KR101280232B1 - 4중 코팅 유산균의 제조방법 및 그 방법으로 제조된 4중 코팅 유산균 - Google Patents

4중 코팅 유산균의 제조방법 및 그 방법으로 제조된 4중 코팅 유산균 Download PDF

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Abstract

본 발명은 4중 코팅된 유산균의 제조방법, 그 방법으로 제조된 4중 코팅된 유산균을 제공한다. 본 발명의 방법으로 코팅된 유산균은 유산균에 수용성 폴리머, 히알루론산, 다공성 입자를 가지는 코팅제, 단백질을 혼합하여 4중 코팅함으로써, 종래 비코팅, 단일, 2중, 3중코팅 유산균군에 비하여 내산성 및 내담즙성이 우수하고, 저온 또는 고온으로 인한 사멸율이 낮으므로, 유산균 본래의 생리활성 기능을 소실하지 않을 수 있다. 따라서 본 발명의 코팅 방법은 유산균의 생리활성 기능을 유지할 수 있게 하여 산업적으로 유용한 방법이다.

Description

4중 코팅 유산균의 제조방법 및 그 방법으로 제조된 4중 코팅 유산균 {Method of preparing quadruple-coating lactic acid bacteria and quadruple-coating lactic acid bacteria prepared thereby}
본 발명은 4중 코팅 유산균의 제조방법, 그 방법으로 제조된 4중 코팅 유산균에 관한 것이다. 보다 상세하게는 본 발명은 수용성 폴리머, 히알루론산, 다공성 입자를 가지는 코팅제, 단백질로 4중 코팅된 유산균의 제조방법, 상기 방법으로 제조된 4중 코팅된 유산균에 관한 것이다.
유산균(lactic acid bacteria)은 락트산 균 또는 젖산균이라고도 하며, 포유류의 장내에 서식하여 잡균에 의한 이상발효를 방지해 정장제(整腸劑)로도 이용되는 유용한 세균이다. 예를 들어, 불가리아젖산균(L. bulgaricus)은 가장 오래 전부터 알려진 유산균으로, 요구르트의 제조에 사용되며 치즈나 발효 버터 제조시의 스타터로도 사용된다. 또한, 호기성 젖산균(L. acidophilus)은 사람 및 모든 포유류와 그 밖의 동물의 장에 존재하며, 버터 또는 우유의 제조나 장내 자가 중독의 치료에 사용되기도 한다. 한편 락티스 젖산구균(L. lactis)은 DL-젖산을 생성하며, 항상 우유 속에 존재하여 버터 또는 치즈 제조에 사용되고 낙농용 젖산균으로서 가장 중요한 균이다.
상기와 같이 유용한 유산균은 장에 정착하여 장관운동 활성화, 유해균 억제, 비타민 및 면역증강 물질 촉진 등 다양한 생리활성 효과를 발휘하는데, 인체의 구조상 사람이 유산균을 섭취하면 유산균이 위산 또는 담즙 산으로 인해 사멸하여 유산균 본래의 생리활성 기능을 발휘하지 못하게 되는 경우가 많았다.
상기와 같은 문제점을 해결하기 위해, 유산균을 코팅하는 방법이 개발되었는데, 종래 유산균의 코팅 기술로는 캡슐제를 이용한 장용코팅제와 젤라틴, 당류, 껌류 등을 이용한 마이크로캡슐화(microencapsulation) 공정 등이 있었다.
구체적으로 종래 유산균의 코팅 기술은 유산균체의 회수 공정 이후에 코팅제를 투입하는 별도의 코팅공정에 의해 실시되는 것을 특징으로 하였다. 보다 구체적으로 종래 유산균 코팅공정은 유산균 분말에 매우 미세한 구형의 비드(Bead) 형성능이 있는 수용액상의 코팅제 조성물이 가해지고, 교반 및 혼합 후 동결 건조하는 것을 특징으로 하였다.
상기의 종래 유산균의 코팅 기술은 통상의 방법으로 배양된 유산균체를 회수하고 건조시켜 분말화한 다음, 코팅제 조성물을 혼합하여 교반하는 공정이 이루어지므로, 고가의 코팅제 및 공정추가에 따르는 비용부담이 발생하며 기타 미생물의 혼입이 우려되므로 무균조작에 어려움이 발생하는 문제점이 지적되었으며, 또한 액상 코팅 후 동결 건조하는 과정에서는 우수한 생존률 및 안정성을 확보하기 위해서 동결보호제 및 안정제의 사용이 필요하므로 재료 또는 공정의 충돌이나 중복이 발생하는 문제점이 있었다.
상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 공기, 수분과의 직접적인 반응이 억제되며 내열성, 내산성 및 내담즙성이 강화되어 생균 안정성 및 가공 안정성이 증강된 3중 코팅 유산균의 제조방법(대한민국 특허출원 제10-2008-10397호)이 개발되었다. 구체적으로 상기 제조방법은 저렴한 단백질 소재를 이용하여 단백질로 단일 코팅된 유산균을 제조한 다음, 잔탄검(xantan gum), 셀룰로즈(cellulose) 또는 리벤(levan)과 같은 다당류를 사용하여 2중 코팅하고, 젤라틴(gelatin), 카세인(casein), 레시틴(lecithin)과 같은 나노입자를 사용하여 3중 코팅하는 것을 특징으로 하였다.
그러나 상기의 개선된 종래 유산균의 코팅 기술 또한 유산균의 표면을 완전히 코팅할 수 없어, 상기의 방법으로 제조된 유산균은 내열성, 내산성 및 내담즙성이 충분히 우수하지 못한 문제점이 여전히 지적되었다.
이에 본 발명자들은 4중 코팅기술 이용하여, 내열성, 내산성 및 내담즙성이 우수한 수용성 폴리머, 히알루론산, 다공성 입자를 가지는 코팅제, 단백질로 4중 코팅된 유산균의 제조방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은
((a) 유산균에 수용성 폴리머를 혼합하여 1차 코팅하는 단계;
(b) 상기 (a)단계에서 1차 코팅된 유산균에 히알루론산을 혼합하여 2차 코팅하는 단계;
(c) 상기 (b)단계에서 2차 코팅된 유산균에 다공성 입자를 가지는 코팅제를 혼합하여 3차 코팅하는 단계; 및
(d) 상기 (c)단계에서 3차 코팅된 유산균에 단백질을 혼합하여 4차 코팅하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 4차 코팅된 유산균의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기의 제조 방법으로 제조된 4중 코팅된 유산균을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 4중 코팅된 유산균 제조방법은
(a) 유산균에 수용성 폴리머를 혼합하여 1차 코팅하는 단계;
(b) 상기 (a)단계에서 1차 코팅된 유산균에 히알루론산을 혼합하여 2차 코팅하는 단계;
(c) 상기 (b)단계에서 2차 코팅된 유산균에 다공성 입자를 가지는 코팅제를 혼합하여 3차 코팅하는 단계; 및
(d) 상기 (c)단계에서 3차 코팅된 유산균에 단백질을 혼합하여 4차 코팅하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
(a) 유산균에 수용성 폴리머를 혼합하여 1차 코팅하는 단계:
상기 수용성 폴리머는 유산균 표면 접합력이 우수하여 코팅시 외부공기의 유입을 차단하고 2차 코팅제인 히알루론산과의 결합력이 우수한 바인더(binder)로 역할을 하는 것이 적합하다. 유산균의 대부분이 혐기성균(anaerobe)이므로 기체 차단성이 우수하며 식품 및 의약품용도로 사용할 수 있는 기제가 바람직하다. 구체적으로 본 발명의 균체 박막코팅제로 사용된 수용성 폴리머는 이에 한정되지는 않지만 카르복시메틸셀룰로오스(carboxymethyl cellulose,CMC), 하이드록시에틸셀룰로오스(hydroxyethylcellulose,HEC), 잔탄검(xanthan gum, XG), 구아검(guar gum,GG), 폴리비닐피롤리돈 (polyvinylpyrroridone, PVP), 카보폴(carbopol), 소듐알기네이트(sodium alginate), 프로필렌 글리콜 알기네이트(propylene glycol alginate)으로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 카르복시메틸셀룰로오스(carboxymethyl cellulose,CMC), 하이드록시에틸셀룰로오스(hydroxyethylcellulose,HEC), 잔탄검(xanthan gum, XG), 구아검(guar gum,GG), 폴리비닐피롤리돈 (polyvinylpyrroridone, PVP) 또는 카보폴(carbopol)이며, 바람직하게는 카르복시메틸셀룰로오스(carboxymethyl cellulose,CMC), 하이드록시에틸셀룰로오스(hydroxyethylcellulose,HEC), 잔탄검(xanthan gum, XG), 구아검(guar gum,GG), 폴리비닐피롤리돈 (polyvinylpyrroridone, PVP) 또는 카보폴(carbopol), 가장 바람직하게는 폴리비닐피롤리돈 (polyvinylpyrroridone, PVP)이다.
또한 상기 유산균은 이에 한정되지는 않지만 락토바실루스 속(Lactobacillus sp.), 비피도박테리움 속(Bifidobacterium sp.), 스트렙토코커스 속(Streptococcus sp.), 락토코커스 속(Lactococcus sp.), 엔테로코커스 속(Enterococcus sp.), 페디오코커스 속(Pediococcus sp.), 류코노스톡 속(Leuconostoc sp.), 바이셀라 속(Weissella sp.)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유산균이며, 바람직하게는 Lactobacillus acidophilus IDCC 3302, Lactobacillus bulgaricus , Lactobacillus casei , Lactobacillus fermentum, Lactobacillus gasseri , Lactobacillus helveticus , Lactobacillus rhamnosus , Lactobacillus johnsonii , Lactobacillus plantrum , Lactobacillus reuteri , Bifidobacterium bifidum , Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis , Bifidobacterium lactis , Bifidobacterium longum , Streptococcus faecalis, Streptococcus faecium , Lactococcus lactis subsp. lactis, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Pediococcus acidolacticii Pediococcus pentosaceus, Leuconostoc carnosum, Leuconostoc citreum, Leuconostoc gasicomitatum, Leuconostoc gellidum, Leuconostoc inhae, Leuconostoc kimchii, Leuconostoc lactis, Leuconostoc mesenteroides subsp.mesenteroides, Leuconostoc paramesenteroides, Weissella cibaria, Weissella confusa, Weissella koreensis, Weissella soli, Weissella viridescens로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유산균, 더 바람직하게는 Lactobacillus acidophilus IDCC 3302이다.
상기 수용성 폴리머는 유산균 배양액 100중량부 대비 0.1 중량부 내지 10 중량부의 비율로 혼합하여 1차 코팅한다. 바람직하게는 유산균 배양액 100 중량부 대비 수용성 폴리머 0.1 중량부 내지 5 중량부로 혼합하고, 가장 바람직하게는 0.1 중량부 내지 0.5 중량부로 혼합한다.
본 발명의 일실시예에서는 폴리비닐피롤리돈이 유산균의 표면에 박막(film)구조를 형성하고 기체 차단성을 높여 유산균의 생존율을 높이고 바인더로써 2차 코팅제인 히알루론산과의 결합력이 우수함을 확인하였다(표 1 참조). 따라서 이 기제를 중합도에 따라 폴리비닐피롤리돈 K-25, K-30, K-90으로 구분하여 락토바실루스 아시도필루스 IDCC 3302의 1차 코팅 원료를 조제하여 생균수를 MRS agar plate에서 각각 평가하였다.
그 결과, 폴리비닐피롤리돈 K-25를 락토바실루스 아시도필루스 IDCC 3302 균체에 0.1 %(w/v)로 사용하였을 때 가장 높은 생존균수를 나타내었다(표 2 참조).
(b) 상기 (a)단계에서 1차 코팅된 유산균에 히알루론산을 혼합하여 2차 코팅하는 단계:
상기 (b)단계에서 (a)단계의 1차 코팅된 유산균에 히알루론산을 혼합하여 2차 코팅한다. 상기 히알루론산은 수분활성 조절기능의 천연 고분자 물질로서 외부유입수분을 제어한다.
상기 히알루론산은 유산균 배양액 100중량부 대비 히알루론산 0.01 중량부 내지 5중량부, 바람직하게는 0.001 중량부 내지 0.05 중량부, 더욱 바람직하게는 0.001 중량부 내지 0.005 중량부로 혼합된다.
본 발명의 일실시예에서는 히알루론산의 최적 농도를 산출하기 위해 폴리비닐피롤리돈 K-25의 농도에 따른 히알루론산 농도를 조합하여 락토바실루스 아시도필루스 IDCC 3302의 2차 코팅 원료를 조제한 후, 생균수를 MRS agar plate에서 각각 평가하였다.
그 결과, 폴리비닐피롤리돈 0.1 %(w/v)와 히알루론산 0.001 %(w/v)를 사용하여 2차 코팅한 락토바실루스 아시도필루스 IDCC 3302의 발현균수가 가장 높게 평가되었다(표 3 참조).
(c) 상기 (b)단계에서 2차 코팅된 유산균에 다공성 코팅제를 혼합하여 3차 코팅하는 단계:
상기 다공성 코팅제는 균체에 다공성 입자성을 가진 기제의 코팅제로서, 외부 수분 및 습윤 공기의 유입을 차단시키기 역할을 한다. 마이크로캡슐화(microencapsulation)에 사용되며, 다공성 입자를 가지는 것은 상기 3차 코팅제로 사용가능하며, 구체적으로는 이에 한정되지는 않지만 알기네이트(alginate), 말토덱스트린(maltodextrin,MD), 키토산(chitosan), 전분(starch), 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol, PEG), 트리아세틴(triacetin), 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 아세틸트리에틸 시트레이트(acetyl triethyl citrate), 트리에틸 시트레이트(triethyl citrate), 또는 글리세린(glycerin)이 포함되며, 바람직하게는 알기네이트(alginate), 말토덱스트린(maltodextrin,MD), 키토산(chitosan), 전분(starch) 또는 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol, PEG)일 수 있으며, 더 바람직하게는 말토덱스트린(maltodextrin,MD)을 말한다.
상기 다공성 코팅제는 유산균 배양액 100중량부 대비 0.1 중량부 내지 10 중량부의 비율, 바람직하게는 0.1 중량부 내지 5 중량부, 더욱 바람직하게는 0.1 중량부 내지 0.5 중량부로 혼합된다.
본 발명의 일실시예에서는 코팅제의 마이크로캡슐화 효과가 상대적으로 가장 높은 기제로 선정된 3차 코팅제인 말토덱스트린과, 2차 코팅제인 히알루론산과의 가장 최적의 결합효율을 구성하기 위해 히알루론산 농도에 따른 말토덱스트린 농도를 조합하여 락토바실루스 아시도필루스 IDCC 3302의 3차 코팅 원료를 조제한 후, 생균수를 MRS agar plate에서 각각 평가하였다.
그 결과, 히알루론산 0.001 %(w/v)와 말토덱스트린 0.4 %(w/v)를 사용하여 3차 코팅한 락토바실루스 아시도필루스 IDCC 3302의 발현균수가 가장 높게 평가되었다.
(d) 상기 (c)단계에서 3차 코팅된 유산균에 단백질을 혼합하여 4차 코팅하는 단계:
상기 단백질은 3차 코팅된 유산균에 다공성 입자구조를 가진 3차 코팅제의 공극을 채우기 위하여 혼합되며, 이에 한정되지는 않지만 바람직하게는 탈지분유, 유청단백, 분리대두단백으로 이루어진 군에서 선택된 단백질 , 바람직하게는 유청단백을 말한다.
상기 4차 코팅제인 단백질은 유산균 배양액 100중량부 대비 단백질 1중량부 내지 30중량부의 비율로 혼합되며, 바람직하게는 1중량부 내지 10중량부, 가장 바람직하게는 5 내지 10 중량부로 혼합된다.
본 발명의 일실시예에서는 락토바실루스 아시도필루스 IDCC 3302의 3차 코팅제로 말토덱스트린 0.4 %(w/v)를 최적 농도로 선정한 후, 다공성 입자구조를 가진 말토덱스트린의 공극을 채울 단백질의 종류를 선발하고 최적농도를 산출하기 위해, 평가한 결과, 유산균 배양액 100 중량부 대비 폴리비닐피롤리돈 K-25 0.1 %(w/v), 히알루론산 0.001 %(w/v), 말토덱스트린 0.4 %(w/v), 유청단백 6 %(w/v)를 사용하였을 때 4차 코팅한 락토바실루스 아시도필루스 IDCC 3302의 발현균수가 가장 높게 평가되었다.
상기 본 발명의 방법으로 4중 코팅된 유산균은 구조적으로 안정하여 수분, 공기등의 외부 환경인자를 효율적으로 차단시켜 높은 경시적 안정성을 나타낼 수 있으며, 이에 의하여 종래 비코팅, 단일 코팅, 2중 코팅, 3중 코팅된 유산균에 비하여 내산성, 내담즙성이 월등하다. 이외에도 4℃의 냉장 보관 실험이나 15℃, 25℃, 37℃에서의 보관 실험과 -70℃에서의 동결 실험 및 50℃에서의 열풍건조 실험에서도 종래 비코팅, 단일 코팅, 2중 코팅, 3중 코팅된 유산균에 비하여 본 발명에 의한 4중 코팅된 유산균이 다수 생존하였다 (실시예 2 내지 8 참조)
또한 본 발명의 4중 코팅된 유산균은 상기와 같은 방법으로 제조된 것을 특징으로 한다. 따라서 본 발명의 4중 코팅된 유산균은 종래 비코팅, 단일 코팅, 2중 코팅, 3중 코팅된 유산균에 비하여 내산성, 내담즙성이 월등히 우수하며, 동결건조시 세포질 결정화로 인한 세포사멸율이 낮고, 열풍건조방식에서 건조온도에 노출되었을 때, 열안정성이 높기에, 위산 또는 담즙산, 저온 또는 고온으로 인해 사멸되어 유산균 본래의 생리활성 기능이 소실되지 않을 수 있다.
따라서, 본 발명은 4중 코팅된 유산균의 제조방법, 그 방법으로 제조된 4중 코팅된 유산균을 제공한다. 본 발명의 방법으로 코팅된 유산균은 유산균에 수용성 폴리머, 히알루론산, 다공성 입자를 가지는 코팅제, 단백질을 혼합하여 4중 코팅함으로써, 종래 비코팅, 단일, 2중, 3중코팅 유산균군에 비하여 내산성 및 내담즙성이 우수하고, 저온 또는 고온으로 인한 사멸율이 낮으므로, 유산균 본래의 생리활성 기능을 소실하지 않을 수 있다. 따라서 본 발명의 코팅 방법은 유산균의 생리활성 기능을 유지할 수 있게 하여 산업적으로 유용한 방법이다.
도 1은 본 발명에 사용된 락토바실루스 아시도필러스 IDCC 3302의 형상을 나타낸 사진이다.
도 2는 락토바실루스 아시도필러스 IDCC 3302에 폴리비닐피롤리돈 K-25를 혼합하여 1차 코팅된 유산균의 형상을 나타낸 사진이다.
도 3은 도 2의 1차 코팅된 유산균에 히알루론산을 혼합하여 2차 코팅된 유산균의 형상을 나타낸 사진이다.
도 4는 도3의 2차 코팅된 유산균에 말토덱스트린을 혼합하여 3차 코팅된 유산균의 형상을 나타낸 사진이다.
도 5는 도4의 3차 코팅된 유산균에 유청단백을 혼합하여 4차 코팅된 유산균의 형상을 나타낸 사진이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1>
4중코팅 유산균 조제
<1-1> 1차 박막코팅제 선정 및 최적농도
유산균 표면 접합력이 우수하여 코팅시 외부공기의 유입을 차단하고 2차 코팅제인 히알루론산과의 결합력이 우수한 바인더(binder)를 선정하였다. 이때 선정기준은 유산균의 대부분이 혐기성균(anaerobe)이므로 기체 차단성이 우수하며 식품 및 의약품용도로 사용할 수 있는 기제를 선정하였다.
