KR101293762B1 - Culture media having enhanced wound healing activity and a method for preparing the same - Google Patents

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Abstract

본 발명은 리소포스파티딘산(lysophosphatidic acid, 이하, 'LPA'로 약칭함)을 배양전 또는 배양중의 줄기세포 배양배지에 처리한 후 줄기세포를 배양하여 제조된 창상치유능이 향상된 줄기세포 배양액, 상기 줄기세포 배양액을 유효성분으로 함유하는 창상 개선 및 치료용 조성물 및 상기 줄기세포 배양액의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 줄기세포 배양액은 창상 동물모델에서 상피조직의 재생, 혈관신생의 촉진, 면역세포의 침윤 촉진 등을 통해 피부창상의 재생을 촉진하는 효과가 있을 뿐만 아니라 부작용이 없고 저렴한 비용으로 제공 가능하므로 이를 창상 개선 또는 치료용 약학 조성물로 활용될 수 있다.The present invention is treated with lysophosphatidic acid (hereinafter, abbreviated as 'LPA') to a stem cell culture medium before or in culture, after the stem cell culture prepared by improving stem cell culture, It relates to a composition for improving and treating wounds containing the stem cell culture as an active ingredient and a method for producing the stem cell culture. Stem cell culture of the present invention has the effect of promoting the regeneration of skin wounds through the regeneration of epithelial tissue, the promotion of angiogenesis, the infiltration of immune cells in wound animal model as well as no side effects and can be provided at low cost It can be used as a pharmaceutical composition for improving or treating wounds.

Description

창상치유능력이 향상된 줄기세포 배양액 및 그의 제조방법{Culture media having enhanced wound healing activity and a method for preparing the same}{Culture media having enhanced wound healing activity and a method for preparing the same}

본 발명은 창상치유능력이 향상된 줄기세포 배양액 및 그의 제조방법에 관한 것이다. The present invention relates to a stem cell culture solution with improved wound healing ability and a method for producing the same.

인간이 살아가는데 있어서, 창상은 필수불가결하게 일어나기에 창상의 빠른 치유를 위한 연구가 활발하게 진행되고 있으며, 창상의 치료를 위한 2012년 전체 창상 치료제 시장은 연간 125억 달러에 달할 것으로 예측할 정도로 시장성 또한 크다(The Global Market for Advanced Wound Care Products 2008; Espicom Business Intelligence).In human life, wounds are indispensable, and research on the rapid healing of wounds is actively conducted, and the market for wound treatment in 2012 for the treatment of wounds is expected to reach $ 12.5 billion annually. (The Global Market for Advanced Wound Care Products 2008; Espicom Business Intelligence).

창상 치유는 손상에 대한 조직의 반응이며, 조직 회복의 과정으로, 주화성(chemotaxis), 세포의 분화 및 복제(differentiation and replication), 기질단백질(matrix protein)의 합성, 혈관의 신생, 창상의 재구성 등을 포함하는 복잡한 생물학적 과정이다(Steed, et al., Clin. Plast. Surg. 25: 397-405, 1998). 이러한 창상 치유 과정의 초기에 나타나 이후 과정을 조절하는 대표적인 물질 중의 하나로 성장인자를 들 수 있는데, 이들은 창상 치유 과정 전반에 걸쳐 강력한 영향을 미치면서 세포의 성장, 분화, 대사 등을 조절하고, 창상 주변 환경 또한 조절하므로, 이를 이용한 치료의 개발이 꾸준히 진행되고 있다Wound healing is a tissue response to injury and is a process of tissue repair, including chemotaxis, differentiation and replication of cells, synthesis of matrix proteins, angiogenesis, and reconstruction of wounds. And complex biological processes including (Steed, et al ., Clin. Plast. Surg . 25: 397-405, 1998). Growth factors are one of the representative substances that appear early in the wound healing process and regulate subsequent processes. They have a powerful effect throughout the wound healing process, controlling cell growth, differentiation, metabolism, and the like. Since the environment is also regulated, the development of treatments using it is steadily in progress.

이들 중 대표적인 것으로, 상피성장인자(EGF, Carpenter et al., Exp. Cell Res., 164: 1-10, 1986), 산성 및 염기성 섬유아세포 성장인자(acid 및 basic FGF, McGee et al., J. Surg. Res., 45: 145-153, 1988), 형질전환 성장인자(TGF-α 및 TGF-β) 및 인슐린유사 성장인자(IGF-Ⅰ 및 Ⅱ) 등의 성장인자(Kris et al., Nat. Biotechnol., 3: 135-140, 1985), 피브로넥틴(fibronecting), 라미닌(laminin), 비트로넥틴(vitronectin), 형질전환인자 유도단백질-3(TGF-β-induced protein 3) 등의 접착인자(Perham et al., Ann. Rev. Biochem., 52: 961-1004, 1983)를 포함한 여러 가지 다양한 단백질이 알려져 있다. Among them, epidermal growth factor (EGF, Carpenter et al ., Exp. Cell Res. , 164: 1-10, 1986), acidic and basic FGF, McGee et al ., J Surg. Res ., 45: 145-153, 1988), growth factors such as transforming growth factors (TGF-α and TGF-β) and insulin-like growth factors (IGF-I and II) (Kris et al ., Nat. Biotechnol ., 3: 135-140, 1985), adhesion factors such as fibronectin, laminin, vitronectin, TGF-β-induced protein 3, and the like. Various proteins are known, including (Perham et al ., Ann. Rev. Biochem ., 52: 961-1004, 1983).

피부의 재생 또는 창상 치료는 염증반응(inflammation), 재상피화(reepithelialization), 육아조직의 형성(granulation), 섬유조직형성(fibroplasia), 창상조직의 수축(contraction)등 여러 가지 과정을 통해 이루어진다(Freedberg et al., J. Clin. Psychol., 57: 433-455, 2001). 피부 재생의 일련의 과정들은 각질세포(keratinocytes), 섬유아세포(fibroblasts), 내피세포(endothelial cells), 대식세포(macrophage), 혈소판(platelets) 등과 같은 여러 세포들의 협력에 의해서 이루어지며 이러한 세포들의 이동, 침윤, 증식, 분화와 같은 복합적인 진행은 다양한 성장인자(growth factor), 사이토카인, 케모카인에 의해서 조절 받기에 상술한 인자나 화학물질의 유효성이 알려져 있다.Skin regeneration or wound healing occurs through a number of processes, including inflammation, reepithelialization, granulation, granulation, fibroplasia, and contraction of wound tissue (Freedberg). et al ., J. Clin. Psychol ., 57: 433-455, 2001). A series of processes of skin regeneration are carried out by the cooperation of several cells, such as keratinocytes, fibroblasts, endothelial cells, macrophages, platelets, and the like. Complex processes such as, infiltration, proliferation, and differentiation are regulated by various growth factors, cytokines, and chemokines, so the effectiveness of the above mentioned factors or chemicals is known.

그러나, 상기 성장인자, 사이토카인을 이용한 창상치유기술은 이들 단백질을 생산, 분리하는 데 많은 비용이 소요되며, 창상 치유과정에는 이들 단백질들이 복합적으로 작용하기에 한 가지 종류의 단백질만을 사용할 경우 창상치료제로 부분적인 창상 완화를 제공하지만, 치유기간이 길고 치료에 대한 반응이 최적에 미치지 못하는 등 비효과적이라는 점 때문에 실제 상용화에 문제점이 있다. However, wound healing techniques using the growth factor and cytokines are expensive to produce and isolate these proteins, and when only one type of protein is used in the wound healing process, these proteins are combined to act as a wound healing agent. This provides partial wound relief, but there is a problem in actual commercialization due to its ineffectiveness such as long healing period and poor response to treatment.

중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs)는 자가 재생 능력과, 높은 생존력, 다양한 세포로의 잠재적인 분화 능력을 가진 세포주이다. 이러한 재생 능력은 중간엽 줄기세포의 조직세포로의 직적접인 분화능력에 의한 것보다 중간엽 줄기세포로부터 분비되는 사이토카인, 성장인자 등에 의한 간접적인 요인에 의한 영향이 더 크다(Fox et al., Br. J. Haematol., 137: 491-502, 2007). 따라서, 중간엽 줄기세포 배양액은 창상조직의 재생을 위한 치료물질로 주목을 받고 있다. 그러나, 활성화되지 않은 중간엽 줄기세포의 경우 세포로부터 분비되는 사이토카인, 성장인자 등의 양이 적은 관계로 활성화되지 않은 중간엽 줄기세포의 배양액은 창상치료제 및 화장품의 조성물로 활용하기에 부적합하다. Mesenchymal stem cells (MSCs) are cell lines with self-renewal ability, high viability and potential differentiation into various cells. This regenerative capacity is more influenced by indirect factors such as cytokines and growth factors secreted from mesenchymal stem cells than by the differentiation ability of mesenchymal stem cells directly into tissue cells (Fox et al . , Br. J. Haematol ., 137: 491-502, 2007). Therefore, mesenchymal stem cell culture has attracted attention as a therapeutic material for regeneration of wound tissue. However, in the case of inactivated mesenchymal stem cells, the culture medium of the inactivated mesenchymal stem cells is not suitable for use as a composition for the treatment of wounds and cosmetics due to the low amount of cytokines and growth factors secreted from the cells.

본 발명의 목적는 활성화되지 않은 줄기세포의 배양액을 활성화시켜 창상치유 능력이 향상된 줄기세포 배양액을 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide a stem cell culture with improved wound healing ability by activating the culture of the inactivated stem cells.

본 발명의 다른 목적은 상기 줄기세포 배양액을 유효성분으로 함유하는 창상 치료용 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a composition for treating wounds containing the stem cell culture as an active ingredient.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 줄기세포 배양액의 제조방법을 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide a method for preparing the stem cell culture.

본 발명의 마지막 목적은 줄기세포 배양액을 활성화시켜 콜라겐 함량을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.The final object of the present invention is to provide a method of increasing the collagen content by activating the stem cell culture.

본 발명자들은 종래 창상 치료효과를 나타내는 성장인자, 사이토카인을 생산, 분리하는 데 많은 비용이 소요되며, 이러한 분리된 단백질을 한 가지 종류만을 사용할 경우 효과가 부분적이며 치유기간이 길어지는 등 비효과적임을 인지하고, 이러한 문제점을 해결하기 위해 창상 치료에 복합적으로 작용할 수 있는 단백질들이 고농도로 함유된 저렴한 비용의 창상 치료제를 개발하고자 예의 노력한 결과, LPA(lysophosphatidic acid)를 줄기세포에 처리하면 창상치료효과가 있는 사이토카인, 성장인자를 고농도로 함유한 배양액을 저렴한 비용으로 중간엽 줄기세포로부터 다량으로 획득할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.The present inventors have a high cost in producing and isolating growth factors and cytokines that exhibit conventional wound healing effects, and when only one type of such separated protein is used, the effect is partial and the healing period is ineffective. As a result of our efforts to develop a low-cost wound treatment product containing high concentrations of proteins that can be combined with wound treatment to solve these problems, treatment of LPA (lysophosphatidic acid) on stem cells has a wound healing effect. The present invention was completed by confirming that a medium containing a high concentration of cytokines and growth factors can be obtained from mesenchymal stem cells at low cost.

