KR101288514B1 - 붉은 곰팡이 병균의 국내종 및 외래종 구분용 미세표식자 마커 및 이러한 마커를 이용하여 붉은 곰팡이 병균의 국내종 및 외래종을 구분하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 붉은 곰팡이 병균(Fusarium graminearum)의 외래종을 구분하기 위한 미세표식자 마커 및 이를 이용하여 붉은 곰팡이 병균의 외래종을 구분하는 방법에 관한 것으로, 붉은 곰팡이 병균 중 외국균주, 외국균주와 교잡된 국내균주 및 국내 토종균주를 PCR 방법을 사용하여 구분하기 위한 붉은 곰팡이의 미세표식자를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 1 및 2로 나타내어지는 프라이머 FgmsTG49을 사용하여 PCR 방법으로 유전자를 증폭하고, 상기 증폭된 유전자의 미세표식자 부위를 확인함으로써 붉은 곰팡이 병균 중 외래종을 구분하는 방법에 따르면 곡류 시료에서 붉은 곰팡이 병균 복합체의 주요 오염종 및 오염가능 독소를 신속하고 정확하게 구분할 수 있으며, 특히 이러한 본 발명에 따르면 외국균주, 외국균주와 교잡된 국내균주 및 국내 토종균주를 3일 이내에 신속하고 정확하게 구분할 수 있어 본 발명의 프라이머 FgmsTG49는 F. graminearum 균주의 외래 유입종과 국내종을 구분할 수 있는 분자마커로서 당 분야에서 매우 효과적으로 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

붉은 곰팡이 병균의 국내종 및 외래종 구분용 미세표식자 마커 및 이러한 마커를 이용하여 붉은 곰팡이 병균의 국내종 및 외래종을 구분하는 방법{Microsatellite marker for identifying domestic species and foreign species of red mold pathogen and method for identifying domestic species and foreign species of red mold pathogen using the marker}

본 발명은 붉은 곰팡이 병균인 후사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum)의 외래종을 구분하기 위한 미세표식자 마커 및 이를 이용하여 붉은 곰팡이 병균의 국내종과 외래종을 구분하는 방법에 관한 것이다.

전 세계적으로 문제가 되고 있는 곡류의 붉은 곰팡이 병균은 보리를 비롯하여 벼, 밀, 옥수수, 조, 수수 등에 병을 일으키는 균으로 발병으로 인한 곡물의 수량감소 뿐만 아니라 곡물의 품질을 저하시키고, 특히 DON(deoxynivalenol)과 NIV(nivalenol) 등의 트라이코쎄신(trichotheceane) 독소를 생산하여 사람과 가축에 중독증을 일으키는 문제가 있어 인축에 큰 피해를 주는 매우 중요한 병균으로 알려져 있다.

붉은 곰팡이 병균은 1879년 이탈리아의 카타네오(Cattaneo)에 의해 처음 보고되었으며, 우리나라에서는 1964년에 정후섭 등이 발생을 최초로 보고하였는데, 밀과 벼에서 분리한 병균은 형태적, 생태적으로 같은 것이며 생육적온은 28℃라고 보고하였고, 이후 이 병균을 아오키(Aoki)와 오도넬(O'Donnell)(1999)은 병원성에 따라 크라운 로트(crown rot)를 일으키는 그룹 1과 헤드 블라이트(head blight)를 일으키는 그룹 2로 나누었다. 한편, 이인원 등에 의하면 우리나라에 분포하는 붉은 곰팡이 병균의 유전자형은 옥수수에서 주로 발생하며 DON(Deoxynivalenol)을 생성하는 lineage 7의 후사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum)균과 보리에서 주로 발생하여 NIV(nivalenol)을 생성하는 lineage 6인 후사리움 아시아티쿰(F. asiaticum)균이 있다고 보고한 바 있다.

우리나라에서 벼 붉은 곰팡이병의 조사는 2005년 작물과학원에서 조사한 것이 처음으로 수확기에 조사한 것을 보면 김제, 해남, 장흥, 부안 등지에서 18~40%(평균 25.8%)의 발병 필지율을 보였고 이들 포장에서 병균을 검출한 결과 15~67%(평균 25.4%)의 검출률을 나타냈다. 또한 벼 출수기에 전북 익산지역에서 비산포자를 채집하여 병균의 유전자형을 조사한 결과를 보면 총 108개의 포자 중에서 NIV형 병균이 54개, DON형 병균이 2개로 나타났다. 반면에 같은 해 보리와 밀에서 분리한 병균의 경우에는 총 347개의 균주 중에서 DON형 균주가 없었다. 2006년 조사 결과를 보면 호남지방의 벼 붉은 곰팡이병은 전 지역에 발생하고 있었으나 지역 또는 조사포장에 따라 발생정도의 차이가 있었는데 전북지방에 비해 전남지방의 발생이 심한 경향을 나타냈다. 특히 전남 해안지방의 함평, 장흥, 강진, 보성 지역이 5~10%의 병든 이삭률을 나타내 발생이 가장 심한 것으로 조사되었다.