본 발명에서는 균체 박막코팅제로 다음과 같은 폴리머를 사용한다. 본 발명에 유용하고 적절한 폴리머로 셀룰로오스 계열로 카르복시메틸셀룰로오스(carboxymethyl cellulose,CMC), 하이드록시에틸셀룰로오스(hydroxyethylcellulose,HEC), 검(gum)계열의 폴리머로 잔탄검(xanthan gum, XG), 구아검(guar gum,GG), 합성 폴리머계열로 폴리비닐피롤리돈 (polyvinylpyrroridone, PVP), 카보폴(carbopol)을 포함한다. 상기의 폴리머는 락토바실루스 아시도필루스 IDCC 3302 (Lactobacillus acidophilus IDCC 3302) 배양액을 원심분리하여 수득된 균체에 일정량을 직접 첨가하여 균일화시킨 후 균체표면의 박막코팅이 되도록 한다. 상기 폴리머는 상기 락토바실루스 아시도필루스 IDCC 3302 (Lactobacillus acidophilus IDCC 3302) 배양액 100ml 당 각각 0.2g 씩 첨가하였다. 1차 박막코팅된 유산균을 분산매에 현탁시켜, -70℃ deep freezer에 3시간 동안 냉동시켰다. 냉동 1차 박막코팅 유산균 샘플을 동결 건조하여 분말화시킨 후, 생존균수를 측정하여 가장 높은 생존율을 보인 실험군을 1차 박막코팅 결합제로 선정하였다.
1차 박막코팅제 선정시험결과
구분 None CMC HEC XG GG PVPK-30 Carbopol
생존율 (%) 33.4 51.4 48.9 45.7 48.6 72.5 62.5
그 결과, [표 1]에서 보는 바와 같이 의약품 및 식품에서 결합제로 많이 사용되고 있는 폴리비닐피롤리돈이 다른 폴리머보다 상대적으로 높은 생존율을 나타내어 제조공정에서 유입되는 수분, 공기등의 위협인자에 대해 효율이 높은 방어기작을 나타내었다.
선정된 폴리비닐피롤리돈 K-30이 유산균의 표면에 박막(film)구조를 형성하고 기체 차단성을 높여 유산균의 생존율을 높이고 바인더로써 2차 코팅제인 히알루론산과의 결합력이 우수함을 확인하였다. 따라서 이 기제를 중합도에 따라 폴리비닐피롤리돈 K-25, K-30, K-90으로 구분하여 상기에서 기재된 방법과 동일하게 상기 락토바실루스 아시도필루스 IDCC 3302 (Lactobacillus acidophilus IDCC 3302) 배양액 100ml 당 0.1g 내지 0.5g 씩 첨가하여, 락토바실루스 아시도필루스 IDCC 3302을 1차 코팅하였다. 생균수를 MRS agar plate에서 각각 평가하여 최종 선정하였다.
락토바실루스 아시도필루스 IDCC 3302 적용 1차 코팅제 선정시험 결과
종류
w/v(%) 		PVPK -25
(x 10 8 CFU /g) 		PVPK -30
(x 10 8 CFU /g) 		PVPK -90
(x 10 8 CFU /g)
None 200 210 225
1 680 560 310
2 520 420 205
3 460 350 140
4 310 110 60
5 250 80 35
그 결과, [표 2]에서 보는 바와 같이, 폴리비닐피롤리돈 K-25를 락토바실루스 아시도필루스 IDCC 3302 균체에 0.1% 사용하였을 때 상대적으로 가장 높은 생존균수를 나타내었다.
<1-2> 2차 코팅제 히알루론산의 최적농도
락토바실루스 아시도필루스 IDCC 3302의 표면 부착 1차 코팅제로 폴리비닐피롤리돈 K-25를 선정한 후, 2차 코팅제인 수분활성 조절기능의 천연 고분자물질인 히알루론산의 최적 농도를 산출하기 위해 폴리비닐피롤리돈 K-25의 농도에 따른 히알루론산 농도를 조합하여 락토바실루스 아시도필루스 IDCC 3302의 2차 코팅 원료를 조제한 후, 생균수를 MRS agar plate에서 각각 평가하여 최종 선정하였다. 구체적으로 상기 락토바실루스 아시도필루스 IDCC 3302 (Lactobacillus acidophilus IDCC 3302) 배양액 100ml 당 폴리비닐피롤리돈 K-25은 0.1g 내지 0.5g 씩 첨가하고, 히알루론산은 0.001g 내지 0.005g을 첨가하였다.
폴리비닐피롤리돈 K-25와 히알루론산 농도조합실험 결과
PVPK-25
농도 w/v(%) 		히알루론산 농도w/v(%)
(x 10 8 CFUof L. acidophilus IDCC 3302/g)
None 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005
None 200 350 335 280 270 150
1 680 760 715 695 630 570
2 520 630 570 550 490 455
3 460 515 520 480 475 430
4 310 430 420 350 330 280
5 250 380 370 310 260 180
그 결과, [표 3] 에서 보는 바와 같이, 폴리비닐피롤리돈 0.1 w/v(%)와 히알루론산 0.001 w/v(%)를 사용하여 2차 코팅한 락토바실루스 아시도필루스 IDCC 3302의 발현균수가 상대적으로 가장 높게 평가되었다.
<1-3> 3차 코팅제 선정 및 최적농도
폴리비닐피롤리돈-히알루론산으로 2차 코팅된 균체에 다공성 입자성을 가진 기제의 코팅을 통해 외부 수분 및 습윤 공기의 유입을 차단시키기 위해 최적의 3차 코팅제를 선정하였다. 일반적으로 다공성 입자성의 코팅제는 마이크로캡슐화(microencapsulation)기제로 많이 사용되며, 본 발명에서는 알기네이트(alginate), 말토덱스트린(maltodextrin,MD), 키토산(chitosan), 전분(starch), 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol, PEG)을 포함한다. 폴리비닐피롤리돈-히알루론산으로 구성된 2차 코팅된 락토바실루스 아시도필루스 IDCC 3302 구조체에 상기 3차 코팅제를 상기 락토바실루스 아시도필루스 IDCC 3302 (Lactobacillus acidophilus IDCC 3302) 배양액 100ml 당 0.1g 되게 첨가하여 균일화시킨 후 3차코팅이 되도록 한다. 3차 코팅된 균체를 분산매에 현탁시켜, -70℃ deep freezer에 3시간 동안 냉동시켰다. 냉동된 3차 코팅 유산균 샘플을 동결건조하여 분말화시킨 후, 생존균수를 측정하여 가장 높은 생존율을 보인 실험군을 3차 코팅제로 선정하였다.
3차 코팅제 선정실험 결과
구분 알기네이트 말토덱스트린 키토산 전분 폴리에틸렌글리콜
생존율 (%) 74 85 71 65 68
그 결과, [표4]에서 보는 바와 같이 3차 코팅제의 마이크로캡슐화 효과가 상대적으로 가장 높은 기제로 말토덱스트린이었다.
선정된 3차 코팅제인 말토덱스트린과 2차 코팅제인 히알루론산과의 가장 최적의 결합효율을 구성하기 위해 히알루론산 농도에 따른 말토덱스트린 농도를 조합하여 락토바실루스 아시도필루스 IDCC 3302의 3차 코팅 원료를 조제한 후, 생균수를 MRS agar plate에서 각각 평가하여 최종 선정하였다. 구체적으로 상기 락토바실루스 아시도필루스 IDCC 3302 (Lactobacillus acidophilus IDCC 3302) 배양액 100ml 당 히알루론산은 0.001g 내지 0.005g을 첨가하고, 말토덱스트린 0.1g 내지 0.5g을 첨가하였다.
히알루론산과 말토덱스트린의 농도조합실험 결과
히알루론산
농도
w/v(%) 		말토덱스트린 농도 w/v(%)
(x 10 8 CFUof L . acidophilus IDCC 3302/g)
None 1 2 3 4 5
None 200 380 460 690 710 700
0.001 350 590 660 740 820 770
0.002 335 550 615 700 790 695
0.003 280 515 520 535 600 555
0.004 270 480 495 515 520 490
0.005 150 445 450 465 480 475
그 결과, [표 5]에서 보는 바와 같이, 히알루론산 0.001 %(w/v)와 말토덱스트린 0.4%(w/v)를 사용하여 3차 코팅한 락토바실루스 아시도필루스 IDCC 3302의 발현균수가 상대적으로 가장 높게 평가되었다.
<1-4> 4차 코팅제 단백질의 선발 및 최적농도
락토바실루스 아시도필루스 IDCC 3302의 3차 코팅제로 말토덱스트린 0.4%를 최적 농도로 선정한 후, 다공성 입자구조를 가진 말토덱스트린의 공극을 채울 단백질의 종류를 선발하고 최적농도를 산출하기 위해 락토바실루스 아시도필루스 IDCC 3302 (Lactobacillus acidophilus IDCC 3302) 배양액 100ml 당 2g 내지 10g을 각각 첨가하여 락토바실루스 아시도필루스 IDCC 3302 4차 코팅 원료를 조제한 후, 생균수를 MRS agar plate에서 각각 평가하여 최종 선정하였다.
4차 코팅 단백질의 선발 및 최적 농도 산출실험결과
종류
농도 w/v(%) 		탈지분유
(x 10 8 CFU/g) 		유청단백
(x 10 8 CFU/g) 		분리대두단백
(x 10 8 CFU/g)
None 200 200 200
2 210 280 250
4 225 325 265
6 290 380 260
8 310 310 275
10 250 305 280
그 결과, [표 6]에서 보는 바와 같이, 폴리비닐피롤리돈K-25 0.1%(w/v), 히알루론산 0.001%, 말토덱스트린 0.4%(w/v)의 비율로 3차 코팅한 락토바실루스 아시도필루스 IDCC 3302 균체에 유청단백을 6%(w/v) 사용하였을 때 4차 코팅한 락토바실루스 아시도필루스 IDCC 3302의 발현균수가 상대적으로 가장 높게 평가되었다.
<실시예 2>
전자현미경(FE-SEM) 구조분석
상기 실시예 1에서 조제한 4중 코팅 락토바실루스 아시도필루스 IDCC 3302의 성상을 조제 공정에 따라 전자현미경 촬영을 통해 구조적 분석을 하였다. 4중 코팅 유산균 조제공정을 단계적으로 전자현미경 구조분석을 하여 도 1 내지 도 5에 나타내었다.
도 1 및 도 2에서 보는 바와 같이, 유산균에 폴리비닐피롤리돈K-25를 혼합하는 경우에, 유산균체 표면을 폴리비닐피롤리돈K-25가 필름과 같은 박막을 형성하면서 코팅된 것을 관찰 할 수 있었다(도2). 또한 폴리비닐피롤리돈K-25와 히알루론산이 혼합되면서 구조적으로 히알루론산 구조가 더욱 조밀해지는 현상을 관찰할 수 있었으며(도3), 다공성 입자구조인 말토덱스트린을 첨가하여 외부 수분과 온도가 쉽게 균체에 전달되지 않게 하고(도4), 마지막으로 유청단백으로 코팅을 진행하면서 균체가 외부로 노출되지 않도록 하였다(도5).
4중 코팅 유산균 대량생산
4중 코팅 락토바실루스 아시도필루스 IDCC 3302의 대량 생산시 재현성을 확인하기 위해, 비코팅 락토바실루스 아시도필루스 IDCC 3302와 생산성을 비교하였다. 생산규모는 1 ton 발효탱크에서 37℃, overnight 배양을 하였다. 균체 회수 후, 1차 코팅제로 폴리비닐피롤리돈K-25 0.1%(w/v), 2차 코팅제인 히알루론산 0.001%(w/v), 3차 코팅제인 말토덱스트린 0.4%(w/v), 4차 코팅제인 유청단백 6%(w/v)를 처리하여 4중 코팅 유산균원료 조제하였다. 대조군인 비코팅 락토바실루스 아시도필루스 IDCC 3302의 원료는 통상적인 원료 조제공정에 따라 조제하였다.
히알루론산을 이용한 4중코팅 유산균의 대량생산시 비코팅 유산균과의 생산성 실험결과
구분 비코팅 락토바실루스 아시도필루스 IDCC 3302 히알루론산 다중코팅 락토바실루스 아시도필루스 IDCC 3302
종료 pH 4.3~4.4
배양액 생균수(x108CFU/ml) 50
원료 생균수(x108CFU/g) 150 320
발현율(%) 41.3 88
그 결과, [표 7]에서 보는 바와 같이 1ton 탱크발효시, 4중코팅 락토바실루스 아시도필루스 IDCC 3302가 비코팅 락토바실루스 아시도필루스 IDCC 3302에 비해 2배 정도 생산성이 향상된 것을 확인하였다.
<실시예 4>
내산성(Acid tolerance)
내산성은 소화관 중 위(stomach)에 유산균제제가 통과할 때 위산(gastric acid)에 노출되게 되는데 이러한 환경을 시험관 조건에서 비코팅, 단일 코팅, 2중 코팅, 3중 코팅 유산균군과 4중 코팅 유산균군과 비교하였다. 본 발명의 실시예서 단일 코팅 유산균은 상기 실시예 <1-1>에 기재된 방법으로 1차 코팅된 유산균이고, 상기 2중 코팅 유산균은 상기 실시예 <1-2>에 기재된 방법으로 2차 코팅된 유산균이고, 상기 3중 코팅 유산균은 상기 실시예 <1-3>에 기재된 방법으로 3차 코팅된 유산균이고, 4중 코팅 유산균은 상기 실시예 1에서 기재된 본 발명의 방법에 의해 4차 코팅된 유산균을 지칭하는 것이다.
보다 상세하게 MRS 배지에 10 % HCl 를 적하하여 pH를 2.3, 2.5으로 적정한 다음, 멸균하여 사용하였으며, 시료 1g을 각각의 pH로 보정된 MRS 배지에 넣어 0시간, 1시간, 2시간 동안 반응시킨 후, 생균수 분석을 하였다. 이때, 실험에 사용한 유산균은 락토바실루스 속(Lactobacillus sp.) 10종, 비피도박테리움 속(Bifidobacterium sp.) 5종, 스트렙토코커스 속 (Streptococcus sp.) 2종을 대상으로 실시예 3의 제조공정에 따라 제조된 4중코팅 유산균과 비코팅, 단일, 2중, 3중코팅 유산균을 제조하였다.
본 발명의 4중코팅 유산균군의 내산성 결과
코팅
유무 		시험균 pH 2.3 (x10 8 CFU/g) pH 2.5 (x10 8 CFU /g)
0
시간 		1
시간 		2
시간 		생 존율
(%) 		0
시간 		1
시간 		2
시간 		생 존율
(%)
비코팅
Lactobacillus acidophilus IDCC 3302 136 61 51 37 136 64 58 42
Lactobacillus bulgaricus 85 39 35 41 85 43 40 47
Lactobacillus casei 79 37 27 34 79 40 34 43
Lactobacillus fermentum 93 42 35 37 93 43 40 43
Lactobacillus gasseri 132 63 48 36 132 70 52 39
Lactobacillus helveticus 167 74 58 34 167 82 68 40
Lactobacillus rhamnosus 191 87 62 32 191 92 73 38
Lactobacillus johnsonii 192 85 63 32 192 89 87 45
Lactobacillus plantrum 120 56 43 35 120 65 58 48
Lactobacillus reuteri 145 62 51 35 145 72 61 42
Bifidobacterium bifidum 123 55 45 36 123 72 50 40
Bifidobacterium breve 188 79 60 31 188 84 67 35
Bifidobacterium infantis 166 73 53 31 166 79 73 43
Bifidobacterium lactis 170 76 54 31 170 87 59 34
Bifidobacterium longum 171 72 61 35 171 77 70 40
Streptococcus faecalis 90 40 29 32 90 48 39 43
Streptococcus faecium 75 34 25 33 75 42 33 44
단일
코팅 		Lactobacillus acidophilus IDCC 3302 180 91 82 45 180 111 98 54
Lactobacillus bulgaricus 125 68 55 44 125 76 61 48
Lactobacillus casei 145 67 57 39 145 74 65 44
Lactobacillus fermentum 122 62 59 48 122 73 65 53
Lactobacillus gasseri 148 82 65 43 148 91 74 50
Lactobacillus helveticus 171 95 74 43 171 98 80 46
Lactobacillus rhamnosus 200 102 92 46 200 113 100 50
Lactobacillus johnsonii 207 95 82 39 207 105 91 43
Lactobacillus plantrum 140 76 60 42 140 85 64 45
Lactobacillus reuteri 150 71 70 46 150 78 72 48
Bifidobacterium bifidum 141 70 65 46 141 90 72 51
Bifidobacterium breve 194 92 80 41 194 95 87 44
Bifidobacterium infantis 182 94 77 42 182 97 85 46
Bifidobacterium lactis 193 91 84 43 193 99 88 45
Bifidobacterium longum 191 92 81 42 191 102 90 47
Streptococcus faecalis 110 65 43 39 110 72 59 53
Streptococcus faecium 96 52 48 50 96 58 53 55
2중
코팅 		Lactobacillus acidophilus IDCC 3302 230 150 132 57 230 150 138 60
Lactobacillus bulgaricus 150 88 75 50 150 96 81 54
Lactobacillus casei 170 107 90 52 170 101 90 52
Lactobacillus fermentum 172 112 109 63 172 125 115 66
Lactobacillus gasseri 168 105 90 53 168 117 109 64
Lactobacillus helveticus 194 120 111 57 194 121 105 54
Lactobacillus rhamnosus 215 130 101 46 215 128 121 56
Lactobacillus johnsonii 227 115 100 44 227 125 111 48
Lactobacillus plantrum 168 105 85 50 168 110 89 52
Lactobacillus reuteri 175 98 90 51 175 113 98 56
Bifidobacterium bifidum 168 111 90 53 168 125 99 58
Bifidobacterium breve 215 132 125 58 215 138 127 59
Bifidobacterium infantis 200 120 107 53 200 135 127 63
Bifidobacterium lactis 225 131 104 46 225 141 124 55
Bifidobacterium longum 220 112 101 45 220 122 110 50
Streptococcus faecalis 135 70 63 46 135 75 70 51
Streptococcus faecium 121 72 66 54 121 75 70 57
3중
코팅 		Lactobacillus acidophilus IDCC 3302 260 180 162 62 260 195 182 70
Lactobacillus bulgaricus 160 108 85 53 160 128 95 59
Lactobacillus casei 175 115 95 54 175 130 105 60
Lactobacillus fermentum 180 125 115 63 180 135 120 66
Lactobacillus gasseri 198 138 120 60 198 140 135 68
Lactobacillus helveticus 204 140 131 64 204 145 141 69
Lactobacillus rhamnosus 248 155 121 48 248 166 141 56
Lactobacillus johnsonii 277 166 145 52 277 178 155 55
Lactobacillus plantrum 205 145 120 58 205 152 141 68
Lactobacillus reuteri 207 125 120 57 207 136 130 62
Bifidobacterium bifidum 198 140 135 68 198 153 145 73
Bifidobacterium breve 279 190 180 64 279 202 198 70
Bifidobacterium infantis 280 170 157 56 280 205 185 66
Bifidobacterium lactis 275 175 154 56 275 207 174 63
Bifidobacterium longum 270 152 141 52 270 189 161 59
Streptococcus faecalis 150 82 75 50 150 108 95 63
Streptococcus faecium 132 91 86 65 132 101 92 69

