KR101281084B1 - 양이온성을 지닌 생분해성 ｐａｏｘ 고분자 미립구 - Google Patents

양이온성을 지닌 생분해성 ｐａｏｘ 고분자 미립구 Download PDF

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Abstract

본 발명은 옥살릴 클로라이드 (oxalyl chloride), 1,4-사이클로헥산디메탄올 (1,4-cyclohexanedimethanol) 및 피페라진디에탄올 (piperazinediethanol)을 이용하여 PAOX (poly(amino oxalate)를 제조하고 이를 미립구로 제조하여 약물전달체로 활용하는 것에 관한 것이다. 본 발명에 따른 PAOX는 생분해성, 생체적합성, 양이온성 등 세 가지 특성을 동시에 지니고 있는 고분자로서 적절한 소수성을 지니고 있는바, 약물의 빠른 방출을 유도하는 미립구로 제조될 수 있다. 또한 상기 미립구는 약물의 세포 내 전달효율을 향상시킴으로써, 급성 간부전, 급성 폐렴 등 급성 염증성 질환을 치료하는 데 있어 약물전달체로서 유용하게 활용될 수 있다.

Description

양이온성을 지닌 생분해성 ＰＡＯＸ 고분자 미립구 {Polyoxalate particle as new biodegradable and biocompatible drug delivery vehicle}
본 발명은 옥살릴 클로라이드 (oxalyl chloride), 1,4-사이클로헥산디메탄올 (1,4-cyclohexanedimethanol) 및 피페라진디에탄올 (piperazinediethanol)을 이용하여 PAOX (poly (amino oxalate))를 제조하고 이를 생분해성 고분자 미립구로 제조하여 약물전달체로 활용하는 것에 관한 것이다.
최근 생명공학기술의 발전으로 다양한 질병치료에 이용 가능한 새로운 단백질 약물들이 계속 발견되었으며, 이러한 단백질의 생체 내 작용기작에 대한 연구도 계속되어 그동안 치료가 힘들다고 여겨졌던 질병의 치료가 가능하게 되었다. 치료용 약물로서의 단백질의 가치는 이미 오래전부터 인식되었으나 매우 짧은 반감기를 가지고 있고 체내에서 불안정하기 때문에 치료 효과를 얻기 위해서는 많은 양의 단백질이 요구되었다. 또한, 단백질 원료 의약품은 펩타이드 결합에 의해 이루어져 있고 일정한 pH 하에서 이온성을 가지고 있으며, 단백질 분자들은 서로 응집하거나 흡착하려는 즉, 부착하려는 성질이 있어 쉽게 변성되며 이렇게 변성된 단백질은 본래 기능을 할 수 없게 된다.
이러한 문제를 해결하고자 단백질 약물을 생분해성 고분자에 공유결합을 통하여 결합하거나, 단백질 약물을 생분해성 고분자 미립구의 표면에 흡착하는 방법, 또는 단백질 약물을 생분해성 고분자 미립구 내부에 포접하는 방법 등이 개발되고 있다.
지금까지는 PLGA (poly (lactide-co-glycolide)) 또는 PLA (poly (lactic acid))와 같은 생분해성 고분자를 이용하여 미립구로 제조하는 기술이 단백질을 효과적으로 전달하기 위한 방법 중 하나로써 폭넓게 사용되어 왔다. 다양한 생분해성 고분자들 중에서 PLGA는 미국식품의약안전청 (FDA)의 승인을 받은 고분자로서 미립구, 봉합사, 이식용 나사, 핀 그리고 조직공학에 의해 제조된 지지체들을 포함한 의학적인 응용에 있어서 널리 사용되고 있다. PLGA 미립구는 면역체계 혹은 순환계로의 단백질과 백신의 전달에 있어서 어느 정도 성공을 이루었다고 볼 수 있다. 더욱이 치료약물을 포접한 PLGA를 기반으로 하는 몇 가지의 미립구는 시판되고 있다. 그 예로서 leuprolide (Lupron Depot) 이나 triptorelin (Trelstar)을 들 수 있다.
하지만 PLGA와 같은 소수성 폴리에스터 마이크로 미립구로부터의 거대분자인 단백질의 초기방출은 비결정성 영역의 다공성으로 인한 확산에 의해 일어나고 그 방출속도는 매우 느린 것으로 알려져 있다. 이러한 PLGA 마이크로 미립구로부터 치료 약물의 느린 방출은 급성 간부전과 급성 폐렴과 같은 급성 염증성 질환을 치료하는데 있어서 적합하지 않기 때문에 고분자 매트릭스의 가수분해 속도를 조절하기 위한 방안으로 소수성인 PLGA를 친수성 고분자와 물리적으로 혼합하는 방법을 사용하고 있다. 게다가 PLGA는 생분해 후 산성의 부산물을 생성하는데 이는 주위의 pH를 낮게하여 염증을 유발시키는 문제점을 안고 있으므로 생체적합성이 우수한 생분해성 고분자 미립구의 개발의 필요성이 증가하고 있다.
본 발명은 상술한 바와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로 옥살릴 클로라이드, 1,4-사이클로헥산디메탄올 및 피페라진디에탄올의 한 단계 반응으로 제조되는 PAOX (poly (amino oxalate))를 제공함을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 PAOX 미립구에 약물이 담지된 약물전달체를 제공함을 목적으로 한다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 화학식 1의 구조를 갖는 PAOX (poly(amino oxalate), 폴리(아미노 옥살레이트))를 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112012008567328-pat00001
상기 화학식 1에서, n은 18~70의 정수이며, X:Y의 몰비는 80~95:5~20 이다.
또한 본 발명은 1,4-사이클로헥산디메탄올 (1,4-cyclohexanedimethanol), 옥살릴 클로라이드 (oxalyl chloride) 및 피페라진디에탄올 (piperazinediethanol)을 중합시켜 상기 화학식 1로 표시되는 PAOX의 제조방법을 제공한다.
상기 1,4-사이클로헥산디메탄올 (1,4-cyclohexanedimethanol)과 피페라진디에탄올 (piperazinediethanol)의 몰비는 80~95:5~20이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 PAOX에 유화제를 첨가하고 초음파 분쇄 및 균질화를 통해 제조되는 PAOX 미립구를 제공한다.