본 발명은 상기 목적을 달성하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명의 일 형태에 따르면, 리소포스파티딘산(lysophosphatidic acid, 이하, 'LPA'로 약칭함)을 배양전 또는 배양중의 줄기세포 배양배지에 처리한 후 줄기세포를 배양하여 제조된 창상치유능이 향상된 줄기세포 배양액이 제공된다.The present invention has been made to achieve the above object, according to one embodiment of the present invention, lysophosphatidic acid (hereinafter, abbreviated as 'LPA') to the stem cell culture medium before or in culture Provided is a stem cell culture solution having improved wound healing ability prepared by culturing stem cells after treatment.

이 때, 상기 LPA는 0.1 내지 100 μM의 농도로 처리되는 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니고, 처리기간은 1 내지 4일인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니며, 상기 줄기세포 배양액에는 콜라겐 및 피브로넥틴과 같은 세포외 기질 단백질의 함량이 LPA 처리 전에 비해 현저히 증가되어 있다.At this time, the LPA is preferably treated at a concentration of 0.1 to 100 μM, but is not limited thereto. The treatment period is preferably 1 to 4 days, but is not limited thereto. The stem cell culture medium may include collagen and fibronectin. The content of extracellular matrix protein is markedly increased compared to before LPA treatment.

상기 줄기세포는 배아 줄기세포 또는 성체 줄기세포인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니고, 상기 성체 줄기세포는 조혈 줄기세포 또는 중간엽 줄기세포인 것이 바람직하며, 중간엽 줄기세포인 것이 더욱 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 중간엽 줄기세포는 제대혈 유래 줄기세포, 태반 유래 줄기세포, 지방 유래 줄기세포, 골수 유래 줄기세포 또는 말초혈액 유래 줄기세포일 수 있고, 채취상의 침습성의 정도에 따라 제대혈 유래 줄기세포, 지방 유래 줄기세포 또는 말초혈액 유래 줄기세포인 것이 더욱 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. Preferably, the stem cells are embryonic stem cells or adult stem cells, but are not limited thereto. The adult stem cells are preferably hematopoietic stem cells or mesenchymal stem cells, and more preferably, mesenchymal stem cells. It doesn't happen. The mesenchymal stem cells may be umbilical cord blood-derived stem cells, placental stem cells, adipose-derived stem cells, bone marrow-derived stem cells or peripheral blood-derived stem cells, cord blood-derived stem cells, adipose-derived stems, depending on the degree of invasiveness in harvesting More preferably, the cells or peripheral blood-derived stem cells are not limited thereto.

본 발명의 다른 일 형태에 따르면, 상기 창상치유능이 향상된 줄기세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 창상치료 및 피부재생용 조성물이 제공된다.According to another aspect of the present invention, there is provided a composition for wound treatment and skin regeneration comprising the stem cell culture solution with improved wound healing ability as an active ingredient.

상기 조성물에는 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제가 추가적으로 포함될 수 있고, 상지 조성물의 제형은 특별히 이에 제한되는 않으나 외용제인 것이 바람직하다.The composition may additionally include a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent, and the formulation of the upper limb composition is preferably, but not limited to, an external preparation.

본 발명의 또 다른 일 형태에 따르면, According to still another aspect of the present invention,

ⅰ) 배양전 또는 배양중의 줄기세포 배양 배지에 LPA를 처리하는 단계; Iii) treating LPA to the stem cell culture medium before or during the culture;

ⅱ) LPA가 처리된 배양배지 내에서 줄기세포를 배양하는 단계; 및 Ii) culturing stem cells in a culture medium treated with LPA; And

ⅲ) 추가배양을 종료하고 줄기세포 배양액을 회수하는 단계를 포함하는 창상치유 능력이 증가된 줄기세포 배양액의 제조방법이 제공된다.Iii) there is provided a method of producing a stem cell culture with increased wound healing ability, including terminating further culture and recovering the stem cell culture.

이 때, 상기 LPA는 0.1 내지 100 μM의 농도로 처리되는 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니고, LPA 처리후 추가배양은 1 내지 4일 동안 수행되는 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. 한편, 단계 ⅰ에 앞서 배양 배지로부터 혈청성분을 제거하는 전처리 단계가 추가될 수 있고, 단계 ⅱ와 ⅲ 사이에, LPA 처리 후 일정 시간 경과후 LPA 함유 배양배지를 LPA를 함유하지 않은 배지로 교환하여 LPA를 배양배지로부터 제거하는 단계가 추가적으로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.At this time, the LPA is preferably treated at a concentration of 0.1 to 100 μM, but is not limited thereto, and further culture after LPA is preferably performed for 1 to 4 days, but is not limited thereto. Meanwhile, a pretreatment step of removing serum components from the culture medium may be added prior to step iii. Between steps ii and iii, after a certain time after LPA treatment, the culture medium containing LPA is replaced with a medium not containing LPA. Removing the LPA from the culture medium may further include, but is not limited thereto.

상기 배양배지는 무혈청배지인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.The culture medium is preferably serum-free medium, but is not limited thereto.

상기 줄기세포는 배아 줄기세포 또는 성체 줄기세포인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니고, 상기 성체 줄기세포는 조혈 줄기세포 또는 중간엽 줄기세포인 것이 바람직하며, 중간엽 줄기세포인 것이 더욱 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 중간엽 줄기세포는 제대혈 유래 줄기세포, 태반 유래 줄기세포, 지방 유래 줄기세포, 골수 유래 줄기세포 또는 말초혈액 유래 줄기세포일 수 있고, 채취상의 침습성의 정도에 따라 제대혈 유래 줄기세포, 지방 유래 줄기세포 또는 말초혈액 유래 줄기세포인 것이 더욱 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. Preferably, the stem cells are embryonic stem cells or adult stem cells, but are not limited thereto. The adult stem cells are preferably hematopoietic stem cells or mesenchymal stem cells, and more preferably, mesenchymal stem cells. It doesn't happen. The mesenchymal stem cells may be umbilical cord blood-derived stem cells, placental stem cells, adipose-derived stem cells, bone marrow-derived stem cells or peripheral blood-derived stem cells, cord blood-derived stem cells, adipose-derived stems, depending on the degree of invasiveness in harvesting More preferably, the cells or peripheral blood-derived stem cells are not limited thereto.

아울러, 본 발명의 또 다른 일 형태에 따르면, In addition, according to another embodiment of the present invention,

ⅰ) 배양전 또는 배양중의 줄기세포 배양 배지에 LPA를 처리하는 단계; 및 Iii) treating LPA to the stem cell culture medium before or during the culture; And

ⅱ) LPA가 처리된 배양배지 내에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포 배양액 내의 콜라겐 함량을 증가시키는 방법이 제공된다.Ii) there is provided a method of increasing collagen content in a stem cell culture comprising culturing stem cells in a culture medium treated with LPA.

이 때, 상기 LPA는 0.1 내지 100 μM의 농도로 처리되는 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니고, LPA 처리후 추가배양은 1 내지 4일 동안 수행되는 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. 한편, 단계 ⅰ에 앞서 배양 배지로부터 혈청성분을 제거하는 전처리 단계가 추가될 수 있고, 단계 ⅱ 이후에 LPA 처리 후 일정 시점에서 LPA 함유 배양배지를 LPA를 함유하지 않은 배지로 교환하여 LPA를 배양배지로부터 제거하는 단계가 추가적으로 포함될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.At this time, the LPA is preferably treated at a concentration of 0.1 to 100 μM, but is not limited thereto, and further culture after LPA is preferably performed for 1 to 4 days, but is not limited thereto. Meanwhile, a pretreatment step of removing serum components from the culture medium may be added prior to step iii, and after step ii, the LPA culture medium is exchanged by replacing the LPA-containing culture medium with a medium not containing LPA at a certain point after the LPA treatment. The step of removing from may further include, but is not limited to.

상기 배양배지는 무혈청배지인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.The culture medium is preferably serum-free medium, but is not limited thereto.

상기 줄기세포는 배아 줄기세포 또는 성체 줄기세포인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니고, 상기 성체 줄기세포는 조혈 줄기세포 또는 중간엽 줄기세포인 것이 바람직하며, 중간엽 줄기세포인 것이 더욱 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 중간엽 줄기세포는 제대혈 유래 줄기세포, 태반 유래 줄기세포, 지방 유래 줄기세포, 골수 유래 줄기세포 또는 말초혈액 유래 줄기세포일 수 있고, 채취상의 침습성의 정도에 따라 제대혈 유래 줄기세포, 지방 유래 줄기세포 또는 말초혈액 유래 줄기세포인 것이 더욱 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. Preferably, the stem cells are embryonic stem cells or adult stem cells, but are not limited thereto. The adult stem cells are preferably hematopoietic stem cells or mesenchymal stem cells, and more preferably, mesenchymal stem cells. It doesn't happen. The mesenchymal stem cells may be umbilical cord blood-derived stem cells, placental stem cells, adipose-derived stem cells, bone marrow-derived stem cells or peripheral blood-derived stem cells, cord blood-derived stem cells, adipose-derived stems, depending on the degree of invasiveness in harvesting More preferably, the cells or peripheral blood-derived stem cells are not limited thereto.

본 발명자들은 동물실험 결과, LPA가 처리된 줄기세포 배양액이 미처리 배양액에 비하여 창상치료 및 피부개선에 더 효과적임을 확인하였고(도 2 및 3 참조), 이는 LPA 처리에 의해 줄기세포의 세포내 및 세포외의 콜라겐의 함량이 증가함에 따른 결과임을 확인하였다(도 4 참조).As a result of animal experiments, the present inventors confirmed that LPA-treated stem cell cultures were more effective for wound treatment and skin improvement than untreated cultures (see FIGS. 2 and 3). In addition, it was confirmed that the result of increasing the content of collagen (see Fig. 4).

따라서, 본 발명의 LPA 처리 줄기세포 배양액은 부작용이 없고 경제적인 가격으로 공급이 가능하며, 창상 치료에 유효한 단백질인 콜라겐 및 피브로넥틴 등이 농축되어 있을 뿐만 아니라, 실제 창상 치료에 있어서 우수한 효과를 나타내므로, 창상 치료제로 효과적으로 사용될 수 있음을 알 수 있다.Therefore, the LPA-treated stem cell culture medium of the present invention can be supplied at an economical price without side effects, and it is not only concentrated in collagen and fibronectin, which are effective proteins for wound treatment, but also shows excellent effects in actual wound treatment. It can be seen that it can be effectively used as a wound healing agent.

