KR101293747B1 - Tissue-specific promoter derived from Oryza sativa and use thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 벼(Oryza sativa) 종자의 배반 또는 배반유래 분열조직에서의 목적 단백질 특이적 발현용 OsTCP11 프로모터 유전자, 이 유전자를 포함하는 발현 벡터, 이 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체, 이 형질전환체의 제조 방법 및 이를 이용하여 목적 단백질의 발현을 유도하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 프로모터 및 이를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 제작된 형질전환체를 벼 종자의 배반 또는 배반유래 분열조직에서 위치 특이적으로 발현시킬 수 있다. 따라서, 이를 이용하여 종자 특이물질 생산, 휴면, 발아 및 생장조절에 유용하게 이용될 수 있다.The present invention is a rice ( Oryza sativa ) OsTCP11 promoter gene for the expression of a target protein specific in the blastocyst or the blastocyst derived meristem of the seed, an expression vector comprising the gene, a transformant transformed with the expression vector, a method for producing the transformant and the same It relates to a method of inducing the expression of the target protein by using.
A transformant prepared using the promoter and a recombinant vector comprising the same according to the present invention can be site-specifically expressed in the blastocyst or the blastocyst-derived meristem of rice seeds. Therefore, it can be usefully used for seed specific material production, dormancy, germination and growth control.
Description
본 발명은 벼(Oryza sativa) 유래 OsTCP11 프로모터 및 이의 용도에 관한 발명이다. 보다 상세하게는 벼 종자의 배반 (scutellum) 또는 배반 유래 분열조직에서의 목적 단백질 특이적 발현용 OsTCP11 프로모터, 이를 포함하는 발현 벡터, 이 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체, 이 형질전환체의 제조 방법 및 이를 이용하여 목적 단백질의 발현을 유도하는 방법에 관한 것이다.The present invention is a rice ( Oryza sativa ) -derived OsTCP11 promoter and its use. More specifically, OsTCP11 promoter for expression of target protein specific in scutellum or blastocyst-derived meristem of rice seed, expression vector comprising the same, transformants transformed with the expression vector, preparation of the transformant A method and a method of inducing expression of a protein of interest using the same.
벼는 세계에서 가장 중요한 식량작물의 하나로 과거 20여 년 동안 꾸준히 수량증대에 힘써왔으나 현재 인구증가 추세로 볼 때 2020년이면 현재의 70% 이상에 달하는 수량을 더 생산해야만 될 형편에 놓여있다. 그러나 벼가 재배되는 농지는 세계 각국의 공업화현상으로 갈수록 줄어들고 육종의 소재가 되는 새로운 유전자원은 고갈되어 외래 유용유전자의 도입이 요구되고 있다. 다행히 분자생물학의 발달로 외래 유용유전자의 분리 및 조작이 가능하게 되어 이 유용유전자를 벼를 비롯한 많은 식물세포에 형질전환하여 새로운 유전자가 조합된 형질전환체를 얻음으로써 여러 가지 생명현상을 규명하는 유전자발현 연구는 물론 육종의 좋은 소재가 되고 있다. 이러한 형질전환을 이용한 신품종 생산은 앞으로 다가오는 21세기에는 고부가가치 산업으로 대두함은 물론이며 인류의 가장 큰 문제점으로 부각되는 식량문제를 어느 정도는 해결할 수 있으리라 생각된다.Rice is one of the world's most important food crops, and has been steadily increasing its yield over the past two decades. However, the current population growth trend means that by 2020, more than 70% of the current crop will be produced. However, the agricultural land where rice is cultivated is getting smaller and smaller as the industrialization phenomenon of each country in the world, and the new genetic resource which is the subject of breeding is depleted and the introduction of the foreign useful gene is required. Fortunately, the development of molecular biology makes it possible to isolate and manipulate foreign useful genes, transforming these useful genes into many plant cells, including rice, to obtain transformants incorporating new genes. Expression studies, of course, has become a good material for breeding. The production of new varieties using this transformation will not only lead to a high value-added industry in the coming 21st century, but will also solve some of the food problems that are the biggest problem of humanity.
현재까지 알려진 벼 형질전환 방법은 80년대에는 원형질체에 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol(PEG))과 전기충격법(electroporation)으로 많은 형질전환체를 획득하였으며, 90년대 후반에는 유전자총 이용법이 보편화되었으며 최근에는 쌍자엽식물에서 널리 이용되어 왔던 아그로박테리움(Agrobacterium) 이용법도 많이 이용되고 있다. 그밖에 화분법(pollen pathway), 미세주사(microinjection) 방법 등이 있다.The rice transformation method known to date has obtained a large number of transformants in the 80's with polyethylene glycol (PEG) and electroporation in the protoplasts, and in the late 90's, the use of a gene gun has become popular. Agrobacterium, which has been widely used in dicotyledonous plants, is also widely used. Other methods include pollen pathway and microinjection method.
벼 형질전환 효율에 영향을 미치는 프로모터(promoter)는 그 출처가 CaMV(Cauliflower mosaic virus), 벼, 옥수수, 콩 및 감자 등에서 클로닝된 것으로 형질전환 효율 향상에 이바지하였다.Promoters affecting rice transformation efficiency were cloned from CaMV (Cauliflower mosaic virus), rice, corn, soybeans and potatoes, and contributed to the improvement of transformation efficiency.