상기 유화제는 폴리비닐알콜(poly(vinyl alcohol))인 것을 포함할 수 있다.
상기 미립구의 평균 크기는 100nm 내지 10μm인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 미립구에 약물을 담지시킨 약물전달체를 제공한다.
상기 약물은 단백질, 화합물, 핵산 및 추출물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 PAOX는 생분해성, 생체적합성, 양이온성 등 세 가지 특성을 동시에 지니고 있는 고분자로서 적절한 소수성을 지니고 있는바, 약물의 빠른 방출을 유도하는 미립구로 제조될 수 있다. 또한 상기 미립구는 약물의 세포 내 전달효율을 향상시킴으로써, 급성 간부전, 급성 폐렴 등 급성 염증성 질환을 치료하는 데 있어 약물전달체로서 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 D2O 에서의 PAOX의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 2는 PAOX의 가수분해 속도론을 나타낸 도이다 (숫자는 평균±표준편차 (n=3)).
도 3 및 도 4는 PAOX 미립구의 SEM 이미지를 나타낸 도이다 (empty PAOX 미립구 (A); BSA-FITC loaded 미립구 (B)).
도 5는 BSA-FITC가 담지된 PAOX 미립구의 크기를 광산란법에 의해서 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 pH에 따른 PAOX 미립구의 표면 전위의 변화를 나타낸 그래프이다 (숫자는 평균±표준편차 (n=3)).
도 7은 MTT assay를 통해 PAOX 미립구의 세포독성을 확인한 그래프이다.
도 8은 pH 7.4에서 PAOX 미립구로부터 방출 속도를 나타낸 도이다 (숫자는 평균±표준편차 (n=3)).
도 9는 배양된 세포를 칼세인으로 처리한 후, 공초점 주사현미경을 이용하여 찍은 사진이다.
도 10은 BSA-FITC 담지된 POX 미립구 또는 BSA-FITC 담지된 PAOX 미립구로 배양된 세포의 공초점 형광 주사현미경 사진이다.
도 11은 PAOX 미립구로 인해서 RAW 264.7 대식 세포의 엔도좀으로부터 세포질로의 카탈레이즈(CAT) 전달율이 증가됨을 나타낸 도이다.
도 12는 PAOX-PEN 미립구의 표면을 SEM으로 관찰한 도이다.
도 13은 PAOX-PEN 미립구의 크기를 광산란법에 의해서 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 펜톡시필린이 포접된 PLGA 또는 PAOX 미립구에서의 약물 방출 속도를 비교한 그래프이다.
도 15는 형광물질인 Rubrene을 포접한 PAOX 미립구의 생물학적 분배를 측정하기 위하여, 마우스 모델의 각 장기를 IVIS imaging system을 통해 형광 세기를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 16은 도 15의 형광 세기를 정량화 하기 위하여 PL(Photoluminescence)을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 17은 MTT assay를 통해 PAOX-PEN 미립구의 세포독성을 확인한 그래프이다.
도 18은 급성 간부전 마우스 모델에서 ALT assay를 통해 PAOX-PEN 미립구의 약물전달능을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 19는 급성 간부전 마우스 모델의 간 조직의 H&E (hematoxylin & eosin) 염색 결과를 나타낸 도이다.
도 20은 급성 간부전 마우스 모델의 간 조직의 TUNEL 염색 결과를 나타낸 도이다.
본 발명은 하기 화학식 1의 구조를 갖는 양이온성을 지닌 생분해성 고분자 PAOX (poly(amino oxalate), 폴리(아미노 옥살레이트))를 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112012008567328-pat00002
상기 화학식 1에서, n은 18~70의 정수이며, X:Y의 몰비는 80~95:5~20 이다.
PAOX (poly(amino oxalate))는 양이온성을 지닌 생분해성 고분자로 빠른 가수분해속도를 가진다. PAOX는 빠른 가수분해 속도에도 불구하고, 적절한 소수성을 유지함으로 인해서 이중 혹은 단일유화방식을 이용하여 미립구를 제조하는데 있어서 큰 안정성을 보일 수 있다.
또한, 본 발명은 1,4-사이클로헥산디메탄올 (1,4-cyclohexanedimethanol), 옥살릴 클로라이드 (oxalyl chloride) 및 피페라진디에탄올 (piperazinediethanol)을 중합시켜 상기 화학식 1로 표시되는 PAOX의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 1,4-사이클로헥산디메탄올 (1,4-cyclohexanedimethanol)은 뛰어난 생체적합성 때문에 이 공중합체의 주 구성성분으로서 사용되었다. 또한, 1,4-사이클로헥산디메탄올은 간접적인 식품 첨가제로서 인간이 섭취할 수 있는 것으로 승인되었고 뛰어난 독성 프로파일 (LD50 : 3200mg/kg 구강 섭취량)을 가지고 있으며, 생체 내에서 상당한 효소의 변환을 겪지 않고, 몸에서 빠르게 제거되는 특성을 가지고 있다.
본 발명은 아민기를 지니고 있는 피페라진디에탄올 (piperazinediethanol)을 단량체로 사용하여 양이온성을 지닌 생분해성 고분자 PAOX (poly(amino oxalate))를 제조하는 것에 관한 것이다. 피페라진디에탄올 (piperazinediethanol)에 있는 3차 아민기는 1,4-사이클로헥산디메탄올 (1,4-cyclohexanedimethanol) 및 옥살릴 클로라이드 (oxalyl chloride)만 중합시킨 기존의 폴리옥살레이트(polyoxalate)보다 친수성과 양이온성을 높여 가수분해 속도를 가속화시킬 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 37℃ 온도를 유지한 상태에서 pH 5.5와 pH 7.4 수용액에서의 가수분해로 인한 고분자의 분자량감소를 측정한 결과 pH 7.4에서의 반감기는 약 36시간이었고, pH 5.0에서의 반감기는 약 14시간임을 확인하였다.