본 발명에 따르면 LPA를 줄기세포에 처리한 후 얻은 세포배양액은 창상 치료에 우수한 효과를 나타낼 뿐 아니라, 부작용이 없고 경제적인 가격으로 공급이 가능하며, 창상 치료에 유효한 단백질인 콜라겐 및 피브로넥틴 등이 농축되어 있어, 본 배양액을 사용하면 창상 재생 과정에 있어서 중요한 과정인 재상피화, 혈관신생, 염증세포의 침윤 등이 촉진된다. 따라서 LPA를 줄기세포에 처리한 후 분리한 세포배양액은 창상치료제 및 피부개선용 화장품 조성물로 활용할 수 있다.According to the present invention, the cell culture solution obtained after treating LPA to stem cells not only shows an excellent effect on the treatment of wounds, but also has no side effects and can be supplied at an economical price. The collagen and fibronectin, which are effective proteins for wound treatment, are concentrated. By using the culture solution, re-epithelialization, angiogenesis, infiltration of inflammatory cells, etc., which are important processes in the wound regeneration process, are promoted. Therefore, the cell culture solution isolated after treating LPA to stem cells can be used as a wound treatment and cosmetic composition for skin improvement.

도 1은 지방으로부터 유래된 중간엽 줄기세포를 현미경으로 촬영한 사진이다.
도 2는 LPA로 유도된 중간엽 줄기세포의 배양액을 동물 피부창상 모델에 처리시 피부 창상이 빨리 회복됨을 나타내는 사진(A) 및 창상 면적을 나타낸 그래프(B)이다.
도 3은 LPA가 처리되지 않은 중간엽 줄기세포의 배양액인 대조군(상부) 및 LPA로 유도된 중간엽 줄기세포의 배양액(하부)을 동물 피부창상 모델에 처리후 창상부위의 조직을 채취하여 촬영한 조직분석 사진이다.
도 4는 LPA로 유도된 중간엽 줄기세포의 세포 파쇄액(A) 및 배양액(B)에서 세포외기질 단백질인 제1형 콜라겐의 함량이 증가됨을 보여주는 웨스턴블랏 분석 결과이다.1 is a photomicrograph of mesenchymal stem cells derived from fat.
Figure 2 is a picture (A) and a graph showing the wound area (A) and the wound area is rapidly recovered when the culture of LPA-induced mesenchymal stem cells in the animal skin wound model.
Figure 3 is a control medium (top), which is a culture medium of mesenchymal stem cells not treated with LPA and culture medium (bottom) of mesenchymal stem cells induced by LPA after treatment in an animal skin wound model and photographed by taking the tissue of the wound site The tissue analysis picture.
4 is a result of Western blot analysis showing that the content of collagen type 1, an extracellular matrix protein, is increased in the cell lysate (A) and culture medium (B) of mesenchymal stem cells induced by LPA.

용어의 정의Definition of Terms

이하, 본 문서에서 사용되는 용어를 설명한다.Hereinafter, terms used in the present document will be described.

'줄기세포'는 개체를 구성하는 세포나 조직의 근간이 되는 세포로서, 어느 특정한 또는 복수 개의 기능적 세포로 분화되는 능력 및 스스로 동일한 세포를 반복적으로 생산할 수 있는 자기 복제 능력을 가진, 미분화 세포를 일컬을 수 있다. 줄기세포는 분화 가능성에 따라 크게 배아 줄기세포 (embryonic stem cell; ES cell)와 성체 줄기세포(adult stem cells)로 나뉠 수 있다. Stem cells are the cells that form the basis of cells or tissues that make up an individual, and are referred to as undifferentiated cells that have the ability to differentiate into any specific or multiple functional cells and self-replicating ability to produce the same cells repeatedly. Can be. Stem cells can be largely divided into embryonic stem cells (ES cells) and adult stem cells (adult stem cells) depending on the possibility of differentiation.

'배아 줄기세포'는 수정란이 형성된 후 자궁내막에 착상하기 전의 매우 초기 단계인 포배기(blastocyst) 배아 중 태아로 발생할 내부세포괴(inner cell mass; ICM)로부터 분리해낸 줄기세포로서, 내배엽, 외배엽 및 중배엽의 3개의 배엽 (embryonic germ layer)에 의해 생성되는 모든 조직의 세포로 분화될 수 있는 전분화능(pluripotent) 세포일 수 있다. Embryonic stem cells are stem cells isolated from the inner cell mass (ICM) that will develop into the fetus in the blastocyst embryo, which is a very early stage after the embryo is formed and before implantation into the endometrium. Endoderm, ectoderm and mesoderm It may be a pluripotent cell capable of differentiating into cells of all tissues produced by the three germ layers of.

반면, '성체 줄기세포'는 발생과정이 끝난 성인 또는 배아 발생 과정이 진행되어 배아의 각 장기가 형성되는 단계에 태반에서 얻어지는, 각 장기에 특이적인 줄기세포로서, 일반적으로 그 조직을 구성하는 세포로만 한정된 분화가 가능한 다분화능(multipotent) 세포이다. 이러한 성체 줄기세포는 성인이 된 후에도 대부분의 장기에 남아 정상적으로 혹은 병리적으로 발생하는 세포의 손실을 보충하는 역할을 할 수 있다. 대표적인 성체 줄기세포로는 골수(bone marrow)에 존재하는 조혈 줄기세포(hematopoietic stem cell)와 혈구 세포 이외의 결합조직(connective tissue) 세포로 분화되는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)일 수 있다. 조혈 줄기세포는 적혈구, 백혈구 등 각종 혈구 세포로 분화되고, 중간엽 줄기세포는 골아세포(osteoblast), 연골아세포(chondroblast), 지방 세포(adipocyte) 및 근아세포(myoblast) 등으로 분화될 수 있다. 중간엽 줄기세포는 중간엽 줄기세포의 중요한 저장소인 골수로부터 분리될 수 있으나, 채취에 어려움이 있을 수 있으며, 지방조직 등에서도 분리배양될 수 있다. 본 발명에 있어서, 중간엽 줄기세포는 줄기세포능, 즉, 분화능 및 증식능을 갖는 모든 세포일 수 있다.On the other hand, ' adult stem cells ' are stem cells specific to each organ, which are obtained from the placenta at the stage where the embryonic process of adult development or embryo development progresses and each organ of the embryo is formed. It is a multipotent cell capable of only limited differentiation. These adult stem cells remain in most organs after adulthood and may serve to compensate for the loss of normal or pathological cells. Representative adult stem cells may be mesenchymal stem cells that are differentiated into hematopoietic stem cells present in bone marrow and connective tissue cells other than blood cells. Hematopoietic stem cells can be differentiated into various blood cells, such as red blood cells and white blood cells, and mesenchymal stem cells can be differentiated into osteoblasts, chondrocytes, adipocytes and myoblasts. Mesenchymal stem cells may be isolated from bone marrow, which is an important reservoir of mesenchymal stem cells, but may be difficult to harvest, and may be isolated and cultured in adipose tissue and the like. In the present invention, mesenchymal stem cells may be any cell having stem cell capacity, that is, differentiation capacity and proliferation capacity.

본 발명에서 LPA는 창상조직 내 활성화된 혈소판으로부터 생산된다. LPA는 혈관신생, 섬유아세포의 이동 등을 증가시킴으로써 창상조직의 재생을 촉진하는 역할을 하는 것으로 보고된 바 있다. In the present invention, LPA is produced from activated platelets in wound tissue. LPA has been reported to play a role in promoting wound regeneration by increasing angiogenesis, fibroblast migration, and the like.

'창상(wound)'은 생체가 손상된 상태를 의미하며, 생체 내부 또는 외부 표면을 이루는 조직, 예를 들면 피부, 근육, 신경조직, 뼈, 연조직, 내부기관 또는 혈관조직이 분단 또는 파괴된 병리학적 상태를 포괄한다. 창상의 예로는, 이들로 한정하는 것은 아니지만, 비-치유 외상성 창상, 방사선조사에 의한 조직의 파괴, 찰과상(abrasion), 골괴저(osteonecrosis), 열상(laceration), 결출상(avulsion), 관통상(penetrated wound), 총상(gun shot wound), 절상, 화상, 동상, 타박상(contusion or bruise), 피부궤양(pressure sores), 피부건조, 피부각화증(keratosis), 갈라짐, 터짐, 피부염, 피부사상균증에 의한 통증, 수술상, 혈관질환 창상, 각막창상 등의 창상, 욕창, 와창, 당뇨성피부미란과 같은 당뇨병 및 순환불량에 관련된 상태, 만성궤양, 성형수술 후 봉합부위, 척추상해성 창상, 부인과적 창상, 화학적 창상 및 여드름 등을 포함하며 개체의 어떠한 부분에 대한 손상이 포함될 수 있다.' Wound ' refers to a condition in which a living body is damaged, and pathological in which tissues that make up an internal or external surface of the living body, such as skin, muscle, nerve tissue, bone, soft tissue, internal organs or vascular tissue, are divided or destroyed. It covers the state. Examples of wounds include, but are not limited to, non-healing traumatic wounds, destruction of tissue by irradiation, abrasion, osteonecrosis, laceration, avulsion, and penetrating wounds. penetrated wounds, gun shot wounds, cuts, burns, frostbite, contusion or bruise, pressure sores, dry skin, keratosis, cracking, bursting, dermatitis, dermatitis Pain, surgical wounds, vascular disease wounds, corneal wounds, bedsores, ulcers, conditions related to diabetes and poor circulation such as diabetic skin erosion, chronic ulcers, sutures after plastic surgery, spinal injury wounds, gynecological wounds And chemical damage and acne, and may include damage to any part of the individual.

'세포외 기질(extracellular matrix, ECM)'은 조직내 또는 세포외의 공간을 채우고 있는 생체고분자의 복잡한 집합체로서, 결합조직에 다량으로 존재하는데, 세포에 의해 합성되고 세포외에 분비, 축적된 분자로 구성되어 있으며, 구성분자로서는 콜라겐(collagen), 엘라스틴(elastin) 등의 섬유성 단백질, 프로테오글리칸(proteoglycan), 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycna)이라는 복합단백질, 피브로넥틴(fibronectin), 라미닌(laminin), 비트로넥틴(vitronectin) 등의 세포부착성 당단백질이 있다. Extracellular matrix (ECM) is a complex collection of biopolymers that fills the intracellular or extracellular space and is present in large amounts in connective tissue, composed of molecules synthesized and secreted and accumulated by cells. Examples of the constituent molecules include fibrous proteins such as collagen and elastin, proteoglycan, glycosaminoglycna complex protein, fibronectin, laminin, and vitronectin. cell-attached glycoproteins such as (vitronectin).

발명의 상세한 설명DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

본 발명은 LPA를 배양전 또는 배양중의 줄기세포 배양배지에 처리한 후 줄기세포를 배양하여 제조된 창상치유능이 향상된 줄기세포 배양액을 제공한다.The present invention provides a stem cell culture solution having improved wound healing ability prepared by culturing stem cells after treating LPA to a culture medium of stem cells before or during culture.

상기 줄기세포는 인간으로부터 얻는 것이 바람직하다.The stem cells are preferably obtained from humans.

또한, 본 발명의 줄기세포는 분화되는 잠재력을 지닌 모든 세포를 포함하며, 상기 줄기세포가 성체로부터 유래된 것이든 배아로부터 유래된 것이든 태아로부터 유래된 것이든 무관하나, 바람직하게는 성체 줄기세포일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 중간엽 줄기세포일 수 있다. In addition, the stem cells of the present invention include all cells having the potential to differentiate, and whether the stem cells are derived from an adult, embryo or derived from the fetus, preferably adult stem cells It may be, more preferably may be mesenchymal stem cells.