마커유전자 발현정도는 형질전환효율에 아주 중요한 영향을 끼치는데 그의 여러 요인은 효율적인 벡터, 적합한 프로모터, 식물 게놈에서의 위치, 복제 수, 3' 비코딩서열(noncoding sequence), 코돈의 빈도 등이 있다. 프로모터는 전환유전자의 패턴을 결정하며 지금까지 2 종류 즉, 항시적인 것과 조직 특이적 프로모터가 사용되어 왔다. 이 항시적인 프로모터는 독립적으로 모든 조직에서 유전자발현을 한다. CaMV35S 프로모터는 강력하고 항시적인 것으로 흔하게 형질전환 연구에 사용되며 광범위하게 벼, 밀, 옥수수에서 사용되었다.The level of marker gene expression has a very important effect on transformation efficiency, and several factors include efficient vector, suitable promoter, location in plant genome, number of copies, 3 'noncoding sequence, and codon frequency. . Promoters determine the pattern of transgenes and two types of promoters have been used, namely, constant and tissue specific. This constitutive promoter independently expresses genes in all tissues. The CaMV35S promoter is a potent and always-on, commonly used in transformation studies and widely used in rice, wheat and corn.
목표하는 조직에서의 유전자발현은 작물개량의 가능성을 시사하고 있는데 벼는 현재 단자엽 식물에서 유전자발현과 프로모터 연구의 모델로서 이용되고 있으며 이미 밝혀진 요소와 DNA 결합인자간 기능적 상호작용을 이해하는데 크게 도움이 될 것이다.Gene expression in target tissues suggests the possibility of crop improvement. Rice is currently used as a model for gene expression and promoter research in monocotyledonous plants, and it is very helpful in understanding the functional interactions between the already identified elements and DNA binding factors. Will be.
벼의 형질전환에 대한 연구는 1980년대 후반에 원형질을 이용하여 폴리에틸렌 글리콜방법이나 전기충격법으로 이용하여 자포니카에서 형질전환체를 획득한 것을 기점으로 인디카에서도 유전자 총, 아그로박테리움(Agrobacterium)을 이용하여 형질전환체를 얻을 수 있었다는 보고가 계속되고 있다. 특히 90년대에 들어서 선발 유전자로도 알려진 제초제 저항성(bar)유전자는 농업적 유용유전자로도 사용하여 형질전환연구에 가장 많이 이용되고 있으며, 그 후 계속해서 새로운 농업유용유전자가 개발, 제작되어 벼 형질전환에 이용하고 있다.Studies on the transformation of rice were carried out in the late 1980s, using the protoplasm, using polyethylene glycol method or electric shock method, and using a total of Agrobacterium genes from Indica. It is reported that a transformant can be obtained. In particular, herbicide-tolerant (bar) genes, also known as selection genes, have been used most often for transformational research in the 1990s. Since then, new agricultural genes have been developed and manufactured. We use for change over.
이와 같은 조직 특이적인 프로모터에 대하여는, 미국특허 US 5,808,034 (Bridges 등, 1998. 09. 15 등록)에 외부의 화학물질에 특이적으로 촉진되는 발현저해자(repressor)를 이용하여 식물의 웅성기관에서 유전자의 다단계 조절(cascade)이 일어나도록 함으로써 생식능력을 조절하는 기술이 개시된 바 있다. 또한, 미국특허 US 6,784,289 (Ouellet 등, 2004. 8. 31 등록)에는 숙주 생명체에서 관여된 단백질의 발현을 증가 또는 감소시킬 수 있는 트랜스레이션 조절 인자의 발현 조절에 관한 기술이 개시되어 있다. 또한, 과일 표피 조직에 특이적으로 발현되는 프로모터(KR 813,118) 및 식물체의 뿌리조직에 특이적으로 발현되는 프로모터(KR 803,390)가 개시된 바가 있다. 벼의 경우에 있어서는 대한민국공개특허 KR 2003-0081377, KR 2001-0085990 등에 조직 특이적인 프로모터에 관한 기술이 기재되어 있다.For such tissue-specific promoters, US Pat. No. 5,808,034 (Bridges et al., Registered on Sep. 15, 1998) uses genes in the male organs of plants using expression repressors that are specifically promoted by external chemicals. Techniques for regulating fertility have been disclosed by allowing cascades of the cells to occur. In addition, US Pat. No. 6,784,289 (Ouellet et al., Aug. 31, 2004) discloses a technique for controlling expression of a translational regulator that can increase or decrease the expression of a protein involved in a host organism. In addition, promoters specifically expressed in fruit epidermal tissue (KR 813,118) and promoters specifically expressed in plant root tissues (KR 803,390) have been disclosed. In the case of rice, a technique related to a tissue-specific promoter is disclosed in Korean Patent Publication No. 2003-0081377, KR 2001-0085990 and the like.
식물의 분열조직에서 조직특이적 발현양상을 보이는 유전자에는 DME 유전자가 알려져 있다. 현재 이 유전자의 기능이 명확히 밝혀져 있지는 않으나, 애기장대의 DME 유전자의 기능은 종자 생성을 위하여 수정할 시 특히 수정 전에 암술에서 특이적으로 발현하는 유전자로 세포분열이 일어날 때 일시적으로 발현이 되는 유전자로 알려져 있다.DME gene is known as a gene showing a tissue-specific expression pattern in meristem of plants. Currently, the function of this gene is not clear, but the function of Arabidopsis DME gene is a gene that is expressed specifically in pistil before modification, especially when it is modified for seed generation. have.