상기 PAOX는 옥살릴 클로라이드를 100% 기준으로 1,4-사이클로헥산디메탄올 (1,4-cyclohexanedimethanol) 및 피페라진디에탄올 (piperazinediethanol)의 비율을 달리 하면서 제조할 수 있다. 안정성 측면에서 1,4-사이클로헥산디메탄올 (1,4-cyclohexanedimethanol) 및 피페라진디에탄올 (piperazinediethanol)의 몰비는 80~95:5~20인 것이 미립구를 제조하는데 있어서 바람직하다. 보다 바람직하게 85:15의 몰비인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 PAOX에 유화제를 첨가하고 초음파 분쇄 및 균질화를 통해 제조된 PAOX 미립구를 제공한다.
보다 구체적으로, 상기 PAOX 미립구의 제조는 DCM에 용해된 상기 화학식 1로 표시되는 PAOX를 유화제 용액에 첨가하여 제조될 수 있다. 상기 유화제로는 이에 제한되지 않으나, 폴리 비닐 알콜(poly(vinyl alcohol))인 것이 바람직하다.
상기 미립구는 유/수 단일 유화법 (oil-in-water single emulsion method)에 의해 제조할 수 있다. 보다 구체적으로, 약물을 PAOX 고분자 용액에 첨가하고, 유화제 용액을 첨가하고 초음파 처리를 통해 균질화하여 유/수 에멀젼을 형성한다. 상기 에멀젼에 유화제 용액을 첨가하고 균질화한다. 회전 증발기 (rotary evaporator)를 사용하여 남아있는 용매를 제거하고 원심분리기에 의해 미립구를 수득할 수 있다. 상기 과정을 통해 수득한 PAOX 미립구의 평균 크기는 100nm 내지 1000nm인 것이 바람직하다.
또한, 상기 미립구는 수/유/수 이중 유화법 (water/oil/water double emulsion method)에 의해 제조할 수 있다. 보다 구체적으로, 약물을 PAOX 고분자 용액에 첨가하여 초음파 분쇄 및 균질화를 통해 수/유 에멀젼을 제조한 후, 이를 유화제 용액에 첨가하고 초음파 분쇄 및 균질화를 통해 수/유/수 에멀젼을 제조한다. 회전증발기를 이용하여 용매를 제거하고 미립구를 수득할 수 있다. 상기 과정을 통해 수득한 PAOX 미립구의 평균 크기는 1 내지 10μm 이며, 바람직하게는 약 2μm이다.
상기 PAOX 미립구에 포함되는 약물이 수용성 거대분자, 즉 단백질, 펩타이드, 핵산등일 경우에는 수/유/수 이중 유화법에 의해 제조되는 것이 바람직하며, 상기 미립구에 포함되는 약물이 불용성 화합물일 경우에는 유/수 단일 유화법에 의해 제조되는 것이 바람직하다.
상기 PAOX 미립구는 아민기를 지니고 있기 때문에 양이온성을 가질 뿐만 아니라 빠른 약물 방출을 유도할 수 있다. 또한 양성자 스폰지 (proton sponge) 효과로 인해서 엔도좀으로부터 세포질로 약물을 빠져나오게 함으로서 세포 내에서의 약물 전달 효율을 높일 수 있다. 즉, 피페라진디에탄올에 있는 3차 아민기가 기존의 폴리옥살레이트보다 친수성과 양이온성을 높였을 뿐만 아니라, 세포 내의 약물 전달의 효율을 향상시킴을 알 수 있었다. 본 발명의 일 실시예에서는 세포 실험을 통해 본 발명의 세포막 비투과성 형광물질인 칼세인이 담지된 PAOX 미립구가 칼세인이 엔도좀에서 세포질로 쉽게 빠져나오도록 도와주는 것을 확인하였다. 또한, 본 발명의 또 다른 일 실시예에서는 과산화수소를 억제하는 물질인 카탈레이즈가 담지된 PAOX 미립구가 카탈레이즈가 담지된 PLGA 미립구와 비교했을 때, 같은 시간에 LPS(lipopolysaccharides)로 활성화된 대식세포에서 더 많은 양의 과산화수소를 억제함을 확인하였다. 또한, 본 발명의 또 다른 일 실시예에서는 아세트아미노펜 (ASAP)으로 유도된 급성 간부전 동물모델에서 펜톡시필린이 담지된 PAOX 미립구가 뛰어난 약물전달 능력이 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명은 상기 PAOX 미립구에 약물을 담지시킨 약물전달체를 제공한다.
본 발명에서 용어 “약물전달체”는 장기간 동안 약물의 지속성 방출이 제어 가능한 약물전달체를 의미한다. 본 발명의 약물전달체에는 한 가지 이상의 약물이 봉입될 수 있으며, 약물의 종류와 투여 목적에 맞도록 분해 속도 조절이 자유로우며 효율적인 약물방출 제어에 효율적이다. 제조된 약물전달체의 약물봉입률, 물리화학적 물성, 약효 및 안정성, 고분자 재료의 분해능 및 형상 조건에 따른 성능데이터 등을 평가 및 비교하여 전달체 특성을 효과적으로 제어 및 개선시킬 수 있다. 본 발명의 약물전달체에 담지된 약물은 세포 내에서 확산, 용해, 삼투압 또는 이온교환 등에 의하여 방출될 수 있다.
약물전달체에 의해 운반될 수 있는 약물은 질병의 예방, 치료, 완화 또는 경감을 위해 사용되는 모든 생물학적, 화학적 물질을 포함한다. 보다 구제적으로, 상기 약물은 단백질, 펩타이드, 화합물, 추출물, 핵산 (DNA, RNA, 올리코뉴클레오티드, 벡터) 등의 다양한 형태를 포함하며, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 사용될 수 있는 약물은 특정 약제나 분류에 의해 제한되지 않으며, 예를 들어, 항산화제, 항생제, 항암제, 소염진통제, 항염증제, 항바이러스제, 항균제, 호르몬 등 일 수 있다. 약제에는 희석제, 방출 지연제, 비활성 오일, 결합제 등의 당 기술 분야의 다양한 부형제가 선택적으로 혼합될 수 있다. 상기 단백질 약물의 일례로 슈퍼옥사이드(superoxide), 카탈레이즈(catalase) 또는 글루타티온(glutathione) 등이 포함될 수 있으며, 상기 화합물 약물의 일례로 펜톡시필린 (pentoxifyline), 덱사메타존 (dexamethasone), 이부프로펜 (Ibuprofen), 나프록센 (Naproxen), 인도메타신 (Indomethacin), 셀레콕시브 (Celecoxib), 프록시캠 (Proxicam), 디클로페낙 (Diclofenac), 토코페롤 (Tocopherol), 토코트리에놀 (Tocotrienol), 레스베라톨 (Resveratol), 아스코르빈산 (Ascobic acid), 리코펜 (lycopene) 또는 나린제닌 (naringenin) 등이 포함될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 약물전달체는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 적절한 방법으로 투여될 수 있다. 본 발명의 약물전달체는 통상의 방법에 따라 경구형 제형 또는 멸균 주사용액 등의 형태로 다양하게 제형화할 수 있으며, 고체의 미립구 분말로 제조할 수 있어, 흡입형 약물전달체로도 이용가능하다.
