 hours. The cells were recovered by centrifuging the culture solution (7,000 xg, 10 minutes), and then plasmids were separated from the cultured cells using the QUAGEN plasmid separation kit. It was confirmed that TTaGT gene of kb size was included.

상기 E. coli 형질전환체(E. coli/p6xHTSaGT)를 암피신린(최종농도 100 ㎍/ml)을 함유한 LB 배지에서 15시간 배양한 후, 배양액을 상기 실시예 2-5에 따라 조효소액을 제조하였다. 상기 조효소액을 상기 실시예 4-1에 따라 TSaGT-아밀로오스 복합체와 상등액을 분리하였다. 상기 얻어진 상등액의 효소활성과 단백질양을 상기 조효소액의 효소활성 및 단백질양과 비교하여 복합체내 TSaGT의 효소활성과 단백질양을 결정하였다. 이를 하기 표 10에 실었다.After incubating the E. coli transformant (E. coli / p6xHTSaGT) for 15 hours in LB medium containing ampicillin (final concentration 100 μg / ml), the culture solution was prepared according to Example 2-5. Was prepared. The crude enzyme solution was separated from the TSaGT-amylose complex and the supernatant according to Example 4-1. The enzyme activity and protein amount of the obtained supernatant were compared with the enzyme activity and protein amount of the crude enzyme solution to determine the enzyme activity and protein amount of TSaGT in the complex. This is shown in Table 10 below.

SampleSample 부피
(ml)volume
(ml) 활성
(U/ml)activation
(U / ml) 총활성
(U)Total activity
(U) 단백질양
(mg/ml)Protein amount
(mg / ml) 총단백질양 (mg)Total protein amount (mg) 비효소활성
(U/mg)Non-enzymatic activity
(U / mg) 수율
(%)yield
(%) 정제도Purification degree 조효소액Crude enzyme solution 0.50.5 4848 2424 3.053.05 1.5251.525 15.73715.737 100100 1One 상등액*Supernatant * 0.50.5 24.9824.98 12.4912.49 2.8132.813 1.4061.406 8.888.88 -- -- 복합체**Complex ** -- -- 11.5111.51 -- 0.1180.118 97.2497.24 47.9547.95 6.176.17

* 상등액 : 복합체 형성 후, 원심분리를 통해 얻어진 상등액 (복합체를 이루지 못한 효소액)* Supernatant: Supernatant obtained through centrifugation after complex formation (enzyme solution that did not form a complex)

** 복합체 : 조효소액의 총활성과 총단백질양에서 상등액의 총효소활성과 총단백질양을 각각 뺀 총효소활성 또는 총단백질양
** Complex: Total enzyme activity and total protein amount of superenzyme minus total enzyme activity and total protein amount of supernatant

상기 표 10에 따라 TSaGT가 아밀로오스에 결합하여 상등액 내 비효소활성이 감소되는 것을 확인 하였고, 계산된 복합체 내 TSaGT의 비효소활성이 97.24 U/mg으로 조효소액의 비효소활성에 비해 6배 가량 증가하였으며, 총 효소활성을 비교한 결과 48%의 수율로 TSaGT가 아밀로오스에 결합한 복합체 형태로 회수되었음을 확인하였다. 상기 실시예로부터 TTaGT와 아미노산 상동성이 85%이상인 4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈는 상기 복합체를 형성할 수 있음을 알 수 있다.
According to Table 10, it was confirmed that TSaGT binds to amylose and the non-enzyme activity in the supernatant is reduced, and the calculated non-enzymatic activity of TSaGT in the complex is 97.24 U / mg, which is 6 times higher than the non-enzyme activity of the crude enzyme solution. As a result of comparing the total enzyme activity, it was confirmed that the TSaGT was recovered in the form of a complex bound to amylose in a yield of 48%. From the above example, it can be seen that 4-alpha-glucanotransferase having an amino acid homology of 85% or more with TTaGT can form the complex.