성체 줄기세포는 배아줄기세포와는 달리 성장한 자가 신체조직에서 추출하기 때문에 생명 윤리적 문제를 피할 수 있을 뿐 아니라 면역 거부 반응의 우려 또한 없으며, 치료를 위한 세포를 자가 조직으로부터 다량 확보할 수 있다는 점에서도 배아줄기세포와 차별되는 장점을 지니고 있다. 이외에도 나중에 필요한 미분화 상태의 줄기세포를 다시 만들어 저장하는 자가 재생산(self-renewal)을 할 수 있으며, 주변 조직의 특성에 자신을 맞추어 분화하는 조직 특이적 분화 능력(tissue- specific differentiation)을 가지고 있기에 바람직할 수 있다.Unlike embryonic stem cells, adult stem cells are extracted from growing autologous body tissues, which not only avoids bioethical problems, but there is also no fear of immune rejection reactions. It has the advantage of being differentiated from embryonic stem cells. In addition, it is possible to perform self-renewal to recreate and store undifferentiated stem cells, which are required later, and to have tissue-specific differentiation ability to differentiate itself according to characteristics of surrounding tissues. can do.

본 발명의 상기 중간엽 줄기세포는 그 유래된 조직이나 기관에 무관하나, 바람직하게는 지방, 골수, 말초혈액 또는 제대혈에서 추출된 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 채취방법의 침습성의 정도에 따라, 지방, 말초혈액 또는 제대혈에서 추출된 것일 수 있고, 지방에서 추출된 것이 가장 바람직하다. The mesenchymal stem cells of the present invention is irrelevant to tissues or organs derived therefrom, preferably, may be extracted from fat, bone marrow, peripheral blood or umbilical cord blood, and more preferably, depending on the degree of invasiveness of the sampling method, It may be extracted from fat, peripheral blood or umbilical cord blood, most preferably from fat.

이는 지방 줄기세포는 골수 유래 줄기세포와 비교해 볼 때 다분화능과 증식력이 거의 비슷하거나 더 우수하며, 실제 임상적 유용성에서 볼 때 소량의 지방 조직에서 충분한 양의 줄기세포를 얻고 배양할 수 있기에 경제적인 이점이 있으며, 실제 시술과정이 골수 채취와는 비교할 수 없을 정도로 고통이 없으며 안전하다. 또한 실제 시술시 국소마취를 하여 전신마취의 위험성을 줄일 수 있을뿐더러, 일주일 이내에 환자의 창상부위가 치유된다는 점(Ogawa et al., Curr. Stem Cell Res. Ther., 1: 13-20, 2006)도 지방 줄기세포의 활용도 및 우수성을 극대화하는 요인으로 작용할 수 있다.This suggests that adipose stem cells have almost the same or better multipotency and proliferative capacity as compared to bone marrow-derived stem cells, and are economical because they can obtain and culture sufficient stem cells in small amounts of adipose tissue from actual clinical utility. There is an advantage, and the actual procedure is painless and safe to compare with bone marrow harvesting. In addition, local anesthesia during the actual procedure can reduce the risk of general anesthesia, and the wound area of the patient heals within a week (Ogawa et al ., Curr. Stem Cell Res. Ther ., 1: 13-20, 2006) can also act as a factor in maximizing utilization and excellence of adipose stem cells.

본 발명의 지방 줄기세포는 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 수득할 수 있다. 예를 들면, 지방 조직은 지방흡입술(주사기 또는 동력-어시스트(assisted) 지방흡인술)에 의해, 또는 지방절제술, 예를 들어 흡입-어시스트 지방성형술(suction-assisted lipoplasty), 초음파-어시스트 지방성형술 및 적출 지방절제술(excisional lipectomy) 또는 이들의 조합에 의해 환자로부터 제거되어 폐기된 지방으로부터 기질 줄기세포를 분리할 수 있으므로, 추가적인 침습적 시술이 필요 없기 때문에 그 유용성이 높아지고, 줄기세포의 분리에 있어서도 안전하며 저렴할 수 있다.Adipose stem cells of the present invention can be obtained by any method known to those skilled in the art. For example, adipose tissue may be obtained by liposuction (syringe or power-assisted liposuction), or by lipostomy, such as suction-assisted lipoplasty, ultrasound-assisted lipoplasty and extraction. Because stromal stem cells can be isolated from fat that has been removed from the patient and discarded by excisional lipectomy or a combination thereof, its usefulness is increased because no additional invasive procedure is required, and it is safe and inexpensive to separate stem cells. Can be.

본 발명에서는 줄기세포에 처리되는 LPA의 농도는 특별히 한정되는 것은 아니나, 0.1 내지 100 μM의 농도로 처리한 것이 바람직하다. 상기 농도 이하에서 처리시 세포배양액 내 유효 단백질의 분비량이 적어 창상치유효과를 나타내지 못할 수 있으며, 상기 농도 이상에서 처리시 LPA가 줄기세포의 생존에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 상기 농도가 적절할 수 있다.In the present invention, the concentration of LPA to be treated in the stem cells is not particularly limited, but is preferably treated at a concentration of 0.1 to 100 μM. When treated below the concentration, the amount of effective protein in the cell culture may not show a wound healing effect, and when treated above the concentration, the concentration may be appropriate because LPA may affect the survival of stem cells. .

본 발명에서는 LPA로 줄기세포를 처리하는 기간에 있어 특별히 한정된 것은 아니나, 1 내지 4 일간 처리하는 것이 바람직할 수 있다. 만일 1 일 이하로 처리시 세포 배양액 내 단백질의 분비량이 적어 창상치유에 효과가 미미할 수 있으며, 4일 이상 처리시에는 줄기세포의 사멸을 유발할 수 있기에 상기 일수로 처리하는 것이 바람직할 수 있다.In the present invention, the treatment of stem cells with LPA is not particularly limited, but may be preferably performed for 1 to 4 days. If the treatment is less than one day, the secretion of protein in the cell culture may be less effective for wound healing, and treatment for more than four days may cause the death of stem cells, so it may be desirable to treat with the same number of days.

활성화되지 않은 중간엽 줄기세포의 경우 세포로부터 분비되는 콜라겐 및 피브로넥틴 등 창상치유를 촉진하는 단백질의 농도가 부족하여 창상 치유 조성물로 사용하기에 적합하지 않은 데 반하여, 본 발명의 LPA로 처리된 줄기세포의 배양액을 사용하면 상기 단백질을 포함한 창상치유 단백질의 농도가 농축되어 있어 빠른 시일 내에 창상 치료효과를 나타낼 수 있다. 즉, 상기 LPA로 처리된 줄기세포의 배양액 내에는 콜라겐 및 피브로넥틴 등 창상치유를 촉진하는 단백질의 농도가 증가되어 있기에, 상기 배양액을 창상 부위에 바를 경우 창상 재생 과정에 있어서 중요한 과정인 재상피화, 혈관신생, 염증세포의 침윤 등이 촉진되어 피부창상의 재생을 촉진시킬 수 있다.Inactivated mesenchymal stem cells lack the concentration of proteins that promote wound healing such as collagen and fibronectin secreted from the cells, and thus are not suitable for use as a wound healing composition, whereas stem cells treated with LPA of the present invention Using a culture of the concentration of the wound healing protein containing the protein is concentrated can exhibit a wound healing effect as soon as possible. That is, since the concentration of proteins that promote wound healing, such as collagen and fibronectin, is increased in the culture medium of stem cells treated with LPA, re-epithelialization and blood vessels, which are important processes in the wound regeneration process, are applied to the wound site. Angiogenesis, infiltration of inflammatory cells, etc. may be promoted to promote regeneration of skin wounds.

본 발명의 창상은 생체가 손상된 상태를 의미하며, 생체 내부 또는 외부 표면을 이루는 조직 등 개체의 어떠한 부분에 대한 손상이 포함을 포함할 수 있다.The wound of the present invention refers to a state in which a living body is damaged, and may include damage to any part of an individual such as tissues forming an internal or external surface of the living body.

본 발명은 또한, 상기 줄기세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 창상 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 약학적 용도 또는 기능성 화장품 용도로 사용이 가능하다. The present invention also provides a composition for improving or treating wounds comprising the stem cell culture as an active ingredient. The composition can be used for pharmaceutical use or functional cosmetic use.

본 발명의 조성물에서 상기 유효성분은, 조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 100 중량%로 함유될 수 있다.The active ingredient in the composition of the present invention may be contained in 0.1 to 100% by weight based on the total weight of the composition.

본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 약학 조성물의 제조에는 고체 또는 액체의 제제용 첨가물을 사용할 수 있다. 제제용 첨가물은 유기 또는 무기 중 어느 것이어도 된다. The compositions of the present invention may further comprise suitable carriers, excipients and diluents conventionally used in the manufacture of pharmaceutical compositions. In addition, the preparation of the pharmaceutical composition may be used as additives for the preparation of solid or liquid. The preparation additive may be either organic or inorganic.

부형제로서는 예를 들면 유당, 자당, 백당, 포도당, 옥수수 전분(corn starch), 전분, 탈크, 소르비트, 결정 셀룰로오스, 덱스트린, 카올린, 탄산칼슘, 이산화규소 등을 들 수 있다. 결합제로서는 예를 들면 폴리비닐알코올, 폴리비닐에테르, 에틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 아라비아고무, 트래거캔스(tragacanth), 젤라틴, 셀락(shellac), 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 구연산칼슘, 덱스트린, 펙틴(pectin) 등을 들 수 있다. 활택제로서는 예를 들면 스테아린산마그네슘, 탈크, 폴리에틸렌글리콜, 실리카, 경화식물유 등을 들 수 있다. 착색제로서는 통상 의약품에 첨가하는 것이 허가되어 있는 것이라면 모두 사용할 수 있다. 이들의 정제, 과립제에는 당의(糖衣), 젤라틴코팅, 기타 필요에 따라 적절히 코팅할 수 있다. 또한, 필요에 따라 방부제, 항산화제 등을 첨가할 수 있다.Examples of the excipient include lactose, sucrose, saccharin, glucose, corn starch, starch, talc, sorbit, crystalline cellulose, dextrin, kaolin, calcium carbonate and silicon dioxide. Examples of the binder include polyvinyl alcohol, polyvinyl ether, ethylcellulose, methylcellulose, gum arabic, tragacanth, gelatin, shellac, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, calcium citrate, Dextrin, pectin, and the like. Examples of the lubricant include magnesium stearate, talc, polyethylene glycol, silica, and hydrogenated vegetable oil. Any coloring agent may be used as long as it is usually allowed to be added to pharmaceuticals. These tablets and granules can be suitably coated with sugar (sugar coating), gelatin coating, and others as required. If necessary, preservatives, antioxidants and the like may be added.