2000년대부터 현재까지 곡류 붉은 곰팡이 병균의 종 및 이에 의해 생산되는 독소 유형을 구분하는 방법 및 이러한 붉은 곰팡이 병균의 유전적 다양성에 대한 연구가 꾸준하게 이루어지고 있다. 붉은 곰팡이병의 발생은 기상환경과 밀접한 관계가 있어 이러한 곡류에 있어 피해가 막심한 붉은 곰팡이 병균의 유전적 다양성에 대한 연구는 장기적인 관점에서 지속적으로 이루어질 필요가 있으며, 특히 이들의 분포현황, 생성독소, 우점종 집단 분석 및 균주별 특성 분석 등이 필요한 상황이다.

한국공개특허 제10-2003-0021839호

FEMS Microbiology Ecology, Volume 55, Issue 2, pages 211-220, February 2006

따라서 본 발명의 목적은 붉은 곰팡이 병균인 후사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum) 중 국내종과 외래종을 PCR 방법을 사용하여 보다 간단하고 정확하게 구별할 수 있는 붉은 곰팡이 병균의 미세표식자 마커를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 붉은 곰팡이 병균의 미세표식자 마커를 이용하여 붉은 곰팡이 병균인 후사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum) 중 국내종과 외래종을 보다 간단하고 정확하게 구분하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 붉은 곰팡이 병균의 미세표식자 마커를 유효성분으로 포함하는 붉은 곰팡이 병균 중 국내종과 외래종의 구분 및 진단을 위한 진단 키트를 제공하기 위한 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 붉은 곰팡이 병균인 후사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum) 중 외국균주, 외국균주와 교잡된 국내균주 및 국내 토종균주를 PCR 방법을 사용하여 구분하기 위한 붉은 곰팡이의 미세표식자를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 1 및 2로 나타내어지는 프라이머 FgmsTG49를 제공한다.

이에 본 발명자들은 붉은 곰팡이 병균인 후사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum)의 국내종과 외래종을 빠르게 정확하게 구분할 수 있는 방법을 개발하기 위해 계속 연구를 진행하던 중 신규한 미세표식자 마커인 FgmsTG49 프라이머가 F. graminearum 균을 외국균주, 외국균주와 교잡된 국내균주 및 국내 토종균주로 보다 간단하고 신속하면서도 정확하게 구분할 수 있다는 것을 발견함으로써 본 발명의 완성에 이르게 되었다.

상기한 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 상기 프라이머 FgmsTG49를 사용하여 PCR 방법으로 유전자를 증폭하는 단계, 및 상기 증폭된 유전자의 미세표식자 부위를 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 붉은 곰팡이 병균 중 국내종과 외래종을 구분하는 방법을 제공한다.

상기한 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 상기 붉은 곰팡이의 미세표식자를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 1 및 2로 나타내어지는 프라이머쌍 FgmsTG49; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 붉은 곰팡이 병균 중 외래종을 구분 및 진단하기 위한 진단 키트를 제공한다.

본 발명에서 "미세표식자(microsatellite)"는 게놈 내 DNA 염기 서열 중에서 2~5개의 염기가 특징적으로 반복되는 부위로, 반복 정도에 따라 다양한 대립유전자가 존재하며, 멘델의 유전법칙에 따라 부모에서 자손으로 유전되므로 염색체 지도 작성의 표지로 이용되거나, 집단 및 개체의 유전적 특성을 규정짓거나, 친자확인 등의 유전자형 분석에 많이 이용된다. 이들 미세표식자 특정 부위는 이를 포함하는 위, 아래쪽 염기서열의 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 통해 증폭이 가능하다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 복제하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 바람직하게는, 상기 프라이머의 길이는 약 5-50 뉴클레오타이드이다. 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 발명에서는 또한 상기 프라이머 FgmsTG49를 사용하여 PCR 방법으로 유전자를 증폭하는 단계, 및 상기 증폭된 유전자의 미세표식자 부위를 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 붉은 곰팡이 병균 중 국내종과 외래종을 구분하는 방법을 제공한다.