실시예Example 8:  8: TTaGTTTaGT -아밀로오스 복합체를 이용한 Using amylose complexes 당전이A former transition 반응 reaction

상기 실시예 5-2에서 얻어진 복합체를 50 mM Tris-HCl 완충용액 (pH 8.0)을 1 ml 넣어 잘 섞어준 뒤 원심분리 (10,000 x g, 3분) 하여 상등액을 걷어내는 방법으로 3회 세척하었다. 상기 복합체를 사용하여 7.5 mg 의 말토오즈와 50 mM Tris-HCl 완충용액 (pH 8.0) 1.5 ml을 넣고 70℃에서 12시간 복합체의 당전이 반응을 실시하고, 반응산물을 박막크로마토그래피(Thin-layer chromatography, TLC)를 이용하여 분석하였다. 대조구로 TTaGT 효소용액을 이용하여 당공여체로 0.1% 수용성전분(soluble starch)과 0.2% 말토오스를 당수용체로하는 반응을 수행하였다. 반응산물 1㎕를 TLC 판(머크 사)에 올린 후, 열풍건조하고, 용매(용매조건)으로 전개하였다. 열풍건조를 통해 용매를 제거한 후 발색시약(조성)에 담근 후 100에서 5분 간 가열하여 시료를 발색시켰다. 분석결과는 도 8 에 나타내었다. The complex obtained in Example 5-2 was added to 1 ml of 50 mM Tris-HCl buffer solution (pH 8.0), mixed well, and washed three times by centrifugation (10,000 xg, 3 minutes) to remove the supernatant. . Using the complex, 7.5 mg of maltose and 1.5 ml of 50 mM Tris-HCl buffer solution (pH 8.0) were added thereto, and the sugar transition reaction of the complex was carried out at 70 ° C. for 12 hours. chromatography, TLC). As a control, a reaction using a TTaGT enzyme solution as a sugar donor with 0.1% soluble starch and 0.2% maltose as a sugar donor was carried out. 1 µl of the reaction product was placed on a TLC plate (Merck), followed by hot air drying, and development with a solvent (solvent conditions). After removing the solvent through hot air drying, the sample was developed by immersing in a color developing reagent (composition) and heating at 100 to 5 minutes. The analysis results are shown in FIG. 8.

상기 도 8을 통하여 TTaGT-아밀로오스 복합체를 이용한 반응에서 추가적인 당공여체의 첨가없이 TTaGT가 복합체 내의 아밀로오스를 당공여체로 하여 당수용체인 말토오스의 사슬길이를 연장시킴을 확인하였다. 동일한 효소활성의 TTaGT용액을 이용한 반응산물과의 비교에서도 산물의 양과 조성이 크게 다르지 않음을 확인하였다. 따라서 상기 제조공정을 통해 얻어진 TTaGT-아밀로오스 복합체는 용액 상태의 TTaGT와 동일한 효소활성을 나타냄을 확인하였으며, 정제를 위해 사용된 아밀로오스가 당전이 반응에서 당공여체로 작용함에 따라 추가적인 당공여체의 첨가 없이 당전이산물을 합성할 수 있음을 알 수 있다.
8, it was confirmed that TTaGT extends the chain length of the sugar receptor maltose by using amylose in the complex as a sugar donor in the reaction using the TTaGT-amylose complex without the addition of a sugar donor. In comparison with the reaction product using the same enzyme activity TTaGT solution it was confirmed that the amount and composition of the product is not significantly different. Therefore, it was confirmed that the TTaGT-amylose complex obtained through the above manufacturing process exhibited the same enzymatic activity as TTaGT in solution. As the amylose used for purification acts as a sugar donor in the sugar transfer reaction, no addition of sugar donor was added. It can be seen that the transition product can be synthesized.