본 발명의 약학조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며(예: 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science, 최신판; Mack Publishing Company, Easton PA), 제제의 형태는 특별히 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 외용제일 수 있다. 본 발명의 외용제에는 시트제, 액상도포제, 분무제, 로션제, 크림제, 파프제, 분제, 침투 패드제, 분무제, 수화겔을 포함한 겔제, 파스타제, 리니멘트제, 연고제, 에어로졸, 분말제, 현탁액제, 경피흡수제 등의 통상적인 외용제의 형태가 포함될 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌[Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042(Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기술되어 있다.The pharmaceutical compositions of the present invention may be prepared in any formulation commonly prepared in the art (e.g., Remington's Pharmaceutical Science, latest edition; Mack Publishing Company, Easton PA), and the form of the formulation is not particularly limited, Preferably it may be an external preparation. The external preparation of the present invention includes a sheet, a liquid coating, a spray, a lotion, a cream, a pape, a powder, a penetrating pad, a spray, a gel including a hydrogel, a pasta, a liniment, an ointment, an aerosol, a powder, a suspension. Formulations may include conventional external preparations such as transdermal absorbents. These formulations are described in Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042 (Chapter 87: Blaug, Seymour), a prescription generally known for all pharmaceutical chemistry.

본 발명의 일례로, 상기 조성물을 창상에 직접 적용될 수 있다. 즉, 창상부위에 산포될 수 있다. 시트의 형태인 경우는 창상 부위에 도포하는데 이때 도포한 부위에 적절히 드레싱하여 창상을 보호하면서 활성 성분의 치료 효과가 감소하는 것을 방지한다. 드레싱은 시판되고 있거나 통상적으로 알려져 있는 어떠한 것도 사용 가능하다. 시판되고 있는 드레싱의 예로는 컴필(Compeel), 듀우덤(Duoderm), 타가덤(Tagaderm) 및 옵사이트(Opsite)를 들 수 있다.In one example of the invention, the composition may be applied directly to the wound. That is, it may be scattered on the wound site. In the form of a sheet, it is applied to the wound site, where appropriate dressing is applied to the applied site to protect the wound while preventing the therapeutic effect of the active ingredient from decreasing. The dressing can be any commercially available or commonly known. Examples of commercially available dressings include Compeel, Duoderm, Tagaderm and Opsite.

본 발명의 외용제에서, 약제학상 허용되는 담체로는 그의 제형에 따라 다르나, 바셀린, 유동 파라핀, 겔화 탄화수소(별명: 플라스티베이스) 등의 탄화수소류; 중쇄지방산 트리글리세라이드, 돈지, 하드 팻트, 카카오지 등의 동식물성 오일; 세탄올, 스테아릴알코올, 스테아린산, 팔미틴산이소프로필 등의 고급지방산 알코올 및 지방산 및 그의 에스테르류; 마크로골(폴리에틸렌글리콜), 1,3-부틸렌글리콜, 글리세롤, 젤라틴, 백당, 당알코올 등의 수용성 기제; 글리세린 지방산에스테르, 스테아린산폴리옥실, 폴리옥시에틸렌경화 피마자유 등의 유화제; 아크릴산에스테르, 알긴산나트륨 등의 점착제; 액화석유가스, 이산화탄소 등의 분사제; 파라옥시벤조산에스테르류 등의 방부제 등을 들 수 있으며, 본 발명의 외용제는 이들을 사용하여 통상의 방법에 따라 제조할 수 있다. 또한, 이들 이외에도 안정제, 향료, 착색제, pH 조정제, 희석제, 계면활성제, 보존제, 항산화제 등을 필요에 따라 배합할 수도 있다. 본 발명의 외용제는 사용은 통상의 방법에 의해 국소창상부에 도포 될 수 있다.In the external preparations of the present invention, pharmaceutically acceptable carriers include hydrocarbons such as petrolatum, liquid paraffin, gelled hydrocarbons (also called plastibases), depending on the formulation thereof; Animal and vegetable oils such as medium chain fatty acid triglyceride, lard, hard fat and cacao butter; Higher fatty acid alcohols and fatty acids such as cetanol, stearyl alcohol, stearic acid and isopropyl palmitate and esters thereof; Water-soluble bases such as macrogol (polyethylene glycol), 1,3-butylene glycol, glycerol, gelatin, white sugar and sugar alcohol; Emulsifiers such as glycerin fatty acid esters, polyoxyl stearic acid and polyoxyethylene-cured castor oil; Pressure-sensitive adhesives such as acrylate ester and sodium alginate; Propellants such as liquefied petroleum gas and carbon dioxide; Preservatives, such as paraoxybenzoic acid ester, etc. are mentioned, The external preparation of this invention can be manufactured according to a conventional method using these. In addition to these, stabilizers, flavors, colorants, pH adjusters, diluents, surfactants, preservatives, antioxidants and the like may be blended as necessary. The external preparation of the present invention can be applied to the topical wounds by conventional methods.

또한, 본 발명에 따른 외용제는 통상적인 반창고의 창상 박리 커버 등과 같은 고체 지지체상에 점착되어 사용될 수 있다. 본 발명의 양태로서, 고체 지지체를 먼저 점착층으로 피복하여 고체 지지체에 배양액의 부착을 향상시킨다. 점착제의 예로는 폴리아크릴레이트 및 시아노아크릴레이트가 포함될 수 있다.In addition, the external preparation according to the present invention may be used by being adhered onto a solid support such as a wound peeling cover of a conventional band-aid. In an aspect of the present invention, the solid support is first coated with an adhesive layer to improve adhesion of the culture solution to the solid support. Examples of the pressure-sensitive adhesive may include polyacrylate and cyanoacrylate.

이러한 형태의 제형은 시판되고 있는 것이 많으며 예로는 천공된 플라스틱 필름 형태의 비부착성 창상 박리 커버를 갖는 반창고(Smith & Nephew Ltd.), Johnson & Johnson의 얇은 스트립(strip), 패취(patch), 스포트(spot), 가소성 스트립 형태의 밴드-에이드(BAND-AID); Colgate-Palmolive Co.(Kendall)의 큐리티 큐러드(Curity CURAD, 오우취리스(Ouchless)) 반창고; 및 American WhiteCross Laboratories, Inc.의 스틱-타이트(STIK-TITE) 탄성 스트립 등을 들 수 있다.Many formulations of this type are commercially available, such as Smith & Nephew Ltd. with a non-adhesive wound release cover in the form of perforated plastic films, thin strips, patches, BAND-AIDs in the form of spots, plastic strips; Curity CURAD (Ouchless) Band-Aid from Colgate-Palmolive Co. (Kendall); And STIK-TITE elastic strips from American White Cross Laboratories, Inc .;

본 발명의 일례로, 본 발명에 따른 약학 조성물은 상기 배양액 분말과 생리식염수를 일정한 부피비로 혼합하고 액상 도포제의 형태로 제형화될 수 있다. 본 발명의 일례로서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 상기한 본 발명의 배양액 분말과 수용성 연고기제를 혼합하고 여기에 생리식염수를 첨가하여 연고제의 형태로 제형화될 수 있다. In one example of the present invention, the pharmaceutical composition according to the present invention may be formulated in the form of a liquid coating agent by mixing the culture powder and physiological saline in a constant volume ratio. As an example of the present invention, the pharmaceutical composition according to the present invention may be formulated in the form of an ointment by mixing the culture solution powder of the present invention and a water-soluble ointment and adding physiological saline thereto.

본 발명의 약학적 유효량은 환자의 창상 종류, 적용부위, 처리회수, 처리시간, 제형, 환자의 상태, 보조제의 종류 등에 따라 변할 수 있다. 사용량은 특별히 한정되지 않지만, 통상 본 발명의 약학 조성물의 일일 유효량은 세포 배양액을 창상에 적용시 1 내지 50 μl/cm2일 수 있으며, 바람직하게는 5 내지 20 ㎕/cm2 일 수 있다. 상기 1 일량은 1일에 1회, 또는 적당한 간격을 두고 하루에 2~3회에 나눠 투여해도 되고, 수일(數日) 간격으로 간헐(間歇)투여해도 된다. The pharmaceutically effective amount of the present invention may vary depending on the type of wound, the site of application, the number of treatments, the treatment time, the formulation, the condition of the patient, the type of adjuvant, and the like. The amount of use is not particularly limited, but usually The daily effective amount of the pharmaceutical composition of the present invention may be 1 to 50 μl / cm 2 when the cell culture is applied to the wound, preferably 5 to 20 μl / cm 2. have. The daily dose may be administered once a day or divided into two to three times a day at appropriate intervals, or may be administered intermittently at intervals of several days.

그러나, 본 발명의 약제학적 조성물의 상기 사용량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 환자의 중증도, 창상 종류, 적용부위, 처리회수, 처리시간, 제형, 환자의 상태, 보조제의 종류 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되는 것이므로 상기 유효량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 아니 된다. However, the amount of the pharmaceutical composition according to the present invention may be used in terms of the route of administration, the age, sex, weight of the patient, the severity of the patient, the type of wound, the site of application, the number of treatments, the treatment time, the dosage form, the condition of the patient, the type of supplement, and the like. The effective amount is not to be understood as limiting the scope of the present invention in any aspect because it is determined in view of various related factors.

아울러, 본 발명은 In addition,

ⅰ) 배양전 또는 배양중의 줄기세포 배양 배지에 LPA를 처리하는 단계; Iii) treating LPA to the stem cell culture medium before or during the culture;

ⅱ) LPA가 처리된 배양배지 내에서 줄기세포를 배양하는 단계; 및 Ii) culturing stem cells in a culture medium treated with LPA; And

ⅲ) 추가배양을 종료하고 줄기세포 배양액을 회수하는 단계를 포함하는 창상치유 능력이 증가된 줄기세포 배양액의 제조방법을 제공한다.Iii) providing a method for producing a stem cell culture with increased wound healing ability, including terminating further culture and recovering the stem cell culture.

상기 줄기세포의 유래 생물종은 그 종류에 있어서 특별히 한정된 것은 아니나, 바람직하게는 인간에서 유래된 것일 수 있다.The stem cell-derived species is not particularly limited in kind, but may preferably be derived from humans.

또한, 상기 줄기세포는 그 종류에 있어서 특별히 한정된 것은 아니나, 바람직하게는 성체 줄기세포일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 중간엽 줄기세포일 수 있다.In addition, the stem cells are not particularly limited in kind, but may preferably be adult stem cells, more preferably mesenchymal stem cells.

본 발명의 일례로, 상기 중간엽 줄기세포는 지방, 골수, 말초혈액 또는 제대혈에서 추출된 것일 수 있다. 이들 중 지방에서 추출한 지방 유래 줄기세포는 다분화능과 증식력이 뛰어나며, 시술과정이 안전하고, 소량의 지방조직에서 충분한 양의 줄기세포를 얻을 수 있어 경제적이다.In one example of the present invention, the mesenchymal stem cells may be extracted from fat, bone marrow, peripheral blood or umbilical cord blood. Among these, fat-derived stem cells extracted from fat are excellent in pluripotency and proliferative ability, a safe procedure, and economically sufficient stem cells can be obtained from a small amount of adipose tissue.