현재 벼의 종자의 배반의 분열조직에 특이적으로 발현되는 프로모터를 이용하여 유용한 외래 유전자를 발현시키는 시스템에 대해서는 개시된 바가 없다. 이 종자의 배반은 배의 발달과 종자 발아, 유식물의 생장에 필요한 수분과 양분을 수송하는 매우 중요한 기관이며, 이러한 배반에서의 유용 유전자의 발현 또는 조절은 종자 특이 물질 생산, 휴면, 발아 및 생장조절과도 직결될 수 있다. 따라서, 유용유전자 활성의 조절을 통해 생장에 관여되는 생리적 현상을 조절할 수 있는 직접적이면서도 적합한 기술로써 이러한 배반에 특이적인 유전자 발현의 조절 기술이 절실히 요구되고 있다.At present, there is no disclosure about a system for expressing useful foreign genes by using a promoter specifically expressed in the meristem of the betrayal of rice seeds. Breeding of these seeds is a very important organ that transports the moisture and nutrients necessary for embryo development, seed germination and seedling growth, and the expression or regulation of useful genes in these blastocysts is responsible for seed specific material production, dormancy, germination and growth. It can also be directly linked to regulation. Therefore, as a direct and suitable technique that can regulate the physiological phenomena involved in growth through the regulation of useful gene activity, there is an urgent need for a technique for regulating gene expression specific to this betrayal.
이에 발명이 해결하고자 하는 과제는, 생장이 우수한 품종 개발을 위해 벼의 종자의 배반 및 배반유래 분열조직에서 목적 단백질을 특이적으로 발현하는 프로모터, 이를 포함하는 발현 벡터, 이 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체, 이 형질전환체의 제조방법 및 이를 이용하여 목적 단백질의 발현을 유도하는 방법에 관한 것이다.The problem to be solved by the present invention, a promoter for expressing the target protein specifically in the blastocyst and blastocyst-derived meristem of the rice seed to develop a variety of excellent growth, an expression vector comprising the same, transformed with the expression vector A transformant, a method for producing the transformant, and a method for inducing expression of a target protein using the same.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명에서는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 벼의 종자의 배반 또는 배반유래 분열조직에서의 목적 단백질 특이적 발현용 프로모터를 제공한다.In order to achieve the above technical problem, the present invention provides a promoter for specific protein-specific expression in the blastocyst or blastocyst derived meristem of the rice seed having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1.
본 발명에서는 또한 상기의 프로모터 및 목적 단백질을 코딩하는 구조 유전자를 작동 가능하게 연결시켜(operatively linked) 제조된 재조합 발현 벡터를 제공한다.The present invention also provides a recombinant expression vector produced by operatively linked to a structural gene encoding the promoter and the target protein.
본 발명에서는 또한 상기 발현 벡터에 의해 형질전환된 형질전환체를 제공한다.The present invention also provides a transformant transformed with the expression vector.
본 발명에 따르면, 상기 형질전환체는 아그로박테리움 투메파시엔스 형질전환체일 수 있다.According to the present invention, the transformant may be an Agrobacterium tumefaciens transformant.
본 발명에서는 또한 상기 발현 벡터 또는 상기 아그로박테리움 투메파시엔스 형질전환체로 형질전환된 형질전환 식물체를 제공한다. The present invention also provides a transformed plant transformed with the expression vector or the Agrobacterium tumefaciens transformant.
본 발명에 따르면, 상기 형질전환 식물체는 벼(Oryza sativa)일 수 있다. According to the present invention, the transgenic plant is rice ( Oryza sativa ).
본 발명에서는 또한 상기 발현 벡터로 식물을 형질전환시켜 목적 단백질을 식물체에서 발현시키는 단계를 포함하는 식물 형질전환체의 제조방법을 제공한다.The present invention also provides a method for producing a plant transformant, comprising the step of transforming a plant with the expression vector to express the target protein in the plant.
상기 식물은 벼(Oryza sativa)일 수 있으며, 바람직하게 본 발명에서는 하기의 단계들을 포함하는 벼의 종자의 배반 또는 배반유래 분열조직에서 특이적으로 발현되는 벼 형질전환체의 제조방법을 제공한다:The plant is rice ( Oryza sativa ), preferably the present invention provides a method for producing a rice transformant specifically expressed in the blastocyst or blastocyst-producing meristem of the rice seed comprising the following steps:
(1) 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 벼 종자의 배반 또는 배반유래 분열조직에서의 목적 단백질 특이적 발현용 프로모터 및 목적 단백질을 코딩하는 구조 유전자를 작동 가능하게 연결시켜(operatively linked) 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계;(1) operably linked by linking a promoter for expression of a target protein specific in the blastocyst or the blastocyst derived meristem of the rice seed comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and a structural gene encoding the target protein (operatively linked); Preparing a recombinant expression vector;
(2) 벼에 상기 발현벡터를 도입하는 단계; 및(2) introducing the expression vector into rice; And
(3) 상기 발현벡터가 도입되어 벼 종자의 배반 또는 배반유래 분열조직에서 특이적으로 발현되는 벼 형질전환체를 선별하는 단계.(3) selecting a rice transformant that is specifically expressed in the blastocyst or the germ-derived meristem of the rice seed by introducing the expression vector.
본 발명에 따르면, 상기 벼에 발현벡터를 도입하는 단계는 상기 발현벡터로 아그로박테리움 투메파시엔스를 형질전환시키는 단계; 및 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스를 벼에 감염시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.According to the present invention, the step of introducing the expression vector into the rice is transforming Agrobacterium tumefaciens with the expression vector; And infecting the transformed Agrobacterium tumefaciens with rice.
본 발명에서는 또한 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 벼 종자의 배반 또는 배반유래 분열조직에서의 목적 단백질 특이적 발현용 프로모터 및 목적 단백질을 코딩하는 구조 유전자를 작동 가능하게 연결시켜(operatively linked) 제조된 재조합 발현 벡터로 벼를 형질전환하여 벼 종자의 배반 또는 배반유래 분열조직에서 목적 단백질의 발현을 유도하는 방법을 제공한다.In the present invention, it is also possible to operatively link a promoter for expression of a target protein specific expression in the blastocyst or blastocyst derived meristem of the rice seed comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and a structural gene encoding the target protein. The present invention provides a method of inducing expression of a target protein in blastocysts or blastocyst-derived meristems of rice seeds by transforming rice with the prepared recombinant expression vector.