이러한 본 발명의 방법은 증폭된 유전자의 미세표식자 부위를 확인하는 단계를 포함한다. 상기 증폭된 유전자의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일 실시예에서는 상기 증폭된 유전자의 미세표식자 부위 확인을 위하여, 프라이머 FgmsTG49의 정방향 프라이머 5' 말단에 PET 염료를 융합시켜 단편 분석(fragment analysis)으로 실시하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서는 상기 프라이머 FgmsTG49; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 붉은 곰팡이 병균 중 외래종을 구분 및 진단하기 위한 진단 키트를 제공한다. 본 발명의 키트에서, 상기 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 설명서를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 미세표식자를 특이적으로 증폭하는 프라이머 FgmsTG49를 이용하여 PCR 분석함으로써 곡류 시료에서 붉은 곰팡이 병균 복합체의 주요 오염종 및 오염가능 독소를 신속하고 정확하게 구분할 수 있으며, 특히 이러한 본 발명에 따르면 종래의 후사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum)의 오염여부 조사시 원인 곰팡이를 분리하고 확인하는 방법이 7일 내지 10일 정도의 시간이 소요된 것에 비해 외국균주, 외국균주와 교잡된 국내균주 및 국내 토종균주를 3일 이내에 신속하고 정확하게 구분할 수 있어 본 발명의 프라이머 FgmsTG49는 F. graminearum 균주의 외래 유입종과 국내종을 구분할 수 있는 분자마커로서 당 분야에서 매우 효과적으로 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 붉은 곰팡이 병균인 F. graminearum 균주 간 미세표식자이를 특이적으로 증폭하는 프라이머 FgmsTG49와 기존의 프라이머 Fg16을 이용하여 PCR 증폭한 후 밴드 패턴을 비교하여 나타낸 것이다.
도 2는 붉은 곰팡이 병균인 F. graminearum 균주 간 FgmsTG49 미세표식자 부위의 염기서열을 비교하여 나타낸 것이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명을 이들만으로 한정하는 것은 아니다.

<실시예 1> 붉은 곰팡이 병균 준비 및 프라이머 제작

2009년 옥수수와 벼 시료에서 분리하여 TEF 유전자 염기서열로 F. grminearum 으로 확인된 28개의 균주를 이용하여 PCR 증폭 및 미세표식자 다양성 분석 실험을 하였다(표 1 및 2). 본 발명자들은 프라이머쌍을 제작하기 위해 Fusarium graminearum 데이터베이스(http://www.broad.mit.edu/annotation/genome/fusarium_graminearum/)와 SciRoKoCo 프로그램을 사용하여 프라이머쌍을 제작하고, 이에 따라, 서열번호 1 및 2로 나타내어지는 미세표식자 증폭을 위한 프라이머 FgmsTG49(정방향 프라이머 FgmsTG49-F: GGGGCCTCTTTGATATCCTC (서열번호 1) 및 역방향 프라이머 FgmsTG49-R: CAGCCAGCTGTCAAGTGAGT (서열번호 2))을 제조하였다.

<실시예 2> 프라이머 FgmsTG49 또는 비교예인 프라이머 Fg16을 이용한 붉은 곰팡이 병균 분석

상기 표 1 및 2의 균주들을 CM 액체배지에 접종하여 25℃ 항온기에서 3일간 현탁배양하였다. 배양된 균사들을 동결건조한 후 마쇄하고 CTAB 완충액 이용해 게놈 DNA를 추출하였다. 추출된 게놈 DNA는 20ng/ul 농도로 맞추어 PCR 증폭에 이용하였다.

상기 각각의 정방향 프라이머(10pmol) 0.5 ul, 역방향 프라이머 (10pmol) 0.5 ul, 게놈 DNA(20ng/ul) 1ul, 4dNTP (10mM) 2 ul, 10X EX Tag 완충액 2.5 ul, TaKara EX tag (5u/ul) 0.2 ul, 멸균수 17.3 ul가 혼합된 PCR 반응 혼합물 25 ul을 94℃에서 30초 동안 어닐링(annealing)하고, 56℃에서 30초 동안 변성(denature)시킨 후, 72℃에서 30초 동안 확장(extension)하는 싸이클을 1 싸이클로 하여 30 싸이클을 실시하였다. PCR 산물을 2% 아가로스 겔에 전기영동하여 확인하였다.

또한, 기존의 F. graminearum 복합체 군 중 주로 F. graminearum 을 확인할 수 있는 Fg16 프라이머(정방향 프라이머 Fg16-F: ctccggatatgttgcgtcaa (서열번호 3) 및 역방향 프라이머 Fg16-R: ggtaggtatccgacatggcaa (서열번호 4))를 이용한 PCR 분석을 수행하였으며, 그 결과 또한 도 1에 같이 나타내었다.

도 1에 나타나는 바와 같이, 등록균주를 포함한 F. graminearum 28 균주를 이용하여 FgmsTG49와 Fg16 PCR 밴드 패턴을 비교하였다. 그 결과 Fg16 PCR 산물은 동일한 크기의 PCR 밴드가 확인되는 반면, FgmsTG49 PCR 산물은 균주의 지역에(국내종, 교잡종, 외래종) 따라 다양한 크기의 PCR 밴드가 확인되었다.