실시예Example 9: 동결건조를 통한  9: through lyophilization TTaGTTTaGT -아밀로오스 복합체의 분말제조-Powder production of amylose complex

상기 실시예 5-2에서 얻어진 복합체를 -70℃에서 동결한 후, 동결건조기(Bondiro, ilshin, 대한민국)를 이용하여 동결건조하였다. 건조 후, 분말화 과정을 거쳐 회수한 후, 15 mg의 동결건조 복합체, 15 mg의 비건조 복합체(상기 실시예 5-2에서 얻어진 복합체) 및 열처리된 TTaGT 효소액을 이용하여 상기 실시예 8에 따라 당전이 반응을 수행한 후, TLC로 각각의 반응산물을 분석하였다. 분석결과는 도 9 에 나타내었다. After freezing the complex obtained in Example 5-2 at -70 ℃, it was lyophilized using a freeze dryer (Bondiro, ilshin, South Korea). After drying, after recovering through a powdering process, using 15 mg of lyophilized complex, 15 mg of non-dried complex (complex obtained in Example 5-2) and heat treated TTaGT enzyme solution according to Example 8 After conducting the sugar transfer reaction, each reaction product was analyzed by TLC. The analysis results are shown in FIG. 9.

상기 도 9에서 알 수 있듯이 복합체의 효소활성은 동결건조 후에도 동결건조 전과 동일한 활성을 유지됨을 확인하였다. 본 실시예로부터 TTaGT-아밀로오스 복합체 내의 아밀로오스가 동결안정제로 작용하여 추가적인 안정제의 첨가 없이 상시 실시예와 같은 건조공정을 통해 TTaGT-아밀로오스 복합체의 분말화가 손쉽게 이룰 수 있음을 확인하였다.As can be seen in Figure 9, the enzyme activity of the complex was confirmed to maintain the same activity as before lyophilization even after lyophilization. From this example, it was confirmed that amylose in the TTaGT-amylose complex acts as a freeze stabilizer, so that the TTaGT-amylose complex can be easily powdered through the same drying process as in the usual example without the addition of an additional stabilizer.

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Claims (10)

4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈를 포함하는 조효소 혼합물을 불용성 아밀로오스 또는 불용성 전분과 혼합하는 단계를 포함하는 조효소 혼합물로부터 순수한 4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈만을 선택적으로 분리하는 방법.A method for selectively separating only pure 4-alpha-glucanotransferase from a coenzyme mixture comprising mixing a coenzyme mixture comprising 4-alpha-glucanotransferase with insoluble amylose or insoluble starch. 제 1항에 있어서, 상기 4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈는 서열번호 1, 및 서열번호 2로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 조효소 혼합물로부터 순수한 4-알파-글루카노트렌스퍼레이즈만을 선택적으로 분리하는 방법.The method of claim 1, wherein the 4-alpha-glucanotransferase selectively separates only pure 4-alpha-glucanotransferase from the coenzyme mixture, characterized in that selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2. How to. 불용성 아밀로오스 또는 불용성 전분과 4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈 효소액을 혼합하는 단계를 포함하는 4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈와 불용성 아밀로오스 또는 불용성 전분과의 복합체 제조 방법.A method for producing a complex of 4-alpha-glucanotransferase with insoluble amylose or insoluble starch, comprising mixing an insoluble amylose or an insoluble starch with a 4-alpha-glucanotransferase enzyme solution. 삭제delete 제3항의 제조방법에 의해서 제조된 4-알파-글루카노트랜스퍼레이즈와 불용성 아밀로오스 또는 불용성 전분과의 복합체.A complex of 4-alpha-glucanotransferase and insoluble amylose or insoluble starch prepared by the method of claim 3. 제5항의 복합체를 이용하여 비배당체, 배당체, 또는 말토올리고당에 추가적인 말토올리고당을 전이시키는 것을 특징으로 하는 당전이 산물의 제조방법.Method for producing a sugar transfer product, characterized in that the transfer of additional malto oligosaccharides to non-glycosides, glycosides, or maltooligosaccharides using the complex of claim 5. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete
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High-level expression of a thermostable 4-alpha-glucanotransferase in Escherichia coli through gene codon optimization. 고려대학교 석사학위논문, 장준혁 (2010.) *
High-level expression of a thermostable 4-α-glucanotransferase in Escherichia coli through gene codon optimization. 고려대학교 석사학위논문, 장준혁 (2010.)

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