본 발명의 일례로, 상기 줄기세포를 분리하고 배양하는 방법으로는, 피하지방제거술을 시행한 환자에서 폐기된 지방조직을 HBSS(Hank's balanced salt solution)로 처리한 후 콜라게나아제(collagenase), 바람직하게는 0.075% 콜라게나아제로 37℃에서 1 내지 2 시간, 바람직하게는 30 분간 처리할 수 있다. 원심분리 후 필렛(pellet)에 세포배양액(1 내지 20% fetal bovine serum, 50 내지 200 U/ml penicillin, 50 내지 200 μg/ml streptomycin이 첨가된 alpha-minimum essential medium)을 첨가하여 재현탁(resuspension)시킨 후 나일론망(nylon mesh)에 통과시켜 콜라게나아제에 의해 지방조직으로부터 분리된 세포를 얻을 수 있다. 나일론망을 통과한 세포는 배양접시(culture dish)에 도포(plating)해서 18 내지 36 시간 후 부착되지 않은 세포를 제거하고 부착된 세포를 세포배양액을 교환해주면서 배양할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the method of isolating and culturing the stem cells, collagenase (collagenase), preferably after treatment of the discarded adipose tissue with HBSS (Hank's balanced salt solution) in patients undergoing subcutaneous fat removal Preferably it can be treated with 0.075% collagenase at 37 ° C. for 1 to 2 hours, preferably 30 minutes. After centrifugation, the pellet is resuspended by adding cell culture solution (alpha-minimum essential medium with 1-20% fetal bovine serum, 50-200 U / ml penicillin, and 50-200 μg / ml streptomycin). The cells isolated from the adipose tissue by collagenase can be obtained by passing through a nylon mesh. Cells that have passed through the nylon network may be plated in a culture dish to remove unattached cells after 18 to 36 hours, and the attached cells may be cultured while exchanging the cell culture solution.

본 발명의 일례로, 상기 줄기세포를 분리하고 배양하는 방법으로는, 환자로부터 얻은 골수를 피콜-하이파크 농도구배(Ficoll-Hypaque gradient, 밀도 1.077 g/cm3, Sigma, USA)를 이용하여 원심분리한 후 배양접시(culture dish)에 도말(plating)한 후 세포배양액을 교환해주면서 배양접시에 부착된 세포를 증식 배양할 수 있다.As an example of the present invention, as a method for isolating and culturing the stem cells, the bone marrow obtained from the patient is centrifuged using a Ficoll-Hypaque gradient (density 1.077 g / cm 3 , Sigma, USA). After separation, the plate is plated in a culture dish, and then the cells attached to the culture dish can be proliferated and cultured while exchanging the cell culture solution.

또한, 본 발명의 줄기세포에 처리되는 LPA의 농도는 특별히 한정되는 것은 아니나, 0.1 내지 100 μM의 농도로 처리한 것이 바람직할 수 있다. 상기 농도 이하에서 처리시 세포배양액 내 유효 단백질의 분비량이 적어 창상치유효과를 나타내지 못할 수 있으며, 상기 농도 이상에서 처리시 LPA에 의해 줄기세포의 생존이 저하될 수 있기에 상기 농도가 적절할 수 있다.In addition, the concentration of LPA to be treated in the stem cells of the present invention is not particularly limited, it may be preferred that the treatment at a concentration of 0.1 to 100 μM. When the concentration is less than the concentration of the effective protein in the cell culture solution may not exhibit a wound healing effect, the treatment may be appropriate because the concentration of the stem cells may be reduced by LPA when treated above the concentration.

또한, 상기 LPA로 줄기세포를 처리하는 기간에 있어 특별히 한정된 것은 아니나, 1 내지 4 일간 처리하는 것이 바람직할 수 있다. In addition, the treatment period of the stem cells with the LPA is not particularly limited, but may be preferably treated for 1 to 4 days.

본 발명은 상기 줄기세포에 LPA로 처리하는 과정 전에 줄기세포에서 혈청성분을 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다.The present invention may further comprise the step of removing the serum components from the stem cells before the process of treating the stem cells with LPA.

상기 줄기세포에서 혈청성분(serum component)을 제거는 당업계에서 통상적으로 수행하는 방법에 의해 수행될 수 있으며, 일례로 HBSS(Hank's balanced salt solution)로 세척함으로 혈청성분을 제거할 수 있다.Removing the serum component (serum component) in the stem cells may be carried out by a method commonly performed in the art, for example, the serum component can be removed by washing with HBSS (Hank's balanced salt solution).

아울러, 본 발명은 상기 단계 ⅱ 및 ⅲ 사이에 LPA 함유 배양배지를 LPA가 함유되지 않은 배양배지로 교환함으로써 배양배지에서 LPA를 제거하는 단계를 추가할 수 있는데, 이는 LPA가 종양형성 및 전이와 관련되어 있기 때문에, 배지에 잔류한 LPA에 의하여 발생할 수 있는 부작용을 최소화하기 위함이다.In addition, the present invention may add the step of removing LPA from the culture medium by replacing the LPA-containing culture medium with the LPA-containing culture medium between the steps ii and iii, which is related to tumor formation and metastasis. In order to minimize side effects caused by LPA remaining in the medium.

한편, 본 발명의 방법에 있어서, 사용되는 배양배지는 무혈청배지인 것이 바람직하나 이에 제한되지 않는다. 무혈청배지의 사용이 선호되는 것은, 배지에 포함되는 우태아혈청(FBS)의 경우 광우병의 원인이 되는 프리온의 감염이 문제될 수 있고, 우태아혈청 내에 포함된 비인간 단백질의 존재에 의하여 원하지 않는 알러지 반응이 야기될 수 있기 때문이다.On the other hand, in the method of the present invention, the culture medium used is preferably serum-free medium, but is not limited thereto. The use of serum-free medium is preferred, in the case of fetal bovine serum (FBS) contained in the medium may be a problem of prion infection that causes mad cow disease, undesired by the presence of non-human proteins contained in fetal bovine serum This is because an allergic reaction can be caused.

아울러, 본 발명의 방법은 상기 단계 ⅲ 이후에, 회수된 줄기세포 배양액을 원심분리하여 줄기세포 배양액에 잔존하고 있는 줄기세포 또는 줄기세포 부스러기를 제거하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.In addition, the method of the present invention may further include the step of removing the stem cells or stem cell debris remaining in the stem cell culture by centrifuging the recovered stem cell culture after step iii.

더 나아가, 본 발명은 Furthermore, the present invention

ⅰ) 배양전 또는 배양중의 줄기세포 배양 배지에 LPA를 처리하는 단계; 및 Iii) treating LPA to the stem cell culture medium before or during the culture; And

ⅱ) LPA가 처리된 배양배지 내에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포 배양액 내의 콜라겐 함량을 증가시키는 방법을 제공한다.Ii) providing a method of increasing collagen content in a stem cell culture comprising culturing the stem cells in a culture medium treated with LPA.

상기 방법에 있어서, 상기 줄기세포의 유래 생물종은 그 종류에 있어서 특별히 한정된 것은 아니나, 바람직하게는 인간에서 유래된 것일 수 있다.In the above method, the stem cell-derived species is not particularly limited in kind, but may preferably be derived from humans.

또한, 상기 줄기세포는 그 종류에 있어서 특별히 한정된 것은 아니나, 바람직하게는 성체 줄기세포일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 중간엽 줄기세포일 수 있다.In addition, the stem cells are not particularly limited in kind, but may preferably be adult stem cells, more preferably mesenchymal stem cells.

본 발명의 일례로, 상기 중간엽 줄기세포는 지방, 골수, 말초혈액 또는 제대혈에서 추출된 것일 수 있다. 이들 중 지방에서 추출한 지방 유래 줄기세포는 다분화능과 증식력이 뛰어나며, 시술과정이 안전하고, 소량의 지방조직에서 충분한 양의 줄기세포를 얻을 수 있어 경제적이다.In one example of the present invention, the mesenchymal stem cells may be extracted from fat, bone marrow, peripheral blood or umbilical cord blood. Among these, fat-derived stem cells extracted from fat are excellent in pluripotency and proliferative ability, a safe procedure, and economically sufficient stem cells can be obtained from a small amount of adipose tissue.

본 발명의 일례로, 상기 줄기세포를 분리하고 배양하는 방법으로는, 피하지방제거술을 시행한 환자에서 폐기된 지방조직을 HBSS(Hank's balanced salt solution)로 처리한 후 콜라게나아제(collagenase), 바람직하게는 0.075% 콜라게나아제로 37℃에서 1 내지 2 시간, 바람직하게는 30 분간 처리할 수 있다. 원심분리 후 필렛(pellet)에 세포배양액(1 내지 20% fetal bovine serum, 50 내지 200 U/ml penicillin, 50 내지 200 μg/ml streptomycin이 첨가된 alpha-minimum essential medium)을 첨가하여 재현탁(resuspension)시킨 후 나일론망(nylon mesh)에 통과시켜 콜라게나아제에 의해 지방조직으로부터 분리된 세포를 얻을 수 있다. 나일론망을 통과한 세포는 배양접시(culture dish)에 도포(plating)해서 18 내지 36 시간 후 부착되지 않은 세포를 제거하고 부착된 세포를 세포배양액을 교환해주면서 배양할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the method of isolating and culturing the stem cells, collagenase (collagenase), preferably after treatment of the discarded adipose tissue with HBSS (Hank's balanced salt solution) in patients undergoing subcutaneous fat removal Preferably it can be treated with 0.075% collagenase at 37 ° C. for 1 to 2 hours, preferably 30 minutes. After centrifugation, the pellet is resuspended by adding cell culture solution (alpha-minimum essential medium with 1-20% fetal bovine serum, 50-200 U / ml penicillin, and 50-200 μg / ml streptomycin). The cells isolated from the adipose tissue by collagenase can be obtained by passing through a nylon mesh. Cells that have passed through the nylon network may be plated in a culture dish to remove unattached cells after 18 to 36 hours, and the attached cells may be cultured while exchanging the cell culture solution.

본 발명의 일례로, 상기 줄기세포를 분리하고 배양하는 방법으로는, 환자로부터 얻은 골수를 피콜-하이파크 농도구배(Ficoll-Hypaque gradient, 밀도 1.077 g/cm3, Sigma, USA)를 이용하여 원심분리한 후 배양접시(culture dish)에 도말(plating)한 후 세포배양액을 교환해주면서 배양접시에 부착된 세포를 증식 배양할 수 있다.As an example of the present invention, as a method for isolating and culturing the stem cells, the bone marrow obtained from the patient is centrifuged using a Ficoll-Hypaque gradient (density 1.077 g / cm 3 , Sigma, USA). After separation, the plate is plated in a culture dish, and then the cells attached to the culture dish can be proliferated and cultured while exchanging the cell culture solution.