본 발명의 프로모터는 서열번호 1의 염기서열을 가지나 상기 서열과 80% 이상의 상동성을 가지는 서열, 바람직하게는 90% 이상의 상동성, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 상동성, 보다 더욱 바람직하게는 98% 이상의 상동성, 가장 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 나타내는 서열로서, 실질적으로 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 염기를 포함한다. 또한, 이러한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 염기 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 염기서열을 갖는 프로모터도 본 발명의 범위에 포함됨은 자명하다.The promoter of the present invention has a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, but a sequence having at least 80% homology with the sequence, preferably at least 90% homology, more preferably at least 95% homology, even more preferably 98 A sequence exhibiting at least% homology, most preferably at least 99% homology, comprising bases having substantially the same or corresponding biological activity. In addition, as long as the sequence having the same or corresponding biological activity as a sequence having such homology, it is obvious that a promoter having a nucleotide sequence in which some sequences are deleted, modified, substituted or added is also included in the scope of the present invention.
본 발명에 있어“상동성"이란 야생형(wild type) 염기서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 염기서열과 상기와 같은 퍼센트 이상의 동일한 서열을 가지는 서열을 포함한다. 이러한 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열 간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.In the present invention, "homology" is intended to indicate a degree of similarity with a wild type base sequence, and includes a base sequence of the present invention and a sequence having the same sequence as the percentage or more as described above. Commercially available computer programs can calculate homology between two or more sequences as a percentage and homology is calculated for adjacent sequences. Can be.
본 발명의 프로모터는 벼 종자의 배반 또는 배반유래 분열조직에서 목적 단백질 내지 목적 유전자 RNA를 발현시킬 수 있으며, 보다 바람직하게 상기 벼 종자의 배반 또는 배반유래 분열조직에서 특이적으로 목적 단백질을 발현시킬 수 있다. Promoter of the present invention can express the target protein to the target gene RNA in the ovulation or blastocyst-like meristem of rice seed, more preferably can express the target protein specifically in the blastocyst or blastocyst-like meristem of said rice seed. have.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명의 OsTCP11 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터로 벼를 형질전환시킨 결과, 프로모터에 작동 가능하게 연결된 목적 단백질이 벼 종자의 배반 또는 배반유래 분열조직에서 특이적으로 발현되었고, 종자의 배반에서 유래한 분열세포에서 특이적으로 발현됨을 확인하였다(도 4).In one embodiment of the present invention, as a result of transforming rice with a recombinant expression vector comprising the OsTCP11 promoter of the present invention, a target protein operably linked to the promoter is specifically expressed in the ovulation or blastocyst derived meristem of the rice seed. It was confirmed that it is specifically expressed in the dividing cells derived from the embryo of the seed (Fig. 4).
본 발명의 위치 특이적 프로모터는 통상의 재조합 발현 벡터의 프로모터로서 작용할 수 있다.The site specific promoters of the present invention can act as promoters of conventional recombinant expression vectors.
본 발명에 있어“재조합 발현 벡터”란 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA를 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 말한다. 적합한 발현 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서(촉진유전자) 같은 발현 조절 서열 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 또한 발현 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현 벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.In the present invention, a "recombinant expression vector" refers to a gene construct that is capable of expressing a target protein or target RNA in a host cell and includes essential regulatory elements operably linked to express the gene insert. Suitable expression vectors include signal sequences or leader sequences for membrane targeting or secretion in addition to expression control sequences such as promoters, operators, initiation codons, termination codons, polyadenylation signals and enhancers (promoter) and can be prepared in various ways depending on the purpose. Can be. The expression vector also includes a selection marker for selecting a host cell containing the vector and, in the case of a replicable expression vector, the origin of replication.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 당업계에 알려진 다양한 구조 유전자를 포함할 수 있으며, 이러한 구조 유전자는 당업계에 알려진 다양한 프로모터와 작동 가능하게 연결된다. 본 발명에서‘프로모터’란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미하며,‘작동 가능하게 연결된다(operably linked)’는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다.The recombinant expression vector of the present invention may include various structural genes known in the art, and such structural genes are operably linked with various promoters known in the art. In the present invention, the term "promoter" refers to a DNA sequence that controls the expression of a nucleic acid sequence operably linked in a particular host cell. 'Operably linked' means that one nucleic acid fragment is linked to another nucleic acid fragment. Refers to those whose function or expression is affected by other nucleic acid fragments.
또한, 상기 구조 유전자는 항생제 저항성 유전자, 제초제 저항성 유전자, 바이러스 저항성 유전자, 해충 저항성 유전자, 대사관련 유전자, 발광 유전자, GFP(green fluorescence protein, AY598428) 유전자, GUS(β-glucuronidase, AF485783) 유전자, GAL(β-galactosidase, AAB49721) 유전자 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.In addition, the structural gene is antibiotic resistance gene, herbicide resistance gene, virus resistance gene, pest resistance gene, metabolism related gene, luminescence gene, GFP (green fluorescence protein, AY598428) gene, GUS (β-glucuronidase, AF485783) gene, GAL (β-galactosidase, AAB49721) gene and the like, but is not limited thereto.
본 발명의 일 실시예에서, 재조합 발현 벡터는 게이트웨이 시스템을 이용하여 프로모터 발현용 pBGWFS7 벡터에 리포터 유전자 GUS를 작동 가능하게 연결시켜 제작하였다.In one embodiment of the invention, the recombinant expression vector was constructed by operably linking the reporter gene GUS to the pBGWFS7 vector for expression of the promoter using a gateway system.
