KR101271964B1 - A pharmaceutical composition for treating gallbladder carcinoma, a method for inhibiting growth or invasion of gallbladder carcinoma and a method for treating gallbladder carcinoma - Google Patents

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Abstract

본 발명은 담낭암의 세포 표면에 존재하는 단백질인 L1CAM (L1 cell adhision molecule)에 특이적으로 결합하는 L1CAM 특이적인 항-L1CAM 항체 또는 그 항-L1CAM 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 담낭암의 성장 또는 전이를 억제하는 약제학적 조성물, 상기 L1CAM의 발현을 억제하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 담낭암의 성장 또는 전이를 억제하는 약제학적 조성물, 상기 약제학적 조성물을 이용하여 담낭암을 치료하는 방법 및 나쁜 예후를 가지는 담낭암의 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여 L1CAM에 특이적인 항-L1CAM 항체 또는 올리고뉴클레오티드를 이용하여 환자의 시료로부터 L1CAM을 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 담낭암 세포 표면의 L1CAM 단백질을 인식하며 담낭암 조직에 특이적으로 결합하는 항체 또는 siRNA, shRNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 이를 포함하는 약제학적 조성물은 담낭암의 성장, 침윤 및 이동을 억제 및 세포 사멸을 유도할 수 있으므로, 보다 안전하면서도 효과적인 담낭암의 예방 및 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.The present invention provides a growth or metastasis of gallbladder cancer comprising an L1CAM-specific anti-L1CAM antibody or an antigen-binding fragment of the anti-L1CAM antibody that specifically binds to L1CAM (L1 cell adhision molecule), a protein present on the cell surface of gallbladder cancer. Pharmaceutical composition that inhibits the growth or metastasis of gallbladder cancer comprising an oligonucleotide that inhibits the expression of L1CAM, a method for treating gallbladder cancer using the pharmaceutical composition, and a gallbladder cancer having a poor prognosis. A method for detecting L1CAM from a patient's sample using an anti-L1CAM antibody or oligonucleotide specific for L1CAM to provide information necessary for diagnostic or prognostic prediction. Antibodies or siRNAs, shRNAs or antisense oligonucleotides that recognize L1CAM protein on the surface of gallbladder cancer cells of the present invention and specifically bind to gallbladder cancer tissues, and pharmaceutical compositions comprising the same, inhibit the growth, infiltration and migration of gallbladder cancer, and inhibit cell death. Inducible, therefore, may be widely used in the prevention and treatment of safer and more effective gallbladder cancer.

Description

담낭암 치료용 약제학적 조성물 및 이를 이용한 담낭암의 성장, 전이 억제 및 치료 방법{A pharmaceutical composition for treating gallbladder carcinoma, a method for inhibiting growth or invasion of gallbladder carcinoma and a method for treating gallbladder carcinoma}A pharmaceutical composition for treating gallbladder carcinoma, a method for inhibiting growth or invasion of gallbladder carcinoma and a method for treating gallbladder carcinoma}

본 발명은 담낭암 치료용 약제학적 조성물 및 이를 이용한 담낭암의 성장, 전이 억제 및 치료 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 담낭암의 세포 표면에 존재하는 단백질인 L1CAM (L1 cell adhision molecule)에 특이적으로 결합하는 항-L1CAM 항체 또는 그 항-L1CAM 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 담낭암의 성장 또는 전이를 억제하는 약제학적 조성물, 상기 L1CAM의 발현을 억제하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 담낭암의 성장 또는 전이를 억제하는 약제학적 조성물, 상기 약제학적 조성물을 이용하여 담낭암을 치료하는 방법 및 나쁜 예후를 가지는 담낭암의 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여 L1CAM에 특이적인 항-L1CAM 항체 또는 올리고뉴클레오티드를 이용하여 환자의 시료로부터 L1CAM을 검출하는 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a pharmaceutical composition for treating gallbladder cancer and a method for inhibiting growth and metastasis of gallbladder cancer using the same. More specifically, the present invention relates to L1CAM (L1 cell adhision molecule), a protein present on the cell surface of gallbladder cancer. A pharmaceutical composition that inhibits the growth or metastasis of gallbladder cancer comprising an anti-L1CAM antibody or an antigen-binding fragment of the anti-L1CAM antibody, which binds to a cell, and the growth or metastasis of the gallbladder cancer comprising an oligonucleotide that inhibits the expression of L1CAM. Inhibiting pharmaceutical compositions, methods of treating gallbladder cancer using the pharmaceutical compositions, and using anti-L1CAM antibodies or oligonucleotides specific to L1CAM to provide information necessary for the diagnosis or prediction of gallbladder cancer with a poor prognosis. A method for detecting L1CAM from a patient's sample.

담낭암(gallbladder carcinoma, 이하 GBC라고도 함)은 담낭(쓸개)에서 생기는 악성 종양으로, 담낭 세포에서 발생하는 선암종이 거의 대부분을 차지하고 있어 일반적으로 담낭암이라 하면 담낭 선암종을 말한다. 담낭은 간 바로 아래 위치한 작은 복숭아 모양의 장기로서, 지방질의 소화를 돕기 위해 간이 생산하는 분비물인 담즙을 저장하고 있다가, 음식을 섭취하면 담관을 통해 소장으로 담즙을 배출하는 역할을 한다. Gallbladder carcinoma (also referred to as GBC) is a malignant tumor of the gallbladder (gallbladder), and most of the adenocarcinomas that occur in the gallbladder cells are generally called gallbladder adenocarcinoma. The gallbladder is a small peach-shaped organ just below the liver that stores bile, a secretion produced by the liver to aid in the digestion of fat, and when ingested, it acts to release bile into the small intestine through the bile ducts.

담낭암은 아주 흔하게 발생하지는 않으나 다른 암과는 달리 조직검사가 대부분 불가능하여 조기 진단이 어렵고, 일단 발생하면 다른 암들과 비교하여 훨씬 예후가 좋지 않은 특징을 가지며, 미국에서는 매년 약 6000-7000명이 발생한다. 담낭암 발생의 위험 인자로는 담석과 만성 담낭염, 췌담관 합류 이상, 석회화 담낭(porcelain gallbladder), 장티푸스 보균자, 여러 가지 화학물질 등이 제시되고 있지만 이들이 어떠한 과정에 의해 담낭암 발생과 연관되어 있는지는 아직 명확하게 밝혀져 있지 않으며, 담낭암의 발생 원인에 대한 기전은 아직 잘 알려져 있지 않으며, 담낭암의 치료를 위한 타겟 분자도 알려져 있지 않다. Gallbladder cancer is not very common, but unlike other cancers, most biopsies are impossible, so early diagnosis is difficult, and once it occurs, it has a much poorer prognosis than other cancers. . Risk factors for the development of gallbladder cancer include gallstones, chronic cholecystitis, pancreatic bile duct abnormalities, calcified gallbladder, typhoid carriers, and various chemicals. It is not known, and the mechanism of the cause of gallbladder cancer is not well known, and the target molecule for the treatment of gallbladder cancer is not known.

공지의 암 예후 인자(prognostic factor)로 잘 알려져 있는 EGFR(epidermal growth factor receptor, 상피성장인자 수용체)의 유전자는 원암유전자(proto-oncogene)으로서 암의 생성(tumorigenesis)과 aggressive growth behaviour에 관여하는 것으로 밝혀져 있으며, EGFR은 유방암, 폐암, 대장암, 신장암, 담낭암, 두경부암, 난소암, 전립선암, 자궁경부암 및 위암 등 여러 다양한 암에서 과다발현된다 (Modjtahedi, H. and Dean, C. The receptor for EGF and its ligands: expression, prognostic value and target for therapy in cancer. Int. J. Oncol. 4: 277-296, 1994). 또한, EGFR 발현과 암 예후와의 관계는 암마다 다 같지 않다 (Nicholson, R.I. et al. EGFR and cancer prognosis. Eur. J. Cancer 37, S9-S15, 2001). 예를 들면, EGFR은 방광암, 자궁경부암, 식도암, 두경부암 및 난소암에서는 강력한 예후 인자(strong prognosis factor)이지만, 비소세포폐암(NSCLC, non-small cell lung carcinoma)에서는 약한 예후 인자(weak pronostic indicator)로 밝혀졌다. 그러나 담낭암에 대해서는 알려진 바가 없다.The gene for epidermal growth factor receptor (EGFR), a well-known cancer prognostic factor, is a proto-oncogene that is involved in cancer production and aggressive growth behavior. EGFR is overexpressed in many different cancers, including breast cancer, lung cancer, colon cancer, kidney cancer, gallbladder cancer, head and neck cancer, ovarian cancer, prostate cancer, cervical cancer and stomach cancer (Modjtahedi, H. and Dean, C. The receptor). for EGF and its ligands: expression, prognostic value and target for therapy in cancer.Int. J. Oncol. 4: 277-296, 1994). In addition, the relationship between EGFR expression and cancer prognosis is not the same between cancers (Nicholson, R.I. et al. EGFR and cancer prognosis. Eur. J. Cancer 37, S9-S15, 2001). For example, EGFR is a strong prognosis factor in bladder cancer, cervical cancer, esophageal cancer, head and neck cancer and ovarian cancer, but weak pronostic indicator in non-small cell lung carcinoma (NSCLC). It turned out. However, nothing is known about gallbladder cancer.

또한 EGFR에 대한 치료용 항체의 각 암세포 성장에 대한 억제 효율도 15-50% 정도로 다르게 나타났으며, 또한 같은 암 종류라 하더라도 생체 외 및 생체 내 성장 저해 (in vitro and in vivo growth inhibition) 효과가 다르게 나타났다 (Dassonville, O. et al., EGFR targeting therapies: monoclonal antibodies versus tyrosine kinase inhibitors similarities and differences. Critical Reviews in Oncology/Hematology 62, 53-61,2007). 현재 EGFR에 대한 항체는 대장암 및 두경부암 치료제로서 임상적으로 이용되고 있을 뿐, 상기에서 열거한 EGFR이 과발현된 암조직 모두에 대한 치료제로 다 사용되고 있는 것이 아니다.In addition, the inhibitory efficiency of each antibody for the growth of cancer cells against EGFR was about 15-50%, and the same type of cancer had an in vitro and in vivo growth inhibition effect. (Dassonville, O. et al., EGFR targeting therapies: monoclonal antibodies versus tyrosine kinase inhibitors similarities and differences. Critical Reviews in Oncology / Hematology 62, 53-61, 2007). Currently, the antibody against EGFR is used clinically as a therapeutic agent for colorectal cancer and head and neck cancer, and the above-mentioned EGFR is not used as a treatment for all overexpressed cancer tissues.

