KR101293363B1

KR101293363B1 - 인터페론 수용체 유전자를 포함하는 조류독감 예방용 조성물

Info

Publication number: KR101293363B1
Application number: KR1020110018244A
Authority: KR
Inventors: 양주성; 부경현; 류재규; 송창선; 허강녕
Original assignee: 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2011-02-28
Filing date: 2011-02-28
Publication date: 2013-08-05
Also published as: KR20120098351A

Abstract

본 발명은 조류인플루엔자 바이러스의 세포내 증식을 억제할 수 있는 인터페론 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 조류독감 예방용 조성물, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 조류독감 예방용 DNA 백신 및 상기 폴리뉴클레오티드, 벡터, 조성물 또는 DNA 백신을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 조류독감을 예방하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법을 이용하면, 조류인플루엔자 바이러스의 증식을 억제할 수 있으면서도, 인테페론에 의한 부작용을 해소할 수 있으므로, 조류인플루엔자 바이러스에 의해 발병되는 조류독감의 예방에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

인터페론 수용체 유전자를 포함하는 조류독감 예방용 조성물{A Composition for Preventing Bird Flu Comprising Interferon Receptor gene}

본 발명은 인터페론 수용체 유전자를 포함하는 조류독감 예방용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 본 발명은 조류인플루엔자 바이러스의 세포내 증식을 억제할 수 있는 인터페론 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 조류독감 예방용 조성물, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 조류독감 예방용 DNA 백신 및 상기 폴리뉴클레오티드, 벡터, 조성물 또는 DNA 백신을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 조류독감을 예방하는 방법에 관한 것이다.

인플루엔자 바이러스(Influenza virus)는 오르소믹소 계통(Family Orthomyxoviridae)에 속하는 RNA 바이러스로서 혈청형은 A형, B형 또는 C형 3가지로 구분된다. 그 중 A형은 사람, 말, 돼지, 기타 포유류 그리고 다양한 종류의 가금과 야생조류에서 감염이 확인되고 있어, 조류인플루엔자(Avian Influenza)라고도 알려져 있다(Selmons et al., Avian Dis., 18(1):119-124(1974); Turek R et al., Acta Virol., 27(6):523-527(1983); Webster RG et al., Microbiol Rev., 56(1):152-179(1992)). 이러한 조류인플루엔자는 전파가 빠르고 병원성이 다양하며, 닭, 칠면조, 야생 조류 등 여러 종류의 조류에 감염되며, 주로 닭과 칠면조에 피해를 주는 급성 바이러스성 전염병이다. 특히, 오리는 감염되더라도 임상증상이 잘 나타나지 않는 질병으로서, 이 중 고병원성 조류 인플루엔자(HPAI, Highly Pathogenic Avian Influenza)는 국제수역사무국(OIE)에서도 보고 의무가 있는 질병으로 규정하고 있으며, 1997년 홍콩에서의 조류인플루엔자바이러스에 의한 인체감염 사례가 처음 보고된 이래, 공중보건학적 측면에서도 매우 중요시되고 있는 질병이다.

조류인플루엔자 바이러스의 혈청형은 바이러스 표면의 두 가지 단백질인 생물학적 글루티닌(Hemagglutinin, HA) 및 뉴라미니다아제(Neuraminidase, NA)의 종류에 따라 구분되며, 혈청형에 따라 144종류(HA 단백질 16종 및 NA 단백질 9종)로 분류할 수 있다. 상기 HA는 바이러스가 체세포에 부착하는 역할을 하며, NA는 바이러스가 세포 내로 침투할 수 있도록 하는 것으로 알려져 있는데(Alexander DJ, Vet. Microbiol., 74(1-2):3-13(2000)), 전 세계적으로 야생조류에 대한 인플루엔자 감염 역학조사를 실시한 결과 현존하는 모든 16종의 HA형과 9종의 NA형 인플루엔자 바이러스가 야생조류에서 감염되고 있음이 확인되었다(Selmons et al., Avian Dis., 18(1):119-124(1974)). A형으로 분류되는 조류인플루엔자 바이러스는 인수(人獸) 공통 전염병 바이러스로, 병원성에 따라 닭에 감염 시 가벼운 호흡기 증상을 유발하는 비병원성 조류 인플루엔자, 1-30% 내외의 폐사와 산란 저하를 유발하는 저병원성 조류인플루엔자(Low pathogenic avian influenza, LPAI) 그리고 95% 이상의 높은 치사율을 보이고 "조류독감(버드플루: Bird flu)"이라고도 불리는 고병원성 조류 인플루엔자(Highly pathogenic avian influenza, HPAI) 등 크게 3가지 병형으로 구분하고 있다(Alexander DJ, Vet. Microbiol., 74(1-2):3-13(2000)).