본 발명의 약물전달체가 이용될 수 있는 질병에는 이에 제한되지는 않으나, 급성 간부전, 급성 폐렴 등을 포함하는 급성 염증성 질환일 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 상세히 설명하도록 한다. 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 일 예에 지나지 않으며, 이에 의하여 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
< 실시예 1. 재료 및 방법>
1. PAOX 고분자 합성
1,4-사이클로헥산디메탄올 (13.34 mmol) 및 피페라진디에탄올 (2.35 mmol)을 질소 하에서 30 mL의 DCM(dry dichloromethane)에 용해하고, 4℃에서 피리딘 (pyridine, 37.0 mmol)을 한 방울씩 첨가하였다. 이 후, 5 mL의 dry DCM 내의 옥살릴 클로라이드 (15.7 mmol)를 4℃에서 혼합물에 한 방울씩 첨가하였다. 반응은 질소 하에서 실온에서 6시간 동안 계속되었고, 염수 용액으로 반응을 종결하고 여기에 추가적으로 DCM을 첨가함으로서 생기는 층 분리 현상을 이용하여 추출하였다. 모아진 유기 층을 무수의 Na2SO4로 건조하고 진공 하에 농축하였다. 수득된 고분자는 차가운 헥산 (수율>70%)으로 침전에 의해 분리되었다. 분자량은 폴리스티렌을 표준으로 사용하여 겔 투과 크로마토그래피 (GPC, Futecs,Korea)에 의해 측정되었다. 고분자의 화학적 구조는 400 MHz 1H NMR spectrometer (JNM-EX400, JEOL)에 의해 밝혀졌다 (1H NMR in deuterated chloroform on a 400MHz spectrometer: 4.1-4.5 (m,CH2OCO), 2.9-3.0(m,NCH2CH2NCH2CH2), 1.8-2.0(m,CH2CH), 1.4-1.6(m,CH2CH2CHCH2CH2CH), 1.0-1.1(m,CH2CH2CHCH2CH2CH)).
2. PAOX 미립구의 제조 및 특성
약물이 담지된 PAOX 미립구는 수/유/수 이중 유화법 (water/oil/water double emulsion method)에 의해 제조되었다. 100 mL 탈이온수 내의 10 mg의 단백질 (BSA-FITC or catalase)을 150 mg의 PAOX를 함유한 1 mL의 DCM에 첨가하고, 30초 동안 초음파 분해 (Fisher Scientific, Sonic Dismembrator 500)하고, 1분 동안 균질화 (PRO Scientific, PRO 200) 하였다. 제조된 w/o 에멀젼에 10 mL의 8% (w/w) 수용성 PVA (polyvinyl alcohol) 용액을 첨가하고 혼합물을 1분 동안 균질화 하였다. 생성된 w/o/w 에멀젼을 용매를 증발시키기 위해 상온에서 3시간 동안 교반하였다. 4℃에서 5분 동안 11,000×g로 원심분리에 의해 PAOX 미립구를 수득하였고 회수된 펠릿을 동결건조하였다. 1 mg의 PAOX 미립구에 ~45 mg의 BSA-FITC를 캡슐에 넣었고 PAOX 미립구의 단백질 포접율은 >70% 이었다. PAOX 미립구의 약물 포접률은 약물의 용해도에 따라 달라질 수 있으며, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
empty PAOX 미립구는 유/수 단일 유화법 (oil-in-water single emulsion method)에 의해 제조되었다. 500 mL의 DCM에 용해된 50 mg의 PAOX 고분자를 5 mL의 10 (w/v)% PVA 용액에 첨가하였다. 상기 혼합물을 30초 동안 초음파 분쇄하고, 1 분 동안 고운 o/w 에멀젼을 형성하기 위해 균질화하였다.상기 에멀젼에 20 mL의 1 (w/w)% PVA 용액을 첨가하고 1분 동안 균질화 하였다. 이 후 원심분리 및 동결건조에 의해 PAOX 미립구를 수득하였다. 수득된 PAOX 미립구의 SEM 이미지를 주사전자현미경 (S-3000N, Hitachi)을 사용하여 확인하였다. PBS에서 PAOX 미립구 부유물의 크기는 동적 광산란에 의해 측정하였고, 표면 전위는 미립구 크기 측정기 (ELS-8000, Photal Otsuka Electronics, Japan)를 사용하여 측정하였다.
3. PAOX의 가수 분해 반응 속도론
PAOX 고분자를 고운 미립구로 하여 37℃에서 약한 기계적 교반 하에서 PBS (phosphate buffer solution, pH 7.4, 100 mM)에 넣었다. 수화된 고분자를 특정한 시간에서 모은 후, 동결건조하였다. 분자량을 가수분해 속도를 계산하기 위해 GPC를 사용함으로써 측정하였다.
4. PAOX 미립구의 세포독성
PAOX 미립구의 세포독성은 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 분석을 이용하여 조사하였다. RAW 264.7 대식 세포를 24 웰 플레이트 내에 1x106cells/well 농도로 이식하였고, ~ 90% 단층에 도달할 때까지 배양하였다. 상기 세포를 다양한 농도의 미립구 (10 mg/mL to 100 mg/mL)로 처리하고, 1 또는 2일간 배양하였다. 각각의 웰에 100 mL의 MTT 용액을 처리하고 4시간 동안 배양하였다. 200㎕의 디메틸설폭사이드를 포르마잔 결정체를 용해시키기 위해 세포에 첨가하였다. 배양 10분 후, 570 nm에서 흡광도를 마이크로 플레이트 리더 (Thermolex, Molecular Device Co.)를 이용하여 측정하였다. 미립구가 처리된 세포의 흡광도를 대조군과 비교함으로써 세포의 생존율을 측정하였다.