이와 같이, 단백질이 암세포에서 발현되는 것만으로 상기 단백질이 암의 예후 인자일 것임은 쉽게 유추할 수 있는 것이 아닐 뿐만 아니라, 이와 같은 발현 및 암의 예후와의 관련성은 암 종류마다 다름이 종래에 잘 알려져 있었다. 암에 있어 강력하고 나쁜(strong and poor) 예후 인자는 암에 대한 치료 효과 및 예후를 용이하게 예측할 수 있게 할 뿐만 아니라, 이들 인자를 타겟으로 하는 치료제를 개발하여 선택적이고 효과적인 암의 치료 방법의 개발을 가능하게 하는바, 각 암의 종류에 따른 이러한 예후 인자의 발굴은 암의 진단 및 치료에 있어 매우 중요하다.
As such, the fact that only the protein is expressed in cancer cells may not be easily inferred that the protein is a prognostic factor of cancer, and the relationship between the expression and the prognosis of the cancer may vary depending on the type of cancer. It was known. Strong and poor prognostic factors for cancer not only make it easy to predict the therapeutic effect and prognosis for cancer, but also develop therapeutic agents targeting these factors to develop selective and effective treatment methods for cancer. In this regard, the discovery of these prognostic factors according to the type of cancer is very important in the diagnosis and treatment of cancer.

한편, L1CAM (L1 cell adhesion molecule)은 세포 표면에서 세포간부착(cell-to-cell adhesion)을 중개하는 면역글로불린 수퍼패밀리 세포부착단백질들(immunoglobulin superfamily cell adhesion molecules, CAMs)에 속하는 내재성 막 당단백질(integral membrane glycoprotein)중 하나로서, 그 분자량은 220 kDa에 달한다. L1CAM은 원래 뉴런에서 발견되었으며(Bateman, et al, EMBO J. 15:6050-6059; 1996), 그 기능은 뉴런의 이동, 신경 돌기의 성장 및 세포 이동으로 알려져 있다. 사람의 L1CAM 유전자는 마우스와 뮤린의 L1CAM 상동체(homolog)에서 축퇴성 올리고뉴클레오티드(degenerate oligonucleotide)를 프로브로 사용하여 인간 태아의 뇌 cDNA 라이브러리로부터 분리하였다(Hlavin, M. L. & Lemmon, V. Genomics 11: 416-423, 1991; 미국 특허 제 5872225 호, 등록일 1999. 2. 16). 이것은 원래 주로 뇌에서 발현되는 것으로 알려졌지만 몇몇 정상조직 및 최근에는 여러 암세포에서도 발견되기 시작하였다. On the other hand, L1CAM (L1 cell adhesion molecule) is an endogenous membrane sugar belonging to immunoglobulin superfamily cell adhesion molecules (CAMs) that mediate cell-to-cell adhesion at the cell surface. One of the proteins (integral membrane glycoprotein), the molecular weight of 220 kDa. L1CAM was originally found in neurons (Bateman, et al, EMBO J. 15: 6050-6059; 1996) and its function is known as neuronal migration, neurites growth and cell migration. Human L1CAM genes were isolated from human fetal brain cDNA libraries using degenerate oligonucleotides as probes in L1CAM homologs of mice and murines (Hlavin, ML & Lemmon, V. Genomics 11: 416-423, 1991; US Pat. No. 5,872,225, Feb. 16, 1999). It was originally known to be expressed mainly in the brain, but it has also been found in some normal tissues and recently in many cancer cells.

L1CAM과 암과의 연관성은, L1CAM이 흑색종(melanoma), 신경아세포종(neuroblastoma), 난소암 및 대장암 등 여러 암에서 발현되는 것이 보고되었으며 (Takeda, et al., J. Neurochem. 66:2338-2349, 1996; Thies et al, Eur. J. Cancer, 38:1708-1716, 2002; Arlt et al., Cancer Res. 66:936-943, 2006; Gavert et al., J. Cell Biol. 168:633-642, 2005), 막 결합 형(membrane bound form) 외에도 절단된 산물(cleavage product)이 세포 외로 분비되는 것이 발견된다 (Gutwein et al., FASEP J. 17(2):292-4, 2003). 그리고 최근 암세포의 성장에 중요한 역할을 하는 분자의 하나로 탐색됨으로써(Primiano, et al., Cancer Cell. 4(1):41-53 2003), 암치료의 새로운 타겟으로 부상되었다(US2004/0115206 A1 출원 2004.6.17). 최근 L1CAM이 대장암의 인베이시브 프론트(invasive front)에서 발현되고(Gavert, et al., J Cell Biol. 14;168(4):633-42. 2005), 난소암에서 이 분자에 대한 항체가 암세포 성장과 전이를 억제함이 밝혀졌다(Arlt, et al., Cancer Res. 66:936-943. 2006). The association of L1CAM with cancer has been reported to be expressed in several cancers, including melanoma, neuroblastoma, ovarian cancer and colorectal cancer (Takeda, et al., J. Neurochem. 66: 2338). -2349, 1996; Thies et al, Eur. J. Cancer, 38: 1708-1716, 2002; Arlt et al., Cancer Res. 66: 936-943, 2006; Gavert et al., J. Cell Biol. 168 : 633-642, 2005) In addition to membrane bound forms, cleavage products are found to be secreted extracellularly (Gutwein et al., FASEP J. 17 (2): 292-4, 2003). And recently, as one of the molecules that play an important role in the growth of cancer cells (Primiano, et al., Cancer Cell. 4 (1): 41-53 2003), has emerged as a new target of cancer therapy (US2004 / 0115206 A1 application) 2004.6.17). Recently L1CAM is expressed in the invasive front of colorectal cancer (Gavert, et al., J Cell Biol. 14; 168 (4): 633-42. 2005), and antibodies against this molecule in ovarian cancer Has been shown to inhibit cancer cell growth and metastasis (Arlt, et al., Cancer Res. 66: 936-943. 2006).

그러나 L1CAM이 담낭암에 발현된다는 사실은 아직 알려져 있지 않았으며, 더욱이 담낭암의 성장과 전이에 중요하게 작용하는지도 알려져 있지 않으며, L1CAM이 고발현되어 있는 담낭암 환자의 사망률이 저발현되어 있는 담낭암 환자의 사망률보다 더 높은지, 즉 L1CAM이 담낭암의 나쁜 예후 인자임이 아직 알려지지 않았으며, 더욱이 L1CAM에 대한 항체가 담낭암의 증식이나 전이를 억제함으로써 치료제로서 가능성이 있다는 사실은 아직 알려지지 않았다. However, it is not yet known that L1CAM is expressed in gallbladder cancer, and it is not known that it plays an important role in the growth and metastasis of gallbladder cancer, and the mortality rate of gallbladder cancer patients with low expression of gallbladder cancer patients with high L1CAM expression It is not yet known whether it is higher, ie L1CAM is a poor prognostic factor for gallbladder cancer, and furthermore, it is not yet known that antibodies against L1CAM have potential as therapeutic agents by inhibiting the growth or metastasis of gallbladder cancer.

유럽 특허출원 EP 1 172 654 A1 및 미국 특허출원 US 2004/0259084호는, L1CAM이 난소암, 자궁내막암 또는 그러한 암의 소인의 존재에 대한 표식이 된다는 전제 하에, 난소암 또는 자궁내막암의 진단 및 예후를 위해 환자의 샘플에서 L1CAM의 항체를 통해 L1CAM 수준을 결정하는 것을 특징으로 하는 수단 및 세포 독성을 가진 약물과 L1CAM 항체 및 그 부분을 결합시켜 충분한 양으로 환자에게 투여하여 암을 치료하는 방법에 대해 개시하고 있다. 그러나 이 문헌들은 단지 L1CAM 단백질이 체액 또는 조직에서 난소암 또는 자궁내막암의 매우 특이적인 마커임을 기재하고 있을 뿐이다.European patent application EP 1 172 654 A1 and US patent application US 2004/0259084 disclose the diagnosis of ovarian cancer or endometrial cancer, provided that L1CAM is a marker for the presence of ovarian cancer, endometrial cancer or the predisposition of such cancer. And means for determining L1CAM levels through antibodies of L1CAM in a patient's sample for prognosis and methods for treating cancer by combining L1CAM antibodies and portions thereof with a drug with cytotoxicity and administering to the patient in a sufficient amount. Is disclosed. However, these documents only describe that L1CAM protein is a very specific marker of ovarian cancer or endometrial cancer in body fluids or tissues.

미국 특허출원 US 2004/0115206호는 L1CAM에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 암세포 사멸을 유도하는 제제, 세포 사멸을 위해 상기 항체를 사용하는 수단 및 L1CAM 항체가 포함된 약제학적 조성물에 관하여 개시하면서, 암세포에서 세포 성장을 저해하고 세포사를 유도할 수 있는 유효량의 항 L1CAM 항체를 세포에 접촉(contacting)시키는 것에 의해 세포의 성장을 억제하고 세포 사멸을 유도하는 것이 개시되어 있다. 그러나 이 문헌 역시 L1CAM이 발현되는 암의 예로서 유방암, 대장암, 자궁경부암에 대해서만 언급하고 있고, 인 비트로 시험만 했을 뿐, 담낭암과의 관련성에 대해서는 언급하고 있지 않다. 또한, 항 L1CAM 항체를 암세포에 접촉시킴으로써 세포 성장 억제 및 세포 사멸을 유도하는 것에 대해서만 개시하고 있을 뿐, 암세포의 이동, 침투 및 전이를 억제할 수 있다는 것은 개시하고 있지 않다. US patent application US 2004/0115206 discloses an agent that induces cancer cell death using an antibody that specifically binds L1CAM, a means of using the antibody for cell death, and a pharmaceutical composition comprising L1CAM antibody. Inhibiting cell growth and inducing cell death by contacting the cells with an effective amount of an anti-L1CAM antibody capable of inhibiting cell growth and inducing cell death in cancer cells. However, this document also mentions breast cancer, colon cancer and cervical cancer only as an example of cancer expressing L1CAM, and has only been tested in vitro and does not mention the relationship with gallbladder cancer. In addition, it only discloses to induce cell growth inhibition and cell death by contacting the anti-L1CAM antibody with cancer cells, but does not disclose that cancer cell migration, penetration and metastasis can be suppressed.

또한, 국제출원 PCT/EP2005/008148은 난소 및 자궁내막암에서 과발현되는 L1CAM 단백질 및 그들의 발현을 저해하는 조성물 및 이를 이용하여 난소 및 자궁내막암을 예방 및 치료하는 방법을 제공한다. 이 문헌은 L1CAM 단백질의 기능을 저해하는 L1CAM 항체 및 그의 유도체를 포함하는 조성물이 난소암 및 자궁내막암의 기능을 억제하여 암세포의 이동 및 진전을 저지하여 암의 치료가 가능하다고 기재하고 있다. 그러나 이 문헌 역시 단지 난소암 및 자궁내막암에서 세포 표면 또는 수용성 형태의 L1CAM이 암세포의 이동을 촉진한다는 것에 대해서만 기재하고 있을 뿐이다. In addition, international application PCT / EP2005 / 008148 provides L1CAM proteins overexpressed in ovarian and endometrial cancer and compositions that inhibit their expression and methods for preventing and treating ovarian and endometrial cancer using the same. This document describes that compositions comprising L1CAM antibodies and derivatives thereof that inhibit the function of L1CAM protein inhibit the function of ovarian cancer and endometrial cancer and thus inhibit the migration and progression of cancer cells, thereby treating cancer. However, this document also only describes that cell surface or soluble form of L1CAM promotes the migration of cancer cells in ovarian and endometrial cancers.