4중
코팅 		Lactobacillus acidophilusIDCC 3302 300 268 235 78 300 272 258 86
Lactobacillus bulgaricus 188 165 145 77 188 176 165 88
Lactobacillus casei 175 155 136 78 175 171 142 81
Lactobacillus fermentum 205 178 155 76 205 196 155 76
Lactobacillus gasseri 265 233 202 76 265 248 231 87
Lactobacillus helveticus 335 295 248 74 335 302 259 77
Lactobacillus rhamnosus 383 333 295 77 383 352 305 80
Lactobacillus johnsonii 423 370 318 75 423 399 318 75
Lactobacillus plantrum 240 211 188 78 240 225 204 85
Lactobacillus reuteri 290 254 222 77 290 263 248 86
Bifidobacterium bifidum 247 215 196 79 247 233 206 83
Bifidobacterium breve 377 335 294 78 377 348 304 81
Bifidobacterium infantis 333 291 276 83 333 299 289 87
Bifidobacterium lactis 340 300 281 83 340 312 295 87
Bifidobacterium longum 343 301 275 80 343 321 289 84
Streptococcus faecalis 180 156 140 78 180 167 151 84
Streptococcus faecium 150 134 115 77 150 145 138 92
그 결과, pH 2.1과 2.3으로 2시간 노출시켰을 때, 비코팅 유산균에 비해 폴리비닐피롤리돈 K25-히알루론산-말토덱스트린-유청단백 구조로 4중코팅된 유산균이 약 40%이상의 높은 내산성을 나타내었다.
< 실시예 5>
내담즙산성( Bile tolerance )
담즙산(bile acid)은 간(liver)에서 만들어져 담도로 빠져나와 소장(small intestine)으로 흘러나오고 소장 말단의 회장(ileum)에서 다시 95%흡수되어 다시 간으로 들어가는 장관순환을 한다. 이 과정에서 소장에 정착한 유산균에 영향을 미친다. 따라서 담즙산에 노출되었을 때 4중 코팅된 유산균과 비코팅, 단일, 2중, 3중코팅 유산균의 생존율 차이를 시험관 환경에서 비교하였다.보다 상세하게는 담즙산 0.3%가 첨가되지 않은 배지와 첨가된 배지를 멸균하여 사용하였으며, 각각의 배지에 4중코팅된 유산균과 비코팅, 단일, 2중, 3중코팅 유산균 시료 1g을 각각 접종하고, 5 시간 동안 반응시킨 후, 0.9% NaCl 용액을 희석수로 사용하여 생균수 분석을 하였다. 이때, 실험에 사용한 유산균은 락토바실루스 속(Lactobacillus sp.) 10종, 비피도박테리움 속(Bifidobacterium sp.) 5종, 스트렙토코커스 속 (Streptococcus sp.) 2종을 대상으로 실시예 3의 제조공정에 따라 제조된 4중코팅 유산균과 비코팅, 단일, 2중, 3중코팅 유산균을 제조하였다.
본 발명의 4중코팅 유산균군의 내담즙산성 결과
코팅유무 시험균 MRS MRS+0.3% bile 생존율(%)
비코팅
 Lactobacillus acidophilusIDCC 3302 136 84 61
Lactobacillus bulgaricus 85 45 52
Lactobacillus casei 79 40 50
Lactobacillus fermentum 93 49 52
Lactobacillus gasseri 132 57 43
Lactobacillus helveticus 167 60 36
Lactobacillus rhamnosus 191 74 39
Lactobacillus johnsonii 192 101 52
Lactobacillus plantrum 120 66 55
Lactobacillus reuteri 145 72 49
Bifidobacterium bifidum 123 60 48
Bifidobacterium breve 188 55 29
Bifidobacterium infantis 166 59 35
Bifidobacterium lactis 170 64 38
Bifidobacterium longum 171 63 36
Streptococcus faecalis 90 29 32
Streptococcus faecium 75 32 42