또한, 본 발명의 줄기세포에 처리되는 LPA의 농도는 특별히 한정되는 것은 아니나, 0.1 내지 100 μM의 농도로 처리한 것이 바람직할 수 있다. 상기 농도 이하에서 처리시 세포배양액 내 유효 단백질의 분비량이 적어 창상치유효과를 나타내지 못할 수 있으며, 상기 농도 이상에서 처리시 LPA에 의해 줄기세포의 생존이 저하될 수 있기에 상기 농도가 적절할 수 있다.In addition, the concentration of LPA to be treated in the stem cells of the present invention is not particularly limited, it may be preferred that the treatment at a concentration of 0.1 to 100 μM. When the concentration is less than the concentration of the effective protein in the cell culture solution may not exhibit a wound healing effect, the treatment may be appropriate because the concentration of the stem cells may be reduced by LPA when treated above the concentration.

또한, 상기 LPA로 줄기세포를 처리하는 기간에 있어 특별히 한정된 것은 아니나, 1 내지 4 일간 처리하는 것이 바람직할 수 있다. In addition, the treatment period of the stem cells with the LPA is not particularly limited, but may be preferably treated for 1 to 4 days.

본 발명의 방법은 단계 ⅰ에 앞서, 줄기세포에서 혈청성분을 제거하는 전처리 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.The method of the present invention may further include a pretreatment step of removing serum components from stem cells prior to step iii.

상기 줄기세포에서 혈청성분(serum component)을 제거는 당업계에서 통상적으로 수행하는 방법에 의해 수행될 수 있으며, 일례로 HBSS(Hank's balanced salt solution)로 세척함으로 혈청성분을 제거할 수 있다.Removing the serum component (serum component) in the stem cells may be carried out by a method commonly performed in the art, for example, the serum component can be removed by washing with HBSS (Hank's balanced salt solution).

아울러, 본 발명은 상기 단계 ⅰ 및 ⅱ 사이에 LPA 함유 배양배지를 LPA가 함유되지 않은 배양배지로 교환함으로써 배양배지에서 LPA를 제거하는 단계를 추가할 수 있는데, 이는 LPA가 종양의 형성 및 전이와 관련되어 있기 때문에, 배지에 잔류한 LPA에 의하여 발생할 수 있는 부작용을 최소화하기 위함이다.In addition, the present invention may add a step of removing the LPA from the culture medium by replacing the LPA-containing culture medium with the LPA-containing culture medium between the steps iii and ii, which is the LPA and the tumor formation and metastasis Because it is related, it is to minimize the side effects that can be caused by LPA remaining in the medium.

한편, 본 발명의 방법에 있어서, 사용되는 배양배지는 무혈청배지인 것이 바람직하나 이에 제한되지 않는다. 무혈청배지의 사용이 선호되는 것은, 배지에 포함되는 우태아혈청(FBS)의 경우 광우병의 원인이 되는 프리온의 감염이 문제될 수 있고, 우태아혈청 내에 포함된 비인간 단백질의 존재에 의하여 원하지 않는 알러지 반응이 야기될 수 있기 때문이다.On the other hand, in the method of the present invention, the culture medium used is preferably serum-free medium, but is not limited thereto. The use of serum-free medium is preferred, in the case of fetal bovine serum (FBS) contained in the medium may be a problem of prion infection that causes mad cow disease, undesired by the presence of non-human proteins contained in fetal bovine serum This is because an allergic reaction can be caused.

상기 배양액에는 콜라겐, 피브로넥틴, VEGF, SDF-1 등 창상치유를 촉진하는 단백질이 농축되어 있는데, 종래에는 비싼 생산 비용으로 제조 가능했던 이들 단백질의 농축액을 본 발명의 제조방법에 의해 저렴한 비용으로 대량생산할 수 있다는 장점이 있다. The culture medium is concentrated protein that promotes wound healing, such as collagen, fibronectin, VEGF, SDF-1, the mass concentration of these proteins can be produced at a low cost by the production method of the present invention, which was conventionally produced at high production cost There is an advantage that it can.

또한, 본 발명에 의해 제조된 배양액을 창상 부위에 바를 경우 창상 재생 과정에 있어서 중요한 과정인 재상피화, 혈관신생, 염증세포의 침윤 등이 촉진되어 피부창상의 재생을 촉진하는 효과가 우수하기에, 화상조직, 수술 후의 감염, 수술창상 파괴, 내부궤양, 출혈, 골괴저, 욕창, 와창, 타협된 절단부위, 비-치유 외상성 창상, 화장, 면도후, 치과작업, 만성궤양(당뇨병, 정맥류성 정맥, 졸중 후의), 방사선조사에 의한 조직의 파괴, 척추상해성 창상, 부인과적 창상, 화학적 창상, 혈관질환 창상, 당뇨성 피부미란, 당뇨성 발, 신체적 외상, 성형수술후 봉합부위, 햇빛화상(sunburn) 또는 외음절개술 등을 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니며, 다양한 상태에 대하여 동물 및 인간에게서 창상 개선 또는 치료에 유용할 수 있다.In addition, when the culture solution prepared by the present invention is applied to the wound site, re-epithelialization, angiogenesis, infiltration of inflammatory cells, etc., which are important processes in the wound regeneration process, are promoted, so that the regeneration of the skin wound is excellent. Burn tissue, postoperative infection, surgical wound destruction, internal ulcers, bleeding, bone ulcers, pressure sores, ulcers, compromised cuts, non-healing traumatic wounds, cremation, after shaving, dental work, chronic ulcers (diabetes, varicose veins) , After stroke), destruction of tissue by irradiation, spinal injury wound, gynecological wound, chemical wound, vascular disease wound, diabetic skin erosion, diabetic foot, physical trauma, suture after plastic surgery, sunburn (sunburn) Or episiotomy, etc., but may be useful for improving or treating wounds in animals and humans for a variety of conditions.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These embodiments are only for illustrating the present invention, and thus the scope of the present invention is not construed as being limited by these embodiments.

실시예Example 1:  One: 중간엽Intermediate lobe 줄기세포의 분리 Isolation of Stem Cells

본 발명의 조성물에 포함된 중간엽 줄기세포는 인체 지방 또는 골수로부터 추출할 수 있다. 본 발명자들은 부산대학병원에서 지방제거수술을 시행한 환자에서 수득한 지방조직으로부터 기질 줄기세포를 분리하였다. 분리한 지방조직을 HBSS로 씻어준 후 핀셋과 가위를 이용하여 지방조직을 얇게 자른 다음 0.075% 콜라게나아제를 37℃에서 30 분간 처리하였다. 원심분리 후 펠렛에 세포배양액(10% fetal bovine serum, 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin가 첨가된 alpha-minimum essential medium)을 첨가하여 재현탁시킨 후 100 ㎛ 나일론망(nylon mesh)에 통과시켜 콜라게나아제에 의해 지방조직으로부터 분리된 세포를 수득하여였다. 나일론망을 통과한 세포는 배양접시에 도말해서 24 시간 후 부착되지 않은 세포를 제거하였다. 배양접시에 부착된 세포를 세포배양액을 교환해주면서 배양하였다(도 1). 선택적으로, 골수로부터 중간엽 줄기세포를 분리하기 위해서는 환자로부터 얻은 골수를 피콜-하이파크 농도구배(밀도 = 1.077 g/cm3, Sigma, USA)를 이용한 원심분리법을 이용해 분리한 후, 배양접시 도말한 후 세포배양액을 교환해주면서 배양접시에 부착된 세포를 증식 배양할 수 있다.Mesenchymal stem cells included in the composition of the present invention can be extracted from human fat or bone marrow. The present inventors isolated the stromal stem cells from the adipose tissue obtained from a patient who had undergone a fat removal surgery at Pusan National University Hospital. The isolated adipose tissue was washed with HBSS, and the adipose tissue was thinly cut using tweezers and scissors, and then treated with 0.075% collagenase at 37 ° C. for 30 minutes. After centrifugation, the pellet was resuspended by adding cell culture solution (alpha-minimum essential medium with 10% fetal bovine serum, 100 U / ml penicillin, and 100 μg / ml streptomycin), and then resuspended in 100 μm nylon mesh. Was passed to obtain cells isolated from adipose tissue by collagenase. Cells passed through the nylon net were plated in a culture dish to remove unattached cells after 24 hours. The cells attached to the culture dish were cultured while exchanging the cell culture solution (FIG. 1). Optionally, to separate the mesenchymal stem cells from the bone marrow, the bone marrow obtained from the patient was isolated by centrifugation using a picol-high park concentration gradient (density = 1.077 g / cm 3 , Sigma, USA), and then plate culture plates. After that, the cells attached to the culture dish can be proliferated and cultured while exchanging the cell culture solution.

실시예 2: LPA 처리 및 세포 배양액의 분리Example 2: LPA Treatment and Isolation of Cell Cultures

중간엽 줄기세포를 서로 다른 두 개의 15 cm 배양접시에서 세포가 포화되지 전(sub-confluent) 단계까지 증식 배양한 후, HBSS로 2 회 세척하여 혈청 성분을 제거하였다. 각각의 중간엽 줄기세포를 10 μM LPA가 포함된 20 ml의 배양배지(alpha minimum essential medium)과 포함되지 않은 배양배지(대조군)로 배양하였다. 48 시간 후 각각의 배양액을 회수하여 3000 rpm에 10분 동안 원심 분리하여 세포 부스러기를 제거하였다. Mesenchymal stem cells were proliferated and cultured in two different 15 cm plates to sub-confluent stages, and then washed twice with HBSS to remove serum components. Each mesenchymal stem cell was incubated with a culture medium (alpha minimum essential medium) containing 10 μM LPA and a culture medium (control) not included. After 48 hours, each culture was recovered and centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes to remove cell debris.

실시예 3: 동물 창상 모델을 이용한 실험Example 3: Experiment with Animal Wound Models

6주령의 랫트(Sprague Dawley Rat)를 두 그룹으로 나누어 2% 농도의 엔플란(Enflurane)으로 호흡마취 시킨 후, 등허리 부위 털을 전기 클리퍼를 사용하여 제거하였다. 이어, 노출된 부위를 70%의 에탄올로 소독하고, 8 ㎜ 생검펀치(biopsy punch)로 창상을 유도한 후, 근육층이 손상되지 않도록 가위로 창상면을 둥글게 오려냈다. 두 그룹의 동물의 유도된 창상 부위에 각각 HBSS, LPA를 처리하여 얻은 중간엽 줄기세포 배양액을 10 μl 처리하였다. 9 일째에 창상 부위를 육안으로 관찰하고(도 2의 A), 창상의 면적을 측정하였다(도 2의 B). Six-week-old rats (Sprague Dawley Rats) were divided into two groups, respiratory anesthesia with 2% concentration of Enflurane, and the back waist hairs were removed using an electric clipper. Subsequently, the exposed area was disinfected with 70% ethanol, the wound was induced with an 8 mm biopsy punch, and the wound surface was cut out with scissors so as not to damage the muscle layer. Induced wound sites of the two groups of animals were treated with 10 μl of mesenchymal stem cell culture obtained by treating HBSS and LPA, respectively. On the 9th day, the wound site | part was visually observed (A of FIG. 2), and the area of the wound was measured (B of FIG. 2).

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, LPA로 유도된 배양액을 처리한 그룹에서 재상피화가 가장 활발히 일어난 것을 알 수 있었다. 본 결과는 LPA로 유도된 중간엽 줄기세포의 배양액이 피부 창상의 재상피화를 촉진하는 효과가 있음을 시사하는 것이다.As a result, as shown in Figure 2, it was found that re-epithelialization occurred most actively in the group treated with LPA-induced culture. This result suggests that LPA-induced culture of mesenchymal stem cells promotes re-epithelialization of skin wounds.