5. 공 초점 레이저 주사 현미경
RAW 264.7 세포를 100 μL의 BSA-FITC가 담지된 PAOX 미립구 부유물 (1mg/mL in PBS)로 30분 동안 처리하였다. 배지를 포함한 미립구들을 제거하고, 세포를 새 배지로 두 번 세척하였다. PAOX 미립구가 세포 내로 이입되고 BSA-FITC가 세포질로 전달되는 과정을 공 초점 레이저 주사 현미경 (Carl Zeiss, Inc.)을 사용하여 2, 4 및 20 시간 후에 관찰하였다.
또한 엔도좀의 안정성에 대한 PAOX 미립구의 영향을 조사하기 위해서 단백질이 담지되지 않은 PAOX 미립구의 섭취 (particle uptake), 칼세인 (calcein), 세포막 비투과성 형광물질을 추적자로서 사용하였다. 세포를 30분 동안 30 μg의 칼세인으로 처리하고, 새 배지로 교환하였다. 그 다음에, 세포를 30분 동안 100 μg의 empty PAOX 또는 POX 미립구로 처리하고 배양하였다. 배지를 함유한 미립구를 제거하고, 세포를 새 배지로 세척하였다. 형광 이미지를 1 및 3시간 후에 측정하였다.
6. BSA-FITC 방출 속도
10 mg의 BSA-FITC를 담지한 PAOX 미립구를 5 mL의 PBS (pH 7.4)를 함유한 테스트 튜브에 두었다. 튜브를 계속적으로 흔들고 37℃에서 배양하였다. 1 분 동안 5000×g에서 원심분리 하였다. 2 mL의 상등액의 aliquot를 취해서 같은 부피의 fresh PBS로 대체하였다. 상등액 내의 BSA-FITC의 농도는 형광분광광도계 (Jasco, FP6000, Japan)를 사용하여 측정하였고, 방출 속도는 BSA-FITC 표준 용액의 농도를 비교하여 측정하였다.
7. 세포로의 약물 전달 확인
7-1. 카탈레이즈
PAOX 미립구의 세포질로 단백질 약물을 전달하는 능력을 확인하기 위해서 모델 단백질 약물로 카탈레이즈 (catalase)를 사용하였다. RAW 264.7 세포 (1x106cells)를 12시간 동안 카탈레이즈, 카탈레이즈가 담지된 PAOX 미립구, 카탈레이즈가 담지된 PLGA 미립구 또는 카탈레이즈가 담지되지 않은 PAOX 미립구로 사전처리 하고, 1 μg의 PMA (phorbol-12-myristate-13-acetate)를 이용하여 세포를 활성화시켜 과산화수소 생성을 유도하였다. PMA은 과산화수소를 포함하여 활성 산소 종의 생성을 위한 세포를 자극하기 위해 사용하였다. 다음으로 DCFH-DA (dichlorofluorescin-diacetate)를 각각의 웰에 첨가하고, 30분 동안 배양하였다. DCFH-DA에서 생성되는 형광의 세기를 유세포 분석기 (BectonDickinson, US)로 측정하여 세포질로 카탈레이즈를 전달하는 PAOX 미립구의 효율을 분석하였다.
7-2. 펜톡시필린 (pentoxifylline)
모델 화합물 약물로 펜톡시필린을 사용하였다. 먼저, PAOX 100 ㎎과 펜톡시필린 10 ㎎을 다이클로로메탄(dichloromethane) 1㎖에 완전히 용해한 후, PVA 5%와 PVA 1%를 사용하여 단일 유화법으로 펜톡시필린이 포접된 PAOX 미립구를 제조하였다. 대조군으로 펜톡시필린이 포접된 PLGA 미립구를 이용하였다.
8. 생물학적 분배 (biodistribution) 측정
PAOX 미립구의 약물전달체로서의 기능을 확인하기 위하여 생물학적 분배 (biodistribution)를 측정하였다. PAOX 고분자 100 ㎎과 형광물질인 Rubrene 5 ㎎을 이용하였으며, PVA 5%와 PVA 1%를 이용하여 단일 유화법으로 PAOX 미립구를 제조하였다. 상기 PAOX 미립구 10 ㎎을 1 ml의 멸균된 PBS에 분산시켜 200 μL를 마우스 꼬리 정맥을 통하여 주사하였고, 정확한 생채 내 분포를 관찰하기 위해 주사 2시간 후 심장, 폐, 간, 비장, 신장을 적출하여 확인하였다.
9. 급성 간부전 동물모델에서 약물전달능력 평가
PAOX 고분자는 빠른 가수분해 속도와 양성자 스폰지 효과로 세포질 내로 약물을 빨리 전달하여 빠른 치료를 유도할 것이라는 가정하에 마우스 급성 간부전 (acute Liver Failure(ALF)) 모델을 실험 모델로, 펜톡시필린 (PEN)을 모델 약물로 이용하였다.
급성 간부전 발생의 발생 요인은 여러 가지가 알려져 있지만, 최근 부각되고 있는 것은 해열진통제인 아세트아미노펜 (APAP, acetaminophen)이 주성분인 타이레놀의 과다복용으로, 이는 미국과 영국 등 유럽의 ALF의 발생원인 중 50% 이상을 차지하고 있다. 간부전은 각 장기의 부전으로 이어지고, 심한 경우 사망에 이르는 질환이다. 또한, 모델 약물로 사용된 펜톡시필린은 허혈성 간질환에 사용되는 약물이다.
실시예 7과 같은 방법으로 제조된 PAOX-PEN 미립구의 세포 독성을 확인하기 위하여, MTT assay(Tetrzolium-based colorimetric)를 실시하였으며, PAOX-PEN 미립구의 약물 로딩 양과 일일 복용량을 고려하여 PAOX-PEN 미립구의 효과를 평가하기 위한 방법으로, 간 기능 평가에 주로 사용되는 시험법인 ALT (alanine transaminase) assay를 실시하였다.