단일
코팅		 Lactobacillus acidophilus IDCC 3302 180 122 68
Lactobacillus bulgaricus 125 72 58
Lactobacillus casei 145 87 60
Lactobacillus fermentum 122 69 57
Lactobacillus gasseri 148 78 53
Lactobacillus helveticus 171 76 45
Lactobacillus rhamnosus 200 94 47
Lactobacillus johnsonii 207 124 60
Lactobacillus plantrum 140 86 62
Lactobacillus reuteri 150 88 59
Bifidobacterium bifidum 141 81 58
Bifidobacterium breve 194 77 40
Bifidobacterium infantis 182 83 46
Bifidobacterium lactis 193 81 42
Bifidobacterium longum 191 84 44
Streptococcus faecalis 110 49 45
Streptococcus faecium 96 45 47
2중
코팅		 Lactobacillus acidophilus IDCC 3302 230 165 72
Lactobacillus bulgaricus 150 97 65
Lactobacillus casei 170 115 68
Lactobacillus fermentum 172 115 67
Lactobacillus gasseri 168 109 65
Lactobacillus helveticus 194 126 65
Lactobacillus rhamnosus 215 129 60
Lactobacillus johnsonii 227 140 62
Lactobacillus plantrum 168 114 68
Lactobacillus reuteri 175 113 65
Bifidobacterium bifidum 168 107 64
Bifidobacterium breve 215 118 55
Bifidobacterium infantis 200 108 54
Bifidobacterium lactis 225 128 57
Bifidobacterium longum 220 121 55
Streptococcus faecalis 135 81 60
Streptococcus faecium 121 70 58
3중
코팅		 Lactobacillus acidophilus IDCC 3302 260 208 80
Lactobacillus bulgaricus 160 124 78
Lactobacillus casei 175 131 75
Lactobacillus fermentum 180 138 77
Lactobacillus gasseri 198 142 72
Lactobacillus helveticus 204 144 71
Lactobacillus rhamnosus 248 178 72
Lactobacillus johnsonii 277 202 73
Lactobacillus plantrum 205 153 75
Lactobacillus reuteri 207 153 74
Bifidobacterium bifidum 198 154 78
Bifidobacterium breve 279 195 70
Bifidobacterium infantis 280 201 72
Bifidobacterium lactis 275 187 68
Bifidobacterium longum 270 180 67
Streptococcus faecalis 150 105 70
Streptococcus faecium 132 99 75