또한, 본 발명은 본 발명의 프로모터를 포함한 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.The present invention also provides a transformant transformed with a recombinant expression vector comprising the promoter of the present invention.
본 발명에서 본 발명의 재조합 발현 벡터로 형질전환하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 미세사출법 (microprojectile bombardment), 입자 총 충격법 (particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 일렉트로포레이션(electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법 (microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 인-플란타 형질전환법(In planta transformation), 진공 침윤법(Vacuum infiltration method), 화아침지법(floral meristem dipping method), 또는 아그로박테리아 분사법(Agrobacteria spraying method)을 이용할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, transformation with the recombinant expression vector of the present invention may be performed by transformation techniques known to those skilled in the art. For example, microprojectile bombardment, particle gun bombardment, silicon carbide whiskers, sonication, electroporation, PEG-mediated fusion PEG-mediated fusion, microinjection, liposome-mediated method, In planta transformation, Vacuum infiltration method, floral meristem dipping method) or Agrobacteria spraying method (Agrobacteria spraying method) may be used, but is not limited thereto.
또한 형질전환체는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 및 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)가 가능하나 이에 한정되는 것은 아니다. In addition, the transformant is Escherichia coli ), Bacillus subtilis ( Bacillus subtilis), Streptomyces (Streptomyces), Pseudomonas (Pseudomonas), Proteus Mira Billy's (Proteus mirabilis ), Staphylococcus and Agrobacterium tumefaciens ( Agrobacterium) tumefaciens ) is possible, but is not limited thereto.
또한, 상기 형질전환체는 식물 또는 식물세포일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 식물이란 전체 식물(whole plant), 식물의 일부분, 캘러스, 식물 조직, 식물 세포 및 식물 종자를 모두 포함한다. 상기 본 발명에 따른 방법이 적용될 수 있는 식물체로는 단자엽 식물 또는 쌍자엽 식물이 포함되며, 바람직하게는 단자엽 식물이며, 예를 들어 벼, 밀, 보리 또는 옥수수일 수 있으며, 특히 벼가 바람직하다.In addition, the transformant may be a plant or a plant cell, but is not limited thereto. Plants include whole plants, parts of plants, callus, plant tissues, plant cells and plant seeds. Plants to which the method according to the present invention can be applied include monocotyledonous plants or dicotyledonous plants, preferably monocotyledonous plants, for example, rice, wheat, barley or corn, particularly rice.
본 발명의 일 실시예에서 재조합 벡터는 아그로박테리움 투메파시엔스에 형질전환되었으며, 벼에 접종하여 형질전환체를 제작하였다.In one embodiment of the present invention, the recombinant vector was transformed into Agrobacterium tumefaciens, inoculated in rice to produce a transformant.
또한, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 벼 종자의 배반 또는 배반유래 분열조직에서의 목적 단백질 특이적 발현용 프로모터 및 목적 단백질을 코딩하는 구조 유전자를 작동 가능하게 연결시켜(operatively linked) 제조된 재조합 발현 벡터로 벼를 형질전환하여 벼의 종자의 배반의 분열조직에서 목적 단백질의 발현을 유도하는 방법에 관한 것이다.In addition, the present invention is operatively linked to the target protein specific expression promoter and structural gene encoding the target protein in the ovulation or blastocyst induced meristem of the rice seed comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: (operatively The present invention relates to a method of inducing the expression of a target protein in the meristem of the blastocyst of rice seed by transforming rice with the prepared recombinant expression vector.
본 발명에 따른 프로모터 및 이를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 제작된 형질전환체를 벼 종자의 배반 또는 배반유래 분열조직에서 위치 특이적으로 발현시킬 수 있다. 따라서, 이를 이용하여 종자 특이물질 생산, 휴면, 발아 및 생장조절에 유용하게 이용될 수 있다.A transformant prepared using the promoter and a recombinant vector comprising the same according to the present invention can be site-specifically expressed in the blastocyst or the blastocyst-derived meristem of rice seeds. Therefore, it can be usefully used for seed specific material production, dormancy, germination and growth control.
도 1은 OsTCP11 프로모터에서 발견된 종자 발아와 관련된 모티프를 나타낸 것이다.
도 2는 게이트웨이 시스템을 통해 제조된 벼 형질전환용 OsTCP11 프로모터의 발현 벡터의 모식도를 나타낸 것이다.
도 3은 형질전환 벼의 게놈 PCR 분석 결과를 나타낸 것이다. 여기에서 WT는 대조구로서 동진 벼를 나타낸다.
도 4는 OsTCP11 프로모터가 삽입된 형질전환 벼의 GUS 염색 분석 결과를 보여주는 것이다. 여기에서, em는 배이고, sc는 배반이고, en은 배유이고, c는 배반으로부터 유래된 캘러스이고, Sp는 잔이삭(spikelet)이고, p는 내화영(palea)이고, l은 외화영(lemma)이고, a는 꽃밥(anther)이고, o는 씨방(ovary)이고, cl은 자엽초 (coleoptile)이고, rd는 유근 (radicle)이고, L은 잎(leaf)이고, R은 뿌리(root)를 나타낸다.1 shows motifs associated with seed germination found in the OsTCP11 promoter.
Figure 2 shows a schematic diagram of the expression vector of the OsTCP11 promoter for rice transformation prepared through a gateway system.
Figure 3 shows the results of genomic PCR analysis of transformed rice. Here, WT represents Dongjin rice as a control.