실험을 위해 6 주령 balb/c female mouse를 이용하였으며, 각 군을 설정하였다. PAOX-PEN 미립구의 경우 10㎎/1㎖ (PBS)에 분산시켜 각각 50 ㎕, 100 ㎕, 200 ㎕를 마우스의 꼬리정맥을 통하여 주사하였으며, free PEN의 경우 복용량을 계산하여 투여하였고, 음성대조군에는 PBS 만을 투여하였다. 1 시간 후, 25㎎/1㎖ 농도의 APAP 200 ㎕ 를 복강주사로 주입하여 급성 간부전을 유도하였다. 10 시간 후, 마우스를 희생시켜 혈액을 심장에서 채혈하였다. 상기 혈액을 적정 시간 동안 배양하고, 원심분리를 통해 상층에 있는 혈장만을 가지고, ALT assay를 실시하였다. 또한, 마우스에서 간을 적출하여 H&E (hematoxylin & eosin) 및 TUNEL 염색을 수행하였다.
< 실시예 2. 결과>
1. PAOX의 합성 및 특성
PAOX는 하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이, 옥살릴 클로라이드 및 두 개의 디올, 사이클로헥산디메탄올 및 피페라진디에탄올 사이의 한 단계 축합 반응에 의해서 중합되었다. PAOX 내의 피페라진디에탄올 (15 mol %)의 양은 수성 조건 하에서 분해 속도 및 안정성을 고려하여 선택하였다. 수득된 PAOX 고분자는 고 진공 하에서 건조된 후 엷은 노란색을 띄었다. 하기 반응식 1은 양이온성 PAOX의 합성 반응이다.
[반응식 1]
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PAOX의 화학적 구조는 1H NMR (도 1)에 의해 확립되었다. 1,4-사이클로헥산디메탄올은 3.5 ppm에 히드록실 그룹 옆의 메틸렌 양자를 가지고 있고, 피페라진디에탄올의 히드록실 그룹 옆의 메틸렌 양자는 3.6 ppm에서 나타난다. ~ 4.2 ppm에서의 큰 피크는 페록사레이트 이스터 결합에 근접한 메틸렌 양자와 일치하고 피페라진의 양자는 ~ 3.0 ppm에서 나타나고, 이는 PAOX의 성공적인 중합을 나타낸다. 상기 반응으로부터 획득한 PAOX의 다분산 지수는 1.8 이였으며 분자량은 ~12000이었다. 잘게 분쇄된 PAOX를 엔도좀과 세포질의 환경인 pH 5.5와 7.4에서 배양하며 시간경과에 따른 분자량 변화를 조사하여 가수분해 속도를 측정하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, PAOX는 pH 7.4에서 보다 pH 5.5에서 가수분해 속도가 더 빨랐고, PAOX의 가수분해 반감기는 pH 7.4에서 36시간 및 pH 5.5에서 ~14시간으로 나타났다.
2. PAOX 미립구의 특성
단일 유화법에 의해 형성된 PAOX 미립구는 평탄한 표면 및 ~450 nm의 평균 지름을 가진 둥근 구형이었다 (도 3). 또한, 이중 유화법에 의해 > 70%의 양호한 수득율을 가진 PAOX 미립구의 형성이 가능하였으며, 이는 미립구 내에 단백질이 캡슐화 되도록 하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 이중 유화법에 의해 형성된 BSA-FITC가 담지된 PAOX 미립구는 평탄한 표면을 가진 구형이었으며 다분산성을 띄었다. BSA-FITC가 담지된 PAOX 미립구는 ~1.7 μm의 평균 직경을 가졌다 (도 5). 특히, 단백질이 담지된 PAOX 미립구는 대식세포의 식균 작용에 의해 세포로 이입되므로 약물 전달체로 응용 가능하다.
도 6 및 도 7은 단백질이 담지된 PAOX 미립구의 표면 전위를 pH의 함수로 나타낸 것이다. PAOX는 중성 pH에서 약간의 양전하를 나타내었고, 표면 전위는 pH가 감소함에 따라 증가하였다. 엔도소말 pH에서는 미립구의 표면 전위는 약 + 8mV 이었다. PAOX의 증가된 양전하는 피페라진디에탄올 내의 아미노 그룹의 양자화(protonation) 때문일 수 있다.
약물 전달 시스템의 구현을 위한 중요한 관심사 중에 하나는 세포독성으로, PAOX 미립구의 생체적합성을 평가하였다. RAW 264.7 세포를 다양한 농도의 PAOX 미립구 하에서 1일 또는 2일 동안 배양한 후, 생존율을 측정하였다 (도 7). 실험 결과, 100 μg의 PAOX 미립구로 처리된 세포를 2일 후에 관찰하였을 때 세포 생존력이 약간 감소하였으나, 일반적으로 PAOX 미립구는 우수한 세포 독성 프로파일을 나타내었다. 따라서 본 발명의 PAOX 미립구는 우수한 생체적합성을 가지며 15 mol% 피페라진디에탄올의 융합은 생체적합성에 영향을 주지 않는 것을 확인하였다.
3. 시험관 내 약물 방출
본 발명의 양이온성 PAOX 미립구가 급성 염증 질환의 치료를 위한 적정한 약물 방출의 프로파일을 가졌는지 확인을 위해서 BSA-FITC를 모델 단백질로 사용함으로써 PAOX 미립구의 방출 속도를 측정하였다 (도 8). PAOX 미립구는 BSA-FITC의 방출거동에 있어서 처음 24시간 이후에서 80% 정도의 급방출(initial burst)을 나타내었다. 초기 급방출은 표면에서 느슨하게 흡착되거나 미립구 내에서 약하게 포획된 단백질에 기인한 것이라고도 할 수 있다. 초기 급방출 이후에 방출거동은 지속적이고 느렸다. PAOX 미립구의 단백질 방출속도를 BSA-FITC-담지된 POX 미립구와 비교하였다. POX 및 PAOX 미립구는 단백질 방출 패턴과 유사한 것으로 나타났으나, PAOX는 POX보다 더 빠른 단백질 방출 프로파일을 나타내었다. 이와 같은 PAOX 미립구의 단백질 방출 속도는 주로 주사슬 내의 3차 아민 그룹에 의한 것이고, 이는 친수성 성질을 가진 고분자를 제공하고 고분자의 분해를 가속시킨다.