요컨대, 지금까지 L1CAM이 유방암, 난소암, 대장암, 피부암 등에 발현됨은 밝혀졌으나 담낭암에서 발현된 사실은 밝혀지지 않았으며, 종래 공지된 문헌들에는 L1CAM이 담낭암에서 높은 발현율로 발현되고, 담낭암에 특이적인 나쁜 예후 인자(poor prognositic factor)로서 작용하며, 따라서 L1CAM에 대한 항체와 같이 L1CAM의 활성을 억제하는 물질은 특히 담낭암에 대한 탁월한 진단 또는 치료 효과를 가질 수 있음에 대해서는 전혀 개시하지 않고 있다.
In short, it has been found that L1CAM is expressed in breast cancer, ovarian cancer, colorectal cancer, skin cancer, etc., but it has not been expressed in gallbladder cancer, and conventionally known documents express L1CAM with high expression rate in gallbladder cancer and are specific for gallbladder cancer. It is never disclosed that substances that act as poor prognositic factors, and thus inhibit the activity of L1CAM, such as antibodies against L1CAM, may have an excellent diagnostic or therapeutic effect, particularly for gallbladder cancer.

이에, 본 발명자들은 A10-A3 항체를 이용하여 담낭암 환자의 담남암 조직에서 L1CAM이 고발현됨을 확인하였으며, 특히 담낭암의 전이의 시작을 알리는 인베이시브 프론트(invasive front)에서 L1CAM이 고발현됨을 확인하였다. 그리고 L1CAM의 발현과 생존율과의 상관관계에 대한 통계학적 분석 결과로부터, L1CAM 발현율이 높은 그룹의 담낭암 환자의 사망률이 L1CAM 발현율이 낮은 그룹의 담낭암환자의 사망률보다 확실히 높음을 확인하고, 이러한 결과로부터 L1CAM이 담낭암의 나쁜 예후 인자(poor prognostic factor)임을 증명하는 인자이며 L1CAM이 담낭암 치료의 중요 타겟이 될 수 있음을 밝힘으로써, L1CAM의 활성 또는 발현을 억제하는 물질을 포함하는, 담낭암의 성장 또는 전이를 억제하는 약제학적 조성물이 담낭암의 진단 및 치료에 이용할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
Thus, the present inventors confirmed that L1CAM was highly expressed in gallbladder cancer tissue of gallbladder cancer patients using A10-A3 antibody, and particularly, that L1CAM was highly expressed in an invasive front indicating the onset of gallbladder cancer metastasis. It was. From the statistical analysis of the correlation between the expression and survival rate of L1CAM, it was confirmed that the mortality rate of gallbladder cancer patients in the group with high L1CAM expression rate was significantly higher than that of gallbladder cancer patients in the group with low L1CAM expression rate. It is a factor that proves the poor prognostic factor of gallbladder cancer and suggests that L1CAM may be an important target for the treatment of gallbladder cancer, thereby preventing the growth or metastasis of gallbladder cancer, including substances that inhibit the activity or expression of L1CAM. The present invention has been completed by confirming that inhibitory pharmaceutical compositions can be used for the diagnosis and treatment of gallbladder cancer.

본 발명의 목적은 L1CAM의 활성 또는 발현을 억제하는 물질을 포함하는 담낭암의 성장 또는 전이를 억제하는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다. It is an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition that inhibits the growth or metastasis of gallbladder cancer comprising a substance that inhibits the activity or expression of L1CAM.

본 발명의 다른 목적은 상기 약제학적 조성물을 이용하여 담낭암을 치료하는 방법을 제공하는 것이다. Another object of the present invention to provide a method for treating gallbladder cancer using the pharmaceutical composition.

본 발명의 다른 목적은 L1CAM을 검출하여 담낭암 환자를 진단 또는 예후를 예측하는 방법을 제공하는 것이다.
Another object of the present invention is to provide a method of detecting L1CAM to diagnose a gallbladder cancer patient or predict the prognosis.

상기의 목적을 달성하기 위한 일 양태로서, 본 발명은 L1CAM의 활성 또는 발현을 억제하는 물질을 포함하는 담낭암 세포의 성장 또는 전이를 억제하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
As one aspect for achieving the above object, the present invention relates to a pharmaceutical composition for inhibiting the growth or metastasis of gallbladder cancer cells comprising a substance that inhibits the activity or expression of L1CAM.

본 발명자는 L1CAM이 담낭암 세포에서 과발현되며, 사망 위험율을 높이는 담낭암의 예후 인자(poor prognostic factor)임을 최초로 밝혔으며, 본 발명에 따른 L1CAM의 활성 또는 발현을 억제하는 물질을 포함하는 약제학적 조성물은 담낭암에 특이적으로 암 치료를 가능하게 하는 효과를 가질 수 있다. The inventors first revealed that L1CAM is overexpressed in gallbladder cancer cells and is a prognostic factor of gallbladder cancer which increases the risk of death, and the pharmaceutical composition comprising a substance that inhibits the activity or expression of L1CAM according to the present invention is gallbladder cancer. It may have the effect of enabling cancer treatment specifically.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서, 담낭암에서 L1CAM의 고발현 여부를 확인하기 위해 69명의 환자 (9명: 고분화성 선암, 42명: 중분화성 선암, 17명: 저분화성 선암, 1명: 미분화성 선암)의 조직 샘플에 대하여 면역조직화학적 분석을 한 결과, 담낭암에서 L1 발현은 담낭의 정상 상피 조직에서는 발견되지 않았으나 (도 1A), 담낭암 조직의 63.8%에서 매우 높은 발현율을 나타냈으며 (도 1C), 특히, 담낭암의 전이의 시작을 알리는 종양의 인베이시브 프론트(invasive front)에서 L1CAM이 고발현됨을 확인할 수 있었다 (도 1D). In one specific embodiment of the present invention, 69 patients (9: highly differentiated adenocarcinoma, 42: moderately differentiated adenocarcinoma, 17: low-differentiated adenocarcinoma, 1: undifferentiated) to confirm the high expression of L1CAM in gallbladder cancer A histochemical analysis of tissue samples of adenocarcinoma) showed that L1 expression in gallbladder cancer was not found in normal epithelial tissue of the gallbladder (FIG. 1A), but was very high in 63.8% of gallbladder cancer tissues (FIG. 1C). In particular, it was confirmed that L1CAM was highly expressed in the invasive front of the tumor indicating the start of metastasis of gallbladder cancer (FIG. 1D).

또한, 본 발명의 구체적인 일 실시예에서 L1CAM 발현과 생존율간의 상관관계 분석를 분석한 결과, OS (overall survival) 생존율의 경우, L1CAM을 발현하는 환자 그룹은 15.4%를 보인데 반해 L1CAM을 발현하지 않은 환자 그룹은 45.9%를 보였고, DFS (disease-free survival) 생존율의 경우에도, L1CAM을 발현하는 환자 그룹의 DFS는 19.4%인데 반해 L1CAM을 발현하지 않은 환자 그룹에서의 DFS는 48.4%로서 L1CAM을 발현하지 않은 환자군의 생존율이 더 높은 것을 확인할 수 있었다 (도 2 참조). 이러한 결과는 L1CAM 발현이 임상 결과에 중요한 영향을 미치는 인자임을 보여주는 것이며, L1CAM을 치료타겟으로 할 경우 생존율을 더 높일 수 있음을 시사한다. In addition, as a result of analyzing the correlation analysis between L1CAM expression and survival rate in a specific embodiment of the present invention, in the case of OS (overall survival) survival rate, the L1CAM-expressing patient group showed 15.4%, whereas the patients who did not express L1CAM expression The group showed 45.9%, and even for DFS (disease-free survival), the DFS of the L1CAM-expressing patient group was 19.4%, whereas the DFS in the non-L1CAM-expressing patient group was 48.4%, which did not express L1CAM. It was confirmed that the survival rate of the patient group was higher (see FIG. 2). These results show that L1CAM expression is an important factor in the clinical outcome, suggesting that the survival rate can be increased by using L1CAM as a therapeutic target.

아울러, 본 발명자는 L1CAM이 담낭암 환자의 예후 인자로서 생존율과 재발율에 영향을 미칠 수 있는지를 분석하기 위해, 단변량 분석 및 다변량 분석을 수행하였으며, 그 결과 L1CAM 발현이 담낭암 환자의 생존율 (OS 및 DFS)에 영향을 미치는 통계학적으로 유의미한 위험 인자임을 확인할 수 있었다 (표 3 및 표 4 참조). 특히, 다변량 분석을 통해, L1CAM 발현 (HR, 3.503; 95% CI, 1.148-10.689, P=0.028)이 짧은 DFS를 예측할 수 있는 독립적 예후 인자임을 확인하였다 (표 4 참조). 이러한 결과들은 L1CAM 발현이 담낭암 환자의 생존율을 예측하는데 매우 유용한 마커이며, 아울러 L1CAM 발현이 현재 사용되고 있는 임상학적 단계보다 통계적으로 더 유의성을 가짐을 보여주고 있다.
In addition, the present inventors performed univariate analysis and multivariate analysis to analyze whether L1CAM may affect survival and recurrence rate as prognostic factors of gallbladder cancer patients, and as a result, L1CAM expression was associated with survival rate of gallbladder cancer patients (OS and DFS). Statistically significant risk factor (see Tables 3 and 4). In particular, multivariate analysis confirmed that L1CAM expression (HR, 3.503; 95% CI, 1.148-10.689, P = 0.028) is an independent prognostic factor that can predict short DFS (see Table 4). These results indicate that L1CAM expression is a very useful marker for predicting survival of gallbladder cancer patients, and that L1CAM expression is statistically more significant than the current clinical stage.

따라서, 본 발명에 따른 L1CAM의 활성 또는 발현을 억제하는 물질을 포함하는 약제학적 조성물은 담낭암에 특이적으로 치료를 가능하게 하는 효과를 가질 수 있으며, 구체적인 일 양태로서, 본 발명의 약제학적 조성물은 L1CAM의 활성을 억제하는 물질을 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 활성억제물질은 담낭암세포 표면 항원 또는 분비된 표면 항원(L1CAM)을 특이적으로 인식하는 항체이다. 이들 항체를 사용하였을 때 담낭암 세포의 성장, 이동 또는 침윤이 억제될 수 있다. Therefore, the pharmaceutical composition comprising a substance that inhibits the activity or expression of L1CAM according to the present invention may have the effect of enabling specific treatment for gallbladder cancer, and as a specific aspect, the pharmaceutical composition of the present invention It may include a substance that inhibits the activity of L1CAM. Preferably, the activity inhibitor is an antibody that specifically recognizes gallbladder cancer cell surface antigen or secreted surface antigen (L1CAM). The use of these antibodies can inhibit growth, migration or invasion of gallbladder cancer cells.