고병원성 조류 인플루엔자(HPAI)는 1980년도 이후 미국, 호주, 파키스탄 또는 홍콩 등 전 세계적으로 발생이 확인되고 있다. 특히 2003년 12월 한국을 시작으로 2004년 베트남, 일본 또는 태국 등 동남아시아와 극동아시아전 지역에서 거의 동시 다발적으로 혈청형 A/H5N1 고병원성 조류 인플루엔자가 발생되었다. 특히 베트남과 태국 등지에서 발생한 고병원성 조류 인플루엔자는, 인체에 감염이 안되는 전통적인 고병원성 조류 인플루엔자와는 달리 감염조류와 접촉 시 인체 감염이 가능한 변이형 조류독감(변이형 A/H5N1 HPAI) 바이러스임이 확인되었다(Song CS et al., Korean J.Poult. Sci., 31(2):129-136(2004)).

인플루엔자 바이러스는 호흡기에 감염되어 전신증상을 일으키고, 주기적으로 모습을 바꿀 뿐 아니라, 숙주를 죽이지 않고 숙주가 죽기 전에 다른 숙주로 이동하기도 하는데, 이에 대한 예방백신이 개발되어 있기는 하지만 바이러스의 변이를 따라 잡지는 못하고 있는 실정이며, 아직 근본적인 바이러스 치료는 이루어지지 않고 있다. 한편, 아만타딘(amantadine)과 리만타딘(rimantadine)은 인플루엔자 바이러스의 M2 이온채널 단백질의 기능을 억제하는 물질로 생체 내 인플루엔자 바이러스의 증식을 억제하는 대표적인 항바이러스 제제들이다. 그러나 이들 두 가지 항바이러스 제제들은 인플루엔자 바이러스 M2 단백질의 이온채널기능에 영향을 미치지 못하는 변이 바이러스의 출현이 매우 쉽게 일어나는 단점이 있는 것으로 확인되고 있다. 이러한 단점을 보완하기 위하여 개발된 자나미비르(zanamivir)와 오셀타미비르(oseltamivir; 타미플루)는 인플루엔자 바이러스의 뉴라미니다제(neuraminidase) 단백질의 기능을 억제하는 물질로 생체 내 인플루엔자 바이러스의 증식을 억제하는 대표적인 항바이러스 제제들이다. 그러나 자나미비르는 흡입 및 정맥 투여해야 하는 단점이 있으며, 오셀타미비르는 경구투여가 가능하나 최근 내성 바이러스의 출현 보고와 경구투여시 구토와 현기증 등의 부작용이 있어 단점으로 지적되고 있다(Ward P et al., J. antimicrob. Chemother., 55:15-121(2005)).

한편, Mx 단백질은 단량체 GTPase로서, 바이러스 복제를 억제하므로, 일반적으로는 항바이러스 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다(Samuel, Virology 183:1-11(1991)). 이러한 Mx의 항바이러스 효과는 음성 가닥 RNA 바이러스(예를 들면 오소믹소바이러스(orthomyxovirus))를 대상으로 하여 검증되었으나, Mx 단백질 자체는 제1형 인터페론(IFN) 수용체를 갖는 모든 세포에서 발현되는데, 상기 Mx 단백질을 암호화하는 유전자는 바이러스의 감염에 대응하여 유도되는 체내의 인터페론(IFN)의 수준상승에 반응하여, 그의 발현이 유도되는 것으로 알려져 있다(Bazzigher, L., et al., Virology, 186:154-160, 1992). 이처럼 Mx 단백질의 발현은 체내의 IFN의 수준에 의존적이기 때문에, 체내의 IFN의 수준을 증가시키는 급성 및 만성 바이러스 감염시에도 Mx 단백질이 동일하게 발현된다(Fernandez, M., et al., J. Infectious Diseases, 180:262-267, 1999).