4. 세포의 활용 및 세포 내 전달
본 발명의 PAOX의 양이온성이 세포로 이입되는 과정을 용이하게 하는지 여부를 입증하기 위해, BSA-FITC 담지된 PAOX 미립구의 내재화를 공초점 레이저 주사현미경을 사용하여 조사하였다. 도 9는 다양한 시점에서 BSA-FITC 담지된 PAOX 미립구 또는 BSA-FITC 담지된 POX 미립구로 배양된 RAW 264.7 세포의 발광 이미지를 도시한 것이다. 배양 2시간 뒤, 세포에 의한 식균 작용 및 엔도솜의 내재화를 나타내는 녹색 발광이 세포의 주위에 관찰되었다. PAOX 미립구는 POX 미립구보다 더 많은 녹색 발광을 나타내었으며, 이는 PAOX 미립구의 증진된 세포 내 이입을 암시한다. 녹색 발광은 세포질 내로 확산되었으며, 시간에 따라 그 강도가 증진되었고, 이는 PAOX 미립구에 담지된 BSA-FITC가 세포질로 전달되고 있음을 암시한다. POX 미립구에 의해 전달된 FITC-BSA는 배양 20시간 뒤에 약해짐을 나타냈으나, PAOX 미립구에 의해 전달된 FITC-BSA와 함께 훨씬 더 밝은 녹색 발광이 관찰되었으며, 이는 PAOX 미립구에 의한 단백질의 효율적인 방어를 나타내고 있음을 암시한다. 상기 결과를 통하여 PAOX 내의 3차 아민 그룹의 존재가 세포 내로의 이입 및 단백질의 엔도좀의 탈출을 용이하게 하여서 단백질의 세포질 내로 전달을 촉진한다는 것을 확인하였다.
본 발명의 양이온성 PAOX 미립구에 의한 엔도좀으로부터의 전달된 약물의 효율적인 탈출을 더 확인하기 위해, 세포막 비투과성 칼세인이 사용되었으며, 그 분포가 시각화되었다. 도 10에 나타낸 바와 같이, 칼세인만으로 처리된 세포는 세포막 주위에서 약한 세기의 형광의 분포를 나타내었으며, 이는 엔도솜 또는 세포 주위의 엔도소말 구획 내에 칼세인이 내재되었음을 나타낸다. 그러나 POX 미립구의 처리 후에, 내재된 칼세인은 엔도솜으로부터 분산되며, 녹색 발광은 배양한 지 3시간 후에 세포질 내에서 관찰되었다. 이는 POX 미립구가 엔도솜으로부터 약간은 칼세인의 탈출을 돕는다는 것을 나타낸다. 반면 PAOX 미립구의 첨가는 엔도솜으로부터의 칼세인의 탈출을 훨씬 더 용이하게 만들었다. 칼세인은 세포질 내에서 분산되며, 그 강도는 PAOX 미립구 첨가 3시간 후에 증가되었다. 상기 결과를 통하여 본 발명의 PAOX의 양이온성이 단백질 약물의 엔도좀 탈출을 촉진하고 세포질로의 전달을 용이하게 한다는 것을 확인하였다.
5. 세포로의 약물 전달.
5-1. 카탈레이즈 전달.
도 11은 PMA-자극된 세포에서 과산화수소의 생성에 대한 카탈레이즈의 영향을 증명하는 유세포 분석의 결과를 나타낸 것이다. PMA-자극된 세포에서는 DCFH-DA가 과산화수소에 의해 산화됨으로써 강한 형광성을 보였다. 반면 카탈레이즈 또는 빈 PAOX 미립구로 사전 처리한 세포는 PMA-유도된 형광에 있어서 거의 억제하는 효과가 없었으며, PLGA 미립구에 의해 전달된 카탈레이즈는 PMA-유도된 형광에 있어서 약간 억제하는 효과를 보였다. 그러나 100 μg의 카탈레이즈가 담지된 PAOX 미립구로 처리된 군에서는 PMA-유도된 형광을 상당히 감소시켰으며, 이를 통해 본 발명의 PAOX 미립구의 단백질 약물전달체로서의 뛰어난 기능을 확인하였다.
5-2. 펜톡시필린 전달.
도 12 및 13에 펜톡시필린 미립구의 표면 및 크기를 확인한 결과를 나타내었다. 도 12는 펜톡시필린을 로딩시킨 PAOX 미립구의 표면을 SEM (scanning electron microscope)으로 관찰한 결과이며, 이를 통해 표면이 매끄러운 구 형태를 나타내고 있음을 확인하였고, 육안으로 관찰하여도 ㎛이하의 사이즈를 나타냄을 확인하였다. 도 13은 광산란법으로 펜톡시필린을 로딩시킨 PAOX 미립구의 사이즈를 측정한 결과이며, 이를 통해 약 100㎚에서 1000 ㎚ 입자 크기를 나타냄을 확인하였다.
또한, 펜톡시필린이 포접된 PLGA와 PAOX 미립구에서 약물의 방출속도를 비교한 결과, PLGA와 PAOX 모두 초기속방출 (initial burst) 거동을 보이고 전반적인 방출거동은 유사하지만 PAOX 미립구가 PLGA 미립구보다 더 빠른 방출속도를 보임을 확인하였다 (도 14). 이를 통해 본 발명의 PAOX 미립구의 빠른 약효를 요구하는 질병의 약물전달체로서의 뛰어난 기능을 확인하였다.
6. 생물학적 분배 (biodistribution) 측정
PAOX 미립구의 생채 내 분포를 확인하기 위하여, 심장, 폐, 간, 비장, 신장등 적출해낸 각 장기를 각 군 별 (조직 별)로 정렬한 후에 IVIS imaging system을 통하여 형광세기를 측정하였다. 실험 결과 도 15에 나타낸 바와 같이, 간에서 가장 높은 강도를 띄는 것으로 보아 간에 가장 많이 PAOX 미립구가 모인 것을 알 수 있었다.