Figure 4 shows the results of GUS staining analysis of transgenic rice in which the OsTCP11 promoter is inserted. Where em is embryo, sc is betrayal, en is endosperm, c is callus derived from betrayal, Sp is spikelet, p is palea, and l is lemma ), A is anther, o is ovary, cl is coleoptile, rd is radicle, L is leaf, and R is root Indicates.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail to facilitate understanding of the present invention. However, the embodiments according to the present invention can be modified into various other forms, and the scope of the present invention should not be construed as being limited to the following embodiments. Embodiments of the invention are provided to more fully describe the present invention to those skilled in the art.
<실시예 1> 게놈 DNA의 PCR에 의한 OsTC11 프로모터 영역의 클로닝 및 염기서열 분석Example 1 Cloning and Sequence Analysis of OsTC11 Promoter Region by PCR of Genomic DNA
PLACE(Plant Cis-acting Elements database: http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/) 프로그램을 이용하여 유전자 발현 모티프를 분석한 결과 amybox, GARE (GA responsive element), GCN, WRKY710S, Amy3D, pyrimidin box, prolamin box 등 다수의 종자 발아와 관련된 모티프가 확인되었다. Gene expression motifs were analyzed using PLACE (Plant Cis-acting Elements database: http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/) program. Amybox, GARE (GA responsive element), GCN, WRKY710S, Motif-related motifs such as amy3D, pyrimidin box, and prolamin box were identified.
도 1에는 OsTCP11 프로모터에서 발견된 종자 발아와 관련된 모티프를 나타내었다.1 shows motifs related to seed germination found in the OsTCP11 promoter.
OsTCP11 유전자의 프로모터 영역을 분리하기 위하여 번역시작 상위염기서열 2087kb의 염기서열 정보를 벼 게놈 데이타베이스에서 추출하고 상기 단편을 증폭하기 위한 프라이머를 디자인하여 정방향 프라이머(sense primer) OsTCP11P-F: 5'-CACCGATAGCGATCTTTAGTCCCGGATTGG-3'(서열번호 2)와 역방향 프라이머(antisense primer) OsTCP11P-R: 5'-CTTGAGCTGCTCATGATTAGACCTGC-3'(서열번호 3)을 합성하여 동진 벼의 게놈 DNA를 주형으로 하여 Takara사의 Primestar 중합효소(polymerase)와 함께 PCR 반응액에 넣어 Applied Biosystem 9700기를 이용하여 유전자를 증폭하였다. 이용된 PCR 반응조건은 95℃에서 10 분간 변성한 후, 94℃ 1분, 56℃ 1분, 72℃ 2분을 35회 반복한 후 다시 확장 반응을 위하여 72℃에서 10 분간 처리하였다. PCR 반응이 끝난 후 증폭된 유전자를 1% 아가로즈에 전기영동 한 후 OsTCP11 프로모터로 추정되는 밴드를 잘라내어 QIAquick 겔 추출 키트를 이용하여 정제한 후 클로닝(cloning)에 이용하였다.In order to isolate the promoter region of OsTCP11 gene, base sequence information of 2087kb of base sequence was extracted from rice genome database, and a primer was designed to amplify the fragment. Forward primer OsTCP11P-F: 5'- CACCGATAGCGATCTTTAGTCCCGGATTGG-3 '(SEQ ID NO: 2) and antisense primer OsTCP11P-R: 5'-CTTGAGCTGCTCATGATTAGACCTGC-3' (SEQ ID NO: 3) were synthesized by using genomic DNA of Dongjin rice as a template. The gene was amplified using an Applied Biosystem 9700 in a PCR reaction solution with polymerase). The PCR reaction conditions used were denatured at 95 ° C. for 10 minutes, and then repeated at 94 ° C. for 1 minute, 56 ° C. for 1 minute, and 72 ° C. for 2 minutes 35 times, followed by further treatment at 72 ° C. for 10 minutes. After the PCR reaction, the amplified gene was electrophoresed in 1% agarose, and the band estimated as OsTCP11 promoter was cut out and purified using a QIAquick gel extraction kit, and then used for cloning.
상기 PCR 산물을 게이트웨이 클로닝 벡터(pENTER/D-TOPO, Invitrogen)에 클로닝하고 전체 염기서열을 결정하였으며, 이에 따라 서열번호 1로 표시되는 염기 서열을 갖는 OsTCP11 프로모터 유전자를 확보하였다.The PCR product was cloned into a gateway cloning vector (pENTER / D-TOPO, Invitrogen) and the entire nucleotide sequence was determined, thereby obtaining an OsTCP11 promoter gene having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1.
<실시예 2> 벼 형질전환용 벡터(vector) 제작Example 2 Preparation of Vector for Rice Transformation
상기 분리된 OsTCP11 프로모터 유전자를 목적 벡터인 pBGWFS7 벡터 (PSB 사, Plant System Biology)에 도입시켰다. 콜로니 PCR과 시퀀싱으로 도입된 유전자를 확인한 후 벼에 형질전환하기 위하여 아그로박테리움 투메파시엔스 감염에 의해 형질전환하였다.The isolated OsTCP11 promoter gene was introduced into a target vector, pBGWFS7 vector (PSB, Plant System Biology). After confirming the gene introduced by colony PCR and sequencing, it was transformed by Agrobacterium tumefaciens infection to transform the rice.
도 2에는 게이트웨이 시스템을 통해 제조된 벼 형질전환용 OsTCP11 프로모터의 발현 벡터의 모식도를 나타내었다.Figure 2 shows a schematic diagram of the expression vector of the OsTCP11 promoter for rice transformation prepared through a gateway system.