4중코팅
 Lactobacillus acidophilusIDCC 3302 300 288 96
Lactobacillus bulgaricus 188 181 96
Lactobacillus casei 175 170 97
Lactobacillus fermentum 205 199 97
Lactobacillus gasseri 265 254 96
Lactobacillus helveticus 335 321 96
Lactobacillus rhamnosus 383 369 96
Lactobacillus johnsonii 423 402 95
Lactobacillus plantrum 240 232 97
Lactobacillus reuteri 290 285 98
Bifidobacterium bifidum 247 240 97
Bifidobacterium breve 377 361 96
Bifidobacterium infantis 333 318 95
Bifidobacterium lactis 340 329 97
Bifidobacterium longum 343 316 92
Streptococcus faecalis 180 169 94
Streptococcus faecium 150 140 93
그 결과, 각각의 유산균을 0.3% bile에 5시간 노출시켜 생존균수를 비교한 결과, [표9]에서 보는 바와 같이 4중코팅된 유산균이 비코팅, 단일, 2중, 3중코팅 유산균에 비해 상대적으로 높은 내담즙산성을 나타내었다.
< 실시예 6>
동결시 생존율 비교
유산균 생균제 원료를 생산하는 방법 중 가장 많이 사용되는 방법이 동결건조방식이다. 동결건조를 하기 위해서는 건조 전, 샘플을 동결해야하는데 이 과정에서 대부분의 유산균은 균체 내 세포질의 액상구조가 결정화되면서 부피가 팽창하게 되고 불규칙적인 생긴 결정이 세포막을 손상시키면서 사멸에 이르게 된다. 4중코팅 유산균은 세포 내외의 수분을 히알루론산이 흡수하기 때문에 동결시 결정화에 따른 세포막 손상을 최소화한다. 본 발명에서는 4중코팅 유산균과 비코팅, 단일, 2중, 3중코팅 유산균이 동결시 생존율을 비교하여 히알루론산이 동결건조시 생존율을 높일 수 있는 신개념의 cryoprotective agent로 사용가능성을 확인하였다. 보다 상세하게 4중코팅 유산균을 분산용매 현탁액을 비코팅, 단일, 2중, 3중코팅 유산균 분산용매 현탁액을 각각 -70℃ deep freezer에 3시간동안 동결 후, 동결건조기에서 24시간 건조하였다. 건조된 각각의 시료 1g을 채취하여 생균수 분석을 하였다. 이때, 실험에 사용한 유산균은 락토바실루스 속(Lactobacillus sp.) 10종, 비피도박테리움 속(Bifidobacterium sp.) 5종, 스트렙토코커스 속 (Streptococcus sp.) 2종을 대상으로 실시예 3의 제조공정에 따라 4중코팅 유산균과 비코팅, 단일, 2중, 3중코팅 유산균을 제조하였다.
본 발명의 4중코팅 유산균의 -70℃ 동결시 생존율 실험결과
균주 비코팅 유산균의
생존율 (%)		 단일코팅 유산균의 생존율(%) 2중코팅 유산균의 생존율(%) 3중코팅 유산균의 생존율(%) 4중코팅
유산균의 생존율(%)
Lactobacillus acidophilus IDCC 3302 42 52 60 71 88
Lactobacillus bulgaricus 35 47 55 69 82
Lactobacillus casei 31 45 53 65 83
Lactobacillus fermentum 45 52 60 62 81
Lactobacillus gasseri 46 53 60 70 86
Lactobacillus helveticus 36 45 52 68 75
Lactobacillus rhamnosus 32 44 51 67 89
Lactobacillus johnsonii 44 53 59 66 92
Lactobacillus plantrum 31 41 51 64 72
Lactobacillus reuteri 35 46 51 65 73
Bifidobacterium bifidum 49 55 60 71 86
Bifidobacterium breve 35 42 51 68 76
Bifidobacterium infantis 40 50 58 62 80
Bifidobacterium lactis 46 52 55 71 95
Bifidobacterium longum 48 55 60 72 91
Streptococcus faecalis 36 45 55 65 84
Streptococcus faecium 38 44 57 65 81
그 결과, 동결시 4중코팅된 유산균군의 생존율이 비코팅 유산균군의 생존율보다 36~57% 증가된 것을 확인할 수 있었다.
< 실시예 7>
50 ℃ 열풍건조시 생존율 비교
유산균의 원료 조제방식 중 균일한 입자 모양을 만들거나, 분무건조를 하기 위해서는 액상으로 캐리어(carrier)에 분무후 50℃ 정도에서 공기 중에서 건조하게된다. 이때 유산균은 대부분 열에 약하거나 공기에 취약하기 때문에 장시간 노출시 사멸하게 된다. 따라서 4중코팅된 유산균이 열에 대한 안정성을 검토하기 위해 4중코팅 유산균군과 비코팅, 단일, 2중, 3중코팅 유산균군을 50℃에서 3시간 노출시켜 건조시켜 원료를 조제하였다. 보다 상세하게는 균체 회수 후, 1차 코팅제로 폴리비닐피롤리돈 K-25, 2차 코팅제인 히알루론산, 3차 코팅제인 말토덱스트린, 4차 코팅제인 유청단백을 처리하여 원료 조제하였다. 대조군인 비코팅 유산균 원료는 통상적인 원료 조제공정에 따라 조제하였다. 건조된 각각의 시료 1g을 채취하여 생균수 분석을 하였다. 이때, 실험에 사용한 유산균은 락토바실루스 속(Lactobacillus sp.) 10종, 비피도박테리움 속(Bifidobacterium sp.) 5종, 스트렙토코커스 속 (Streptococcus sp.) 2종을 대상으로 실시예 3의 제조공정에 따라 4중 코팅된 유산균과 비코팅, 단일, 2중, 3중코팅 유산균을 제조하였다.
본 발명의 4중코팅 유산균군의 50℃ 열풍건조시 생존율 실험결과
균주 비코팅 유산균의
생존율 (%)		 단일코팅 유산균의 생존율(%) 2중코팅 유산균의 생존율(%) 3중코팅 유산균의 생존율(%) 4중코팅
유산균의 생존율(%)
Lactobacillus acidophilus IDCC 3302 24 35 41 52 67
Lactobacillus bulgaricus 32 39 41 48 61
Lactobacillus casei 35 39 43 49 63
Lactobacillus fermentum 25 32 45 51 62
Lactobacillus gasseri 29 40 52 61 70
Lactobacillus helveticus 24 35 40 42 59
Lactobacillus rhamnosus 28 39 45 51 65
Lactobacillus johnsonii 28 37 42 53 66
Lactobacillus plantrum 24 39 44 55 61
Lactobacillus reuteri 21 31 41 42 55
Bifidobacterium bifidum 31 40 43 48 61
Bifidobacterium breve 20 32 41 47 58
Bifidobacterium infantis 19 24 29 35 48
Bifidobacterium lactis 27 35 41 52 64
Bifidobacterium longum 29 39 47 51 69
Streptococcus faecalis 41 45 52 59 72
Streptococcus faecium 46 49 55 62 78
그 결과, 50℃ 열풍건조 동안 비코팅 유산균군에 비해 4중코팅된 유산균군이 28~43%의 생존율이 증가하였다.
< 실시예 8>
온도별 경시적 안정성
<8-1> 4중코팅된 유산균군과 비코팅, 단일, 2중, 3중코팅 유산균군의 4℃ 경시적 안정성 비교실험
상기 실시예 3에서 제조된 본 발명에 의한 4중코팅된 유산균군과 비코팅, 단일, 2중, 3중코팅 유산균군을 365일 동안 4℃ 냉장보관 후, 시간 경과에 따라 원료 1g 당 유산균수를 측정하여 그 결과를 표 12에 기재하였다. 이때, 실험에 사용한 유산균은 락토바실루스 속(Lactobacillus sp.) 10종, 비피도박테리움 속(Bifidobacterium sp.) 5종, 스트렙토코커스 속 (Streptococcus sp.) 2종을 대상으로 실시예 3의 제조공정에 따라 4중코팅된 유산균군과 비코팅, 단일, 2중, 3중코팅 유산균군을 제조하였다.
본 발명의 4중코팅 유산균과 비코팅, 단일, 2중, 3중코팅 유산균군의 4℃ 경시적 안정성 비교실험
코팅
유무		 시험균 4℃ 경시적 안정성 생존율
(%)
0일 60일 180일 365일
비코팅 Lactobacillus acidophilus IDCC 3302 150 137 124 93 62
Lactobacillus bulgaricus 94 90 79 56 59
Lactobacillus casei 87 84 76 54 62
Lactobacillus fermentum 102 95 86 65 63
Lactobacillus gasseri 132 119 100 87 65
Lactobacillus helveticus 167 145 125 116 69
Lactobacillus rhamnosus 191 141 138 130 68
Lactobacillus johnsonii 211 179 142 116 54
Lactobacillus plantrum 120 96 86 72 60
Lactobacillus reuteri 145 102 92 84 57
Bifidobacterium bifidum 128 110 96 78 60
Bifidobacterium breve 188 140 126 106 56
Bifidobacterium infantis 166 142 166 100 60
Bifidobacterium lactis 170 137 119 90 52
Bifidobacterium longum 171 145 130 105 61
Streptococcus faecalis 90 83 71 52 57
Streptococcus faecium 75 68 64 52 69
단일
코팅		 Lactobacillus acidophilus IDCC 3302 180 171 149 124 69
Lactobacillus bulgaricus 125 115 102 82 66
Lactobacillus casei 145 137 119 98 68
Lactobacillus fermentum 122 111 107 85 70
Lactobacillus gasseri 148 138 128 105 71
Lactobacillus helveticus 171 161 139 126 74
Lactobacillus rhamnosus 200 192 168 144 72
Lactobacillus johnsonii 207 196 168 134 65
Lactobacillus plantrum 140 128 119 95 68
Lactobacillus reuteri 150 132 113 93 62
Bifidobacterium bifidum 141 135 121 97 69
Bifidobacterium breve 194 182 150 128 66
Bifidobacterium infantis 182 164 138 116 64
Bifidobacterium lactis 193 175 141 113 59
Bifidobacterium longum 191 179 149 127 67
Streptococcus faecalis 110 102 89 68 62
Streptococcus faecium 96 89 81 70 73
2중
코팅		 Lactobacillus acidophilus IDCC 3302 230 201 178 165 72
Lactobacillus bulgaricus 150 141 125 103 69
Lactobacillus casei 170 155 132 125 74
Lactobacillus fermentum 172 154 139 129 75
Lactobacillus gasseri 168 151 139 120 72
Lactobacillus helveticus 194 179 165 147 76
Lactobacillus rhamnosus 215 188 174 165 77
Lactobacillus johnsonii 227 194 180 156 69
Lactobacillus plantrum 168 152 142 120 72
Lactobacillus reuteri 175 161 135 119 68
Bifidobacterium bifidum 168 155 147 124 74
Bifidobacterium breve 215 183 174 150 70
Bifidobacterium infantis 200 181 155 136 68
Bifidobacterium lactis 225 196 174 150 67
Bifidobacterium longum 220 191 169 156 71
Streptococcus faecalis 135 122 111 99 74
Streptococcus faecium 121 115 109 90 75