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 인터페론을 세포내에서 과발현시킬 경우, 조류인플루엔자 바이러스의 증식을 억제할 수 있을 것으로 기대되었으나, 상기 인터페론은 세포에 일정수준 이상으로 존재할 경우 세포자멸(apoptosis)을 유도하는 부작용이 있으므로, 인터페론 대신에 인터페론 수용체를 사용할 수 있는지에 대해 예의 연구한 결과, 인터페론 수용체가 발현된 세포는 조류인플루엔자 바이러스의 감염에 대해 저항성을 나타내어, 조류인플루엔자 바이러스의 감염에 의한 세포괴사를 방지할 수 있을 뿐만 아니라, 감염된 세포내에서 조류인플루엔자 바이러스의 증식을 억제할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 세포내에서 조류인플루엔자 바이러스의 증식을 억제할 수 있는 인터페론 수용체 유전자를 포함하는 조류독감 예방용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 세포내에서 조류인플루엔자 바이러스의 증식을 억제할 수 있는 인터페론 수용체 유전자를 포함하는 DNA 백신을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 인터페론 수용체 유전자, 상기 조성물 또는 상기 DNA 백신을 개체에 투여하여 조류독감을 예방하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시양태에 의하면, 본 발명은 인터페론의 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 하고, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조류독감 예방용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 항 바이러스 효과를 나타내는 것으로 알려진 Mx, RNase L, PKR, OAS 등의 다양한 항바이러스 단백질의 발현이 인터페론에 의하여 유도된다는 점에 착안하여, 상기 인터페론 유전자를 세포에서 과발현시킬 경우, 조류인플루엔자 바이러스의 감염에 대한 저항성이 증진될 수 있으나, 상기 인터페론은 세포에 일정수준 이상으로 존재할 경우 세포자멸(apoptosis)을 유도하는 부작용이 있다는 점에 주목하여, 상기 인터페론 대신에 인터페론 수용체를 과발현시켜도 동일한 항바이러스 효과를 나타낼 수 있는지 확인하고자 하였다.

이를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 통하여 유전자Bank 상에 등재된 서열정보를 토대로 닭의 인터페론 수용체(IFNAR) 유전자의 서열정보를 확인하고(chIFN-α : X92476 / chIFN-β : NM 001024836), 이에 근거하여 재조합 IFNAR 유전자(IFN-α 수용체를 암호화하는 IFNAR1 유전자(서열번호 1) 및 IFN-β 수용체를 암호화하는 IFNAR2 유전자(서열번호 2))를 수득하였다. 상기 수득한 재조합 IFNAR 유전자의 항바이러스 활성을 검증한 결과, 상기 재조합 IFNAR 유전자가 도입된 세포에서는 조류인플루엔자 바이러스인 H9N2의 증식을 35% 가까이 저해하고, 상기 재조합 IFNAR 유전자와 IFN을 동시에 처리할 경우에는 저해효과가 추가로 10 내지 20% 증가함을 확인하였고, 이러한 효과는 조류인플루엔자 바이러스 뿐만 아니라, NDV와 같이 사람에게서 질병을 유발시키는 파라믹소바이러스에 대하여도 동일하게 나타남을 확인하였으므로, 재조합 IFNAR 유전자가 대부분의 바이러스의 감염에 대하여 저항성을 나타내게 할 수 있으므로, 바이러스성 질병에 대한 범용적인 예방효과를 나타냄을 알 수 있었다.

본 발명의 다른 실시양태에 의하면, 본 발명은 인터페론의 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 하고, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조류독감 예방용 DNA 백신을 제공한다.

본 발명에서 용어, "DNA백신"이란 기존 단백질 백신과는 다른 형태의 백신으로서 특정 항원을 암호화하며 유전자를 포함하고 있는 플라스미드 형태의 백신을 의미한다. 상기 DNA 백신은 면역화 시 백신 접종자 체내의 수지상 세포를 포함한 다양한 세포에 유입되어, 항원 유전자의 전사 및 항원의 생산을 유도하여, B세포와 T 세포에 항원을 제시 체액성 및 세포성 면역반응을 유도하므로, 인체에 큰 부작용이 없이 체내에서 지속적인 항원 발현을 유도할 수 있고, 세포성 면역 반응을 유도하는 데 보다 효과적이며, 제조와 생산이 쉽고, 상온에서도 안정하므로, 안정적인 보관 및 유통이 용이하다는 장점이 있다.