또한, 상기 형광 영상으로 나타낸 결과를 정량화하기 위하여, 수치상으로 나타낸 그래프를 통해 확인하였다. 각 장기의 무게를 측정한 후, 각 장기의 조직을 Triton-X 100과 PBS를 4:1의 비율로 혼합한 용액에 그 무게에 따라 섞어주고, 균질화하였다. 원심 분리 후 상층 액을 분리하여 PL(Photoluminescence)을 측정하였다. 실험 결과 도 16에 나타낸 바와 같이, 간에서 가장 높은 형광 수치를 보였으며, 다음으로 폐와 비장에서 높은 수치를 나타내고 있음을 확인하였다. 상기 실험을 통하여 PAOX 미립구는 간에서 가장 많이 축적되므로 본 발명의 PAOX 미립구를 급성 간부전 치료 약물전달에 적용할 경우, 높은 효율을 나타낼 수 있을 것으로 판단하였다.
7. 급성 간부전 동물모델에서 약물전달 능력 평가
펜톡시필린이 포접된 PAOX 미립구 (PAOX-PEN)의 세포 독성을 확인한 결과, PAOX 미립구 (PAOX-PEN) 1000 μg을 24웰 세포배양 플레이트에 넣어 준 후 40시간 동안 배양한 후에도 약 80%의 세포 생존률을 나타냄을 확인하였다 (도 17). 이는 기존에 약물 전달체로 사용되는 PLGA 미립구와 유사한 것이며, 이를 통해 본 발명의 PAOX-PEN 미립구는 세포 및 생체안정성이 우수함을 확인하였다.
또한, PAOX-PEN 미립구의 치료 효과를 확인하기 위한 ALT assay 결과를 도 18에 나타내었다. PAOX-PEN 미립구 0.5㎎ 처리군에서는 미비한 ALT 감소효과를 나타냈으나, PAOX-PEN 미립구 1㎎ 처리군은 APAP만을 처리했을 경우보다 절반이 감소한 수치를 보였으며, PAOX-PEN 미립구 2㎎ 처리군에서는 PBS만을 처리한 대조군과 비슷한 수치로 회복이 된 것을 확인하였다. PAOX-PEN 미립구 2㎎ 처리군에 포접된 양인 10ug의 free PEN와 PLGA-PEN 미립구 2㎎ 처리군에서는 ALT 감소효과가 나타나지 않았다. 상기 결과는 PAOX 미립구의 수동적인 간 표적 능력과 빠른 분해 및 빠른 방출속도에 기인하는 것으로 판단되었다.
또한, 실험 동물에서 적출한 간의 H&E (hematoxylin & eosin) 조직염색사진을 분석한 결과, APAP로 간부전이 일어난 그룹에서는 neutrophil 등의 염증세포가 많이 간으로 이동하였고 stellate와 kupffer 세포의 괴멸 및 사멸이 일어남을 확인하였다 (도 19). 그러나 PAOX-PEN 미립구 2㎎ 처리군에서는 간 손상이 현저히 완화됨을 확인할 수 있으며, 대조군인 empty PAOX 는 전혀 효과가 없었다.
상기 실험 결과를 TUNEL 염색을 통해 다시 한번 확인하였다. 도 20에 나타낸 바와 같이, APAP로 간부전이 일어난 그룹에서는 stellate와 kupffer 세포의 사멸(apoptosis)이 일어남을 확인하였으며, PAOX-PEN 미립구 2㎎ 처리군에서는 현저히 세포사멸이 억제되었다.
종합적인 실험 결과를 통하여, PAOX 미립구는 약물전달체로서 뛰어난 기능을 가지고 있음을 확인하였다.

Claims (12)

  1. 하기 화학식 1의 구조를 갖는 PAOX (poly(amino oxalate), 폴리(아미노 옥살
    레이트)).
    [화학식 1]
    Figure 112012008567328-pat00004

    상기 화학식 1에서, n은 18~70의 정수이며, X:Y의 몰비는 80~95:5~20 이다.
  2. 1,4-사이클로헥산디메탄올 (1,4-cyclohexanedimethanol), 옥살릴 클로라이드(oxalyl chloride) 및 피페라진디에탄올 (piperazinediethanol)을 중합시키는 것을 특징으로 하는 하기 화학식 1로 표시되는 PAOX의 제조방법.
    [화학식 1]
    Figure 112012008567328-pat00005

    상기 화학식 1에서, n은 18~70의 정수이며, X:Y의 몰비는 80~95:5~20 이다.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 1,4-사이클로헥산디메탄올과 피페라진디에탄올의 몰비는 80~95:5~20인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항의 PAOX에 유화제를 첨가하고, 초음파 분쇄 및 균질화를 통해 제조되는 PAOX 미립구.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 유화제는 폴리비닐알콜인 것을 특징으로 하는 PAOX 미립구.
  6. 제 4항에 있어서,
    상기 미립구의 평균 크기는 100nm 내지 10μm인 것을 특징으로 하는 PAOX 미립구.
  7. 제 4항에 따른 미립구에 약물을 담지시킨 약물전달체.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 약물은 단백질, 화합물, 핵산 및 추출물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 약물전달체.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 단백질은 카탈레이즈, 슈퍼옥사이드 및 글루타티온으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 약물전달체.
  10. 제 8항에 있어서,
    상기 화합물은 펜톡시필린 (pentoxifyline), 덱사메타존 (dexamethasone), 이부프로펜(Ibuprofen), 나프록센 (Naproxen), 인도메타신 (Indomethacin), 셀레콕시브 (Celecoxib), 프록시캠 (Proxicam), 디클로페낙 (Diclofenac), 토코페롤 (Tocopherol), 토코트리에놀 (Tocotrienol), 레스베라톨 (Resveratol), 아스코르빈산 (Ascobic acid), 리코펜 (lycopene) 및 나린제닌 (naringenin)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 약물전달체.
  11. 제 7항에 있어서,
    상기 약물전달체는 급성 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약물전달체인 것을 특징으로 하는 약물전달체.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 급성 염증성 질환은 급성 간부전 또는 급성 폐렴인 것을 특징으로 하는 약물전달체.
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