이러한 항체는 단일클론항체 및 이에 대한 카이메릭 항체, 인간화 항체 및 인간 항체를 모두 포함하는 것이고, 신규한 항체 외에 이미 당해 기술분야에서 공지된 항체들도 포함될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 항체는 종래 본 발명자가 개발한 L1CAM에 대한 단일클론항체인 A10-A3 또는 4-63, 공지의 항체 UJ127 및 이들의 카이메릭 항체, 인간화 항체 및 인간 항체이다. 바람직하게, 상기 A10-A3 및 4-63 항체는 각각 수탁번호 KCTC10909BP 및 KCTC 10966BP에 의해 분비되어 생산될 수 있다.Such antibodies include both monoclonal antibodies and chimeric antibodies, humanized antibodies and human antibodies thereto, and may include antibodies already known in the art in addition to novel antibodies. More preferably, the antibodies are monoclonal antibodies A10-A3 or 4-63, known antibody UJ127 and chimeric antibodies, humanized antibodies and human antibodies developed by the present inventors. Preferably, the A10-A3 and 4-63 antibodies may be produced by secretion by Accession Nos. KCTC10909BP and KCTC 10966BP, respectively.

상기 항체는 L1CAM을 특이적으로 인식하는 결합의 특성을 갖는 한, 2개의 중쇄와 2개의 경쇄의 전체 길이를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체의 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.Such antibodies include functional fragments of antibody molecules, as well as complete forms having the full length of two heavy chains and two light chains, as long as they have the properties of binding specifically recognizing L1CAM. The functional fragment of the molecule of an antibody means the fragment which has at least an antigen binding function, and includes Fab, F (ab '), F (ab') 2 , Fv, etc.

바람직하게는, 상기 항체로서 A10-A3 항체의 VH 및 VL 가변영역을 인간 항체 불변영역 C1 및 C에 각각 융합시켜 제조한 유전자로부터 발현시킨 Chimeric A10-A3 항체를 사용할 수 있다. 본 발명의 실시예에 의하면, 상기 Chimeric A10-A3 항체는 원래의 항체인 A10-A3 항체와 유사한 수준으로 L1CAM 단백질에 대한 특이적 결합능을 나타내면서도(도 3), in vitro에서 상기 L1CAM 단백질을 발현시키는 담낭암 세포에 특이적으로 결합할 수 있고(도 4), in vivo 조건 즉 상기 담낭암이 이식된 누드마우스의 체내에 투여될 경우에도 담낭암의 증식을 일정 수준 억제하는 효과를 나타낼 수 있다(도 5).
Preferably, as the antibody, a Chimeric A10-A3 antibody expressed from a gene prepared by fusing the VH and VL variable regions of the A10-A3 antibody to human antibody constant regions C1 and C, respectively. According to an embodiment of the present invention, the Chimeric A10-A3 antibody expresses the L1CAM protein in vitro while showing specific binding ability to L1CAM protein at a level similar to that of the original antibody, A10-A3 antibody (FIG. 3). It can specifically bind to the gallbladder cancer cells (Fig. 4), and even when administered in vivo conditions, that is, when the gallbladder cancer is administered in the body of the transplanted nude mouse can exhibit an effect of inhibiting the proliferation of gallbladder cancer (Fig. 5). ).

또 다른 구체적인 일 양태로서, 상기 약제학적 조성물은 L1CAM의 발현을 억제하는 물질을 포함할 수 있다. L1CAM을 발현하는 담낭암 세포에서 L1CAM의 발현을 억제하는 물질들을 이용하여 L1CAM의 발현을 억제시키면, 암세포의 성장과 전이 역할을 하는 L1CAM의 작용이 줄어들어, 담낭암의 치료가 가능하다. 바람직하게는, 상기 L1CAM의 발현을 억제하는 물질은 siRNA, shRNA 및 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotide)로 구성되는 군으로부터 선택되고, 더욱 바람직하게는 5'-TGGTACAGTCTGGGdtdt-3'(서열번호 1) 또는 5'-CAGCAACTTTGCTCAGAGGdtdt-3'(서열번호 2)의 서열을 포함하는 siRNA일 수 있다. 이러한 siRNA을 이용하여 L1CAM을 넉다운(knock-down)시켜서 암세포의 증식, 침투 및 이동 정도를 감소시킬 수 있다. In another specific aspect, the pharmaceutical composition may include a substance that inhibits the expression of L1CAM. Inhibiting the expression of L1CAM by using substances that inhibit the expression of L1CAM in gallbladder cancer cells expressing L1CAM reduces the action of L1CAM, which plays a role in the growth and metastasis of cancer cells, thereby treating gallbladder cancer. Preferably, the substance that inhibits the expression of L1CAM is selected from the group consisting of siRNA, shRNA and antisense oligonucleotide, more preferably 5'-TGGTACAGTCTGGGdtdt-3 '(SEQ ID NO: 1) or 5 It may be an siRNA comprising the sequence of '-CAGCAACTTTGCTCAGAGGdtdt-3' (SEQ ID NO: 2). Such siRNA can be knocked down to reduce the extent of proliferation, invasion and migration of cancer cells.

용어 "siRNA"는 RNA 간섭 또는 유전자 사일런싱(silencing)을 매개할 수 있는 약 20 뉴클레오티드 크기의 작은 핵산 분자를 의미하며, "shRNA"는 siRNA 타겟 서열의 센스 및 안티센스 서열이 5-9개의 염기로 구성된 루프(loop)를 사이에 두고 위치한 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA)를 의미한다. 최근 유전자 수준에서 단백질의 발현을 조절하기 위한 방법으로 RNA 간섭(RNA interference, RNAi) 현상을 이용한 방법이 연구되고 있으며, 일반적으로 siRNA는 상보적인 서열을 갖는 mRNA에 특이적으로 결합하여 단백질 발현을 억제하는 것으로 밝혀졌다. The term "siRNA" refers to a small nucleic acid molecule of about 20 nucleotides in size that can mediate RNA interference or gene silencing, and "shRNA" refers to 5-9 bases of the sense and antisense sequences of the siRNA target sequence. Short hairpin RNA (short hairpin RNA) is positioned between the configured loop (loop). Recently, a method using RNA interference (RNAi) phenomenon has been studied as a method for controlling protein expression at the gene level. In general, siRNA specifically binds to mRNA having a complementary sequence to inhibit protein expression. Turned out to be.

본 발명의 조성물에 포함되는 siRNA를 제조하는 방법에는 siRNA를 직접 화학적으로 합성하는 방법(Sui G 등, (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99:5515-5520), 인 비트로 전사를 이용한 siRNA의 합성법(Brummelkamp TR 등, (2002) Science 296:550-553) 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 shRNA는 siRNA의 고가의 생합성 비용, 낮은 세포 형질감염 효율로 인한 RNA 간섭 효과의 단시간 유지 등의 단점을 극복하기 위한 것으로 RNA 중합효소 Ⅲ의 프로모터로부터 아데노 바이러스, 렌티 바이러스 및 플라스미드 발현 벡터 시스템을 이용하여 이를 세포 내로 도입하여 발현시킬 수 있으며, 이러한 shRNA는 세포 내에 존재하는 siRNA 프로세싱 효소(Dicer or Rnase Ⅲ)에 의해 정확한 구조를 갖는 siRNA로 전환되어 목적 유전자의 사일런싱을 유도함이 널리 알려져 있다. The method for producing siRNA included in the composition of the present invention includes a method for chemically synthesizing siRNA directly (Sui G et al., (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99: 5515-5520), and methods for synthesizing siRNA using in vitro transcription (Brummelkamp TR et al. (2002) Science 296: 550-553), but are not limited thereto. In addition, shRNA overcomes disadvantages such as high cost of biosynthesis of siRNA, short time maintenance of RNA interference effect due to low cell transfection efficiency, and uses adenovirus, lentivirus and plasmid expression vector system from promoter of RNA polymerase III. It can be introduced into a cell to express it, and it is widely known that such shRNA is converted into an siRNA having an accurate structure by an siRNA processing enzyme (Dicer or Rnase III) present in the cell to induce silencing of a target gene.

용어 "안티센스"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적 서열 내에서, 전형적으로 mRNA와 RNA:올리고머 헤테로이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드 염기의 서열 및 서브유닛간 백본을 갖는 올리고머를 지칭한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다. 이 안티센스 올리고머는 mRNA의 번역을 차단 또는 저해하고 mRNA의 스플라이스 변이체를 생산하는 mRNA의 프로세싱 과정을 변화시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 안티센스 올리고머는 L1CAM 유전자의 mRNA에 상보적인 안티센스 올리고머이다.The term “antisense” refers to a sequence and subnucleotide sequence of nucleotide bases, wherein the antisense oligomers hybridize to the target sequence in RNA by Watson-Crick base pairing, allowing formation of mRNA and RNA: oligomeric heterodimers, typically within the target sequence. Refers to oligomers with interunit backbones. Oligomers may have an exact sequence complement or approximate complementarity to the target sequence. This antisense oligomer can alter the processing of mRNA that blocks or inhibits translation of mRNA and produces splice variants of mRNA. Thus, the antisense oligomers of the invention are antisense oligomers complementary to the mRNA of the L1CAM gene.

바람직하게는 본 발명의 조성물에는 공지의 치료제를 직접 또는 간접적으로 결합시키거나, 함께 포함시킬 수 있다. 항체와 결합될 수 있는 치료제에는 방사성핵종, 약제, 림포카인, 독소 및 이중특이적 항체 등이 포함되나, 본 발명의 조성물에 포함되는 치료제는 이에 제한되는 것은 아니며, 항체와 결합시킬 수 있거나 항체, siRNA, shRNA 및 안티센스 올리고뉴클레오티드와 함께 투여하여 암 치료 효과를 얻을 수 있는 공지의 치료제라면 가능하다.Preferably, the composition of the present invention may be directly or indirectly combined with a known therapeutic agent, or included together. Therapeutic agents that can be combined with the antibody include radionuclides, drugs, lymphokines, toxins, and bispecific antibodies, but the therapeutic agents included in the compositions of the present invention are not limited thereto, and can be combined with the antibody or the antibody. It is possible to use any known therapeutic agent that can be administered together with siRNA, shRNA and antisense oligonucleotide to obtain a cancer therapeutic effect.

상기한 방사선핵종에는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I 및 186Re 등이 있으며, 이로 제한되지 않는다.The radionuclides include 3 H, 14 C, 32 P, 35 S, 36 Cl, 51 Cr, 57 Co, 58 Co, 59 Fe, 90 Y, 125 I, 131 I and 186 Re, but are not limited thereto. Do not.

상기한 약제 및 독소에는, 에토포시드, 테니포시드, 아드리아마이신, 다우노마이신, 카르미노마이신, 아미노프테린, 닥티노마이신, 미토마이신류, 시스-백금 및 시스-백금 동족체, 블레오마이신류, 에스페라미신류, 5-플루오로우라실, 멜팔란 및 기타 질소 머스타드 등이 있으며, 이로 제한되지 않는다.
The above drugs and toxins include etoposide, teniposide, adriamycin, daunomycin, carminomycin, aminopterin, dactinomycin, mitomycin, cis-platinum and cis-platinum homologs, bleomycins. , Esperamicins, 5-fluorouracil, melphalan and other nitrogen mustards, and the like.