본 발명의 또 다른 실시양태에 의하면, 본 발명은 인터페론 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 조성물, 또는 상기 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 DNA 백신을 투여하는 단계를 포함하는, 조류독감을 예방하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 용어, "예방"이란 상기 인터페론 수용체를 암호화하는 유전자를 포함하는 조성물의 투여로 조류인플루엔자 바이러스 감염에 의한 질환 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 용어, "개체"는 조류인플루엔자 바이러스 감염으로 인한 직, 간접적 원인에 의해 유발된 질환을 가진 닭, 오리 등의 가금류를 의미한다. 상기 핵산을 포함하는 본 발명의 유전자, 조성물 또는 DNA 백신을 개체에게 투여함으로써, 상술한 조류인플루엔자 바이러스 감염에 의한 유발되는 조류독감과 같은 질환을 효과적으로 예방할 수 있다. 본 발명의 조성물을 기존의 조류인플루엔자 바이러스 감염 질환 예방제와 병행하여 투여할 수도 있다.

본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 바람직한 투여방식은 피하, 피내, 근육, 정맥 투여 등이다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 용어, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체의 성별, 연령, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 상기 유효량은 당업자에게 인식되어 있듯이 처리의 경로, 부형제의 사용 및 다른 약제와 함께 사용할 수 있는 가능성에 따라 변할 수 있으나, 대체로 본 발명의 조성물의 유효용량은 성인을 기준으로 1회에 0.01 내지 0.2 ㎎/㎏이 바람직하며 2 내지 4주 간격으로 1회 이상 투여 가능하다.

본 발명의 조성물 또는 DNA 백신은 상기 인터페론 수용체를 암호화하는 유전자를 단독으로 투여되거나 당 분야에 공지된 다른 다른 보조제 또는 사이토킨과 공동 투여될 수 있다. 공동 투여될 수 있는 면역 반응을 자극할 수 있는 사이토킨은 예를 들어 과립구-대식구 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(GCSF), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, TNF-α, INF-γ, Flt3 리간드 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물 또는 DNA 백신은 인터페론 수용체를 암호화하는 유전자의 유입을 촉진시키는 제제 예를 들어, 리포좀을 이용하거나 콜레스테롤, 콜레이트 및 데옥시콜산을 비롯한 다수의 스테롤류중 1종의 친유성 담체와 함께 배합할 수도 있다. 또한, 세포에 의해 흡수되는 펩티드에 접합시킬 수도 있다. 유용한 펩타이드의 예로는 펩타이드 호르몬, 항원 또는 항체 및 펩타이드 독소 등이 있다.

본 발명의 조성물 또는 DNA 백신은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 투여될 수 있으며, 경구 투여시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 주사제는 생리식염액, 링겔액 등의 수성용제, 식물유, 고급 지방산 에스텔(예, 올레인산에칠 등), 알코올류(예, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제(예, 아스코르빈산, 아황산수소나트퓸, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제(예, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약제학적 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 다양한 제형으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릴시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다.