실시예 4: 조직학적 분석Example 4: Histological Analysis

상기 실시예 3에서 분석을 수행한 랫트를 CO2 가스를 이용하여 희생시킨 후 창상 주위의 조직을 채취하여 조직학적 분석을 수행하였다. 구체적으로, 일반적인 조직 처리과정을 거쳐 4 μM 두께의 절편을 만든 후에 헤마톡실린 및 에오신(hematoxylin&eosin, H&E) 염색과 면역조직화학 염색을 통해 분석하였다. 재상피화(re-epithelialization) 정도를 확인하기 위해 H&E 염색 결과를 현미경으로 촬영하여 상피층 양 끝단 사이의 간격을 측정하였다(도 3). Rats subjected to the analysis in Example 3 were sacrificed using CO 2 gas, and tissues around the wound were collected to perform histological analysis. Specifically, 4 μM-thick sections were made through general tissue processing and analyzed by hematoxylin and eosin (hematoxylin & eosin, H & E) staining and immunohistochemical staining. In order to confirm the degree of re-epithelialization, the results of H & E staining were taken under a microscope to measure the distance between both ends of the epithelial layer (FIG. 3).

그 결과, 도 3에서 나타난 바와 같이, H&E 결과 대조군에 비하여, LPA로 유도된 중간엽 줄기세포의 배양액을 처리한 조건에서 창상조직의 재상피화, 창상조직 내 육아조직의 생성증가가 더 활발함을 알 수 있었다.As a result, as shown in Figure 3, compared to the H & E control group, the re-epithelialization of the wound tissue and the increase in the generation of granulation tissue in the wound tissue was more active under the conditions treated with the culture medium of LPA-induced mesenchymal stem cells. Could know.

실시예 5: 줄기세포에서의 콜라겐 발현 분석Example 5: Collagen Expression Analysis in Stem Cells

상기 실시예 3 및 4와 같은 LPA에 의해 유도된 중간엽 줄기세포의 배양액의 창상치료효과가 어떤 기전을 통해 나타나는 것인지 확인하기 위하여, 중간엽 줄기세포 파쇄액(lysate)과 배양액을 대상으로 한 단백질 발현양상을 분석하였다. 구체적으로, 중간엽 줄기세포에 LPA를 48시간 동안 처리한 후 줄기세포 파쇄액 및 배양액 상층액을 회수하였다. 희석된 줄기세포 파쇄액 및 상층액 내 단백질을 SDS-PAGE 전기영동시스템을 이용해 단백질의 분자량에 따라 전기영동 한 다음, 분리된 단백질을 니트로셀룰로오스막(nitrocellulose membrane, NC막)으로 전기압을 이용해 이동시킨 후 상기 막을 5% 농도로 탈지분유가 함유된 0.1% Tween-20이 첨가 PBS 용액(PBST)을 반응시켜 단백질이 붙지 않은 막 표면을 차단하였다. 이어, 줄기세포 파쇄액 및 배양액 내의 제1형 콜라겐의 함유량을 측정하기 위해 제1형 콜라겐에 특이적인 항체(Rockland, USA) 1:1,000으로 희석한 후 막과 1시간 동안 반응시킨 후 PBST용액으로 3회 세척한 후 고추냉이 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase)가 결합된 2차 항체를 1시간 반응시키고 PBST용액으로 3회 세척하였다. NC막에 결합된 고추냉이 퍼옥시다아제의 발광용 시약을 첨가한 후 엑스레이 필름에 현상하여 줄기세포 파쇄액 및 배양액 내의 제1형 콜라겐을 검출하였다(도 4). 이 때, 내재 표준 단백질로는 GAPDH(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)를 사용하였다.In order to confirm the mechanism by which the wound treatment effect of the culture medium of LPA-induced mesenchymal stem cells such as Examples 3 and 4 is expressed, the mesenchymal stem cell lysate and the protein for the culture medium Expression patterns were analyzed. Specifically, after treating the mesenchymal stem cells with LPA for 48 hours, the stem cell lysate and the culture supernatant were recovered. Dilute stem cell lysate and supernatant proteins are electrophoresed according to the molecular weight of proteins using SDS-PAGE electrophoresis system, and then the separated proteins are transferred to nitrocellulose membranes (NC membranes) using electric pressure. After the membrane was reacted with 0.1% Tween-20 containing skim milk powder at a concentration of 5%, PBS solution (PBST) was added to block the protein-free membrane surface. Subsequently, in order to measure the content of collagen type 1 in the stem cell lysate and the culture medium, the type 1 collagen-specific antibody (Rockland, USA) was diluted 1: 1,000 and reacted with the membrane for 1 hour, followed by PBST solution. After washing three times, horseradish peroxidase-bound secondary antibody was reacted for 1 hour and washed three times with PBST solution. After adding a light-emitting reagent of wasabi peroxidase bound to the NC membrane, it was developed on an X-ray film to detect type 1 collagen in stem cell lysate and culture medium (FIG. 4). At this time, GAPDH (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) was used as an internal standard protein.

측정결과 도 4에 나타난 바와 같이, LPA를 처리하여 유도한 줄기세포의 파쇄액(도 4의 A)은 물론, 줄기세포 배양액 내(도 4의 B) 제1형 콜라겐의 양이 대조군에 비해 증가됨을 알 수 있었다.As shown in FIG. 4, the amount of type 1 collagen in the stem cell culture solution (FIG. 4A) as well as in the stem cell culture medium (FIG. 4B) was increased compared to the control group. And it was found.

이러한 결과는, LPA 처리에 의한 줄기세포 배양액의 창상치유 능력의 향상이 LPA 처리에 의하여 중간엽 줄기세포가 세포 증식을 촉진하는 성장인자 등의 물질의 다량 분비뿐만 아니라, 창상 치료에 직접적으로 관여하는 세포외기질의 주요 성분인, 콜라겐의 발현 및 배양액으로의 분비 촉진에 따른 것임을 시사하는 것이다.These results indicate that the improvement of wound healing ability of stem cell culture medium by LPA treatment is directly involved in wound treatment as well as the large secretion of substances such as growth factors that promote mesenchymal stem cell proliferation by LPA treatment. This suggests that expression of collagen, which is a major component of the extracellular matrix, and the promotion of secretion into the culture medium.

Claims (17)

리소포스파티딘산(lysophosphatidic acid, 이하, 'LPA'로 약칭함)을 배양전 또는 배양중의 중간엽 줄기세포 배양배지에 처리한 후 상기 중간엽 줄기세포를 배양하여 제조된, LPA가 처리되지 않은 중간엽 줄기세포 배양배지(대조군)보다 창상치유능이 향상된 중간엽 줄기세포 배양액.Lysophosphatidic acid (hereinafter, abbreviated as 'LPA') was treated by mesenchymal stem cell culture medium before or during incubation, followed by culturing the mesenchymal stem cells. Mesenchymal stem cell culture with improved wound healing ability than mesenchymal stem cell culture medium (control). 제1항에 있어서,
상기 중간엽 줄기세포는 인간 유래인 중간엽 줄기세포 배양액.The method of claim 1,
The mesenchymal stem cells are human-derived mesenchymal stem cell culture. 삭제delete 삭제delete 제 1항에 있어서,
상기 중간엽 줄기세포는 지방, 골수, 말초혈액, 또는 제대혈에서 추출된, 중간엽 줄기세포 배양액.The method of claim 1,
The mesenchymal stem cells are extracted from fat, bone marrow, peripheral blood, or umbilical cord blood, mesenchymal stem cell culture. 제 1항, 제 2항 및 제 5항 중 어느 한 항의 중간엽 줄기세포 배양액을 유효성분으로 함유하는 창상 개선 또는 치료용 조성물.A wound improvement or treatment composition comprising the mesenchymal stem cell culture of any one of claims 1, 2 and 5 as an active ingredient. 제 6항에 있어서,
상기 조성물을 외용제 형태로 제형화되는, 조성물.The method according to claim 6,
The composition is formulated in an external preparation form. ⅰ) 배양전 또는 배양중의 중간엽 줄기세포 배양 배지에 LPA를 처리하는 단계;
ⅱ) LPA가 처리된 배양배지 내에서 중간엽 줄기세포를 배양하는 단계; 및
ⅲ) 추가배양을 종료하고 중간엽 줄기세포 배양액을 회수하는 단계를 포함하는 LPA가 처리되지 않은 중간엽 줄기세포 배양배지(대조군)보다 창상치유 능력이 증가된 중간엽 줄기세포 배양액의 제조방법.Iii) treating LPA to the mesenchymal stem cell culture medium before or during the culture;
Ii) culturing the mesenchymal stem cells in LPA-treated culture medium; And
Iii) a method for producing mesenchymal stem cell culture with increased wound healing ability than LPA-treated mesenchymal stem cell culture medium (control), which comprises the step of terminating further culture and recovering the mesenchymal stem cell culture. 제 8항에 있어서,
단계 ⅰ 전에 중간엽 줄기세포 배양 배지에서 혈청성분을 제거하는 단계를 추가적으로 포함하는 제조방법.The method of claim 8,
And removing serum components from the mesenchymal stem cell culture medium before step iii. 제 8항에 있어서,
단계 ⅲ 후에 회수된 배양액으로부터 중간엽 줄기세포 또는 중간엽 줄기세포 부스러기를 제거하는 단계를 추가적으로 포함하는, 제조방법. The method of claim 8,
And removing mesenchymal stem cells or mesenchymal stem cell debris from the culture medium recovered after step iii. 제 8항에 있어서,
상기 LPA는 0.1 내지 100 μM의 농도로 처리되는, 제조방법.The method of claim 8,
The LPA is treated at a concentration of 0.1 to 100 μM, manufacturing method. 제 8항에 있어서,
상기 LPA는 1 내지 4 일간 처리되는, 제조방법.The method of claim 8,
The LPA is treated for 1 to 4 days. 제 8항에 있어서,
상기 중간엽 줄기세포는 인간으로부터 유래한 것인, 제조방법.The method of claim 8,
The mesenchymal stem cells are derived from human, manufacturing method. 삭제delete 삭제delete 제 8항에 있어서,
상기 중간엽 줄기세포는 지방, 골수, 말초혈액, 또는 제대혈에서 추출된, 제조방법.The method of claim 8,
The mesenchymal stem cells are extracted from fat, bone marrow, peripheral blood, or umbilical cord blood. ⅰ) 배양전 또는 배양중의 중간엽 줄기세포 배양 배지에 LPA를 처리하는 단계; 및
ⅱ) LPA가 처리된 배양배지 내에서 중간엽 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포 배양액 내의 콜라겐 함량을 증가시키는 방법.Iii) treating LPA to the mesenchymal stem cell culture medium before or during the culture; And
Ii) a method of increasing collagen content in mesenchymal stem cell culture comprising culturing the mesenchymal stem cells in a culture medium treated with LPA.
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