또한, 본 발명에 따른 조성물은, 투여방식에 따라 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. In addition, the composition according to the present invention may include an acceptable carrier depending on the mode of administration.

투여 방식에 적합한 제제는 당 분야에 공지되어 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 암 치료를 위해 약학적 유효량으로 투여될 수 있다. 전형적인 투여량 수준은 표준 임상적 기술을 사용하여 최적화할 수 있다.
Suitable formulations for the mode of administration are known in the art. In addition, the pharmaceutical compositions of the present invention may be administered in a pharmaceutically effective amount for the treatment of cancer. Typical dosage levels can be optimized using standard clinical techniques.

또 다른 일 양태로서, 본 발명은 상기 약제학적 조성물을 이용하여 담낭암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 치료방법은 상기 약제학적 조성물을 약학적 유효량으로 인체 내에 투여하는 것을 포함한다. 상기 약제학적 조성물은 비 경구, 피하, 복강 내, 폐 내, 및 비강 내로 투여될 수 있고, 국부적 면역억제 치료를 위해, 필요하다면 병변 내 투여를 포함하는 적합한 방법에 의해 투여된다. 비 경구 주입에는 근육 내, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내 또는 피하투여가 포함된다. 바람직한 투여방식은 정맥 주사, 피하주사, 피내 주사제, 근육주사 및 점적 주사이다. In another aspect, the present invention relates to a method for treating gallbladder cancer using the pharmaceutical composition. Specifically, the treatment method of the present invention comprises administering the pharmaceutical composition in a human body in a pharmaceutically effective amount. The pharmaceutical composition may be administered orally, subcutaneously, intraperitoneally, pulmonary, and intranasally, and is administered by a suitable method, including intralesional administration if necessary for local immunosuppressive treatment. Non-oral infusions include intramuscular, intravenous, intraarterial, intraperitoneal or subcutaneous administration. Preferred modes of administration are intravenous injection, subcutaneous injection, intradermal injection, intramuscular injection and instillation injection.

본 발명의 약제학적 조성물 인체 내에 투여하여, 이에 포함된 L1CAM에 특이적인 항체를 담낭암 세포 표면 항원인 L1CAM에 결합시켜 암세포의 증식 또는 전이를 억제시킴으로써 담낭암을 치료할 수 있다.
The pharmaceutical composition of the present invention can be administered to a human body to treat gallbladder cancer by inhibiting the proliferation or metastasis of cancer cells by binding an antibody specific for L1CAM contained therein to L1CAM, a gallbladder cancer cell surface antigen.

또한, 본 발명의 약제학적 조성물을 인체 내에 투여하여 항체를 분비된 L1CAM과 결합시켜 암세포의 성장 및 전이를 차단시킴으로써, 담낭암을 치료할 수 있을 뿐만 아니라 이를 인체 내에 투여하여 암세포 표면 항원인 L1CAM에 결합시켜 이를 인지하는 면역세포가 암세포를 포식, 자살 또는 살해시킴으로써 담낭암을 치료할 수 있다.
In addition, by administering the pharmaceutical composition of the present invention in the human body by binding the antibody secreted L1CAM to block the growth and metastasis of cancer cells, gallbladder cancer can be treated as well as administered in the human body by binding to L1CAM, a cancer cell surface antigen Immune cells that recognize this can treat gallbladder cancer by preying, suicide or killing cancer cells.

또한, 본 발명의 약제학적 조성물에 포함된 L1CAM의 발현 억제물질을 이용하여 L1CAM의 발현을 억제시키면, 담낭암세포의 성장과 전이 역할을 하는 L1CAM의 작용이 줄어들어, 암치료가 가능하다.
In addition, by inhibiting the expression of L1CAM using the expression inhibitor of L1CAM included in the pharmaceutical composition of the present invention, the growth and metastasis of gallbladder cancer cells reduces the action of L1CAM, cancer treatment is possible.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 나쁜 예후를 가지는 담낭암의 진단 또는 예후·예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여, L1CAM에 특이적인 항-L1CAM 항체 또는 L1CAM에 특이적인 올리고뉴클레오티드를 이용하여 환자의 시료로부터 L1CAM을 검출하는 방법에 관한 것이다. In another aspect, the present invention provides a patient's sample using an anti-L1CAM antibody specific to L1CAM or an oligonucleotide specific to L1CAM in order to provide information necessary for diagnosis or prognosis and prediction of gallbladder cancer having a poor prognosis. It relates to a method for detecting L1CAM from.

본 발명에서 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 담낭암 발병 여부를 확인하는 것이다. As used herein, the term "diagnostic" means identifying the presence or characteristic of a pathological condition. For the purposes of the present invention, the diagnosis is to determine whether gallbladder cancer develops.

본 발명에서 용어, "예후"는 담낭암 절제 수술의 재발, 전이성 확산, 및 약물 내성을 비롯한 담낭암-기인성 사망 또는 진행의 가능성 등 병의 경과 및 완치 여부를 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상 예후는 담낭암 생존 예후를 의미하며, 바람직하게는 담낭암을 수술로 절제한 환자의 예후를 의미한다.As used herein, the term "prognosis" refers to confirming the progress and cure of the disease, including the possibility of recurrence of the gallbladder cancer resection surgery, metastatic spread, and the possibility of gallbladder cancer-associated death or progression, including drug resistance. For the purposes of the present invention, prognosis refers to the prognosis of gallbladder cancer survival, preferably the prognosis of a patient who has surgically resected gallbladder cancer.

본 발명에서 용어, "예측"이란 환자가 수술, 화학요법 또는 방사선 치료 등 치료법에 대해 선호적으로 또는 비선호적으로 반응하여 환자가 치료된 후 생존할 여부에 대한 가능성과 관련된다.As used herein, the term "prediction" relates to the likelihood that a patient will survive after being treated by preferentially or unfavorably responding to treatments such as surgery, chemotherapy or radiation therapy.

본 발명에서 용어 "환자의 시료"란 담낭암 마커 유전자인 L1CAM의 발현 수준에서 차이가 나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. As used herein, the term "patient sample" includes, but is not limited to, samples such as tissue, cells, whole blood, serum, plasma, saliva, sputum, cerebrospinal fluid, or urine, which differ in the expression level of the gallbladder cancer marker gene L1CAM. Do not.

상기에서 설명한 바와 같이, L1CAM은 담낭암 세포에서 과발현되며, 사망 위험율을 높이는 담낭암의 예후 인자(poor prognostic factor)임을 확인한 바, L1CAM에 특이적인 항체 또는 올리고뉴클레오티드를 이용하여 담낭암에 특이적으로 암 진단, 및 예후·예측을 가능하게 하는 효과를 가질 수 있다. 구체적으로, 담낭암 세포 표면의 L1CAM 단백질을 인식하며 담낭암 조직에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 siRNA, shRNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 이용하여 환자의 시료로부터 L1CAM을 검출함으로써, 담낭암을 진단 또는 예후·예측에 유용하게 이용될 수 있다.
As described above, L1CAM is over-expressed in gallbladder cancer cells and has been confirmed to be a prognostic factor of gallbladder cancer, which increases the risk of death. Thus, L1CAM-specific antibodies or oligonucleotides can be used to specifically diagnose gallbladder cancer. And prognostics and predictions. Specifically, by detecting L1CAM from a patient's sample using an antibody that recognizes the L1CAM protein on the surface of the gallbladder cancer cell and specifically binds to the gallbladder cancer tissue, or siRNA, shRNA or antisense oligonucleotide, the gallbladder cancer is diagnosed or diagnosed in prognosis and prognosis. It can be usefully used.

본 발명의 담낭암 세포 표면의 L1CAM 단백질을 인식하며 담낭암 조직에 특이적으로 결합하는 항체 또는 siRNA, shRNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 이를 포함하는 약제학적 조성물은 담낭암의 성장, 침윤 및 이동을 억제 및 세포 사멸을 유도할 수 있으므로, 보다 안전하면서도 효과적인 담낭암의 예방 및 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.
Antibodies or siRNAs, shRNAs or antisense oligonucleotides that recognize L1CAM protein on the surface of gallbladder cancer cells of the present invention and specifically bind to gallbladder cancer tissues, and pharmaceutical compositions comprising the same, inhibit the growth, infiltration and migration of gallbladder cancer, and inhibit cell death. Inducible, therefore, may be widely used in the prevention and treatment of safer and more effective gallbladder cancer.

도 1은 정상 담낭 조직과 담낭암 조직에서의 L1 발현 여부를 확인하기 위한 면역조직화학적 분석결과를 나타낸 것이다. 파라핀 절편의 염색에는 A10-A3, 단일클론 마우스 항 L1 항체를 사용하였다. (A) 담낭의 정상 상피조직에서는 L1 발현이 음성으로 나타났으며, (B) 내부 양성 대조군으로서 말초 신경 조직에서는 L1 면역염색이 나타났으며, (C) 담낭암 조직에서 L1 발현이 특이적으로 나타났으며 담낭암 세포막에서 우세하게 존재하였고, 특히 (D) 종양의 인베이시브 프론트(invasive front)에서 현저한 L1 발현을 관찰할 수 있었다.
도 2는 69명의 담낭암 환자에서 조사한 L1 발현과 생존율간의 상관관계를 나타낸 것이다 (A 및 B). OS (A) 및 DFS (B)에 대한 Kaplan-Meier 방법에 따른 생존 곡선을 L1 발현에 따라 log-rank test와 비교하여 나타내었다.
도 3은 Chimeric A10-A3(cA10-A3) 항체의 L1CAM 단백질에 대한 특이적 결합능을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 JCRB1033 세포에서 L1CAM 단백질의 발현에 미치는 Chimeric A10-A3(cA10-A3) 항체의 영향을 유세포분석기로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 담낭암 세포인 JCRB1033이 이식된 누드마우스에 chimeric A10-A3 항체(cA10-A3)를 투여하고 시간의 경과에 따른 종양 용적의 변화(A) 및 누드마우스의 체중변화(B)를 측정한 그래프이다. Figure 1 shows the results of immunohistochemical analysis to determine whether L1 expression in normal gallbladder tissue and gallbladder cancer tissue. A10-A3, monoclonal mouse anti-L1 antibody was used for staining paraffin sections. (A) L1 expression was negative in normal epithelial tissue of the gallbladder, (B) L1 immunostaining in peripheral nerve tissue as an internal positive control, and (C) L1 expression was specific in gallbladder cancer tissue Predominantly in the gallbladder cancer cell membrane, and particularly (D) the expression of L1 was observed in the invasive front of the tumor.
2 shows the correlation between L1 expression and survival in 69 gallbladder cancer patients (A and B). Survival curves according to Kaplan-Meier method for OS (A) and DFS (B) are shown in comparison with log-rank test according to L1 expression.
Figure 3 is a graph showing the results of analyzing the specific binding capacity of the Chimeric A10-A3 (cA10-A3) antibody to L1CAM protein.
Figure 4 is a graph showing the results of analyzing the effect of Chimeric A10-A3 (cA10-A3) antibody on the expression of L1CAM protein in JCRB1033 cells by flow cytometry.
Figure 5 is administered to chimeric A10-A3 antibody (cA10-A3) to nude mice transplanted with gallbladder cancer cells JCRB1033 and measured the change in tumor volume (A) and weight change of nude mice (B) over time It is a graph.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the constitution and effects of the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for illustrating the present invention, but the scope of the present invention is not limited by these examples.