본 발명의 방법을 이용하면, 조류인플루엔자 바이러스의 증식을 억제할 수 있으면서도, 인테페론에 의한 부작용을 해소할 수 있으므로, 조류인플루엔자 바이러스에 의해 발병되는 조류독감의 예방에 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 IFNAR1 및 2 유전자의 구조를 나타내는 모식도이다.
도 2는 효율적인 RT-PCR을 위하여 인간, 마우스 및 닭의 각기 다른 종간 공통염기서열을 분석한 결과를 나타내는 모식도이다.
도 3은 IFNAR1 및 2 유전자를 추출한 결과를 나타내는 전기영동사진이다.
도 4는 벡터에 삽입된 삽입물의 크기를 확인한 결과를 나타내는 전기영동사진이다.
도 5는 chIFNAR1의 단편 1 및 2의 염기서열을 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 chIFNAR2의 단편 1 및 2의 염기서열을 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 chIFNAR1의 유전적 배경을 나타내는 모식도이다.
도 8은 chIFNAR2의 유전적 배경을 나타내는 모식도이다.
도 9는 벡터에 삽입된 삽입물의 크기를 확인한 결과를 나타내는 전기영동사진이다.
도 10은 chIFNAR1 및 2의 염기서열을 확인한 결과를 나타낸다.
도 11은 HeLa 세포에 pcDNA chIFAR1 및 2 각각의 플라스미드 벡터를 도입하고 면역형광분석를 통해 확인한 결과를 나타내는 공초점 현미경 사진이다.
도 12는 HEK-293T cell 에 pcDNA chIFNAR1 및 2 각각의 플라스미드 벡터를 도입한 후, 웨스턴 블럿 분석을 통해 확인한 결과를 나타내는 사진이다.
도 13은 IFNAR1 및 2의 과발현에 의해, 바이러스의 증식이 저해되고, chIFN 에 의한 항바이러스 효과도 증폭됨을 확인한 결과를 나타내는 사진 및 그래프이다.
도 14는 닭의 세포에서 chIFNAR1 및 2를 과발현 시킬 경우 바이러스의 증식을 저해하는 정도를 정량적으로 분석한 결과를 나타내는 히스토그램 및 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 닭의 IFNAR1 ,2 gene 클로닝

실시예 1-1: 프라이머 설계

NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 통하여 GenBank 상에 등재된 서열정보를 토대로 닭의 인터페론 수용체(IFNAR1 및 IFNAR2)의 서열정보를 확인하였다(chIFNAR1: AY744159 / chIFNAR2: AY538711). 상기 닭의 IFNAR1 및 2의 유전자를 닭의 세포에서 과발현 시키기 위해 포유동물 전용 발현벡터인 pcDNA 3.1a 벡터에 클로닝하기 위해 프라이머 세트를 설계 하였다. 이때 닭의 세포로부터 RNA를 추출, RT-PCR를 통한 cDNA 합성 방법으로 클로닝을 진행 하였으며, 이를 위하여 각 IFNAR1 및 2 유전자의 서열을 단편 1 및 2 로 분할하여 각기 프라이머를 설계 하였다(도 1). 한편, 효율적인 RT-PCR을 위하여 인간, 마우스 및 닭의 각기 다른 종간 공통염기서열을 분석하여 각 유전자의 sense 프라이머를 설계 하였다(도 2).

chIFNAR1 fragment 1

sense: 5'-ggatccgccgccaccatgtatgcttgtgcttctgggc-3'(서열번호 3)

antisense: 5'-gaacaggcctcctttatcc-3'(서열번호 4)

chIFNAR1 fragment 2

sense: 5'-ggataaaggaggcctgttc-3'(서열번호 5)

antisense: 5'-ctcgagtagtatgtcatttcctagtgtt-3'(서열번호 6)

chIFNAR2 fragment 1

sense: 5'-ggtaccgccgccaccatggaatcactgatgattggcccacttcggtttactcagc-3'(서열번호 7)

antisense: 5'-ccaacggatccttctgcc-3'(서열번호 8)

chIFNAR2 fragment 2

sense: 5'-ggcagaaggatccgttgg-3'(서열번호 9)

antisense: 5'-ctcgagtcttcgtacgtattcactttt-3'(서열번호 10)

실시예 1-2: PCR

10일령 유정란을 국립축산과학원으로부터 수령하여 TEC(primary trachea epithelial cell)를 Percoll gradient method를 이용하여 분리하고, 4일동안 37℃ 및 5% CO₂의 조건하에서 배양하였다. 이어, 상기 TEC에 조류인플루엔자 바이러스인 H1N1를 0.1moi로 24시간 동안 감염 시키거나, ConA와 PMA를 1,000X 농도로 16시간 동안 처리하여 자극하였다. 그런 다음, 상기 세포로부터 TRIZOL reagent(Promega, USA)를 이용, RNA를 추출하였다. 추출된 RNA에 DNase(Promega, USA)를 37℃에서 1시간동안 처리한 다음, DNaes inhibitor(Promega, USA)를 처리하여 상기 DNase를 불활성화 시키고, random hexamer(Promega, USA)와 M-MLV 역전사효소(SUPERBIO, Korea)를 이용한 역전사 반응을 수행하여 cDNA를 합성하였다. 상기 합성된 cDNA 2ul를 주형으로 하고 상기 설계한 각 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다.