완성된 벡터를 아그로박테리움 투메파시엔스(LBA4404)에 형질전환하기 위하여 동결과 해동(freeze and thaw)을 2-3번 반복한 후, 37℃의 열충격(heat shock)방법에 의해 형질전환한 후 YEP 배지(Yeast 10g, NaCl 5g, peptone 10g, Agar 15g /1L)에서 철야배양(overnight)하여 콜로니를 확인하였다.Freeze and thaw was repeated 2-3 times to transform the finished vector into Agrobacterium tumefaciens (LBA4404), and then transformed by heat shock at 37 ° C. Colonies were confirmed by overnight incubation in YEP medium (Yeast 10g, NaCl 5g, peptone 10g, Agar 15g / 1L).
콜로니 PCR에 의해 형질전환이 확인된 콜로니는 벼에 형질전환하기 위하여 AB 배지(AB buffer(K2HPO4 60g, NaH2PO4 20g/1L), AB Salts(NH4Cl 60g, MgSO47H2O 6g, KCl 3g, CaCl22H2O 0.265g, FeSO4.7H2O 50mg/1L), Glucose 5g/1L)에서 배양하였다. Colonies confirmed to be transformed by colony PCR were prepared using AB medium (AB buffer (K 2 HPO 4 60 g, NaH 2 PO 4 20 g / 1 L), AB Salts (NH 4 Cl 60 g, MgSO 4 7H 2). O 6g, were cultured in KCl 3g, CaCl 2 2H 2 O 0.265g, FeSO 4 .7H 2 O 50mg / 1L), Glucose 5g / 1L).
<실시예 3> 아그로박테리움을 이용한 벼 형질전환Example 3 Transformation of Rice Using Agrobacterium
아그로박테리움에 의한 벼 형질전환은 2N6 배지에서 동진벼의 캘러스를 유도하기 위하여 종자를 락스에 세척한 후 적당히 건조시켜 N6 배지 (Duchefa 사 vitamin 포함 배지)에 2,4-D 호르몬이 2 mg/L 첨가된 배지에 치상하였다. 27℃에서 3-4주간 암배양하여 캘러스를 유도한 후, 2N6 새 배지에 배형성 캘러스(embryogenesis callus)를 배양(sub-culture)하였다.Agrobacterium-induced rice transformation was performed by washing the seeds in lacs to induce the callus of dongjinbyeon in 2N6 medium, then drying it appropriately, and 2 mg / L of 2,4-D hormone in N6 medium (Duchefa vitamin containing medium). It was wound on the added medium. After induction of callus by cancer culture at 27 ° C. for 3-4 weeks, embryogenic callus was sub-cultured in 2N6 fresh medium.
형질전환 유전자를 포함하는 아그로박테리움 형질전환된 유전자를 AB 액체배지에 배양한 후 배형성 캘러스와 20분간 공배양(coculture) 시킨 후 3일간 암배양 하였다. 멸균수에 cefotaxime을 첨가하여 아그로박테리움이 완전히 제거될 때까지 씻은 후 다시 2N6 배지에 cefotaxime과 ppt(포스피노트리신, phosphinothricin)가 6 ㎍/L로 첨가된 배지에서 3주간 암 배양하였다. cefotaxime과 ppt가 첨가된 2N6 배지에서 갈변되지 않고 살아남은 캘러스를 다시 cefotaxime과 ppt가 첨가된 2N6 배지에 옮겨 2 주간 암배양하였다. 캘러스에서 슈팅(shooting) 유도를 위해 cefotaxime과 ppt가 첨가된 MSR 배지 (Duchefa MS 배지에 Maltose와 Sorbitol 첨가)에 옮겨 4주간 양 배양하여 슈팅된 후 발근이 되면 온실로 옮기기 이전에 순화처리를 실시하였다.Agrobacterium transformed genes containing the transformed genes were cultured in AB liquid medium and cocultured with embryogenic callus for 20 minutes and then cultured for 3 days. Cefotaxime was added to sterile water, washed until complete removal of Agrobacterium, and then cultured for 3 weeks in a medium containing 6 μg / L of cefotaxime and ppt (phosphinothricin) in 2N6 medium. Callus which survived browning in 2N6 medium containing cefotaxime and ppt was transferred to 2N6 medium containing cefotaxime and ppt and cultured for 2 weeks. To induce shooting in the callus, the cells were transferred to cefotaxime and ppt-added MSR medium (added Maltose and Sorbitol to Duchefa MS medium) for 4 weeks, and then shot and cultured. .
형질전환된 벼의 유묘에서 게놈 DNA를 분리하여 PCR 분석하여 도입한 벡터가 삽입되었는지 확인하였다. 상기 단편을 증폭하기 위한 프라이머로 정방향 프라이머(sense primer) OsTCP11P-5: 5'-CTCTCTCTCAGTGCAACAGTG-3'(서열번호 4)와 역방향 프라이머(antisense primer) EGFP-R : 5'-GGTCTTGTAGTTGCCGTCGTCC-3'(서열번호 5)을 합성하였다. Genomic DNA was isolated from seedlings of transformed rice and PCR analyzed to confirm that the introduced vector was inserted. Forward primer (sense primer) OsTCP11P-5: 5'-CTCTCTCTCAGTGCAACAGTG-3 '(SEQ ID NO: 4) and reverse primer (antisense primer) EGFP-R: 5'-GGTCTTGTAGTTGCCGTCGTCC-3' (sequence) No. 5) was synthesized.
도 3은 형질전환 벼의 게놈 PCR 분석 결과를 나타낸 것이다. 여기에서 WT는 대조구로서 동진 벼를 나타낸다.Figure 3 shows the results of genomic PCR analysis of transformed rice. Here, WT represents Dongjin rice as a control.