실시예Example 1: 조직 샘플 준비 1: Tissue Sample Preparation

실험에 사용된 환자의 조직은 1998년 1월과 2009년 3월 사이에 충남대학교 병원에서 외과적 절제술을 받은 담낭 선암종 환자 69명 (남자 30명과 여자 39명)으로부터 얻었다. 환자의 평균연령은 67세였다 (35세 - 87세 범위). 모든 샘플은 10% 포르말린으로 고정하고 파라핀에 임베딩시켰다. 종양은 모두 선암종으로 진단되었고, 담낭에서 발생된 원발성 종양으로 판단되었다. 종양의 병기(stage)는 American Joint committee on Cancer (AJCC) system에 따라 분류하였다. 샘플을 기관(institutional review board)에 의해 승인된 프로토콜에 따라 준비하였다.
The tissues of the patients used for the study were obtained from 69 patients (30 males and 39 females) who underwent surgical resection at Chungnam National University Hospital between January 1998 and March 2009. The mean age of the patients was 67 years (range 35 to 87 years). All samples were fixed with 10% formalin and embedded in paraffin. All tumors were diagnosed as adenocarcinoma and were considered to be primary tumors in the gallbladder. Stages of tumor were classified according to the American Joint committee on Cancer (AJCC) system. Samples were prepared according to the protocol approved by the institutional review board.

실시예Example 2: 조직학적 분화 단계에 따른 분류 2: Classification according to histological differentiation stage

담낭암 샘플을 일반적인 헤마톡실린-에오신 염색(H&E staining)을 하여 조사하였다. 세계보건기구(WHO) 분류기준에 따라 샘플을 고분화성(G1), 중분화성(G2), 저분화성(G3), 및 미분화성(G4) 선암으로 분류하였다. 샘플 중 9개는 고분화성, 42개는 중분화성, 17개는 저분화성이었고 오직 한 개만이 미분화성이었다.
Gallbladder cancer samples were examined by normal hematoxylin-eosin staining (H & E staining). Samples were classified according to the World Health Organization (WHO) classification into highly differentiated (G1), moderately differentiated (G2), lowly differentiated (G3), and undifferentiated (G4) adenocarcinomas. Nine of the samples were highly differentiated, 42 were differentiated, 17 were low and only one was undifferentiated.

실시예Example 3: 면역조직화학적 분석 3: Immunohistochemical Analysis

실시예Example 3-1: 면역조직화학적 염색 3-1: Immunohistochemical Staining

L1CAM (또는 L1 이라고도 함)에 대한 면역조직화학을 EnVision-HRP detection system (Dakocytomation, Carpinteria, CA), 정제된 A10-A3, L1CAM에 대한 뮤린 단일클론항체를 이용하여 수행하였다. 조직 절편을 4℃에서 A10-A3과 함께 배양한 것을 제외하고는 모든 과정은 실온에서 진행하였다. 암 조직 블럭에서 4㎛ 두께의 절편을 잘라 슬라이스에 도포한 후 56℃에서 1-2시간 동안 건조한 다음 크실렌으로 5분 동안 3회 탈파라핀화시켰고, 100%, 90%, 80% 및 70% 알코올로 각각 1분 동안 처리하였다. target retrieval solution (DakoCytomation s1699)에 슬라이드를 담근 후 압력 쿠커를 이용하여 4분 동안 항원성을 회복한 후, 조직 절편을 3% 과산화수소로 10분 동안 처리하여 내재성 퍼옥시다제를 제거하였다. 절편은 4℃의 축축한 챔버 내에서 background reducing diluent (DakoCytomation s3022)로 희석된 A10-A3 (80 ng/ml)와 함께 밤새 배양시켰다. Immunohistochemistry for L1CAM (or also called L1) was performed using the EnVision-HRP detection system (Dakocytomation, Carpinteria, Calif.), Purified A10-A3, murine monoclonal antibodies against L1CAM. All procedures were run at room temperature except that tissue sections were incubated with A10-A3 at 4 ° C. 4 μm thick sections were cut from the cancer tissue block, applied to slices, dried at 56 ° C. for 1-2 hours and then deparaffinized with xylene for 5 minutes, 100%, 90%, 80% and 70% alcohol. Each for 1 minute. After immersing the slide in the target retrieval solution (DakoCytomation s1699) and restoring antigenicity for 4 minutes using a pressure cooker, tissue sections were treated with 3% hydrogen peroxide for 10 minutes to remove endogenous peroxidase. Sections were incubated overnight with A10-A3 (80 ng / ml) diluted with background reducing diluent (DakoCytomation s3022) in a damp chamber at 4 ° C.

일차 항체(A10-A3, 4-63, 1:50 dilution)를 도포하여 15분 동안 반응시키고 항-마우스 면역글로불린-HRP에 15분 동안 처리하였다. 그런 다음 증폭제(Amplification reagent)에 15분 동안 방치한 후 항-플루오레세인-HRP에 15분 동안 반응시켰다. DAB를 이용하여 5분 동안 발색한 다음 Meyer's hematoxylin으로 대조염색을 하였다. 각각의 단계가 끝나면 TBST 완충용액으로 5분 동안 2회 세척하였다. 그런 다음, 슬라이드를 Envision 시약으로 30분 동안 처리한 후 DAB chromogen을 이용하여 5분 동안 발색한 다음, Mayer's hematoxylin으로 대조염색을 하여 고정시켰다. 일차항체를 제외한 마우스 IgG1 대조군을 음성 대조군으로 사용하였으며, 절편에 존재하는 말초 신경 다발을 내부 양성 대조군으로 사용하였다. 종양 세포의 5% 이상에서 명확하게 L1CAM 면역염색이 된 샘플은 L1CAM에 대하여 면역양성으로 간주되었다.  Primary antibodies (A10-A3, 4-63, 1:50 dilution) were applied and reacted for 15 minutes and treated with anti-mouse immunoglobulin-HRP for 15 minutes. Thereafter, the mixture was left in an amplification reagent for 15 minutes and then reacted with anti-fluorescein-HRP for 15 minutes. 5 minutes of color development using DAB was followed by counterstaining with Meyer's hematoxylin. At the end of each step, wash twice with TBST buffer for 5 minutes. The slides were then treated with Envision reagent for 30 minutes and then developed for 5 minutes with DAB chromogen and then counterstained with Mayer's hematoxylin for fixation. A mouse IgG1 control except the primary antibody was used as a negative control, and peripheral nerve bundles present in sections were used as internal positive controls. Samples that were clearly L1CAM immunostained in at least 5% of tumor cells were considered immunopositive for L1CAM.

실시예Example 3-2: 면역조직화학적 염색의 분석 3-2: Analysis of Immunohistochemical Staining

상기 면역조직화학 염색결과를 분석하였다. 샘플은 종양세포가 막 염색이 됨을 명확히 나타낼 때 L1CAM 염색에 대하여 면역양성으로 간주되었다. 양성 염색이 된 퍼센티지는 4 점 척도를 사용하여 등급을 매겼다 (<5% = 0; =5% to <20% = +1; =20% to <50% = +2; =50% = +3). 0과 +1 염색 점수를 가지는 경우를 저발현 그룹(low expression group (LEG))으로 간주하고, +2 및 +3 염색 점수를 가지는 경우를 고발현 그룹(high expression group(HEG))으로 간주하였다. The immunohistochemical staining results were analyzed. Samples were considered immunopositive for L1CAM staining when clearly indicating that tumor cells were membrane stained. Percentages with positive staining were graded using a 4-point scale (<5% = 0; = 5% to <20% = +1; = 20% to <50% = +2; = 50% = +3 ). Cases with 0 and +1 staining scores were considered low expression group (LEG) and cases with +2 and +3 staining score were considered high expression group (HEG). .

실시예Example 4: 통계학적 분석 4: statistical analysis

x2 테스트 또는 linear-by-linear associationdmf 이용하여 카테고리 변수의 그룹 비교를 수행하였다. 평균값 비교는 독립 샘플 T-테스트 또는 one-way ANOVA로 수행하였다. 담낭암에 대한 수술일부터 사망일까지 그리고 이미지 양식에 의해 확인된 첫번째 재발일까지 생존율 [OS (overall survival) 및 DFS(disease-free survival)]을 각각 측정하였다. 생존곡선은 Kaplan-Meier method을 이용하여 작성하였고 log-rank test를 이용하여 분석하였다. 생존을 위한 예후 인자를 확인하기 위해 Cox's proportional hazards model을 수행하였다. P<0.05이면 통계적으로 유의미한 것으로 간주하였고, 모든 통계 분석을 SPSS version 16.0 statistical software program을 이용하여 수행하였다.
Group comparisons of category variables were performed using the x 2 test or linear-by-linear associationdmf. Mean value comparisons were performed by independent sample T-test or one-way ANOVA. Survival [OS (overall survival) and DFS (disease-free survival)] were measured from the day of surgery to the date of death for gallbladder cancer and the first relapse confirmed by imaging modalities. Survival curves were prepared using the Kaplan-Meier method and analyzed using the log-rank test. Identify prognostic factors for survival Cox's proportional hazards model was performed. P <0.05 was considered statistically significant and all statistical analyzes were performed using the SPSS version 16.0 statistical software program.

실험결과 및 분석Experiment result and analysis

담낭암에서 In gallbladder cancer L1CAML1CAM 발현에 대한 면역조직화학적 분석결과 Immunohistochemical Analysis of Expression

담낭암에서의 L1CAM 발현 여부를 확인하기 위해 69명의 환자 (9명: 고분화성 선암, 42명: 중분화성 선암, 17명: 저분화성 선암, 1명: 미분화성 선암)를 대상으로 한 종양 샘플의 면역조직화학적 분석을 한 결과, 담낭암에서 L1CAM 발현은 담낭의 정상 상피 조직에서는 발견되지 않았으나 (도 1A), 담낭 세동맥 내피 세포 및 내부 양성 대조군으로서 신경 섬유에서 발견되었으며 (도 1B), 담낭암 조직의 63.8%에서 매우 높은 발현율을 나타냈으며, 담낭암 세포막에 우세하게 나타났다 (도 1C). 특히, 담낭암의 전이의 시작을 알리는 종양의 인베이시브 프론트(invasive tumor front)에서 L1CAM이 고발현됨을 확인하였다 (도 1D).
Immunization of Tumor Samples in 69 Patients (9: Highly Differentiated Adenocarcinoma, 42: Neutral Adenocarcinoma, 17: Low Differentiated Adenocarcinoma, 1: Undifferentiated Adenocarcinoma) to Determine L1CAM Expression in Gallbladder Cancer Histochemical analysis showed that L1CAM expression in gallbladder cancer was not found in normal epithelial tissue of the gallbladder (FIG. 1A), but was found in nerve fibers as gallbladder arterial endothelial cells and internal positive control (FIG. 1B), 63.8% of gallbladder cancer tissues. Showed a very high expression rate, predominantly in the gallbladder cancer cell membrane (Fig. 1C). In particular, it was confirmed that L1CAM was highly expressed in the invasive tumor front of the tumor indicating the start of metastasis of gallbladder cancer (FIG. 1D).