실시예 1-3: 클로닝 및 염기서열 확인

PCR 산물을 아가로스겔에 전기영동하여 예측된 크기(chIFNAR1F1 : 662bp, chIFNAR1F2 : 1045bp, chIFNAR2F1 : 942bp, chIFNAR2F2 : 582bp)에 해당하는 밴드를 Corebio gel extraction kit를 이용하여 추출하였다(도 3). 상기 추출된 DNA를 pGEM T-EASY 벡터(Promega, USA)에 클로닝하고 선발과정을 통해 PCR 산물이 삽입된 클론을 분리하였다. 이때, 벡터내에 정확한 크기의 삽입물이 삽입되었는지를 확인하기 위하여 각각의 클론들로부터 플라스미드를 수득하고, 이를 EcoRI으로 절단한 다음 아가로스겔에 전기영동하여 확인하였다(도 4). 또한, 상기 EcoRI으로 절단된 절편의 염기서열을 확인하여 chIFNAR1의 단편 1 및 2와(도 5) chIFNAR2의 단편 1 및 2(도 6)가 정확히 삽입되었는지를 확인하였다.

각각의 chIFNAR1 및 2 에 대하여 반복적 PCR을 통해 동일하게 나타나는 염기서열의 변이를 확인하였으며 이를 통하여 주형으로 사용한 닭의 TEC의 유전적 배경(genetic background)임을 확인하였고, chIFNAR1(도 7)과 chIFNAR2(도 8)에서의 유전적 배경을 명기하였다.

실시예 1-4: 서브클로닝 및 sequencing 확인

동물세포 발현벡터인 pcDNA vector 로 서브클로닝 하기 위해, 각기 얻어진 pGEM 클론 들의 각 단편 삽입물들을 제한효소로 절단하여 수득하고, 이를 pcDNA3.1a 벡터에 서브클로닝 하였다. 먼저, chIFNAR1의 경우 pGEM chIFNAR1F1은 BamH1 및 Stu I으로 절단하고, pGEM chIFNAR1F2는 Stu I 및 Xho I으로 절단하여 각각의 삽입물을 수득하고, 각 삽입물을 BamH1 및 XhoI으로 절단한 pcDNA 3.1a 벡터에 서브클로닝하였다. 또한, chIFNAR2의 경우, pGEM chIFNAR2F1 및 pGEM chIFNAR2F2를 모두 BamH1 및 Sac I으로 절단하여 각각의 절편을 수득하고, 이를 T4 ligation kit(TAKARA, Japan)을 이용하여 하나의 단편으로 형성한 다음, Kpn I 및 Xho I으로 절단한 pcDNA 벡터에 서브클로닝 하였다.

이 후 얻어진 각 클론에 대하여 선발과정을 통해 각 삽입물이 도입된 각 클론을 분리하였으며, 이때, 각 클론에 도입된 삽입물을 확인하기 위하여, 각 클론으로부터 얻어진 플라스미드를 제한효소로 절단하고 아가로스겔에 전기영동하여 확인하였다(도 9). 또한, 상기 절단된 각 삽입물의 염기서열을 결정하여 정확안 삽입물이 얻어졌는지를 추가로 확인하였다(도 10A 및 10B).

실시예 2: 발현검정

실시예 2-1: HeLa 세포에 pcDNA chIFAR1 및 2 각각의 플라스미드 벡터를 도입하고 면역형광분석(Immuno fluorescent Assay)를 통해 확인

HeLa 세포 1.5 x 10⁵cell에 Viva magic reagent(Vivagen, Korea)를 이용하여 DNA 2㎍을 48시간 동안 도입하였다. 이 후, 2% 포르말린을 이용하여 상온에서 30분 동안 고정시켰으며, 10% 염소혈청을 이용하여 블로킹하였다. 3% 염소혈청에 항-His Ab를 1:2,000 희석하여 1차 항체를 처리하였으며, 염소의 IgG FITC-conjugated 항-마우스 항체(Molecular probe, US)를 이용하여 공초점 현미경으로 검출하였다. 이를 통하여 제작한 pcDNA 3.1a 벡터에 의해 His 태깅된 chIFNAR1 및 2 각각의 신호를 확인하여 HeLa 세포내의 세포질에서 발현되어졌음을 검증하였다(도 11).