<실시예 4> OsTCP11 프로모터의 조직발현 검정을 위한 형질전환 벼의 GUS 단백질 염색에 의한 분석Example 4 Analysis by GUS Protein Staining of Transgenic Rice for Tissue Expression Assay of OsTCP11 Promoter
OsTCP11 프로모터 삽입이 확인된 형질전환 벼를 GUS 염색법으로 분석한 결과 유묘의 발달된 잎과 뿌리에서는 거의 GUS 염색이 되지 않았으나, 성숙한 종자에서 강하게 염색되는 것을 알 수 있었다. 특히 종자 내에서도 배(embryo)와 배유(endosperm)에는 거의 염색되지 않고 배반 (scutellum)에서만 특이적이고 강하게 염색되었음을 알 수 있었다. The transgenic rice with OsTCP11 promoter insertion was analyzed by GUS staining, but the GUS staining of the leaves and roots of seedlings showed little staining, but was strongly stained in mature seeds. In particular, it was found that even in the seed, embryos and endosperm were hardly stained, but specifically and strongly stained only in the scutellum.
또한 형질전환 벼의 성숙 종자를 2N6배지에서 치상하면 배반조직에서 캘러스가 유도되는데, 이렇게 유도한 캘러스 조직에서 매우 강한 GUS 염색을 확인하였다. 반면 성숙되지 않은 벼의 이삭과 화분, 수술, 암술 등 대부분의 생식기관에서는 GUS 염색이 거의 관찰되지 않음을 확인하였다. 또한 발아후 유묘의 자엽초와 유근, 성숙한 잎과 뿌리 등 대부분의 영양기관 (vegetative organ)에서도 GUS 염색이 관찰되지 않았다. 이를 통해 OsTCP11 프로모터가 대표적인 단자엽 식물인 벼에서 목적 단백질을 주요하게 종자의 배반 및 배반유래 캘러스 조직에서 발현시킬 수 있음을 증명하였다.In addition, when the mature seeds of the transformed rice were healed in 2N6 medium, callus was induced in the blastocyst tissue, and thus the GUS staining was confirmed in the induced callus tissue. On the other hand, GUS staining was rarely observed in most reproductive organs such as ear, pollen, surgery, and pistil of immature rice. In addition, GUS staining was not observed in most vegetative organs such as cotyledons and roots of seedlings and mature leaves and roots after germination. Through this, OsTCP11 promoter is mainly used for the expression of the target protein in rice, which is a typical monocotyledonous plant. It has been demonstrated that it can be expressed in tissue.
도 4에는 OsTCP11 프로모터가 삽입된 형질전환 벼의 GUS 단백질 염색 분석 결과를 보여주는 것이다. 여기에서, em는 배이고, sc는 배반이고, en은 배유이고, c는 배반으로부터 유래된 캘러스이고, Sp는 잔이삭(spikelet)이고, p는 내화영(palea)이고, l은 외화영(lemma)이고, a는 꽃밥(anther)이고, o는 씨방(ovary)이고, cl은 자엽초 (coleoptile)이고, rd는 유근 (radicle)이고, L은 잎(leaf)이고, R은 뿌리(root)를 나타낸다.Figure 4 shows the results of GUS protein staining analysis of transgenic rice in which the OsTCP11 promoter is inserted. Where em is embryo, sc is betrayal, en is endosperm, c is callus derived from betrayal, Sp is spikelet, p is palea, and l is lemma ), A is anther, o is ovary, cl is coleoptile, rd is radicle, L is leaf, and R is root Indicates.
본 발명에 따른 프로모터 및 이를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 제작된 형질전환체를 벼의 종자의 배반의 분열조직에서 위치 특이적으로 발현시킬 수 있다. 따라서, 이를 이용하여 종자 특이물질 생산, 휴면, 발아 및 생장조절에 유용하게 이용될 수 있다.The transformant prepared by using the promoter according to the present invention and a recombinant vector comprising the same can be site-specifically expressed in the meristem of the betrayal of rice seed. Therefore, it can be usefully used for seed specific material production, dormancy, germination and growth control.
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Claims (11)
하기의 단계들을 포함하는 벼 종자의 배반 또는 배반유래 분열조직에 특이적으로 발현되는 벼 형질전환체의 제조방법:
(1) 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 벼 종자의 배반 또는 배반유래 분열조직에서의 목적 단백질 특이적 발현용 프로모터 및 목적 단백질을 코딩하는 구조 유전자를 작동 가능하게 연결시켜(operatively linked) 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계;
(2) 벼에 상기 발현벡터를 도입하는 단계; 및
(3) 상기 발현벡터가 도입되어 벼 종자의 배반 또는 배반유래 분열조직에서 특이적으로 발현되는 벼 형질전환체를 선별하는 단계.9. The method of claim 8,
A method for preparing a rice transformant specifically expressed in blastocysts or blastocyst-derived meristems of rice seeds comprising the following steps:
(1) operably linked by linking a promoter for expression of a target protein specific in the blastocyst or the blastocyst derived meristem of the rice seed comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and a structural gene encoding the target protein (operatively linked); Preparing a recombinant expression vector;
(2) introducing the expression vector into rice; And
(3) selecting a rice transformant that is specifically expressed in the blastocyst or the germ-derived meristem of the rice seed by introducing the expression vector.
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| KR101054891B1 (en) | 2009-08-18 | 2011-08-09 | 대한민국 | WMDE1 promoter expressed in meristem of rice leaves and roots, expression vector containing this promoter, transformant transformed with this expression vector, and method for producing the transformant |
| KR20110019199A (en) * | 2009-08-19 | 2011-02-25 | 대한민국(농촌진흥청장) | Recombinant expression vector comprising plim3 promoter and transformant transformed therewith |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20130070297A (en) | 2013-06-27 |
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