L1CAML1CAM 발현과 임상병리학적 요소간의 상관관계 분석 Correlation Analysis between Expression and Clinical Pathologic Factors

담낭암 환자의 예후에 영향을 줄 수 있는 다양한 임상병리학적 요소와 L1CAM 발현과의 상관관계를 분석한 결과를 하기 표 1에 나타내었다. L1CAM 음성 그룹과 L1CAM 양성 그룹간에 연령 및 성별에 의한 차이는 없었다. 그러나, 중분화성 담낭암 또는 저분화성 담낭암에서의 L1CAM 발현이 고분화성 담낭암에서보다 훨씬 높게 나타나 (P < 0.01), L1CAM 발현이 담낭암의 조직학적 분화단계와 상관관계가 있음을 나타내었다. 또한, L1CAM 발현은 진행된 병리학적 T 단계, 진행된 임상 단계, 및 양성 정맥/림프 침습과 매우 연관성이 있는 것으로 나타났다. 그러나 림프절 전이, 원격 전이, 신경주위 침윤과 같은 다른 임상병리학적 요소는 L1CAM 발현과 통계학적으로 유의적인 상관관계를 보이지 않았다.
The results of analyzing the correlation between various clinicopathological factors and L1CAM expression that may affect the prognosis of gallbladder cancer patients are shown in Table 1 below. There was no difference in age and sex between the L1CAM negative and L1CAM positive groups. However, L1CAM expression in moderately differentiated gallbladder cancers or low-differentiated gallbladder cancers was much higher than in highly differentiated gallbladder cancers (P <0.01), indicating that L1CAM expression correlates with the histological differentiation stage of gallbladder cancers. In addition, L1CAM expression has been shown to be highly correlated with advanced pathological T stage, advanced clinical stage, and benign venous / lymph invasion. However, other clinicopathological factors such as lymph node metastasis, distant metastasis, and perivascular invasion did not show a statistically significant correlation with L1CAM expression.

Figure 112011052499319-pat00001
Figure 112011052499319-pat00001

L1CAML1CAM 발현과  Expression 생존율간의Survival rate 상관관계 분석 Correlation analysis

담낭암에서 L1CAM 발현의 임상적 유용성을 더 조사하기 위해, L1CAM 발현 단계를 포함하여 다양한 임상병리학적 요소에 따른 생존율 OS와 DFS를 비교하여 하기 표 2에 나타내었다. 그 결과, 연령과 성별은 OS 및 DFS에 영향을 미치지 않았지만, 높은 조직학적 분류단계, 진행된 병리학적 T 단계, 임상 단계, 림프절 전이, 양성 정맥/림프 침윤, 및 L1CAM 발현을 보이는 환자는 짧은 생존율과 매우 상관성이 높은 것으로 나타났다. 담낭암 환자의 평균적인 생존 기간은 37개월 (범위, 1-117 개월)이었다. L1CAM 발현에 따른 생존 곡선은 도 2에 나타내었다. 이 기간에 L1CAM을 발현하는 환자 그룹의 OS 생존율은 15.4%인데 반해서 L1CAM을 발현하지 않은 환자 그룹에서의 OS 생존율은 45.9%로 현저히 높았으며 (도 2A, P=0.016), DFS 생존율의 경우에도, L1CAM을 발현하는 환자 그룹의 DFS는 19.4%인데 반해서 L1CAM을 발현하지 않은 환자 그룹에서의 DFS도 48.4%로서 L1CAM을 발현하지 않은 환자군의 생존율이 더 높은 것을 확인할 수 있었다 (도 2B, P=0.012). 이러한 결과는 L1CAM 발현이 임상 결과에 중요한 영향을 미침을 보여주는 것이다.
In order to further investigate the clinical utility of L1CAM expression in gallbladder cancer, the survival rate OS and DFS according to various clinicopathological factors including L1CAM expression stages are compared in Table 2 below. As a result, age and gender did not affect OS and DFS, but patients with high histologic sorting, advanced pathological T stage, clinical stage, lymph node metastasis, benign venous / lymph infiltration, and L1CAM expression had short survival rates and It was found to be very correlated. The average survival for gallbladder cancer patients was 37 months (range, 1-117 months). Survival curves according to L1CAM expression are shown in FIG. 2. In this period, the OS survival of the L1CAM-expressing patient group was 15.4%, while the OS survival in the L1CAM-free patient group was 45.9% (Fig. 2A, P = 0.016). The DFS of the L1CAM-expressing patient group was 19.4%, whereas the DFS of the L1CAM-expressing patient group was 48.4%, indicating that the survival rate of the L1CAM-free patient group was higher (FIG. 2B, P = 0.012). . These results show that L1CAM expression has a significant effect on clinical outcome.

Figure 112011052499319-pat00002
Figure 112011052499319-pat00002

단변량Univariate 및  And 다변랑Multistory 분석에 따른  According to analysis L1CAML1CAM 발현과  Expression 생존율간의Survival rate 상관관계 분석 Correlation analysis

담낭암 환자에서 OS (overall survival) 및 DFS (disease-free survival)에 관한 단변량 및 다변량 분석을 수행하기 위해, 몇 개의 변수를 분류하였다. 그리고, L1CAM의 담낭암 환자의 예후 인자로서 생존율과 재발율에 영향을 미칠 수 있는 임상학적 의미를 분석하기 위해, 단변량 분석을 수행하였으며, 그 결과는 하기 표 3에 나타내었다. 표 3에서 보듯이, 진행된 병리학적 T 단계 (P=0.009), 진행된 임상 단계(P=<0.0001), 림프절 전이 (P=0.001) , 원격 전이 (P=0.001), 양성 정맥/림프 침윤 (P=0.001), 양성 신경주위 침윤 (P=0.010), 및 L1CAM 발현 (P=0.017)이 담낭암 환자의 OS에 영향을 미치는 중요한 위험 인자로 나타났다. DFS의 경우, 진행된 병리학적 T 단계 (P=0.015), 진행된 임상 단계(P=0.001), 원격 전이 (P=0.0044), 양성 정맥/림프 침윤 (P=0.002), 양성 신경주위 침윤 (P=0.001), 및 L1CAM 발현 (P=0.016)이 담낭암 환자의 DFS에 영향을 미치는 통계학적으로 중요한 위험 인자로 나타났다.
Several variables were classified to perform univariate and multivariate analyzes of OS (overall survival) and DFS (disease-free survival) in gallbladder cancer patients. In addition, univariate analysis was performed to analyze the clinical significance of L1CAM that may affect survival and recurrence rate as prognostic factors of gallbladder cancer patients, and the results are shown in Table 3 below. As shown in Table 3, advanced pathological T stage (P = 0.009), advanced clinical stage (P = <0.0001), lymph node metastasis (P = 0.001), distant metastasis (P = 0.001), benign venous / lymph infiltration (P = 0.001), benign peripheral infiltration (P = 0.010), and L1CAM expression (P = 0.017) were important risk factors affecting OS in gallbladder cancer patients. For DFS, advanced pathological T stage (P = 0.015), advanced clinical stage (P = 0.001), distant metastasis (P = 0.0044), benign venous / lymph infiltration (P = 0.002), benign perivascular infiltration (P = 0.001), and L1CAM expression (P = 0.016) were statistically significant risk factors affecting DFS in gallbladder cancer patients.

Figure 112011052499319-pat00003
Figure 112011052499319-pat00003

또한, 이들 다양한 인자들의 예후에 미치는 독립적인 영향을 분석하기 위해, Cox's proportional hazards model을 이용하여 다변량 분석을 수행하여 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다. 본 실험에서 고분화성 담낭암 환자의 수가 적어 유의미한 결과를 얻을 수 없으므로, 조직학적 분류단계 변수는 다변량 분석에서 제외하였다. 다변량 분석 결과, 원격 전이 (Hazard ratio (HR), 4.479; 95% Confidence interval (CI), 1.101-18.231), P=0.036) 및 양성 정맥/림프 침윤 (HR, 35.582; 95% CI, 1.002-1263.712, P=0.050)이 짧은 OS를 예측할 수 있는 독립적 예후 인자로 나타났다. DFS의 경우, 진행된 임상 단계 (HR, 3.091; 95% CI, 1.043-9.160, P=0.042) 및 L1CAM 발현 (HR, 3.503; 95% CI, 1.148-10.689, P=0.028)이 짧은 DFS을 예측할 수 있는 독립적 예후 인자로 나타났다.
In addition, to analyze the independent effects on the prognosis of these various factors, multivariate analysis was performed using Cox's proportional hazards model and the results are shown in Table 4 below. Since the number of highly differentiated gallbladder cancer patients was not significant in this study, significant results could not be obtained. Histological classification parameters were excluded from the multivariate analysis. Multivariate analysis showed distant metastasis (Hazard ratio (HR), 4.479; 95% Confidence interval (CI), 1.101-18.231), P = 0.036) and positive vein / lymph infiltration (HR, 35.582; 95% CI, 1.002-1263.712 , P = 0.050) is an independent prognostic factor for predicting short OS. For DFS, advanced clinical stages (HR, 3.091; 95% CI, 1.043-9.160, P = 0.042) and L1CAM expression (HR, 3.503; 95% CI, 1.148-10.689, P = 0.028) can predict short DFS Independent prognostic factors.

Figure 112011052499319-pat00004
Figure 112011052499319-pat00004

상기 결과들은 L1CAM 발현이 담낭암 환자의 생존율을 예측하는데 매우 유용한 마커이며, 아울러 L1CAM 발현이 현재 사용되고 있는 임상학적 단계보다 통계적으로 더 유의성을 가짐을 보여주고 있다.
The results show that L1CAM expression is a very useful marker for predicting survival of gallbladder cancer patients, and that L1CAM expression is statistically more significant than the clinical stage currently being used.