실시예 2-2: HEK -293T cell 에 pcDNA chIFNAR1 및 2 각각의 플라스미드 벡터를 도입한 후, 웨스턴 블럿 분석을 통해 확인

HEK-293T 세포 5.0 x 10⁵cell에 CaCl₂와 HEPES 완충 식염수(HBS)를 이용하여 DNA 6㎍을 도입하였다. 48시간이 경과한 이후, 세포를 수득하고, RIPA 완충액(150mM NaCl, 1% NP40, 0.5% deoxycholic acid, 50mM Tris-HCl pH8.0, 0.2mM PMSF, protease inhibitor cocktail)을 이용하여 4℃에서 30분동안 용해시켰으며, 13,200rpm 및 4℃의 조건하에 10분동안 원심분리하여 상층액을 수득하고, 이를 SDS-PAGE에 적용한 후, 1번 항체(anti-His 1:5,000, anti-β actin 1:10,000) 및 2번 항체(HRP-conjugated anti-mouse IgG 1:5,000)를 이용하고 ECL 용액으로 형광반응을 유도한 웨스턴 블럿을 수행하여 pcDNA 3.1a vector에 의해 His 태깅된 chIFNAR1 및 2 각각의 신호를 확인하여 제대로 발현되었음을 검증할 수 있었다(도 12).

실시예 3: 항바이러스 효능 검정

실시예 3-1: pcDNA chIFNAR1 및 2 각각의 DNA 플라스미드를 이용하여 닭의 세포에서 IFNAR 유전자를 과발현 시킬 경우 조류인플루엔자 바이러스에 대해 비특이적 저항성 유도검정

10일령 유정란을 국립축산과학원으로부터 수령하여 TEC를 분리하고, 4일 동안 37℃ 및 5% CO₂의 조건하에 배양한 다음, Viva magic reagent 이용하여 DNA 2㎍ 각각을 도입하였다. 48시간이 경과한 후, IFNAR의 활성을 추가로 증폭시키기 위해 닭의 IFN-α/β를 각기 24시간 동안 처리하였다. 이때, 닭의 IFN-α/β로는 HEK-293T 세포에 pcDNA chIFN-α/β 각각의 DNA를 48시간 동안 도입시킨 후 수득한 배양상층액을 사용하였다. IFN-α/β를 처리한 후, 조류인플루엔자 바이러스인 H9N2을 0.1moi로 24시간 동안 감염시키고, 감염된 세포용해물을 이용하여 웨스턴 블랏을 수행하고, H9N2가 감염된 닭의 항혈청을 이용하여 바이러스 단백질 신호를 확인하였다. 그 결과, IFNAR1 및 2의 과발현에 의해, 바이러스의 증식이 저해되었고, chIFN 에 의한 항바이러스 효과도 증폭됨을 확인하였다(도 13A).

또한, 웨스턴 블럿 분석결과를 컴퓨터 프로그램(quantity one software, Bio-Rad Laboratories, USA)에 적용하여 각 밴드의 밀도를 정량적으로 분석한 결과, IFNAR1 및 2의 과발현 자체만으로도 바이러스의 증식을 35% 가까이 저해하고, IFN을 동시에 처리할 경우에는 저해효과가 추가로 10 내지 20% 증가함을 확인하였다(도 13B).