3중
코팅		 Lactobacillus acidophilus IDCC 3302 260 235 222 205 79
Lactobacillus bulgaricus 160 149 135 123 77
Lactobacillus casei 175 168 151 136 78
Lactobacillus fermentum 180 171 149 144 80
Lactobacillus gasseri 198 181 159 150 76
Lactobacillus helveticus 204 189 171 161 79
Lactobacillus rhamnosus 248 226 204 198 80
Lactobacillus johnsonii 277 257 216 204 74
Lactobacillus plantrum 205 189 169 159 78
Lactobacillus reuteri 207 191 171 153 74
Bifidobacterium bifidum 198 174 166 156 79
Bifidobacterium breve 279 249 211 200 72
Bifidobacterium infantis 280 254 231 210 75
Bifidobacterium lactis 275 244 206 195 71
Bifidobacterium longum 270 251 209 197 73
Streptococcus faecalis 150 139 128 118 79
Streptococcus faecium 132 124 118 104 79








4중
코팅		 Lactobacillus acidophilusIDCC 3302 300 291 278 272 90
Lactobacillus bulgaricus 188 185 175 171 91
Lactobacillus casei 175 171 163 156 89
Lactobacillus fermentum 205 196 189 182 88
Lactobacillus gasseri 265 254 248 246 93
Lactobacillus helveticus 335 321 315 308 92
Lactobacillus rhamnosus 383 374 345 327 85
Lactobacillus johnsonii 423 411 401 398 94
Lactobacillus plantrum 240 236 224 217 90
Lactobacillus reuteri 290 281 270 248 85
Bifidobacterium bifidum 247 241 239 234 95
Bifidobacterium breve 377 369 349 346 91
Bifidobacterium infantis 333 321 303 301 90
Bifidobacterium lactis 340 326 311 303 89
Bifidobacterium longum 343 339 334 330 96
Streptococcus faecalis 180 177 169 165 91
Streptococcus faecium 150 149 142 140 93
그 결과, 4℃ 냉장보관을 365일간 지속한 후, 4중코팅된 유산균군과 비코팅 유산균군 원료의 생존균수를 분석한 결과, 4중코팅된 유산균군이 비코팅 유산균군에 비하여 약 25~40% 생존율이 높았다.
<8-2> 본 발명의 4중코팅된 유산균군과 비코팅, 단일, 2중, 3중코팅 유산균군의 15℃ 경시적 안정성 비교실험
상기 실시예 3에서 제조된 본 발명에 의한 4중코팅된 유산균군과 비코팅, 단일, 2중, 3중코팅 유산균군을 365일 동안 15℃ 보관 후, 시간 경과에 따라 원료 1g 당 유산균수를 측정하여 그 결과를 [표 13]에 기재하였다. 이때, 실험에 사용한 유산균은 락토바실루스 속(Lactobacillus sp.) 10종, 비피도박테리움 속(Bifidobacterium sp.) 5종, 스트렙토코커스 속 (Streptococcus sp.) 2종을 대상으로 실시예 3의 제조공정에 따라 4중코팅 유산균과 비코팅 유산균을 제조하였다.
본 발명의 4중코팅 유산균군과 비코팅, 단일, 2중, 3중코팅 유산균군의 15℃ 경시적 안정성 비교실험
코팅
유무		 시험균 15℃ 경시적 안정성 생존율
(%)
0일 60일 180일 365일
비코팅 Lactobacillus acidophilus IDCC 3302 150 135 104 81 54
Lactobacillus bulgaricus 94 88 69 49 52
Lactobacillus casei 87 82 69 52 59
Lactobacillus fermentum 102 90 77 54 52
Lactobacillus gasseri 132 113 97 79 59
Lactobacillus helveticus 167 140 122 109 65
Lactobacillus rhamnosus 191 121 97 89 46
Lactobacillus johnsonii 211 115 149 125 59
Lactobacillus plantrum 120 90 72 66 55
Lactobacillus reuteri 145 97 86 76 52
Bifidobacterium bifidum 128 105 94 63 49
Bifidobacterium breve 188 130 121 103 54
Bifidobacterium infantis 166 137 111 93 56
Bifidobacterium lactis 170 125 117 92 54
Bifidobacterium longum 171 142 120 100 58
Streptococcus faecalis 90 82 72 51 56
Streptococcus faecium 75 67 60 39 52
단일
코팅		 Lactobacillus acidophilusIDCC 3302 180 169 125 106 59
Lactobacillus bulgaricus 125 114 90 71 57
Lactobacillus casei 145 133 110 91 63
Lactobacillus fermentum 122 111 89 68 56
Lactobacillus gasseri 148 135 112 94 64
Lactobacillus helveticus 171 160 137 117 69
Lactobacillus rhamnosus 200 184 120 102 51
Lactobacillus johnsonii 207 189 149 130 63
Lactobacillus plantrum 140 120 101 79 57
Lactobacillus reuteri 150 136 103 84 56
Bifidobacterium bifidum 141 125 95 74 53
Bifidobacterium breve 194 171 135 114 59
Bifidobacterium infantis 182 157 131 109 60
Bifidobacterium lactis 193 169 139 111 58
Bifidobacterium longum 191 174 142 120 63
Streptococcus faecalis 110 101 89 66 60
Streptococcus faecium 96 85 71 53 56
2중
코팅		 Lactobacillus acidophilusIDCC 3302 230 201 191 174 76
Lactobacillus bulgaricus 150 137 111 94 63
Lactobacillus casei 170 164 135 115 68
Lactobacillus fermentum 172 152 128 108 63
Lactobacillus gasseri 168 158 139 119 71
Lactobacillus helveticus 194 175 164 143 74
Lactobacillus rhamnosus 215 184 142 120 56
Lactobacillus johnsonii 227 201 179 156 69
Lactobacillus plantrum 168 153 129 107 64
Lactobacillus reuteri 175 152 127 108 62
Bifidobacterium bifidum 168 148 131 100 60
Bifidobacterium breve 215 189 160 141 66
Bifidobacterium infantis 200 174 151 136 68
Bifidobacterium lactis 225 199 161 146 65
Bifidobacterium longum 220 187 170 151 69
Streptococcus faecalis 135 123 109 91 68
Streptococcus faecium 121 111 94 76 63
3중
코팅		 Lactobacillus acidophilus IDCC 3302 260 241 222 208 80
Lactobacillus bulgaricus 160 149 138 110 69
Lactobacillus casei 175 161 145 126 72
Lactobacillus fermentum 180 171 150 120 67
Lactobacillus gasseri 198 179 166 144 73
Lactobacillus helveticus 204 189 177 153 75
Lactobacillus rhamnosus 248 225 179 158 64
Lactobacillus johnsonii 277 240 221 199 72
Lactobacillus plantrum 205 189 169 147 72
Lactobacillus reuteri 207 195 171 140 68
Bifidobacterium bifidum 198 170 155 126 64
Bifidobacterium breve 279 256 221 198 71
Bifidobacterium infantis 280 264 241 201 72
Bifidobacterium lactis 275 251 225 189 69
Bifidobacterium longum 270 259 230 197 73
Streptococcus faecalis 150 140 132 108 72
Streptococcus faecium 132 111 102 88 67