실시예Example 5:  5: L1CAML1CAM 단백질에 특이적으로 결합하는  Specifically binding to proteins ChimericChimeric A10-A3 항체의 담낭암 성장저해효과 분석 Analysis of Gallbladder Cancer Growth Inhibition Effect of A10-A3 Antibody

실시예Example 5-1:  5-1: ChimericChimeric A10-A3 항체의 생산 및  Production of A10-A3 antibodies and L1CAML1CAM 단백질에 대한  For protein 결합능Cohesion

A10-A3 항체의 VH 및 VL 가변영역을 인간 항체 불변영역 C1 및 C에 각각 융합시켜 제조한 유전자를 포함한 발현 플라스미드를 CHO 세포주에 트랜스팩션시킨 후, 세포배양액으로부터 Protein A 컬럼을 이용하여 정제하였다. Chimeric A10-A3 항체의 L1CAM 단백질에 대한 특이적 결합능을 ELISA로 분석하였다(도 3). 이때, 대조군으로는 A10-A3 항체를 이용하였다. 도 3은 Chimeric A10-A3 항체의 L1CAM 단백질에 대한 특이적 결합능을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 3에서 보듯이, Chimeric A10-A3 항체는 대조군으로 사용된 A10-A3 항체와 유사한 정도의 L1CAM 단백질에 대한 특이적 결합능을 나타냄을 알 수 있었다.
Expression plasmids containing genes prepared by fusing the VH and VL variable regions of the A10-A3 antibody to the human antibody constant regions C1 and C, respectively, were transfected into CHO cell lines and purified from the cell culture using a Protein A column. Specific binding capacity of the Chimeric A10-A3 antibody to L1CAM protein was analyzed by ELISA (FIG. 3). At this time, A10-A3 antibody was used as a control. Figure 3 is a graph showing the results of analyzing the specific binding capacity of the Chimeric A10-A3 antibody to L1CAM protein. As shown in Figure 3, Chimeric A10-A3 antibody showed a specific binding capacity to the L1CAM protein to a similar degree as the A10-A3 antibody used as a control.

실시예Example 5-2:  5-2: ChimericChimeric A10-A3 항체의 담낭암 세포에 대한  A10-A3 Antibody Against Gallbladder Cancer Cells 결합능Cohesion

담낭암 세포인 JCRB1033(Hasumura S. et al. Combination therapy of hyperthermia and other methods in liver and bile tract cancers-evaluation of these methods using cancer cell lines in vitro. Gan To Kagaku Ryoho 4 Pt 2-3: 1905-1912)를 10% FBS가 첨가된 Williams'E medium(Invitrogen)에서 37℃ 5% CO2 조건에서 배양하였다. JCRB1033 (Hasumura S. et al. Combination therapy of hyperthermia and other methods in liver and bile tract cancers-evaluation of these methods using cancer cell lines in vitro.Gan To Kagaku Ryoho 4 Pt 2-3: 1905-1912) Was incubated at 37 ° C. 5% CO 2 in Williams'E medium (Invitrogen) to which 10% FBS was added.

그런 다음, 상기 수득한 Chimeric A10-A3 항체의 JCRB1033 세포에 대한 결합능을 조사하기 위하여, 배양된 세포를 세포 분리 완충액(GIBCO)으로 20분 37에서 처리하여 단일세포로 분리한 뒤, 40㎛ 스트레이너(strainer)를 통과시켜 5 ×105 세포를 유세포 분석기(Flow cytometry)에 적용하여 분석하였다. Then, in order to examine the binding capacity of the obtained Chimeric A10-A3 antibody to JCRB1033 cells, the cultured cells were treated with cell separation buffer (GIBCO) at 20 minutes 37 and separated into single cells, followed by 40 μm strainer ( 5 × 10 5 cells were analyzed by flow cytometry through a strainer).

구체적으로, 단일 세포화된 JCRB1033 세포를 PBA(1%의 BSA를 PBS에 용해)에 부유시키고 Chimeric A10-A3 항체를 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. 4℃에서 1,200 rpm으로 5분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하고, 여기에 항-인간 Ig(Fc)-FITC(BD)를 200배 희석하여 4℃에서 30분 동안 반응시킨 다음 PBA로 2회 세척하고, 프로피디움 요오다이드(Propidium Iodide, PI) 음성인 세포들만 골라 유세포분석기(FACS caliber)로 분석하였다(도 4). 도 4는 JCRB1033 세포에서 L1CAM 단백질의 발현에 미치는 Chimeric A10-A3 항체의 영향을 유세포분석기로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 4에서 보듯이, Chimeric A10-A3 항체는 L1CAM 단백질이 발현된 JCRB1033 세포에 효과적으로 결합할 수 있음을 확인하였다.
Specifically, single-celled JCRB1033 cells were suspended in PBA (1% BSA dissolved in PBS) and the Chimeric A10-A3 antibody was reacted at 4 ° C. for 30 minutes. The supernatant was removed by centrifugation at 1,200 rpm for 5 minutes at 4 ° C, diluted 200-fold with anti-human Ig (Fc) -FITC (BD) and reacted at 4 ° C for 30 minutes, and then twice with PBA. After washing, only cells that were propidium iodide (PI) negative were picked and analyzed by flow cytometry (FACS caliber) (FIG. 4). Figure 4 is a graph showing the results of analyzing the effect of Chimeric A10-A3 antibody on the expression of L1CAM protein in JCRB1033 cells by flow cytometry. As shown in Figure 4, Chimeric A10-A3 antibody was confirmed that can effectively bind to JCRB1033 cells expressing L1CAM protein.

실시예Example 5-3:  5-3: ChimericChimeric A10-A3 항체의 담낭암 성장 저해효과 Inhibitory Effect of A10-A3 Antibody on Gallbladder Cancer Growth

5주령의 누드 마우스 BALB/c Slc-nu를 일본 SLC. Inc.에서 구입하고, 1주일동안 순화시켰다. 그 후, 상기 배양된 담낭암 세포인 JCRB1033를 상기 누드마우스의 피하에 1 x 107개 이식하였으며, 1주일 째에 상기 chimeric A10-A3 항체와 대조군인 Synagis(isotype human IgG1)를 각각 10 mg/kg의 농도로 매주 3회씩 꼬리정맥으로 주사하였다. 종양 용적(Tumor volume)은 가로(mm)x세로(mm)x높이(mm)/2로 산출하였다. 실험최종일에 상기 누드 마우스에 대한 독성을 검증하기 위하여 상기 누드마우스의 체중을 측정하였다. 표준 편차 (SDs) 및 p value는 ANOVA(Prisim, GraphPad software, USA) 및 student t test를 사용하여 산출하였다(도 5). 도 5는 담낭암 세포인 JCRB1033이 이식된 누드마우스에 chimeric A10-A3 항체를 투여하고 시간의 경과에 따른 종양 용적의 변화(A) 및 누드마우스의 체중변화(B)를 측정한 그래프이다. 도 5에서 보듯이, 상기 chimeric A10-A3 항체는 담낭암의 성장을 억제할 수 있음을 알 수 있었다.
Nude mice BALB / c Slc- nu , 5 weeks of age, were obtained from Japanese SLC. It was purchased from Inc. and purified for one week. Thereafter, 1 × 10 7 JCRB1033 cells, which were cultured gallbladder cancer cells, were implanted subcutaneously in the nude mouse, and at 1 week, 10 mg / kg of the chimeric A10-A3 antibody and the control Synagis (isotype human IgG1), respectively. The tail vein was injected three times a week at the concentration of. Tumor volume was calculated as width (mm) x length (mm) x height (mm) / 2. The body weight of the nude mice was measured to verify toxicity on the nude mice on the last day of the experiment. Standard deviations (SDs) and p values were calculated using ANOVA (Prisim, GraphPad software, USA) and student t test (FIG. 5). Figure 5 is a graph measuring the change in tumor volume (A) and the weight change (B) of nude mice administered with chimeric A10-A3 antibody to nude mice transplanted with gallbladder cancer cells JCRB1033. As shown in Figure 5, the chimeric A10-A3 antibody was found to be able to inhibit the growth of gallbladder cancer.

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Claims (8)

L1CAM(L1 cell adhision molecule)에 특이적으로 결합하는 항-L1CAM 항체 또는 그 항-L1CAM 항체의 항원 결합 단편을 포함하는, 담낭암의 성장 또는 전이를 억제하는 약제학적 조성물.
A pharmaceutical composition that inhibits growth or metastasis of gallbladder cancer, comprising an anti-L1CAM antibody or antigen-binding fragment of the anti-L1CAM antibody that specifically binds to L1 cell adhision molecule (L1CAM).
제1항에 있어서,
상기 L1CAM에 특이적으로 결합하는 L1CAM 특이적인 항-L1CMA 항체 또는 그 항-L1CAM 항체의 항원 결합 단편은 세포막 결합 형태 또는 세포막에서 유리된 형태를 인식하는 것인 조성물.
The method of claim 1,
The L1CAM specific anti-L1CMA antibody or antigen-binding fragment thereof of the anti-L1CAM antibody that specifically binds to L1CAM recognizes a cell membrane bound form or a free form in the cell membrane.
제1항에 있어서,
상기 항체는 수탁번호 KCTC 10966BP의 하이브리도마에 의해 분비되는 4-63, KCTC 10909BP의 하이브리도마에 의해 분비되는 A10-A3 항체, Ab4, 인간화항체, 인간항체 또는 UJ127인 조성물.
The method of claim 1,
Wherein said antibody is 4-63 secreted by hybridoma of accession number KCTC 10966BP, A10-A3 antibody, Ab4, humanized antibody, human antibody or UJ127 secreted by hybridoma of KCTC 10909BP.
L1CAM의 발현을 억제하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 담낭암의 성장 또는 전이를 억제하는 약제학적 조성물.
A pharmaceutical composition that inhibits growth or metastasis of gallbladder cancer, comprising oligonucleotides that inhibit expression of L1CAM.
제4항에 있어서,
L1CAM의 발현을 억제하는 올리고뉴클레오티드는 L1CAM을 암호하는 유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 및 shRNA로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
5. The method of claim 4,
The oligonucleotide that inhibits the expression of L1CAM is selected from the group consisting of antisense oligonucleotides, siRNAs and shRNAs for genes encoding L1CAMs.
제5항에 있어서,
상기 siRNA는 5'-TGGTACAGTCTGGGdtdt-3'(서열번호 1) 또는 5'-CAGCAACTTTGCTCAGAGGdtdt-3'(서열번호 2)의 서열을 가진 조성물.
The method of claim 5,
Wherein said siRNA has a sequence of 5'-TGGTACAGTCTGGGdtdt-3 '(SEQ ID NO: 1) or 5'-CAGCAACTTTGCTCAGAGGdtdt-3' (SEQ ID NO: 2).
나쁜 예후를 가지는 담낭암의 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여, L1CAM에 특이적인 항-L1CAM 항체를 이용하여 담낭암 환자의 시료로부터 L1CAM을 검출하는 방법.
A method for detecting L1CAM from a sample of gallbladder cancer patients using anti-L1CAM antibodies specific for L1CAM to provide information necessary for the diagnosis or prognosis of gallbladder cancer with a poor prognosis.
나쁜 예후를 가지는 담낭암의 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여, L1CAM에 특이적인 올리고뉴클레오티드를 이용하여 담낭암 환자의 시료로부터 L1CAM을 검출하는 방법. A method for detecting L1CAM from a sample of gallbladder cancer patients using oligonucleotides specific to L1CAM to provide information necessary for the diagnosis or prognosis of gallbladder cancer with a poor prognosis.
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