<실시예 3> 미세표식자 마커 FgmsTG49를 이용한 균주 및 다양성 분석

F. graminearum 균주 식별 가능성을 분석하기 위해 FgmsTG49 마커의 정방향 프라이머 5‘ 말단에 PET 염료를 융합시켜 DON 생산 균주인 F. graminearum 균주를 대상으로 단편 분석(fragment analysis)을 실시하였다. 그 결과는 하기 표 3에 나타내었다.

F. graminearum 균주의 미세표식자 부위 다양성을 분석하기 위한 PCR반응은 다음과 같다. 상기 각각의 정방향 프라이머(10pmol) 0.5 ul, 역방향 프라이머 (10pmol) 0.5 ul, 게놈 DNA(20ng/ul) 1ul, 4dNTP (10mM) 2 ul, 5X PrimeSTAR Tag 완충액 2.5 ul, PrimeSTAR tag (TaKara, 5u/ul) 0.2 ul, 멸균수 17.3 ul가 혼합된 PCR 반응 혼합물 25 ul을 94℃에서 30초 동안 어닐링하고, 56℃에서 30초 동안 변성시킨 후, 72℃에서 30초 동안 확장하는 싸이클을 1 싸이클로 하여 35 싸이클을 실시하였다. PCR 산물을 4% 아가로스 겔에 전기영동하여 확인한 후 마크로젠에 GeneScan 서비스를 의뢰하였다.

상기 표 3에서 보듯이, 등록균주를 포함한 28개의 DON 생산균주인 F. graminearum 균주를 3개의 군, 즉 group A는 외국균주, group B는 국내에서 분리된 외국균주와 교잡된 국내균주, group C는 국내에서 분리된 토종균주로 구분되었다.

<실시예 4> 미세표식자 염기서열 분석

또한, 상기 결과를 확인하기 위해 각 group 대표균주의 실제 미세표식자 부위 염기서열을 분석하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2는 본 발명에 따른 붉은 곰팡이 병균의 미세표식자를 특이적으로 증폭하는 프라이머 FgmsTG49를 이용하여 붉은 곰팡이 균주 간의 미세표식자 부위의 염기서열을 비교하여 나타낸 것이다. 여기에서 보듯이, F. graminearum 균주의 각 group별로 반복적인 염기서열에 있어서 명백한 차이가 있음을 확인할 수 있었다.

본 발명에 따른 미세표식자를 특이적으로 증폭하는 프라이머 FgmsTG49를 이용하여 PCR 분석함으로써 곡류 시료에서 붉은 곰팡이 병균 복합체의 주요 오염종 및 오염가능 독소를 신속하고 정확하게 구분할 수 있으며, 특히 이러한 본 발명에 따르면 종래의 후사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum)의 오염여부 조사시 원인 곰팡이를 분리하고 확인하는 방법이 7일 내지 10일 정도의 시간이 소요된 것에 비해 외국균주, 외국균주와 교잡된 국내균주 및 국내 토종균주를 3일 이내에 신속하고 정확하게 구분할 수 있어 본 발명의 프라이머 FgmsTG49는 F. graminearum 균주의 외래 유입종과 국내종을 구분할 수 있는 분자마커로서 당 분야에서 매우 효과적으로 이용될 수 있을 것으로 기대된다. 또, 곡류수입이 빈번한 우리나라에서 수입곡류의 붉은 곰팡이병원균 오염실태 및 외국균주의 오염을 신속하게 파악할 수 있을 것으로 예상된다.

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Claims (4)

1. 후사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum) 중 외국균주, 외국균주와 교잡된 국내균주 및 국내 토종균주를 PCR 방법을 사용하여 구분하기 위한 붉은 곰팡이의 미세표식자를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 1 및 2로 나타내어지는 프라이머 FgmsTG49.
2. 서열번호 1 및 2로 나타내어지는 프라이머 FgmsTG49를 사용하여 유전자를 증폭하는 단계, 및 상기 증폭된 유전자의 미세표식자 부위를 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 후사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum) 중 외래종을 구분하는 방법.
3. 제 2 항에 있어서,
   상기 증폭된 유전자의 미세표식자 부위 확인을 프라이머 FgmsTG49의 정방향 프라이머 5' 말단에 PET 염료를 융합시켜 단편 분석(fragment analysis)을 실시함으로써 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 서열번호 1 및 2로 나타내어지는 프라이머 FgmsTG49; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 후사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum)의 외래종을 구분 및 진단하기 위한 진단 키트.

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