실시예 3-2: 닭의 세포에서 chIFNAR1 및 2를 과발현 시킬 경우 바이러스의 증식을 저해하는 정도를 정량적으로 분석하기 위해 재조합 NDV - GFP 바이러스를 이용하여 저해양상을 분석

10일령 유정란을 국립축산과학원으로부터 수령하여 TEC를 분리하고, 4일 동안 37℃ 및 5% CO₂의 조건하에 배양한 다음, Viva magic reagent 이용하여 DNA 2㎍ 각각을 도입하였다. 48시간이 경과한 후, IFNAR의 활성을 추가로 증폭시키기 위해 닭의 IFN-α/β를 각기 24시간 동안 처리하였다. IFN-α/β를 처리하고 24시간이 경과한 후, 감염시에 GFP를 발현하는 재조합 NDV-GFP 바이러스를 TCID50 0.1로 24시간 동안 도입하였다. 이 후, 상기 세포를 트립신처리하고 유세포분석(flow cytometry analysis)을 통해 전체 세포 중에서 GFP 양성인 세포의 비율을 측정함으로써 바이러스 감염에 대한 저해양상을 확인하였다(도 14). 그 결과, IFNAR1 및 2의 과발현 그 자체 만으로도 40%의 저해율을 나타내었으며 chIFN-α, β 를 동시에 처리시 20~30% 의 추가적인 저해효과를 나타냄을 다시한번 확인할 수 있었다.

<110> SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY Foundation for Corporate Collaboration <120> A Composition for Preventing Bird Flu Comprising Interferon Receptor gene <130> PA110114/KR <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1707 <212> DNA <213> IFNAR1 <400> 1 atgtatgctt gtgcttctgg gcggctagcg gctgtgctgc tttgtgtctt ggtcgtggtg 60 tcccggtgct gtgcaggcca gactaatctg aagagtcctc aggatattca ggtttatgct 120 gtaaatacaa atttcaccct aatgtggaac tacactggag atggtaccaa cgtgacattt 180 tcagcacaat accagtgctt tgatgatctt cagacaagtg aaccagaatg gaaggaatta 240 tctggttgcc agaatgtcag tcacacagaa tgtgactttt cttcagcaat aactgcatac 300 tatgatacgc atcacatccg cataagggct gaaagaaggg aagccaagtc tccatggtct 360 agcattttcg aaatgattcc gtatgaaata gctcagattg gtccccctga aatagcgttg 420 cagtccataa atggagccat taaaattaac atttctcctc cagaagcaaa tcaggttcga 480 aaaatgtggc taatttctgt gttttttaaa tacaatgtag ttatctggga caattcatcc 540 aatgtagaaa aggtcagaag tattttaccc attgatgtaa taaatgatct tgctccagag 600 actacctatt gtttgaaagt tcaagcaact gttcctctgg 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1440 gtgtggcaga attcatctgg ttcttccagt gaaagcgact catcggattc agatatggac 1500 ccaaaaagtg aatacgtacg aagactcgag 1530 <210> 3 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ggatccgccg ccaccatgta tgcttgtgct tctgggc 37 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gaacaggcct cctttatcc 19 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ggataaagga ggcctgttc 19 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ctcgagtagt atgtcatttc ctagtgtt 28 <210> 7 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ggtaccgccg ccaccatgga atcactgatg attggcccac ttcggtttac tcagc 55 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ccaacggatc cttctgcc 18 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 ggcagaagga tccgttgg 18 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 ctcgagtctt cgtacgtatt cactttt 27

Claims

인터페론의 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 하고, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조류독감 예방용 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 인터페론의 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 인터페론(α,β,ο) 수용체 1인 IFNAR1(interferon (α,β,ο) receptor 1) 유전자 또는 인터페론(α,β,ο) 수용체 2인 IFNAR2 (interferon (α,β,ο) receptor 2) 유전자인 것인 조성물.
제2항에 있어서, 상기 IFNAR1 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 것인 조성물.
제2항에 있어서, 상기 IFNAR2 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 것인 조성물.
인터페론의 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 하고, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조류독감 예방용 DNA 백신.
제5항에 있어서, 상기 인터페론의 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 인터페론(α,β,ο) 수용체 1인 IFNAR1(interferon (α,β,ο) receptor 1) 유전자 또는 인터페론(α,β,ο) 수용체 2인 IFNAR2 (interferon (α,β,ο) receptor 2) 유전자인 것인 백신.
제6항에 있어서, 상기 IFNAR1 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 것인 백신.
제6항에 있어서, 상기 IFNAR2 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 것인 백신.
서열번호 1 또는 2의 염기서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 조성물, 또는 상기 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 DNA 백신을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 조류독감을 예방하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 개체는 가금류인 것인 조류독감을 예방하는 방법.