4중
코팅		 Lactobacillus acidophilusIDCC 3302 300 281 255 266 88
Lactobacillus bulgaricus 188 175 165 162 86
Lactobacillus casei 175 166 153 149 84
Lactobacillus fermentum 205 186 178 174 84
Lactobacillus gasseri 265 244 135 226 85
Lactobacillus helveticus 335 298 285 272 81
Lactobacillus rhamnosus 383 358 335 318 83
Lactobacillus johnsonii 423 397 371 360 85
Lactobacillus plantrum 240 222 204 198 82
Lactobacillus reuteri 290 272 261 250 86
Bifidobacterium bifidum 247 236 217 201 81
Bifidobacterium breve 377 354 335 329 87
Bifidobacterium infantis 333 318 297 276 82
Bifidobacterium lactis 340 314 282 271 79
Bifidobacterium longum 343 302 299 277 80
Streptococcus faecalis 180 175 152 143 79
Streptococcus faecium 150 148 139 129 86
그 결과, 15℃ 보관을 365일간 지속한 후, 본 발명의 4중코팅 유산균과 비코팅 유산균 원료의 생존균수를 분석한 결과, 본 발명의 4중코팅 유산균이 비코팅 유산균에 비하여 약 30~40% 생존율이 높았다.
<8-3> 본 발명의 4중코팅 유산균과 비코팅, 단일, 2중, 3중코팅 유산균군의 25℃ 경시적 안정성 비교실험
상기 실시예 3에서 제조된 본 발명에 의한 히알루론산 다중코팅 유산균과 비코팅 유산균을 365일 동안 25℃ 보관 후, 시간 경과에 따라 원료 1g 당 유산균수를 측정하여 그 결과를 [표 14]에 기재하였다. 이때, 실험에 사용한 유산균은 락토바실루스 속(Lactobacillus sp.) 10종, 비피도박테리움 속(Bifidobacterium sp.) 5종, 스트렙토코커스 속 (Streptococcus sp.) 2종을 대상으로 실시예 3의 제조공정에 따라 본 발명의 4중코팅 유산균과 비코팅, 단일, 2중, 3중코팅 유산균군을 제조하였다.
4중코팅된 유산균군과 비코팅, 단일, 2중, 3중코팅 유산균군의 25℃ 경시적 안정성 비교실험
코팅
유무		 시험균 25℃ 경시적 안정성 생존율
(%)
0일 60일 180일 365일
비코팅 Lactobacillus acidophilus IDCC 3302 150 120 89 75 50
Lactobacillus bulgaricus 94 73 54 46 48
Lactobacillus casei 87 75 64 50 57
Lactobacillus fermentum 102 79 60 51 50
Lactobacillus gasseri 132 106 87 75 56
Lactobacillus helveticus 167 124 106 100 59
Lactobacillus rhamnosus 191 113 82 70 36
Lactobacillus johnsonii 211 160 137 121 57
Lactobacillus plantrum 120 78 55 54 45
Lactobacillus reuteri 145 92 74 61 42
Bifidobacterium bifidum 128 97 92 51 39
Bifidobacterium breve 188 120 105 96 51
Bifidobacterium infantis 166 127 96 77 46
Bifidobacterium lactis 170 116 97 70 41
Bifidobacterium longum 171 128 106 91 53
Streptococcus faecalis 90 81 57 39 43
Streptococcus faecium 75 62 50 46 61




단일
코팅		 Lactobacillus acidophilus IDCC 3302 180 161 124 93 52
Lactobacillus bulgaricus 125 101 81 62 50
Lactobacillus casei 145 122 101 85 59
Lactobacillus fermentum 122 100 82 62 51
Lactobacillus gasseri 148 126 101 84 57
Lactobacillus helveticus 171 155 119 102 60
Lactobacillus rhamnosus 200 152 125 76 38
Lactobacillus johnsonii 207 169 140 122 59
Lactobacillus plantrum 140 120 88 65 47
Lactobacillus reuteri 150 113 89 67 45
Bifidobacterium bifidum 141 120 80 59 42
Bifidobacterium breve 194 158 124 100 52
Bifidobacterium infantis 182 161 109 85 47
Bifidobacterium lactis 193 152 101 81 42
Bifidobacterium longum 191 145 123 105 55
Streptococcus faecalis 110 92 70 49 45
Streptococcus faecium 96 90 82 59 62



2중
코팅		 Lactobacillus acidophilus IDCC 3302 230 179 140 121 53
Lactobacillus bulgaricus 150 123 99 78 52
Lactobacillus casei 170 134 125 102 60
Lactobacillus fermentum 172 150 116 91 53
Lactobacillus gasseri 168 146 119 97 58
Lactobacillus helveticus 194 169 145 120 62
Lactobacillus rhamnosus 215 174 109 86 40
Lactobacillus johnsonii 227 175 159 136 60
Lactobacillus plantrum 168 132 110 80 48
Lactobacillus reuteri 175 155 115 82 47
Bifidobacterium bifidum 168 142 120 73 44
Bifidobacterium breve 215 179 135 116 54
Bifidobacterium infantis 200 177 111 98 49
Bifidobacterium lactis 225 182 131 101 45
Bifidobacterium longum 220 169 145 123 56
Streptococcus faecalis 135 105 90 62 46
Streptococcus faecium 121 102 99 76 63




3중
코팅		 Lactobacillus acidophilus IDCC 3302 260 231 190 161 62
Lactobacillus bulgaricus 160 134 119 96 60
Lactobacillus casei 175 152 131 119 68
Lactobacillus fermentum 180 160 130 109 61
Lactobacillus gasseri 198 174 155 132 67
Lactobacillus helveticus 204 169 136 106 52
Lactobacillus rhamnosus 248 201 194 161 65
Lactobacillus johnsonii 277 221 165 138 50
Lactobacillus plantrum 205 165 130 102 50
Lactobacillus reuteri 207 174 120 99 48
Bifidobacterium bifidum 198 162 140 112 57
Bifidobacterium breve 279 241 195 161 58
Bifidobacterium infantis 280 245 202 159 57
Bifidobacterium lactis 275 229 192 165 60
Bifidobacterium longum 270 239 198 148 55
Streptococcus faecalis 150 129 98 87 58
Streptococcus faecium 132 112 106 88 67






4중
코팅		 Lactobacillus acidophilusIDCC 3302 300 261 248 236 78
Lactobacillus bulgaricus 188 165 145 142 75
Lactobacillus casei 175 143 131 129 73
Lactobacillus fermentum 205 151 145 141 68
Lactobacillus gasseri 265 221 195 194 73
Lactobacillus helveticus 335 265 255 241 71
Lactobacillus rhamnosus 383 336 295 282 73
Lactobacillus johnsonii 423 374 341 339 80
Lactobacillus plantrum 240 208 182 174 72
Lactobacillus reuteri 290 267 231 221 76
Bifidobacterium bifidum 247 231 185 178 72
Bifidobacterium breve 377 335 325 317 84
Bifidobacterium infantis 333 298 252 249 74
Bifidobacterium lactis 340 288 241 248 72
Bifidobacterium longum 343 292 265 253 73
Streptococcus faecalis 180 171 132 131 72
Streptococcus faecium 150 147 131 122 81
그 결과, 25℃ 보관을 365일간 지속한 후, 히알루론산을 이용한 4중코팅된 유산균군과 비코팅 유산균군 원료의 생존균수를 분석한 결과, 본 발명의 4중코팅된 유산균군이 비코팅 유산균군에 비하여 약 10~35% 생존율이 높았다.
<8-4> 본 발명의 4중코팅된 유산균군과 비코팅, 단일, 2중, 3중코팅 유산균군의 37℃ 경시적 안정성 비교실험
상기 실시예 3에서 제조된 본 발명에 의한 본 발명의 4중코팅된 유산균군과 비코팅, 단일, 2중, 3중코팅 유산균군을 365일 동안 37℃ 보관 후, 시간 경과에 따라 원료 1g 당 유산균수를 측정하여 그 결과를 [표 15]에 기재하였다. 이때, 실험에 사용한 유산균은 락토바실루스 속(Lactobacillus sp.) 10종, 비피도박테리움 속(Bifidobacterium sp.) 5종, 스트렙토코커스 속 (Streptococcus sp.) 2종을 대상으로 실시예 3의 제조공정에 따라 본 발명의 4중코팅된 유산균군과 비코팅, 단일, 2중, 3중코팅 유산균군을 제조하였다.
본 발명의 4중코팅된 유산균군과 비코팅, 단일, 2중, 3중코팅 유산균군의 37℃ 경시적 안정성 비교실험
코팅
유무		 시험균 37℃ 경시적 안정성 생존율
(%)
0일 60일 180일 365일
비코팅 Lactobacillus acidophilus IDCC 3302 150 110 75 62 41
Lactobacillus bulgaricus 94 73 39 38 40
Lactobacillus casei 87 60 59 43 49
Lactobacillus fermentum 102 63 55 42 40
Lactobacillus gasseri 132 92 77 66 49
Lactobacillus helveticus 167 104 96 90 53
Lactobacillus rhamnosus 191 103 76 55 26
Lactobacillus johnsonii 211 155 129 95 49
Lactobacillus plantrum 120 63 46 36 30
Lactobacillus reuteri 145 83 68 35 24
Bifidobacterium bifidum 128 96 87 56 45
Bifidobacterium breve 188 115 91 71 37
Bifidobacterium infantis 166 105 76 50 30
Bifidobacterium lactis 170 98 75 35 20
Bifidobacterium longum 171 118 91 75 43
Streptococcus faecalis 90 75 47 32 36
Streptococcus faecium 75 60 43 37 50
단일
코팅		 Lactobacillus acidophilus IDCC 3302 180 152 108 77 43
Lactobacillus bulgaricus 125 101 88 55 44
Lactobacillus casei 145 115 109 75 52
Lactobacillus fermentum 122 95 80 52 43
Lactobacillus gasseri 148 112 106 75 51
Lactobacillus helveticus 171 134 125 92 54
Lactobacillus rhamnosus 200 152 91 58 29
Lactobacillus johnsonii 207 169 136 105 51
Lactobacillus plantrum 140 110 81 47 34
Lactobacillus reuteri 150 125 79 39 26
Bifidobacterium bifidum 141 103 96 66 47
Bifidobacterium breve 194 154 110 77 40
Bifidobacterium infantis 182 155 126 90 35
Bifidobacterium lactis 193 142 78 48 25
Bifidobacterium longum 191 149 110 85 45
Streptococcus faecalis 110 92 70 44 40
Streptococcus faecium 96 85 71 49 52







2중
코팅		 Lactobacillus acidophilus IDCC 3302 230 184 140 110 48
Lactobacillus bulgaricus 150 132 112 73 49
Lactobacillus casei 170 153 131 96 57
Lactobacillus fermentum 172 154 112 82 48
Lactobacillus gasseri 168 141 128 94 56
Lactobacillus helveticus 194 162 130 114 59
Lactobacillus rhamnosus 215 167 105 73 34
Lactobacillus johnsonii 227 184 151 127 56
Lactobacillus plantrum 168 132 90 65 39
Lactobacillus reuteri 175 135 85 54 31
Bifidobacterium bifidum 168 142 116 84 50
Bifidobacterium breve 215 162 123 96 45
Bifidobacterium infantis 200 152 115 82 41
Bifidobacterium lactis 225 169 109 72 32
Bifidobacterium longum 220 170 140 107 49
Streptococcus faecalis 135 113 91 56 42
Streptococcus faecium 121 106 92 65 54
3중
코팅		 Lactobacillus acidophilus IDCC 3302 260 221 189 150 58
Lactobacillus bulgaricus 160 142 132 94 59
Lactobacillus casei 175 161 147 117 67
Lactobacillus fermentum 180 152 135 102 57
Lactobacillus gasseri 198 174 152 128 65
Lactobacillus helveticus 204 182 160 138 68
Lactobacillus rhamnosus 248 162 142 104 42
Lactobacillus johnsonii 277 233 209 188 68
Lactobacillus plantrum 205 169 136 96 47
Lactobacillus reuteri 207 152 115 82 40
Bifidobacterium bifidum 198 174 144 114 58
Bifidobacterium breve 279 201 185 159 57
Bifidobacterium infantis 280 223 177 148 53
Bifidobacterium lactis 275 205 171 121 44
Bifidobacterium longum 270 221 180 140 52
Streptococcus faecalis 150 132 106 84 56
Streptococcus faecium 132 110 101 76 58
4중
코팅		 Lactobacillus acidophilus IDCC 3302 300 241 235 211 70
Lactobacillus bulgaricus 188 155 135 124 66
Lactobacillus casei 175 132 121 114 65
Lactobacillus fermentum 205 138 125 122 59
Lactobacillus gasseri 265 200 175 169 64
Lactobacillus helveticus 335 218 205 202 60
Lactobacillus rhamnosus 383 325 285 229 59
Lactobacillus johnsonii 423 352 321 307 72
Lactobacillus plantrum 240 188 162 151 63
Lactobacillus reuteri 290 231 201 192 66
Bifidobacterium bifidum 247 222 185 151 61
Bifidobacterium breve 377 312 285 264 70
Bifidobacterium infantis 333 274 232 209 62
Bifidobacterium lactis 340 265 241 221 65
Bifidobacterium longum 343 281 265 219 64
Streptococcus faecalis 180 165 132 114 63
Streptococcus faecium 150 145 131 108 72
그 결과, 37℃ 보관을 365일간 지속한 후, 본 발명의 4중코팅된 유산균군과 비코팅 유산균군 원료의 생존균수를 분석한 결과, 본 발명의 4중코팅된 유산균군이 비코팅 유산균군에 비하여 약 30%이상 생존율이 증가하였다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 4중 코팅된 유산균의 제조방법, 그 방법으로 제조된 4중 코팅된 유산균을 제공한다. 본 발명의 방법으로 코팅된 유산균은 유산균에 수용성 폴리머, 히알루론산, 다공성 입자를 가지는 코팅제, 단백질을 혼합하여 4중 코팅함으로써, 종래 비코팅, 단일, 2중, 3중코팅 유산균군에 비하여 내산성 및 내담즙성이 우수하고, 저온 또는 고온으로 인한 사멸율이 낮으므로, 유산균 본래의 생리활성 기능을 소실하지 않을 수 있다. 따라서 본 발명의 코팅 방법은 유산균의 생리활성 기능을 유지할 수 있게 하여 산업적으로 유용한 방법이다.

Claims (8)

  1. (a) 유산균에 수용성 폴리머를 혼합하여 1차 코팅하는 단계;
    (b) 상기 (a)단계에서 1차 코팅된 유산균에 히알루론산을 혼합하여 2차 코팅하는 단계;
    (c) 상기 (b)단계에서 2차 코팅된 유산균에 다공성 입자를 가지는 코팅제를 혼합하여 3차 코팅하는 단계; 및
    (d) 상기 (c)단계에서 3차 코팅된 유산균에 단백질을 혼합하여 4차 코팅하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 4중 코팅된 유산균의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (a)단계에서 수용성폴리머는 카르복시메틸셀룰로오스(carboxymethyl cellulose,CMC), 하이드록시에틸셀룰로오스(hydroxyethylcellulose,HEC), 잔탄검(xanthan gum, XG), 구아검(guar gum,GG), 폴리비닐피롤리돈 (polyvinylpyrroridone, PVP), 카보폴(carbopol), 소듐알기네이트(sodium alginate), 프로필렌 글리콜 알기네이트(propylene glycol alginate)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 4중 코팅된 유산균의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 (c)단계에서 다공성 입자를 가지는 코팅제는 알지네이트(alginate), 말토덱스트린(maltodextrin,MD), 키토산(chitosan), 전분(starch), 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol, PEG), 트리아세틴(triacetin), 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 아세틸트리에틸 시트레이트(acetyl triethyl citrate), 트리에틸 시트레이트(triethyl citrate), 또는 글리세린(glycerin)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 4중 코팅된 유산균의 제조방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 (d)단계에서 단백질은 탈지분유, 유청단백, 분리대두단백으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 4중 코팅된 유산균의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 유산균은 락토바실루스 속(Lactobacillus sp.), 비피도박테리움 속(Bifidobacterium sp.), 스트렙토코커스 속(Streptococcus sp.), 락토코커스 속(Lactococcus sp.), 엔테로코커스 속(Enterococcus sp.), 페디오코커스 속(Pediococcus sp.), 류코노스톡 속(Leuconostoc sp.), 비셀라 속(Weissella sp.)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 4중 코팅된 유산균의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 (a)단계에서 상기 수용성 폴리머는 유산균 배양액 100 중량부 대비 0.1중량부 내지 10중량부의 비율로 혼합하여 1차 코팅하는 단계;
    상기 (b)단계에서 상기 히알루론산은 유산균 배양액 100 중량부 대비 0.001중량부 내지 5중량부의 비율로 혼합하여 2차 코팅하는 단계;
    상기 (c)단계에서 상기 다공성 입자를 가지는 코팅제는 유산균 배양액 100 중량부 대비 0.1중량부 내지 10중량부의 비율로 혼합하여 3차 코팅하는 단계; 및
    상기 (d)단계에서 상기 단백질은 유산균 배양액 100 중량부 대비 1중량부 내지 30중량부의 비율로 혼합하여 4차 코팅하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 4중 코팅된 유산균의 제조방법.
  7. 제1항의 제조방법으로 제조된 4중 코팅된 유산균.
  8. 제7항에 있어서, 상기 유산균은 락토바실루스 속(Lactobacillus sp.), 비피도박테리움 속(Bifidobacterium sp.), 스트렙토코커스 속(Streptococcus sp.), 락토코커스 속(Lactococcus sp.), 엔테로코커스 속(Enterococcus sp.), 페디오코커스 속(Pediococcus sp.), 류코노스톡 속(Leuconostoc sp.), 비셀라 속(Weissella sp.)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 4중 코팅된 유산균.
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